Ryseck, Ilona: Modulation von Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen in Kultur durch humanes Kammerwasser, Transforming Growth Factor-Beta 2 und Ascorbinsäure

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Kapitel 5. Diskussion

5.1 Humanes Kammerwasser

Sowohl die Proliferation als auch die Migration boviner kornealer Endothelzellen in Zellkultur wurde unter Einfluß von humanem Kammerwasser gehemmt. Die Experimente wurden mit unverdünntem und 10%igem humanem Kammerwasser durchgeführt. Es ergab sich eine nahezu vollständige Hemmung von Proliferation und Migration unter Einwirkung von unverdünntem Kammerwasser. Die Proliferations - und Migrationsrate betrug 70% der Kontrollzellkulturen, wenn dem Medium 10% Kammerwasser zugesetzt wurde.

In dieser Studie wurde primäres (normales) Kammerwasser verwendet, das während Routine - Kataraktextraktionen entnommen wurde. Postoperativ, sowie durch verschiedene Erkrankungen, kann sich die Zusammensetzung des Kammerwassers verändern (sekundäres Kammerwasser). So kann es zu einem erhöhten Gehalt an Serum - Makromolekülen (Weinsieder et al. 1975), Insulin (Coulter et al. 1980) und Prostaglandinen (Eakins et al. 1972) kommen. Es ist bekannt, daß diese Moleküle die Zellteilung beeinflussen (Barnes und Sato 1980).

Die Wirkung von Kammerwasser auf die Proliferation okulärer Zellen wurde schon vielfach untersucht, wohingegen in dieser Studie erstmalig am Wundmodell der hemmende Einfluß von Kammerwasser auf die Migration gezeigt wurde.

Primäres Kammerwasser hat einen hemmenden Einfluß auf die Proliferation von Thymozyten (Granstein et al. 1990) und Lymphozyten (Kaiser et al. 1989), stimuliert jedoch die Proliferation von Fibroblasten (Burke et al. 1982/83).

Bei Verwendung von sekundärem Kammerwasser des Kaninchens konnte eine fördernde Wirkung auf die Proliferation von Kaninchen - Linsenepithelzellen (Reddan et al. 1979) und bovinen kornealen Endothelzellen (Ledbetter et al. 1983) beobachtet werden.

Die Ergebnisse dieser publizierten Studien sind schwierig zu vergleichen, da die Versuchsbedingungen stark variieren (Konzentrationen, primäres oder sekundäres Kammerwasser, unterschiedliche Spezies). Weiterhin wurden zum Teil qualitative


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Beobachtungen der Kulturmorphologie zur Beurteilung des Wachstums benutzt. In anderen Studien dient die Zellzahl als Maß für die Proliferationsrate.

Welche Faktoren im primären oder sekundären Kammerwasser für eine Stimulation oder Inhibierung des Wachstums kornealer Endothelzellen verantwortlich sind, ist nach wie vor unbekannt.

5.2 Der Transforming Growth Factor Beta 2 (TGF-ß2)

Die Untersuchung des Einflusses von TGF-ß2 auf die Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen in Zellkultur ergab einen gegensätzlichen Effekt. Die Proliferation wurde dabei bis auf den dreifachen Wert der Kontrollzellkulturen stimuliert, wohingegen die Migration sowohl bei der physiologischen Konzentration (1-3 ng/ml) als auch bei Konzentrationen von 0,1 und 10 ng/ml zu 50% inhibiert wurde.

Die biologischen Wirkungen der TGF-ßs sind sehr vielfältig und reichen von der Regulation der Proliferation, Differenzierung, Adhäsion und Migration von Zellen über eine Stimulation von extrazellulärer Matrix - Sezernierung bis zu einer Modulation vieler Entzündungs - und Immunprozesse. TGF-ß spielt in vivo eine wichtige Rolle bei der Gewebserneuerung, Wundheilung und der Morphogenese während der embryologischen Entwicklung (Roberts und Sporn 1990).

Die Wirkungen von TGF-ß auf das Zellwachstum wurden bereits vielfach untersucht, wobei sich sowohl inhibierende als auch stimulierende Effekte gezeigt haben. Es wird angenommen, daß TGF-ß seine inhibitorische Wirkung dadurch entfaltet, daß es die Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus verharren läßt und damit den Eintritt in die S - Phase verzögert (Studie an vaskulären Endothelzellen, Heimark et al. 1986).

Der Einfluß von TGF-ß2 auf die Proliferation wurde schon an zwei verschiedenen okulären Zellarten studiert, wobei sich ein gegensätzlicher Effekt zeigte. So wurde die Proliferation boviner kultivierter Linsenepithelzellen durch TGF-ß2 signifikant inhibiert (Kurosaka und Nagamoto 1994). In derselben Studie wurde der stimulierende Effekt von 10% humanem Kammerwasser im Medium durch Zugabe eines anti-TGF-ß2 Antikörpers aufgehoben. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß der im Kammerwasser enthaltene TGF-ß2 die Proliferation von Linsenepithelzellen in vitro


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hemmt. Einen zu diesen Ergebnissen gegensätzlichen Effekt hat TGF-ß2 auf die Proliferation von kornealen Stromafibroblasten (Kay et al. 1997). In dieser Studie wurde der Einfluß von TGF-ß 1, 2 und 3 untersucht und eine signifikante Stimulierung der Proliferation durch alle drei Isoformen gezeigt. Es liegen keine Studien zum Einfluß von TGF-ß2 auf korneale Endothelzellen vor. Rieck et al. konnten keine signifikante Stimulation der Proliferation humaner kornealer Endothelzellen in Zellkultur durch TGF-ß1 nachweisen (Rieck et al. 1995).

Nach meinem Wissensstand wurde der Einfluß von TGF-ß2 auf die Migration okulärer Zellen bisher nicht untersucht. In einer Studie von Sankar et al. wird ein hemmender Effekt von TGF-ß2 auf die Migration boviner Aortenendothelzellen beschrieben (Sankar et al. 1995).

Studien an den genetisch besser zugänglichen Spezies Drosophila und Caenorhabitides elegans haben das Verständnis darüber, wie die Signaltransduktion von Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren (z.B. TGF-ß-Rezeptor I und II) zum Kern abläuft, entscheidend verbessert. In Drosophila wurden TGF-ß-ähnliche Proteine, genannt Mad (mothers against dpp), identifiziert (Sekelsky et al. 1995) und in Caenorhabitides elegans, Mad - Homologe, die Sma2, Sma3 und Sma4 genannt wurden (Savage et al. 1996). In Xenopus, Maus und Mensch wurden bis zu neun Homologe zu Mad und Sma gefunden, die intrazelluläre Komponenten in der Signaltransduktion der TGF-ßs darstellen. Sie werden SMADs genannt (Derynck et al. 1996).

Eine Studie mit radiomarkiertem TGF-ß1 von Yamashita et al. läßt darauf schließen, daß der bei Bindung von TGF-ß an den TGF-ß-Rezeptor II (TßRII) ausgebildete Rezeptorkomplex ein Heterotetramer darstellt, welcher aus zwei TGF-ß-Rezeptor I (TßRI) und zwei TßRII-Molekülen besteht (Yamashita et al. 1994). TßR I und II sind strukturell ähnlich. Sie besitzen eine kleine cysteinreiche extrazelluläre Region und einen intrazellulären Teil, der hauptsächlich aus der Kinasedomäne besteht. Der TßR I, aber nicht der TßR II, hat eine Region, die reich an Glycin- und Serinresten (GS-Domäne) in der juxtamembranären Domäne ist (Heldin et al. 1997). An dieser GS-Domäne wird TßR I von TßRII durch Phosphorilierung aktiviert (Wrana et al. 1994; Souchelnytskyi et al. 1996). Durch den aktivierten Rezeptorkomplex werden die intrazellulären Smad 2 und 3 Proteine ebenfalls phosphoriliert und bilden anschließend


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einen Komplex mit Smad 4 (Nakao et al. 1997). Dieser Komplex wandert vom Zytoplasma in den Zellkern und bildet dort mit intranuklearen Faktoren einen Komplex, der daraufhin eine Gentranskription initiiert (Heldin et al. 1997, Abb. 5.1.). Die geschilderten Vorgänge wurden an nichtokulären Zellen studiert.

Vor kurzer Zeit wurde entdeckt, daß SMAD 6 und SMAD 7 als Inhibitoren der intrazellulären Signaltransduktion wirken. Sowohl durch TGF-ß als auch durch andere Stimuli wird die Transkription inhibierender SMAD-mRNA induziert (Nakao et al. 1997). Möglicherweise agieren inhibitorische SMADs als autoregulatorische negativ-Feedback-Signale in der Signaltransduktion der TGF-ßs (Heldin et al. 1997).

Abb. 5.1: Signaltransduktion durch TGF-ß (modifiziert aus Usui et al. 1998)

Joyce und Zieske konnten nachweisen, daß humane korneale Endothelzellen die drei TGF-ß-Rezeptoren I, II und III besitzen (Joyce und Zieske 1997). Nach einer Studie von Usui et al. fehlt kultivierten bovinen kornealen Endothelzellen der Rezeptor Typ III (Usui et al. 1998). Aufgrund dieser Tatsache bleibt unklar, durch welche Mechanismen die in der vorliegenden Arbeit durch TGF-ß2 ausgelösten Wirkungen auf die BCEC zustande


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kommen. Eine erklärende Hypothese wäre, daß die Bindungsaffinität von TGF-ß2 an den Rezeptor Typ II für die Signaltransduktion ausreichend ist.

Jampel et al. und Tripathi et al. haben mit voneinander verschiedenen Methoden die Konzentration von TGF-ß2 in humanem Kammerwasser bestimmt. Das Kammerwasser wurde dabei in beiden Studien von Patienten entnommen, bei denen eine Routine - Kataraktoperation durchgeführt wurde. Bei Jampel et al. beträgt die TGF-ß2-Konzentration ca. 3 ng/ml und TGF-ß2 liegt zu ca. 60 % in der aktiven Form vor (Jampel et al. 1993). Die von Tripathi et al. gemessenen TGF-ß2-Konzentrationen betragen ca. 1,5 ng/ml und ca. 12 % liegen in der aktiven Form vor (Tripathi et al. 1994). Im Plasma ist TGF-ß2 nicht nachweisbar (Cheifetz et al. 1987). Somit kann ausgeschlossen werden, daß der hohe TGF-ß2 - Gehalt durch Diffusion aus dem Plasma zustande kommt. Vielmehr konnte in zahlreichen okulären Geweben die Fähigkeit zur Sekretion von TGF-ß2 nachgewiesen werden. Dazu zählen u.a. die Linse (Allen et al. 1998), die Iris (Knisely et al. 1991) und das Ziliarkörperepithel (Heibig et al. 1991; Pasquale et al. 1993). Sie sezernieren TGF-ß2 in der inaktiven oder latenten Form, in der zwei zusätzliche Polypeptidketten nichtkovalent mit dem dimerischen Molekül verbunden sind (Wakefield et al. 1988). Der physiologische Mechanismus der Aktivierung von latentem TGF-ß ist nicht bekannt. In in vitro - Studien konnte gezeigt werden, daß Serinproteasen wie z.B. Plasmin oder Kathepsin D latenten TGF-ß aktivieren können (Lyons et al. 1988).

Bei vielen Erkrankungen des Auges wurde ein erhöhter TGF-ß2 - Gehalt im Kammerwasser gefunden. Dies zeigte sich bei entzündlichen Prozessen, wie einer experimentell induzierten Uveitis (Rocha et al. 1993), oder einer endotoxininduzierten okulären Entzündung (Allen et al. 1996). Desweiteren konnte ein signifikant erhöhter Kammerwassergehalt an TGF-ß2 in Glaukom - und Kataraktaugen nachgewiesen werden (Tripathi et al. 1994, Allen et al. 1998). Welche Rolle TGF-ß2 bei diesen Erkrankungen spielt, ist unklar.

Die gegensätzlichen Wirkungen von TGF-ß2 in der vorliegenden Arbeit verdeutlichen die Multifunktionalität dieses Wachstumsfaktors.


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5.3 Ascorbinsäure

Bei der Beeinflussung der Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen in Zellkultur durch Ascorbinsäure wurde ebenfalls ein gegensätzlicher Effekt festgestellt. Das bedeutet, daß die Proliferation durch Ascorbinsäure gehemmt wurde, wohingegen Ascorbinsäure auf die Migration der Endothelzellen einen stimulierenden Einfluß hatte.

In einer Studie von Bode et al. wurde untersucht, welche Form des Vitamin C bevorzugt von kornealen Endothelzellen an ihrer Rückseite aufgenommen wird. Man kam zu dem Ergebnis, daß die oxidierte Form, also Dehydroascorbinsäure das bevorzugte Substrat für die Aufnahme in die kornealen Endothelzellen ist. Diese Untersuchungen wurden an bovinen kornealen Endothelzellen durchgeführt (Bode et al. 1991).

Es ist bewiesen, daß Zellen, die Substrate nicht durch einen aktiven Transport konzentrieren, Dehydroascorbinsäure bevorzugen, wohingegen Gewebe, die Substrate durch einen Na+ - abhängigen Transport konzentrieren, Ascorbinsäure bevorzugt aufnehmen (Rose 1988, Socci und Delamere 1988). Zu den erstgenannten zählen Leukozyten und Erythrozyten (Bigley et al. 1983), zu den letztgenannten Ileum (Mellors et al. 1977), Niere (Rose 1989) und Retina (Heath und Fiddick 1966). Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß die von den kornealen Endothelzellen aufgenommene Dehydroascorbinsäure intrazellulär zu Ascorbinsäure reduziert wird (Bode et al. 1991). Dies läßt vermuten, daß das so entstandene Regenerationssystem der Dehydroascorbinsäure als Schutz vor derselben aufzufassen ist, da sie einen nachweislich toxischen Effekt hat, der stärker ausgeprägt ist als bei der reduzierten Form des Vitamin C (Rose et al. 1992, Bianchi et al. 1986).

Die Konzentration von Ascorbinsäure in humanem Kammerwasser liegt um ein Vielfaches (ca. 20 - fach) höher als die Plasmakonzentration (Müller und Buschke 1934, Bernadinis et al. 1965). Ähnlich hohe Ascorbinsäurekonzentrationen des Kammerwassers wurden auch bei anderen Spezies gefunden, die überwiegend am Tage wach sind, z.B. Rind und Kaninchen. Bei nachtaktiven Spezies, wie z.B. Ratte, Katze oder Eule ergaben sich bei der Untersuchung der Ascorbinsäure im Kammerwasser Konzentrationen in der Größenordnung der Plasmakonzentration (Ringvold 1980). Es liegt also nahe, daß eine hohe Ascorbinsäurekonzentration im Kammerwasser etwas mit dem einfallenden Licht zu tun hat (s.u.).


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Wie kommt es nun zu dieser hohen Konzentrierung? Der Ort der Kammerwassersekretion ist das Ziliarkörperepithel mit dem pigmentierten Epithel auf der Stromaseite und dem nichtpigmentierten Epithel auf der Kammerwasserseite (Zadunaisky 1978). Helbig et al. untersuchten, über welche Mechanismen Vitamin C vom Ziliarkörperepithel transportiert wird und fanden zwei verschiedene Transportsysteme für die intrazelluläre Akkumulation der Ascorbinsäure. Zum einen existiert ein Natrium - abhängiger Ascorbinsäure - Transport, der eine Stöchiometrie von 2 Na+ zu 1 AS (Ascorbinsäure) besitzt und zum anderen ein Natrium - unabhängiger Transport von Dehydroascorbinsäure mit intrazellulärer Dehydroascorbinsäure - Reduktase. Anschließend kann die intrazellulär akkumulierte Ascorbinsäure ohne Energieverbrauch entlang des elektrochemischen Gradienten oder durch Kopplung an andere Ionen vom Ziliarkörperepithel ins Kammerwasser gelangen (Abb. 5.2. und 5.3.). Diese Ergebnisse basieren auf Untersuchungen an bovinen Ziliarkörperepithelzellen (Helbig et al. 1990).

Abb. 5.2: Ziliarkörperepithel mit pigmentierter (PE) und nichtpigmentierter (NPE) Epithelschicht (aus Helbig et al. 1990)

Abb. 5.3: Modell für die intrazelluläre Akkumulation von Ascorbinsäure (AS) in PE-Zellen
(aus Helbig et al. 1990)


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Zahlreiche Studien haben gezeigt, daß Ascorbinsäure einen hemmenden Einfluß auf die Zellproliferation nimmt. So konnte die antiproliferative bzw. zytotoxische Wirkung von Ascorbinsäure auf Linsenepithelzellen (Wunderlich et al. 1992), Hornhautepithelzellen (Knorr et al. 1996), Fibroblasten (Jampel 1990) sowie Ehrlich - Aszites - Tumorzellen (Benade et al. 1964) nachgewiesen werden. Die zytotoxische Wirkung von Ascorbinsäure ist zelldichteabhängig. Dies konnte für Linsenepithelzellen und Fibroblasten nachgewiesen werden (Jampel 1990, Wunderlich et al. 1992) und zeigt, daß Zellen, die im Zellverband vorliegen, eine höhere Toleranz gegenüber Ascorbinsäure aufweisen. In den durchgeführten Experimenten zur Untersuchung der Migration liegt ein konfluenter Zellrasen vor, in den eine kreisrunde „Wunde“ gesetzt wurde. Die im Wundinneren abgetöteten Zellen wurden vor der Inkubation mit Ascorbinsäure gründlich abgespült, so daß nur Zellen im geschlossenen Zellverband der Ascorbinsäure ausgesetzt waren.

Ich möchte etwas näher auf die bereits vorliegenden Ergebnisse zur Wirkung von Ascorbinsäure auf korneale Endothelzellen anderer Tierspezies und auch auf bovine korneale Endothelzellen eingehen. Die Arbeitsgruppe Yue et al. konnte einen schädigenden Einfluß von Ascorbinsäure auf das Wachstum von kornealen Kaninchenendothelzellen in Zellkultur beschreiben (Yue et al. 1980). Dabei wurden die gewonnenen Endothelzellen mit Medium inkubiert, das Ascorbinsäure in einer Konzentration von 75 µg/ml enthielt. Die Ergebnisse zeigten, daß die mit Ascorbinsäure inkubierten Kulturen einen längeren Zeitraum benötigten, um konfluent zu wachsen und bei Konfluenz eine geringere Zellzahl aufwiesen, als die der Kontrollzellkulturen. Es wird von einem zytotoxischen Effekt gesprochen, der jedoch nicht belegt ist. In unseren Versuchen wurden Vitalitätsprüfungen durchgeführt, die belegen, daß Ascorbinsäure in den untersuchten Konzentrationen keinen toxischen Einfluß auf kultivierte bovine korneale Endothelzellen hat, sondern das eine direkte Hemmung der Zellproliferation erfolgt.

Es liegen Studien vor, die einen fördernden Effekt von Ascorbinsäure auf die Zellteilung pflanzlicher Zellen beschrieben. Dabei wurden Zellinien der Wurzeln von Allium cepa und Vicia faba benutzt (Liso et al. 1984). Ein stimulierender Einfluß von Ascorbinsäure auf tierische Zellen wurde bisher nicht gezeigt.

Der Einfluß von Ascorbinsäure speziell auf die Migration wurde bisher weder für okuläre Zellen noch für andere Zellinien untersucht. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit, die


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einen fördernden Einfluß von Ascorbinsäure auf die Migration der BCEC zeigen, läßt sich aber schlußfolgern, daß tatsächlich keine Zytotoxizität der Ascorbinsäure vorliegt.

Der hohe Gehalt des Kammerwassers an der „Gesamt“-Ascorbinsäure kann am besten durch ihre biochemischen Funktionen, die sie am Auge übernimmt, erklärt werden. So ist sie wahrscheinlich ein Schutzmechanismus für intraokulare Gewebe vor lichtinduzierten Schäden, da sie eine der wichtigsten UV-Licht absorbierenden Komponenten des Kammerwassers ist und außerdem als Redoxsystem lichtinduzierte Radikale unschädlich machen kann. Ascorbinsäure reagiert mit den durch Strahlung entstehenden Superoxidanionen und Hydroxylradikalen.

Desweiteren wurde die Vermutung aufgestellt, daß das Kammerwasser als ein UV-Filter zum Schutz der hinter ihm liegenden Strukturen dient. Es konnte nachgewiesen werden, daß die im Kammerwasser vorhandene Ascorbinsäure die Absorption und die Wellenlänge der Strahlung herabsetzt (Ringvold 1996; Ringvold 1980; Reiss et al. 1986). Nachweislich reduziert der hohe Ascorbinsäuregehalt im Kammerwasser die durch UV- A und UV- B induzierten DNA - Schäden des Linsenepithels (Lin et al. 1994).

Auch für den Schutz vor den innerhalb der Atmungskette und bei der Reduktion von Sauerstoff zu Wasser entstehenden Radikalen sowie vor H2O2, das bei metabolischen Reaktionen entsteht, scheint der hohe Ascorbinsäuregehalt eine entscheidende Rolle zu spielen (Rose et al. 1998).

Nachdem in der vorliegenden Arbeit der hemmende Einfluß von Ascorbinsäure auf die Proliferation der BCEC nachgewiesen wurde, folgte die Durchführung von Versuchen mit 12-S-HETE. Dabei konnte die hemmende Wirkung von Ascorbinsäure bei einer Konzentration von 50µg/ml durch Zugabe von 12-S-HETE in der Konzentration 0,1 µM partiell wieder aufgehoben werden. Diese interessante Beobachtung zeigt den weitreichenden Einfluß von Ascorbinsäure auch auf den Lipoxygenaseweg des Arachidonsäuremetabolismus und korreliert mit den Beobachtungen von Willams et al., Chan et al. und Gupta et al.. Ascorbinsäure hemmt die Bildung von 12-S-HETE durch korneale Zellen (Willams et al 1986). 12-S-HETE begünstigt die Proliferation epidermaler Zellen (Chan et al. 1985). Eine Hemmung der Lipoxygenase, welche die Entstehung von 12-S-HETE bewirkt, hat eine Verzögerung der Wundheilung kornealer Rattenepithelzellen zur Folge (Gupta et al. 1992).


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Zusammenfassend soll diese Arbeit zur Aufklärung beitragen, welche Rolle das Kammerwasser selbst, sowie Faktoren, die in hoher Konzentration im Kammerwasser vorhanden sind, im Wundheilungsprozess kornealer Endothelzellen spielen.

Die durchgeführten Experimente beziehen sich ausschließlich auf bovine korneale Endothelzellen in Zellkultur. Es bleibt zu untersuchen, ob diese Ergebnisse auch für humane korneale Endothelzellen gelten.



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Tue Sep 11 15:37:37 2001