Ryseck, Ilona: Modulation von Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen in Kultur durch humanes Kammerwasser, Transforming Growth Factor-Beta 2 und Ascorbinsäure

Aus der Klinik für Augenheilkunde
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt - Universität zu Berlin


DISSERTATION
Modulation von Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen in Kultur durch humanes Kammerwasser, Transforming Growth Factor-Beta 2 und Ascorbinsäure

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt - Universität zu Berlin

vonIlona Ryseck,
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
PD Dr.med. Dr. (F) P. Rieck
Prof. Dr. med. H.-J. Thiel
Prof. Dr. med. M. Wiederholt

Datum der Promotion: 17.07.2000

Zusammenfassung

Einleitung: Die Wundheilung kornealer Endothelzellen erfolgt hauptsächlich durch Migration benachbarter Zellen. Die Endothelzellen sind in vivo ständig in Kontakt mit Kammerwasser (KW). TGF-ß2 und Ascorbinsäure (AS) sind in hoher Konzentration im KW enthalten. Der Einfluß von humanem KW, TGF-ß2 und AS auf Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen (BCEC) in Kultur wurde untersucht.

Methoden: Proliferation: BCEC der 1.Passage wurden zu 1,5x104 Zellen/Well ausgesät. Mit frischem Medium und Zusatz von humanem KW (10% und 100%), TGF-ß2 (0,1; 1 und 10 ng/ml) und AS (50, 100 und 200 µg/ml) wurden die Kulturen für 72 oder 96 h inkubiert und anschließend gezählt. Migration: Konfluente Zellkulturen der 1.Passage wurden verwendet. Mit einem modifizierten Trepan (_ 5,5 mm) wurde eine zentrale, zirkuläre “Wunde“ gesetzt. Die Kulturen wurden mit frischem Medium, das humanes KW, TGF-ß2 und AS in den o. g. Konzentrationen enthielt, für 72 oder 96 h inkubiert. Zur Auswertung wurden die in den Wundbereich migrierten Zellen an 5 verschiedenen Stellen, ausgehend vom Wundrand, gezählt.

Ergebnisse: Die Proliferation der BCEC wurde durch humanes KW (unverdünntes KW: nahezu 100%; 10%iges KW: 30%) und Ascorbinsäure (ca. 90% bei AS 200 µg/ml) gehemmt. TGF-ß2 stimulierte die Proliferation bis zu einem 3fachen Wert der Kontrollen. Die Migration wurde durch humanes KW (unverdünntes KW: nahezu 100%; 10%iges KW: 30%) und TGF-ß2 (ca. 50% bei allen Konzentrationen) gehemmt. AS hatte einen stimulierenden Einfluß (20-50%) auf die Migration.

Schlußfolgerung: Noch ist unklar, welche Substanzen im KW für den pro- liferationshemmenden Einfluß auf korneale Endothelzellen verantwortlich sind. Sowohl AS als auch TGF-ß2 zeigten einen gegensätzlichen Effekt auf Proliferation und Migration kultivierter BCEC. Die Bedeutung dieser Beobachtungen für die Wundheilung humaner kornealer Endothelzellen in vivo ist Gegenstand weiterer Untersuchungen.

Abstract

Purpose: Corneal endothelial cells are non-proliferating, wound healing primarily occurs by migration of adjacent cells. Endothelial cells in vivo are constantly exposed to aqueous humor (AH). Elevated concentrations of TGF-ß2 and ascorbic acid (AA) are present in aqueous humor. The influence of human AH, TGF-ß2 and AA on proliferation and migration of bovine corneal endothelial cells in vitro was investigated.

Methods: Proliferation assays: BCEC at first passage were seeded at 1.5x104 cells/well. Fresh medium containing human AH (10% and 100%), TGF-ß2 (0,1;1 and 10 ng/ml) and AA (50, 100 and 200 µg/ml) was added to the cells. 72 or 96 hours later the cells were counted. Migration assays: BCEC at first passage were grown to confluency. A central, circular “wound“ was made with an especially designed trephine (_ 5.5 mm). The cultures were incubated with fresh medium containing human AH, TGF-ß2 and AA in the same concentrations for 72 or 96 hours. The cells were then counted in five randomly chosen sections from the wound edge.

Results: Proliferation of BCE cells was inhibited by human AH (pure AH: nearly 100%, 10% AH: 30%) and AA (about 90% at 200 µg/ml). TGF-ß2 stimulated the proliferation up to 3 fold compared to the controls. Migration was inhibited by human AH (pure AH: nearly 100%, 10% AH: 30%) and TGF-ß2 (about 50% at all concentrations). AA had a stimulatory effect (20-50%) on migration.

Conclusion: Presently, it remains unknown which substances in AH are responsible for the inhibiting effect on corneal endothelial proliferation. Both TGF-ß2 and AA showed to have a differential effect on proliferation and migration of cultured BCE cells. The significance of these observations for wound healing of human corneal endothelial cells in vivo has to be investigated.

Schlagwörter:
Endothelzellen, Ascorbinsäure, TGF-beta2, Kammerwasser, Zellkultur

Keywords:
Endothelial-cells, Ascorbic-asset, TGF-beta2, aqueous-humor, cell-culture


Seiten: [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteModulation von Proliferation und Migration boviner kornealer Endothelzellen in Kultur durch humanes Kammerwasser, Transforming Growth Factor-Beta 2 und Ascorbinsäure
1 Einleitung
1.1Die Hornhaut
1.1.1Struktur
1.1.2Funktion
1.2Das Hornhautendothel
1.2.1Struktur und Funktion
1.2.2Wundheilung in vivo
1.3Die Kultivierung von Hornhautendothelzellen
1.4Wundheilung des Hornhautendothels in vitro
1.5Kammerwasser
1.5.1Bildung und Funktion
1.5.2Zusammensetzung
1.6Wachstumsfaktoren (WF)
1.6.1Der Epidermal Growth Factor (EGF)
1.6.2Die Fibroblast Growth Factors (FGF)
1.6.3Die Transformig Growth Factors beta (TGF-ß)
1.6.3.1Der Transforming Growth Factor Beta 2 (TGF-ß2)
1.7L-Ascorbinsäure ( Friedrich 1987, Nobile und Woodhill 1981)
1.7.1Zusammenhang mit Lipoxygenase
2 Ziel der experimentellen Arbeit
3 Material und Methoden
3.1Material
3.1.1Zellen
3.1.2Laborinventar
3.1.2.1Gefäße
3.1.2.2Instrumente
3.1.2.3Geräte
3.1.3Medium und Lösungen
3.1.3.1Zusammensetzung des Kulturmediums
3.1.3.2Sonstige Lösungen
3.2Methoden
3.2.1Präparation und Anlegen der Primärkultur
3.2.2Passage der Primärkultur
3.2.3Proliferationsassay
3.2.4Wundassay
3.2.5Proliferations - Experimente
3.2.5.1Humanes Kammerwasser
3.2.5.2TGF-ß2
3.2.5.3Ascorbinsäure
3.2.6Wundmodell - Experimente
3.2.6.1Humanes Kammerwasser
3.2.6.2TGF-ß2
3.2.6.3Ascorbinsäure
3.2.7Toxizitätstests
3.2.8Statistik
4 Ergebnisse
4.1Humanes Kammerwasser
4.1.1Proliferationsversuche
4.1.2Wundmodellversuche
4.2Transforming Growth Factor Beta 2 (TGF-ß 2)
4.2.1Proliferationsversuche
4.2.2Wundmodellversuche
4.2.3Toxizitätstests
4.3Ascorbinsäure
4.3.1Proliferationsversuche
4.3.2Wundmodellversuche
4.3.3Toxizitätstests
4.3.4Beeinflussung der Wirkung von Ascorbinsäure auf die Proliferation
von BCECdurch 12-S-HETE
5 Diskussion
5.1Humanes Kammerwasser
5.2Der Transforming Growth Factor Beta 2 (TGF-ß2)
5.3Ascorbinsäure
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: einige ausgewählte Konzentrationen von Inhaltsstoffen des Kammerwassers (modifiziert aus Caprioli 1992)

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1 Darstellung TGF-ß-Rezeptor III und Rezeptorkomplex aus TGF-ß-Rezeptor
I und II (modifiziert aus Heldin et al. 1997)
Abb. 1.2. Struktur von TGF-ß2 (aus Miyazono et al. 1993)
Abb. 1.3. Vitamin C (aus Friedrich 1987)
Abb. 1.4: Redoxsystem des Vitamin C, Strukturformeln der L-Ascorbinsäure und der
Dehydro-L-Ascorbinsäure (aus Friedrich 1987)
Abb. 1.5: Metabolisierung von Arachidonsäure
Abb. 3.1: Trepan
Abb. 3.2: Zählraster
Abb. 4.1
Abb. 4.2:
Abb. 4.3: Kontrolle
Abb. 4.4: 10%iges Kammerwasser
Abb. 4.5: unverdünntes Kammerwasser
Abb. 4.6:
Abb. 4.7: Kontrolle
Abb. 4.8: TGF-ß2 0,1 ng / ml
Abb. 4.9: TGF-ß2 1 ng / ml
Abb. 4.10: TGF-ß2 10 ng / ml
Abb. 4.11:
Abb. 4.12: Kontrolle
Abb. 4.13: TGF-ß2 0,1 ng / ml
Abb. 4.14: TGF-ß2 1 ng / ml
Abb. 4.15: TGF-ß2 10 ng / ml
Abb. 4.16: Proliferation TGF-ß2 0,1 ng / ml
Abb. 4.17: Abb. 4.17. Migration TGF-ß2 10 ng / ml
Abb. 4.18:
Abb. 4.19: Kontrolle . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.20: AS 50µg / ml . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.21: AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.22: AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.23: Kontrolle . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.24: AS 50 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.25: AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.26: AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.27
Abb. 4.28: Kontrolle . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.29: AS 50 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.30: AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.31: AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.32: Kontrolle . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.33: AS 50 µg / m . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.34: AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.35: AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.36: Migration Kontrolle . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.37: Migration AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.38: Proliferation Kontrolle . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.39: Proliferation AS 100 µg / ml . . . . . Inkubation 96 h
Abb. 4.40: Proliferation AS 200 µg / ml . . . . . Inkubation 72 h
Abb. 4.41
Abb. 5.1: Signaltransduktion durch TGF-ß (modifiziert aus Usui et al. 1998)
Abb. 5.2: Ziliarkörperepithel mit pigmentierter (PE) und nichtpigmentierter (NPE) Epithelschicht (aus Helbig et al. 1990)
Abb. 5.3: Modell für die intrazelluläre Akkumulation von Ascorbinsäure (AS) in PE-Zellen
(aus Helbig et al. 1990)

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Tue Sep 11 15:37:37 2001