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AUFGABENSTELLUNG & EXPERIMENTELLE VERSUCHSANORDNUNG

2.1 Fragestellung dieser Arbeit

Läsionen des entorhinalen Cortex führen zu einer selektiven partiellen Deafferenzierung der Dendriten der äusseren Molekularschicht des Gyrus dentatus, gefolgt von axonalem Sprouting und reaktiver Synaptogenese. So kommt es zum Sprouting nur solcher kommissuralen Fasern, die ohnehin in der Terminationszone des Tractus perforans liegen. Es liegt nahe, dass für dieses Phänomen bisher noch nicht identifizierte, lamina-spezifisch exprimierte Faktoren in der äusseren Molekularschicht verantwortlich sind, obgleich auch die Möglichkeit bestehen könnte, dass der Verlust repulsiver Faktoren in der betroffenen Schicht das Auswachsen in die Zone der nun freien Dendritenabschnitte ermöglicht.

Diese Arbeit steht im Kontext der Frage, welche Moleküle beim schichten-spezifischen Sprouten im adulten Hippocampus beteiligt sind. Grundsätzlich bestehen folgende Möglichkeiten zur Erklärung der Ursachen des schichtenspezifischen Aussprossens:

  1. Die de novo Expression von bisher nicht vorkommenden Faktoren in den betroffenen Zonen.
  2. Die Reexpression von während der Entwicklung der hippocampalen Terminationszonen Afferenzen vorkommenden membran-assoziierten Faktoren.
  3. Die reduzierte Expression oder Repression von membran-assoziierten Faktoren, die während der Adoleszenz als Stabilisatoren des hippocampalen Systems dienen.

Wie unter 1.4 besprochen, sind nicht allein kontaktabhängige Mechanismen der axonalen Wegfindung bekannt, sondern es wurde auch experimentell distanzvermittelte Attraktion und Repulsion (Chemoattraktion und Chemorepulsion) nachgewiesen. Die drei Interpretationsmöglichkeiten zur Beschreibung des Sproutingphänomens sind also auch gut auf sekretierte Faktoren anwendbar. Vorarbeiten von verschiedenen Arbeitsgruppen gaben erste Hinweise, dass bei der Etablierung der entorhino-hippocampalen sowie kommissuro-hippocampalen Wegfindung membran-assoziierte Faktoren eine entscheidende Rolle spielen (Li et al., 1993; Frotscher & Heimrich, 1993; Woodhams et al., 1993).

Zum Studium der membran-assoziierten Faktoren mussten geeignete Assays etabliert werden, die eine systematische Analyse dieser Faktoren erlauben. Dabei mussten folgende methodische Fragen geklärt werden:

  1. Gibt es geeignete Methoden zur Präparation und Anreicherung membran-assoziierter Proteine, die für in vitro Studien noch ausreichend biologisch aktiv sind?
  2. Wie lassen sich verschiedene Membranfraktionen in geeigneter Weise und simultan auswachsenden Neuriten anbieten?
  3. Wie können auswachsende Neuriten dargestellt und von Dendriten unterschieden werden?
  4. Welche Methoden sind geeignet, mögliche auswachsverstärkende Aktivität zu quantifizieren und das oder die beteiligten Proteine zu identifizieren?

Nach Klärung der methodischen Probleme stehen folgende inhaltliche Fragen offen:

  1. Lässt sich der Einfluss membran-assoziierter Faktoren während der Entwicklung des entorhino-hippocampalen Systems in einem in vitro Assay erfassen?
  2. Gibt es maturationsabhängige Veränderungen im sich entwickelnden Hippocampus?
  3. Ist das zielgerichtete und laminaspezifische Einwachsen entorhinaler Fasern in den Hippocampus von attraktiven oder repulsiven Lenkungsmolekülen kontrolliert?
  4. In welchem Zeitfenster sind diese attraktiven und/oder repulsiven Faktoren im sich entwickelnden Hippocampus präsent?
  5. Sind membran-assoziierte Lenkungsmoleküle im deafferenzierten Hippocampus vorhanden, die die schichten-spezifische Leitung sproutender Fasern steuern?
  6. In welchem zeitlichen Rahmen findet die mögliche schichten-spezifische axonale Lenkung statt?
  7. Lässt sich der Einfluss von membran-assoziierten Faktoren während der Entwicklung zu denen während der Reorganisation im adulten Hippocampus auf entorhinale Axome vergleichen?

2.2  In vitro Assays in der zellbiologischen Forschung

In vitro Assays sind Testsysteme, die es erlauben, komplexe zelluläre Prozesse und den zugrundeliegenden Mechanismen unter standardisierten Bedingungen zu analysieren und so qualitative bzw. quantitative Aussagen ermöglichen. Die Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass durch die Entwicklung geeigneter Assays gerade in den Biowissenschaften enorme Wissenszuwächse folgten [so z.B. Southern blotting (E. Southern, 1979), PCR-Analyse (K. Mullis et al., 1986), Patch-clamp recording (E. Neher & B. Sakmann, 1984), Mutationsanalysen in high out put screening Verfahren (C. Nüsslein-Vollhard & E.


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Wieschaus, 1980) und aktuell die Stammzell-Kultivierung (Mc Kay, 1989). Es ist unumstritten, dass die Erkenntnisse aus in vitro Assays äusserst wertvoll und als Basis für weitere Untersuchungen unabdingbar sind, auch wenn es das Ziel biomedizinischer Forschung immer ist, in vitro Ergebnisse in nachfolgenden Untersuchungen in in vivo oder zumindest unter in vivo-ähnlichen Bedingungen zu überprüfen. Das Testen von Hypothesen in in vitro Assays sind also notwendige Vorbedingungen zur Absicherung vor klinischen Anwendungen.

2.3  In vitro Assays zum Studium membran-assoziierter Faktoren

Die ersten Arbeiten, die Hinweise für einen kontaktabhängigen Mechanismus bei der Zielfindung entorhinaler Fasern in den Hippocampus erbrachten, benutzten den Hirnschnitt-Kokultur Assay (Li et al., 1993; Frotscher & Heimrich, 1993). Dabei werden mit Hilfe eines Tissue Chopper oder Vibratoms Gewebeschnitte von 200-500 µm Dicke angefertigt und daraus dann Hippocampus (Zielgebiet) und entorhinaler Cortex (Urspungsgebiet) präpariert und gemeinsam in Kultur gebracht. Eine Abwandlung daraus ist der Adherence Assay, bei dem an einem Kryotom 10-20µm dicke Hirnschnitte mit erhaltender Histoarchitektur angefertigt (‘organotypische Membranarchitektur‘) und mit primären Einzelzellen aus dem Ursprungsgebiet superkultiviert werden (Emerling & Lander, 1996; Förster et al., 1998). Ergebnisse aus Untersuchungen mit diesem Assay bestätigten die Annahme, dass attraktive membran-assoziierte Faktoren im Gyrus dentatus vorliegen, die durch entorhinale Neurone erkannt werden und gegenüber Faktoren in anderen Regionen bevorzugt werden (Förster et al., 1998). In einem weiteren Assay, dem 3T3 Spreading Assay, arbeitet man mit präparierten Membranen, mit denen man Zellkulturschalen beschichtet und dann Neurone oder 3T3 Fibroblasten kultiviert (Savio & Schwab, 1989). Der Vorteil dieses Assays ist die Möglichkeit, die Membranen vor der Kultivierung zu behandeln und zu modifizieren, so z.B. mit Antikörpern zum Neutralisieren von bestimmten Zelladhäsionsmolekülen. Zur Untersuchung von axonalen Lenkungsmolekülen im retinotectalen System wurde mit Erfolg der Streifenassay eingesetzt, bei dem auswachsende Axone zwei simultan angebotenen, alternierenden Membranfraktionen konfrontiert werden (Bonhoeffer & Huf, 1985). Dieses experimentelle Testsystem schien besonders geeignet, die unter 2.1 genannten Fragen experimentell nachzugehen, da:

  1. zwei Substrate innerhalb eines Experiments enthalten sind (also die systematischen und zufälligen Fehler für beide Substrate gleich sind)[Seite 24↓]
  2. die Membranfraktionen vor dem eigentlichen Auswachsen manipuliert werden können
  3. die Auswertung und Quantifizierung zuverlässig und standardisiert möglich ist.

2.4 Der Streifenassay und der Längenauswachsassay

Der Streifenassay ermöglicht die Beobachtung des morphologischen Verhaltens von auswachsenden Neuriten eines Explantats als Reaktion auf membrangebundene attraktive oder repulsive Faktoren. Der von Dr. F. Bonhoeffer entwickelte Assay wurde mit Erfolg zum Testen von axonalem Auswachsen auf gereinigten Membranfraktionen angewandt (Drescher et al., 1995). Der Längenauswachsassay basiert auf dem Streifenassay und dient allein dem Vergleich axonalem Auswachsens auf verschiedenen Substraten. Der Vorteil dieses Assays liegt in der vorgegebenen Richtung, in der Neuriten nur auswachsen können. Damit lässt sich die Auswachslänge gut quantifizieren und Auswachslängen auf verschiedenen Substraten vergleichen. Eine schematische Darstellung beider Assays ist in Abb. 3 wiedergegeben. Mit Hilfe immunologischer Marker ist die Diskriminierung der auswachsenden Fasern weiterhin bestimmbar. So kann mittels geeigneter Antikörper die dendritische (MAP2) und axonale (MAP1) Identität der auswachsenden Fasern festgestellt werden.


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Abb. 3:

Schematische Illustration der experimentellen Versuchsanordnung sowie die Kriterien axonalen Auswachsverhaltens. I zeigt den experimentellen Ansatz des Streifenassays. In dieser Arbeit wurde das axonale Auswachsverhalten von entorhinalen Explantaten auf Membranen von normotypischen und atypischen Zielregionen, verschiedenen Entwicklungsstadien des Hippocampus und Hippocampi verschiedenener Läsionsstadien verglichen. II Nach den Kriterien von Bähr & Wizenmann (1996) wurde das axonale Auswachsverhalten folgendermassen bestimmt: A klare Auswachspräferenz, B leichte Präferenz und C keine Präferenz/zufälliges Auswachsen. Maßstab 90 µm.


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08.06.2005