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ERGEBNISSE

4.1 Streifenassay und repulsive Faktoren

In initialen Experimenten zur Evaluation des Streifenassays wurden Membranpräparationen von stabil transfizierten NIH 3T3 Zellen, die Ephrin-A3 oder Ephrin-A5 exprimieren, verwendet. Ephrin-A3 und A5 sind bekannte axonale Leitmoleküle, die auf Axonen verschiedener Regionen repulsive Eigenschaften haben (Drescher et al., 1995; Gao et al., 1996). Entorhinale Explantate wurden alternierende Membranstreifen von Laminin und Ephrin-A3 angeboten, und auswachsende Fasern mieden die Ephrin-A3 Membranstreifen und bevorzugten die Lamininstreifen (Abb. 4a). Im Unterschied dazu zeigten entorhinale Neuriten bei der Membrankombination zwischen Laminin und Ephrin-A5 sowie von Membranen von mock-transfizierten (mit leeren Vektor transfizierten) Zellen und Laminin keine Präferenz und wuchsen ungerichtet über beide Membranstreifen (Abb. 4b und 4c).

Abb. 4:

Zielgerichtetes Auswachsen auf Ephrin Membranlinien. In A sind alternierend angeordnet Membranen von Ephrin-A3 transfizierten NIH 3T3 Zellen (grüne Linien mit 1 markiert) und lamininbeschichteten Linien (schwarz). Entorhinale Axone meiden Ephrin-A3 Membranen und präferieren die laminin-beschichteten Linien. Dieses axonale Auswachsverhalten ist spezifisch für Ephrin-A3, da das axonale Auswachsen sowohl auf Membranen von mock-transfizierten Zellen (B) als auch auf Ephrin-A5 transfizierten Zellen (C) zufällig ist und keine Präferenz zeigt. Maßstab 100 µm.

4.2 Das Auswachsen entorhinaler Axone ist abhängig vom Zielgebiet

Um die Spezifität entorhinalen Auswachsens im Streifenassay zu testen, wurden Streifenassays mit Membranen von postnatalen Hippocampi und des Cerebellums, also von einer Hirnregion, in die der entorhinale Cortex in vivo nicht projiziert, durchgeführt. Entorhinale Neuriten zeigten eine klare Auswachspräferenz für Membranen ihrer in vivo


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Zielregion (Abb. 5a). Als eine weitere Kontrolle zum Testen der Auswachsspezifität wurde das Auswahlverhalten von Neuriten untersucht, die in vivo nicht zum Hippocampus projizieren. Auswachsende Axone von Motorcortex-Explantaten zeigten keine Auswachspräferenz zwischen hippocampalen und cerebellären Membranen und kreuzten beide Membranstreifen frei (Abb. 5b).

Abb. 5:

Zielgerichtetes Auswachsverhalten entorhinaler Axone auf hippocampalen Membranen. In A ist ein entorhinales Explantat auf alternierenden Membranen von postnatalen Hippocampi (H) und Cerebellum (C) kultiviert. Entorhinale Axone zeigen eine deutliche Präferenz für ihr natürliches Zielgebiet, den Hippocampus, und meiden Membranen von Cerebellum. In B wurde auf der gleichen Membrananordnung ein Explantat vom Motorcortex kultiviert. Corticale Axone zeigen keine Präferenz und kreuzen beide Membranlinien frei. C ist eine Vergrösserung aus A. Die Pfeile zeigen auf die axonale Endauftreibung, den sogenannten Wachstumskolben. Maßstab in A 90 µm, in C 100 µm.


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Tab. 3:

Verteilung von axonalen Auswahlverhalten für postnatale hippocampale Membranen

 

Kategorie des axonalen Auswahlverhaltens

Entwick-lungsstadien

im Vergleich

Nicht

Klassi

fiziert

Präferenz für alternative Mem-branen

Keine Präferenz/

zufälliges

Auswachsen

Leichte Präferenz für postnatale Membranen

Klare Präferenz für postnatale Membranen

n

Signifi-kanz

des Auswahl-verhaltens

P0 vs E16

2

2

33

3

0

40

n.s.

P0 vs P5

1

2

14

3

0

20

n.s.

P0 vs P10

2

0

14

5

1

22

p=0.05

P0 vs P15

5

0

4

5

9

23

p=0.05

P0 vs P30

1

0

2

3

8

14

p=0.05

P0 vs A

2

 

7

5

26

40

p=0.05

Zielgerichtetes axonales Auswachsen von entorhinalen Explantaten. In diesem Streifenassay Setup wurde das axonale Auswachsverhalten auf hippocampalen Membranen verschiedener Entwicklungsstadien getestet. E16, embryonal Tag 16; P, postnatal Tag 0, 5, 10, 15, 30; A, adult; n.s., nicht signifikant (chi-Quadrat Test).

4.3 Das Auswachsen entorhinaler Axone ist abhängig von der Maturation seines Zielgebiets, des Hippocampus

Um die Auswachspräferenz von entorhinalen Neuriten auf hippocampalen Membranen aus Zeitstadien vor, während und nach der Etablierung entorhino-hippocampaler Verbindung in vivo zu testen, wurden entorhinale Explantate von P0 Ratten auf hippocampalen Membranen von frühembryonalen (E16), postnatal Tag 5, 10, 15, 30 und adulten Ratten kultiviert (Abb. 6, in Tab. 3 zusammengefasst).

Auswachsende Neuriten von entorhinalen Explantaten präferierten Membranen von P0 versus E16 Hippocampi, ein Zeitpunkt, wo noch keine entorhinale Fasern in den Hippocampus ziehen (n = 40). In der Kombination P0 versus P5 hippocampaler Membranen zeigten entorhinale Neuriten keine Präferenz und kreuzten die Membranstreifen frei (n = 20). Auch in der Situation P0 versus P10 zeigten entorhinale Axone ein zufälliges Auswachsmuster (n = 22). Eine erneute Präferenz für frühpostnatale hippocampale Membranen wurde erst wieder in der Kombination P0 versus P15 beobachtet (n = 23). In weiteren Streifenassay Experimenten, in denen frühpostnatale Membranen in Kombination mit hippocampalen Membranen aus älteren Tieren von postnatal Tag 30 (n = 14) bis adult (n = 40) verglichen wurden, zeigten entorhinale Axone eine klare Präferenz für frühpostnatale hippocampale Membranen. Diese


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Resultate indizieren, dass das Auswachsverhalten entorhinaler Axone abhängig ist vom Maturationsstadium des hippocampalen Zielgebiets.

Abb. 6:

Zielgerichtetes axonales Auswachsen auf hippocampalen Membranen verschiedener Entwicklungsstadien. Entorhinale Explantate wurden auf alternierenden Membranen von Hippocampi verschiedener Entwicklungstadien kultiviert und Axone mittels MAP-1 Immunhistochemie dargestellt. Im Vergleich E16 versus P0 zeigen entorhinale Axone eine Auswachspräferenz für postnatale Hippocampus-Membranen (A). In B, C und D zeigen entorhinale

Um das maturations-abhängige Auswachsverhalten entorhinaler Axone mit dem Myelinisierungsprozess zu korrelieren, wurden Hippocampi verschiedener Entwicklungsstadien auf die Expression von zwei myelin-spezifische Proteine (MBP und MAG) immunhistochemisch untersucht. Die Myelinmarker MBP und MAG sind Hauptkomponenten des Myelins im ZNS (Smith, 1992). MBP und MAG immunpositive Strukturen fanden sich in den Strata radiatum und lacunosum-moleculare des Hippocampus und in den Molekularschichten des Gyrus dentatus von P15 an. Die Immunreaktivität war maximal ab P60 (Abb. 7).

4.4 Myelin hat einen starken inhibitorischen Effekt auf die axonale Auswachslänge

Um die Auswachslängen von entorhinalen Axonen auf Myelin und hippocampalen Zellmembranen von verschiedenen Entwicklungsstadien zu quantifizieren, wurden entorhinale Explantate auf Nuclepore Filter mit nur einzelnen Membranstreifen kultiviert, die alternierend mit einem substratfreien Zwischenraum angeordnet waren (siehe hierzu auch 2.3). Das Längenwachstum entorhinaler Axone auf Membranen adulter Hippocampi war gering, während auf frühpostnatalen hippocampalen Membranen entorhinale Neuriten weitaus länger auswuchsen (Abb. 8, 9). Auf Membranen adulter Hippocampi, denen durch physikalische Separation der Myelinanteil entfernt wurde, war das Längenwachstum entorhinaler Neuriten dreimal länger im Vergleich zu adulten hippocampalen Membranen, während die Auswachslängen entorhinaler Axone auf adulten hippocampalen Membranen, die mit dem Antikörper IN-1 präinkubiert wurden, zwischen den beiden Messungen lag (Abb. 8 C, 9 A). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Nogo-A (der vom Antikörper IN-1 neutralisiert wird) nicht der einzige wachstumsinhibitorische Faktor des Myelins ist (McKerracher et al., 1994; Mukhopadhyay et al., 1994; Lozano et al., 1995¸Chen et al., 2000). In Experimenten, in denen ein Kontrollantikörper verwendet wurde, der keine Spezifität für Myelinproteine hat, konnte kein Effekt auf das axonale Längenwachstum beobachtet werden (Abb. 9 B). Myelin selbst zeigte einen starken wachstumsinhibitorischen Effekt auf auswachsende Axone. Entorhinale Axone wuchsen nur spärlich auf Myelin. Das zentrale Myelin verlor stark am auswachsinhibitorischen Effekt, wenn es mit IN-1 präinkubiert wurde, [Seite 37↓]und entorhinale Fasern wuchsen siebenmal länger als auf unbehandelten Myelinpräparationen (Abb. 8 E, F; 9 B).

Abb. 7:

Immunohistochemischer Nachweis von Myelin Basic Protein (MBP) im Hippocampus der Ratte. D-F sind Vergrösserungen aus A-C. Pfeile zeigen auf die hippocampale Fissur. Bei postnatal Tag 10 (P 10) und jünger ist keine MBP Immunreaktivität detektierbar (A, D). Ein schwaches immunreaktives Signal ist bei P15 im Stratum lacunosum-moleculare und im infragranulären Hilus sichtbar (B, E). Im adulten Hippocampus (P 60 und älter) ist ein starkes immunpositives Signal im Stratum lacunosum-moleculare, in der Molekularschicht des Gyrus dentatus (DG) und in der infragranulären Hilusregion detektierbar (C, F).


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Abb. 8:

Auswachsassay von entorhinalen Explantaten auf myelinisierten Membranfraktionen. Axonwachstum auf adulten (A) und postnatalen (B) Hippocampusmembranen. In C und F wurden die Membranfraktionen mit den IN-1 Antikörper vorinkubiert, in D wurde Myelin aus der Hippocampus-Membranfraktion physikalisch entfernt.


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Abb. 9:

Axonales Längenwachstum auf unterschiedlichen Membranfraktionen. In A sind die Auswachstests mit Membranen aus dem Hippocampus, in B mit unterschiedlichen Myelinfraktionen zusammengefasst. Die mit einem Stern (*) markierten Säulen zeigen einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu adulten Hippocampus-Membranen (A) oder zu Myelin aus Hirnstammgewebe (M BS) (Mann-Whitney U-Test, p ≤ 0,001). n = Anzahl der Explantate.

4.5 Myelin beeinflusst nicht das axonale Auswahlverhalten

Um der Hypothese experimentell nachzugehen, dass adulte hippocampale Membranen ein weniger attraktives Substrat darstellen wegen der auswachsinhibitorischen Effekte des Myelins, wurden Streifenassays mit angereicherten Myelin und P0 hippocampalen Membranen durchgeführt (Tab. 4). Entorhinale Axone zeigten eine klare Präferenz für P0 hippocampale Membranen über Membranen aus gereinigten Myelinfraktionen (n = 11). Dieses Auswachsverhalten bestand auch, wenn die Myelinpräparation mit dem Antikörper IN-1 präinkubiert wurde (n = 12, Tab. 4). In Streifenassay Experimenten mit P0 und adulten hippocampalen Membranen, die mit dem Antikörper IN-1 präinkubiert wurden, zeigten entorhinale Axone weiterhin eine klare Auswachspräferenz für Membranen von [Seite 40↓]frühpostnatalen Hippocampi (n= 37, Abb. 10). Unter der Annahme, dass IN-1 nicht alle auswachsinhibitorischen Faktoren des Myelins neutralisiert, wurden entorhinale Explantate auf alternierenden Streifen von frühpostnatalen und adulten, myelinfreien hippocampalen Membranen kultiviert. Entorhinale Axone zeigten weiterhin eine eindeutige Präferenz für frühpostnatale hippocampale Membranen (Tab. 4). Obgleich viele Arbeitsgruppen gezeigt haben, dass junges postnatales Hirngewebe wesentlich stärker das Auswachsen von Neuriten fördert als adultes, ein Phänomen, das der Myelinisierung zugeschrieben wurde, zeigten entorhinale Axone eine Auswachspräferenz für postnatale hippocampale Membranen über adulten hippocampalen Membranen, unabhängig von der Präsenz von Myelin.

Tab. 4:

Verteilung von axonalen Auswahlverhalten für postnatale hippocampale Membranen

 

Kategorie des axonalen Auswahlverhaltens

 

Nicht klassifi-ziert

Keine Präferen/

zufälliges

Auswachsen

Präferenz

für myelinhaltige Membranen

Leichte Präferenz für postnatale Membranen

Klare Präferenz für postnatale Membranen

n

Signifikanz

des Auswahl-verhaltens

P0vs.M

0

2

0

1

8

11

p=0.05

P0vs.M

IN-1 treated

1

1

0

2

8

12

p=0.05

P0vs.A

IN-1 treated

6

8

5

16

2

37

p=0.05

P0vs.A

w/oM

3

4

0

13

1

21

p=0.05

Myelin und zielgerichtetes axonales Auswachsen. Entorhinale Explantate wurden auf alternierenden Membranlinien von frühpostnatalen und adulten Hippocampi sowie auf Myelin kultiviert und deren zielgerichtetes Auswachsen nach den Kriterien von Bähr & Wizenmann (1996) ausgewertet (chi-Quadrat Test).

4.6 Der Einfluss von Membranen deafferenzierter Hippocampi auf das gerichtete axonale Auswachsen

Regulieren membran-assoziierte Faktoren nach Deafferenzierung in den betroffenen Regionen das Einwachsen aussprossender Fasern? Um dieser Frage nachzugehen, wurden Streifenassay Experimente mit Membranen von adulten, nichtlädierten und deafferenzierten Hippocampi durchgeführt. In Experimenten mit Membranstreifen von vier Tagen nach entorhinaler Cortex Läsion (ECL) entnommenen Hippocampi, ein Zeitstadium in dem Degenerationsprozesse und gliale Reaktionen überwiegen, und Hippocampi von adulten Kontrolltieren, zeigten entorhinale Explantate ein zufälliges Auswachsen ohne Präferenz für einen der beiden Membranstreifen (Abb. 11). In einem nächsten Schritt wurden hippocampale [Seite 41↓]Membranen aus einem Läsionsstadium, in dem Sproutingprozesse überwiegen, im Streifenassay mit adulten Hippocampusmembranen verglichen.

Abb. 10:

Axonales Auswachsverhalten auf alternierenden Membranen von adulten Hippocampi. Die mit A* markierten Linien sind myelinfreie adulte Hippocampusmembranen. Entorhinale Axone zeigen keine Präferenz und kreuzen die alternierenden Linien ungerichtet. Maßstab 135 µm.

In der Membrankombination adulter Hippocampus versus Hippocampus 10 dal zeigte sich eine Auswachspräferenz von entorhinalen Axonen für Membranen aus dem deafferenzierten Hippocampus (Abb. 11 C). Diese Auswachspräferenz für Membranen von lädierten Tieren war in weiteren Läsionsstadien, 20 dal, 30 dal und 80 dal, nicht detektierbar im Vergleich zu Membranen von adulten nichtlädierten Tieren (Abb. 11 C, D, E, zusammengefasst in F).

4.7 Auswachslängen entorhinaler Axone auf Membranen
deafferenzierter Hippocampi

Um den Einfluss von Membranen deafferenzierter Hippocampi auf das axonale Längenwachstum zu analysieren, wurde der Längenauswachstest angewandt. Entorhinale Explantate wurden auf Nuclepore Filtern mit Membranstreifen kultiviert, die alternierend mit einem substratfreien Zwischenraum angeordnet waren. Auf adulten hippocampalen Membranen wuchsen entorhinale Axone nur spärlich (Abb. 12 A, 13). Auswachslängen entorhinaler Neuriten stiegen über postläsionale Stadien von 4 dal (Abb. 12 B, 13), bis zu


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Abb. 11:

Axonales Auswachsverhalten auf hippocampalen Membranen verschiedener Läsionsstadien. Entorhinale Explantate wurden auf alternierenden Membranen von Hippocampi verschiedener Läsionsstadien kultiviert und Axone mittels MAP-1 Immunhistochemie dargestellt. Membranen von adulten nichtlädierten Hippocampi sind mit *, die verschiedenen Läsionsstadien mit Zahlen in Tagen nach Läsion (dal) markiert. Entorhinale Axone zeigen in der Kombination adult versus 10 dal eine Auswachspräferenz für die deafferenzierten Hippocampusmembranen (B). In A, C, D und E zeigen entorhinale Axone keine Auswachspräferenz und kreuzen die alternierenden Membranlinien frei. In F sind die Daten graphisch zusammengefasst. Die mit einem Stern (*) markierte Säule zeigt einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu adulten Kontrollmembranen (chi-Quadrat Test, p ≤ 0,05). Maßstab 150 µm.

einem statistisch signifikanten Maximum bei Membranen von Hippocampi 10 dal (Abb. 12C, 13). Das verstärkte Längenwachstum entorhinaler Axone auf deafferenzierten hippocampalen


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Membranen war signifikant bei 20 dal (Abb. 12 D) und 30 dal (Abb. 12 E). Entorhinale Explantate, die auf Membranen von deafferenzierten Hippocampi 80 dal kultiviert wurden, zeigten keine signifikanten Unterschiede ihrer Auswachslänge im Vergleich zu nichtlädierten, adulten hippocampalen Membranen (Abb. 12 F, Abb. 13).

Abb. 12:

Axonales Längenwachstum auf Membranfraktionen verschiedener Läsionsstadien. Entorhinale Explantate wurden kultiviert auf Hippocampusmembranen von adulten Kontrolltieren (A), 4 (B), 10 (C), 20 (D), 30 (E) und 80 (F) Tage nach Läsion (dal). Maßstab 200 µm.


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Abb. 13:

Axonales Längenwachstum entorhinaler Explantate auf Hippocampus-Membranen verschiedener Läsionsstadien. Das Säulendiagramm fasst die mittleren axonalen Auswachslängen aus dem Auswachslängenassay zusammen. Die mit einem Stern (*) markierten Säulen zeigen einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu adulten Hippocampusmembranen (Mann-Whitney U-Test, p ≤ 0,001). n = Anzahl der Explantate.

4.8 Phospholipasebehandlung von Membranen adulter Hippocampi fördert das axonale Längenwachstum

PI-PLC Behandlung von adulten hippocampalen Membranen verstärkte die Auswachslängen entorhinaler Axone im Vergleich zu adulten unbehandelten Membranen um den Faktor vier (Abb. 14). Bei der PI-PLC Behandlung von hippocampalen Membranen 10 dal konnte keine weitere Steigerung axonalen Wachstums induziert werden, und entorhinale Axone wuchsen auf den PI-PLC behandelten Membranen in einer vergleichbaren Länge aus, wie auf den unbehandelten Membranen 10 dal (Abb. 14). Im Streifenassay wurden entorhinale Explantate mit Streifen von adulten Hippocampusmembranen PI-PLC enzymatisch verdauten und mit Hippocampusmembranen 10 dal konfrontiert. Die PI-PLC Behandlung war nicht ausreichend, das gerichtete axonale Auswahlverhalten zu beeinflussen und entorhinale Neuriten bevorzugten weiterhin hippocampale Membranen 10 Tage nach Läsion (Abb. 15).


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Abb. 14:

Axonales Längenwachstum mit vorbehandelten adulten Hippocampusmembranen. Entorhinale Axone wurden auf Membranen aus dem adulten Hippocampus (A), aus dem Hippocampus 10 Tage nach Läsion (10 dal), und auf Membranen, die mit Phoshatidylinositol-spezifischer Phospholipase (PI-PLC) vorbehandelt wurden. Die mit einem Stern (*) markierten Säulen zeigen einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu den Auswachslängen auf adulten Hippocampusmembranen (Mann-Whitney U-Test, p ≤ 0,001). n = Anzahl der Explantate.

4.9 Entorhinale Axone zeigen keine Präferenz zwischen postnatalen und adulten hippocampalen Membranen 10 Tage nach Läsion

In den vorangegangenen Experimenten wurde gezeigt, dass entorhinale Axone zwischen Membranen, die während der Periode, in der der Tractus perforans in den Hippocampus zieht, (E19-P10) und adulten Hippocampusmembranen (≥ P60) klar die erste bevorzugt. Diese Auswachspräferenz blieb auch weiterhin für P0 Membranen bestehen, wenn Myelin aus den adulten Membranen separiert wurde. In folgenden Experimenten wurde nun das Auswachsverhalten entorhinaler Neuriten analysiert, die zwischen Membranen von P0 und 10 dal Hippocampi diskrimieren konnten. In dieser Membrankombination zeigte sich keine


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Präferenz für eine der Membranstreifen und die Axone kreuzten die Membranstreifen frei (Abb. 15).

Abb. 15:

Zielgerichtetes axonales Auswachsverhalten 10 Tage nach Läsion. A Explantate vom entorhinalen Cortex wurden auf alternierenden Membranen von P0 Hippocampi und deafferentierten Hippocampi 10 Tage nach Läsion kultiviert und zeigten keine Auswachspräferenz. In B ist ein entorhinales Explantat auf alternierenden Membranen von Hippocampi frühpostnataler (P0) sowie adulter (A) Tiere kultiviert und zeigt eine deutliche Auswachspräferenz für die P0 Membranen. Maßstab 150 µm.


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HTML-Version erstellt am:
08.06.2005