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MATERIAL UND METHODEN

3.1 Tiere und stereotaktische Operation

Alle Tiere und die mit ihnen durchgeführten Experimente wurden in Übereinstimmung des Europäischen und Deutschen Gesetzes zum Gebrauch von Labortieren durchgeführt.

Die stereotaktischen Läsionen erfolgten an männlichen adulten Wistar Ratten mit einem Körpergewicht von 250-350 g. Unter tiefer Anästhesie mit einer Mischung aus 25 mg/ml Ketamin, 1,2 mg/ml Xylazin und 0,35 mg/ml Acepromazin in 0,9% NaCl (2,5 ml/kg Körpergewicht) wurden die Tiere in einen stereotaktischen Kopfhalter eingespannt (Stoelting, Germany). Ein Standardelektrokoagulator diente zur Inzision in frontaler und sagittaler Ebene zwischen entorhinalen Cortex und Hippocampus (mit vier Einzelpulsen à 2,5 µA für je drei Sekunden). Die folgenden Koordinaten von λ ausgehend und in Anlehnung an Paxinos et al. (1985) wurden verwendet: frontale Inzision: AP, +1,2 mm; L, +3,1-6,1 mm; V, bis auf Tiefe des Craniums; sagittale Inzision: AP, +1,2 zu +4,2 mm; L, 6,1 mm; V, bis auf Tiefe des Craniums. Die Tiere überlebten für 4, 10, 20, 30 und 80 Tage (+- 0,5 d, drei Tiere je Läsionsstadium, ein Tier aus jedem Läsions- und Kontrollstadium für eine experimentelle Versuchsanordnung), wurden tief anästhesiert (s. o.) und dekapitiert. Nach Entfernen der Kutis vom Schädeldach wurde die Ossa parietalis vom Foramen magnum aus mit einer Luer-Zange entfernt und das freiliegende Hirn in +4°C gekühlten sterilen PBS aufgenommen. Die Hippocampi wurden unter visueller Kontrolle eines Binokulars entnommen. Für postnatale hippocampale Membranen wurden 10 P0 Tiere je experimentellem Ansatz verwendet. Hippocampi von adulten nichtoperierten Ratten mit identischen Körpergewicht dienten als Kontrollen.

3.2 Methodologische Überlegungen

Um den Erfolg der stereotaktischen Läsion, also die Diskonnektion des Hippocampus vom entorhinalen Cortex zu überprüfen, wurden die Hirne mit einem Tissue Chopper (Bachofen, Reutlingen, Germany) geschnitten und der Operationseingriff makroskopisch verifiziert. Von jedem Hirn wurden je zwei Schnitte weiter histochemisch analysiert. Die frühen Läsionsstadien (1 - 10 Tage nach Läsion (dal)) wurden mit Fluoro-Jade (FJ) gefärbt (siehe 3.2.1). Dieser Farbstoff stellt spezifisch degenerierende Neurone und deren Fortsätze dar und ist im Vergleich zu Silberfärbemethoden für die Routine praktikabel. Die späteren Läsionsstadien (20 dal - 80 dal) wurden mit Hilfe der Acetylcholin-Esterase (AChE) Methode gefärbt (siehe 3.2.1) und dienen zur Darstellung von AChE-positiven Fasern, die nach ECL in [Seite 27↓]den deafferenzierten Schichten auftauchen und als reaktives Sprouting von septohippocampalen cholinergen Fasern interpretiert werden (Deller & Frotscher, 1997).

3.2.1 Fluoro-Jade (FJ) Färbung und AChE-Histochemie

Für die Fluoro-Jade Färbung (Histo-Chem, USA) und AChE-Histochemie wurden Hirnschnitte auf Gelantine beschichteten Objektträgern aufgezogen und luftgetrocknet. Zur FJ Färbung wurden die Hirnschnitte für 3 min in 100% Ethanol eingetaucht, und rehydriert über 75% Ethanol und doppelt destilliertem Wasser für je 1 min. Die Schnitte wurden dann in frisch angesetzter 0,06% Natriumpermanganat Lösung für 15 min inkubiert. Anschliessend folgte das Waschen in doppelt destilliertem Wasser für 1 min und die Inkubation in 0,001% FJ Lösung in 0,1% Eisessig für 30 min. Nach der Färbung wurden die Schnitte in doppelt destillierten Wasser gewaschen, luftgetrocknet und mit Entellan eingedeckelt (Merck, Germany).

Für den Nachweis der Acetylcholinesterase (AChE) wurde ein modifiziertes Karnovsky-Roots Protokoll angewandt (Mesulam et al., 1987). Aufgezogene und luftgetrocknete Schnitte wurden für 2 x 4 min in einem 0,1 M Maleatpuffer inkubiert und anschliessend für 2 hr in folgender Arbeitslösung entwickelt: 0,1 M Maleatpuffer mit Kupfersulfat, Kaliumhexazyanoferrat, Natriumcitrat und Acetylthiocholine-Jodid. Die Schnitte wurden dann in einem 0,1 M Tris-Puffer gespült und für 3 min in einer 0,7% DAB Lösung unter Sicht entwickelt. Anschliessend wurden die Schnitte gewaschen in 0,1 M Phosphatpuffer und eingedeckelt.

3.3 Präparation der Explantate

In allen Streifen– und Auswachsassays wurden entorhinale Cortices aus E19-P0 Wistar Ratten entnommen. Ratten wurden durch Dekapitation getötet, die Gehirne entnommen und in eiskaltem PBS gewaschen. Die Meningen wurden entfernt und horizontale 300 - 400 µm dicke Schnitte wurden mit einem Vibratom (Series 1000. Tech. Products Inter., USA) angefertigt. Der entorhinale Cortex wurde aus den Hirnschnitten unter einer binoculären Optik bei 40-facher Vergrösserung microdisseziert und bis zur Kultivierung in Suspension bei +37°C und 5,5 % CO2 bei 100 % luftfeuchtigkeit inkubiert. Das Kulturmedium (pH 7,4) bestand aus: Hank’s balanced salt solution, normal horse serum 12,5 % (Gibco, Germany), 2 mM Glutamin, 2,5 mg/ml Glucose (Braun, Germany).


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3.4 Membran– und Myelinpräparation

Hippocampi wurden von E16, P0, P5, P10, P15, P30 und adulten Wistar Rattenhirnen und Cerebelli von P0 Ratten entnommen. Aus zwei Falcon Kulturflaschen (je 75 cm²) mit konfluent ausgewachsenen NIH 3T3 Zellen (ATCC Nr.: CRL-1658), die stabil Ephrin-A3, Ephrin-A5 oder mock-transfiziert sind (Genbank acc. NM004952 (ephrin-A3, H-LERK3), NM001962 (ephrin-A5, H-LERK7) Coding frame kloniert in pcDNA 3.1, unter , www.tigr.org), wurden die Zellen mit einem Zellkratzer gelöst und im Homogenisierungspuffer zur weiteren Membranpräparation aufgenommen. Membranen wurden in Anlehnung an Walter et al. (1987) präpariert. Alle verwendeten Lösungen waren steril, auf +4°C gekühlt und hatten einen pH von 7,4. Der Homogenisierungspuffer war folgendermassen zusammengesetzt: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 15 mM CaCl2, 1 mM Spermidin (von Serva, Germany), Proteaseinhibitor Cocktail aus Aprotinin 500 µg/ml; Pepstatin 300 µg/ml; Leupeptin 750 µg/ml; (von Sigma, Germany). Das Gewebe wurde im Homogenisierungspuffer aufgenommen und erst mit einer dünnen Pipettenspitze und im Anschluss mit einer 27-Gauge Nadel luftblasenfrei homogenisiert. Das Homogenat wurde auf einem Stufengradienten aus 50 % und 5 % Sucrose pipettiert und für 20 min bei 50 000 g (+4°C) in einem SW 50 L Swingout Rotor (Beckmann, Germany) ultrazentrifugiert. Cytoplasmatische und mitochondriale Membranfraktionen bildeten eine dichte Interphase zwischen der 50 % und 5 % Sucrosephase, während die Nuclei pelletierten und das Cytoplasma in der 5%igen Sucrosephase gelöst war. Die Membranfraktion wurde mit einer Spritze aufgenommen und in PBS gewaschen (Eppendorf Zentrifuge). Die Konzentration jeder Membranfraktion wurde in Trispuffer (1,5 mM CaCl2; Proteaseinhibitor Cocktail wie oben beschrieben) auf eine optische Densität von 0,4 bei λ = 220 nm eingestellt (Pharmacia Ultraspect 2000, Germany). Bei einer optischen Densität von 0,4 lag der Proteingehalt der Membranfraktion bei 100-200 µg/ml (bestimmt mit dem Bicinchoninic acid protein Assay mit bovinen Serumalbumin als Standard, in Anlehnung an Simpson & Sonne, 1982). Myelin wurde von anderen Membranen durch Ultrazentrifugation (75 000 g für 10 min) in einem Stufengradienten mit 25 %, 15 % und 5 % Sucrose getrennt (Colman et al., 1982). Myelin wurde aus der Interphase zwischen der 5 % und 15 % Sucrosephase gewonnen, während die myelin-freie Cytoplasmamembranfraktion aus der Interphase zwischen der 15 % und 25 % Sucrosephase gewonnen wurde.

Für die phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C (PI-PLC) Behandlung wurden die Membranfraktionen nach der optischen Densitätsbestimmung bei 37°C für eine Stunde mit [Seite 29↓]PI-PLC (1U/ml; ICN, Germany) inkubiert. Zur Kontrolle der enzymatischen Aktivität wurden Ephrin-A3 angereichte Membranen behandelt und im anschliessenden Streifenassay getestet.

3.5 Streifenassay, Längenauswachsassay und Explantatkultivierung

Membranstreifen wurden in Anlehnung an Walter et al. (1987) mit einer Apparatur von Dr. F. Bonhoeffer angefertigt.

Die Membranstreifen-beschichteten Nuclepore Filter (0,4 µm Poren) wurden dann unter Fluoreszenzsicht beurteilt und nur diejenigen Filter, die ein reguläres Membranmuster aufwiesen, indiziert durch die Verteilung der fluoreszierenden Kugeln, wurden weiter verwendet.

Die membranbeschichteten Nuclepore Filter wurden dann in sterile Inserts (Millicell-CM, Millipore, Germany) mit 1,5 ml Kulturmedium überführt (DMEM/F12 mit 2 mM Glutamin, 0,6 % Glucose, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 12 % fötales Kälberserum). In den Neutralisierungsexperimenten wurden die beschichteten Nuclepore Filter mit den monoklonalen Antikörper IN-1 (Hybridoma Überstand, 15 - 30 µg/ml, Caroni & Schwab, 1988b) oder einem Kontrollantikörper (Antiratten IgG, 20 µg/ml, Sigma, Germany) für 30 min bei 37°C inkubiert und anschliessend in PBS gewaschen. Die Explantate sind noch am gleichen Tag mit einer Pipette unter Schonung des Nuclepore Filter auf die Membranen gebracht worden. Die Kulturen wurden in einem begasten (5,5 % CO2) und humifizierten Inkubator (Nuare US Autoflow, Zapf Instrumets, Germany) für max. 4 Tage gehalten. Für den ersten Tag der Kultivierung wurde 8 µM Cytosinarabinosoid dem Kulturmedium zugesetzt, um die Proliferation und das Auswachsen von nicht-neuronalen Zellen zu inhibieren.

3.6 Analyse des Streifen- und Auswachsassays

Neuriten wurden mit Hilfe des fluoreszierenden vitalen Farbstoff 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinmidyl Ester (Molecular Probes, Netherland) visualisiert. Da dieser Farbstoff nicht zwischen neuronalen und glialen Strukturen diskriminiert, wurde in weiteren Experimenten die Nuclepore Filter immunocytochemisch mit einem monoklonalen Antikörper gegen das 160-kDa grosse Neurofilament (Boehringer, Germany) dargestellt. Nach zweistündiger Fixierung mit 4% PFA wurde zur selektiven Darstellung von Axonen der MAP-1 Antikörper verwendet (Sigma, M 4278) und in einer Konzentration von 5 µg/ml (für Anti-Neurofilament) bzw. 2 µg/ml (für Anti-MAP-1) für 12 Stunden bei +4°C inkubiert. Der sekundäre, biotinylierte Antikörper (Vector, USA) wurde für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und im ABC/DAB Verfahren entwickelt, dann auf Objektträgern über eine 70 %, 80 [Seite 30↓]%, 90 %, 98 % und 100 % Ethanolreihe dehydriert und mit Immu-Mount (Shandon, USA) eingedeckelt.

Im Streifenassay wurde die Analyse als Blindexperiment mit zwei unabhängigen Beobachtern durchgeführt, und das Auswahlverhalten wurde mit einem Drei-Klassen System nach Bähr & Wizenmann (1996) semiquantitativ ausgewertet. Für die statistische Auswertung wurde das Neuritenwachstum der Explantate, die auf P0 bzw. lädierten hippocampalen Membranen wuchsen, verglichen mit der Anzahl der Explantate, die keine Auswachspräferenz oder eine Präferenz für die jeweilige Kontrollmembran zeigten. Im Statview II Programm (Abacus, USA) wurden die Daten transferiert und mit dem chi-Quadrat Test auf statistische Unterschiede analysiert.

Im Längenauswachsassay wurde die Neuritenlänge als die Distanz zwischen der Explantatfront und dem Wachstumskolben des Axons bestimmt. Statistische Unterschiede zwischen den einzelnen Membranstreifen wurden mit Hilfe des Mann-Whitney U-Test ermittelt.

3.7 Immunohistochemische Nachweisverfahren zur Darstellung von Myelin

Um maturations-abhängige Unterschiede in der Expression von basischem Myelinprotein (MBP) und Myelin-assoziiertem Glycoprotein (MAG, beide von Boehringer Mannheim, Germany) zu erfassen, wurden Wistar Ratten unterschiedlicher postnataler Zeitstadien verwendet (P0, P10, P15, P30, P60). Die Tiere wurden tief anästhesiert (siehe unter 3.1) und transkardial mit 10-50 ml PBS langsam perfundiert, gefolgt von 80-200 ml PFA (4 %, mit 15 % Pikrinsäure). Perfundierte Hirne wurden aus der Kalotte freipräpariert und über Nacht bei +4°C im gleichen Fixativ nachfixiert. Horizontale Schnitte von 80 µm Dicke wurden mit einem Vibratom (Series 1000, Technical Products Int., Inc.) geschnitten und in 0,1 M PBS aufgesammelt. Die Schnitte wurden mit 0,6 % H2O2 für 30 min inkubiert zur Inhibition der endogenen Peroxidase. Konsecutive Schnitte wurden alternativ mit Anti-MBP (1:500 verdünnt in 0,1 M PBS mit 1 % NHS, 0,1 % NaN3 und 0,1 % Triton) und Anti-MAG (1:10 verdünnt im selben Puffer) für 48 hr bei +4°C inkubiert. Nach fünfmaligen Waschen mit 0,1 M PBS à 15 min folgte die Inkubation mit dem biotinylierten Anti-Maus IgG (Vector Laboratories, 1:250 verdünnt in 0,1 M PBS) für 2 hr bei Raumtemperatur. Nach fünfmaligen Waschen mit 0,1 M PBS à 15 min folgte die Inkubation mit dem Avidiv-Biotin Peroxidasekomplex im Dunkeln für 2 hr bei Raumtemperatur (Vectastain ABC Elite-Kit, 1:500 verdünnt in 0,1 M PBS). Die Immunreaktivität wurde mit dem Chromogen Diaminobenzidin (DAB) visualisiert (0,07 % DAB mit 0,001 % H2O2 in 0,1 M PBS für 10 [Seite 31↓]min). Anschließend wurden die Schnitte auf gelantinebeschichteten Objektträgern gezogen, dehydriert in Ethanol und mit Entellan (Merk) eingedeckelt.

3.8 Verwendete Mikroskope und Bildgebungsverfahren

Die Untersuchungen von in vivo, d.h. noch laufenden Experimenten wurde mit Hilfe des inversen Mikroskops Olympus IX 70, alle anderen Untersuchungen mit dem Zeiss Axioplan durchgeführt. Die Dokumentation erfolgte mittels der Sensicam (PCO, 12 bit cooled imaging) bzw. mit der Fotokamera MC100. Folgende Filtersätze wurden verwendet: U-MNIBA narrow-band für FITC Fluoreszenz, U-MWIG für TRITC Fluoreszenz. Digitale Bilder oder eingescannte Fotoabzüge wurden in CorelDraw zusammengefasst und beschriftet. Eine digitale Bildbearbeitung im Sinne von Verstärkung von Kontrast und/oder Intensität fand nicht statt.


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08.06.2005