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Diskussion

5.1 Synopsis

Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten zeigten, dass axonales Auswachsen entorhinaler Explantate zielgewebsspezifisch ist und durch membran-assoziierte Moleküle vermittelt wird. Experimente mit Membranen von Hippocampi unterschiedlicher Entwicklungsstadien ergaben, dass entorhinales Auswachsverhalten abhängig ist von der Maturation und weiter, dass die im Hippocampus vorliegenden Faktoren zu einem bestimmten Zeitpunkt transient vorhanden sind, nämlich während des in vivo Zeitpunkts der Terminierung entorhinaler Fasern in den Hippocampus und danach entweder nicht mehr exprimiert werden oder maskiert vorliegen. Im nächsten Schritt wurden die membran-assozierten Faktoren nach einer Deafferenzierung im Hippocampus untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass tatsächlich Membranen von deafferenzierten Hippocampi axonales Längenwachstum im Vergleich zu adulten nichtlädierten Hippocampi steigerten und auch das zielgerichtete axonale Auswachsverhalten positiv beeinflusste. In weiteren Experimenten wurde evident, dass es sich um attraktive Faktoren handelt, die das Auswahlverhalten entorhinaler Axone leiten.

5.2 Membran-assoziierte Moleküle während der Entwicklung

Die präsentierten Experimente wurden durchgeführt, um zu klären, ob zielgerichtetes Auswachsen entorhinaler Axone abhängig ist von der Präsenz von Ziel- und maturationsabhängigen membran-assoziierten Molekülen, die während der entorhino-hippocampalen Entwicklung in einem räumlich-zeitlichen Kontext vorliegen. Während der Entwicklung des entorhino-hippocampalen Systems überqueren entorhinale Axone das Subiculum via Tractus perforans und invadieren ihr spezifisches Zielgebiet in einem zeitlich geordneten Prozess (Snyder et al., 1991; Del Rio et al., 1997; Skutella et al., 1999; Skutella & Nitsch, 2001). In anatomischen Studien wurde mit Hilfe des lipophilen fluoreszierenden Tracers DiI die zeitliche Sequenz der axonalen Einwachsens in den Hippocampus dargestellt (Soriano et al., 1994; Super & Soriano, 1994). Am embryonal Tag 19 erreichen die ersten entorhinalen Axone die äussere Molekularschicht des Gyrus dentatus, während postnatal Tag 1-5 die entorhinale Faserdichte in dieser Zone weiter ansteigt. Im ersten Schritt wurde das axonale Auswahlverhalten auf einen bekannten, transmembranären, GPI-verankerten repulsiven Faktor im Streifenassay getestet. Entorhinale Axone zeigten eine klare Präferenz für Laminin, wenn ihnen zugleich Ephrin-A3 angereicherte Membranen angeboten wurden. Die Spezifität dieses Auswahlverhaltens zeigte sich in Experimenten, in denen alternierend [Seite 48↓]Kontrollmembranen oder Membranen von einem weiteren Mitglied aus der Familie der Ephrine, Ephrin-A5, entorhinalen Explantaten angeboten wurde. In diesen Fällen zeigten entorhinale Axone keine Auswachspräferenz und wuchsen frei über die alternierenden Membranlinien. Der spezifische repulsive Effekt von Ephrin-A3 auf entorhinale Axone korreliert gut mit dem Expressionsmuster von Ephrin-A3 im Hippocampus. Ab embryonal Tag 19, also zu Beginn der Invasion entorhinaler Axone in den Gyrus dentatus, ist Ephrin-A3 im Gyrus dentatus exprimiert. Rezeptorbindungsstudien zeigen weiter, dass Ephrin-A3 und A5 spezifisch in der inneren Molekularschicht vorliegen und durch diese Lokalisation entorhinale Axone, die responsibel für Ephrin-A3 sind, am Einwachsen in diese Schicht hindern und so die Innervation der äusseren Molekularschicht determinieren (Stein et al., 1999). In weiteren Streifenassay Experimenten zeigte sich, dass die axonale Auswachspräferenz zielgebietsspezifisch ist, und Membranen aus Hirnregionen, die normotypisch keine Konnektivität zum entorhinalen Cortex halten, gemieden werden. Auswachsstudien mit Membranen aus Hippocampi unterschiedlicher Entwicklungsstadien ergaben, dass entorhinale Axone hippocampale Membranen aus genau der Entwicklungsphase bevorzugen, in der in vivo entorhinale Fasern im Hippocampus terminieren.

Diese Daten geben Hinweise dafür, dass zum Zeitpunkt der axonalen Termination im Hippocampus membran-assozierte Moleküle vorhanden sind, die eine kontaktvermittelte Attraktivität für entorhinale Fasern vermitteln könnten. Diesen Schluss lassen weitere Experimente von Frotscher & Heimrich (1993) zu. Sie zeigten, dass das Einwachsmuster entorhinaler Fasern unabhängig der zeitlichen Anordnung efferenter Fasersysteme ist und schlossen daraus, dass in der äusseren Molekularschicht Faktoren vorliegen, die entorhinale Axone in diese Schicht lenken. Weiterhin ergaben Experimente aus der Arbeitsgruppe von M. Frotscher, dass in der äusseren Molekularschicht des Gyrus dentatus spezifische hyaluronidase-sensitive ECM Moleküle vorliegen, die die Adhäsion und das Einwachsen entorhinaler Zellen regulieren (im Microsphere Adhesion und Kokultur Assay, Förster et al., 1998, 2001). Das Glycoprotein Reelin, das von Cajal-Retzius Zellen sezerniert wird und in der Marginalzone der Hippocampusformation während der Entwicklung vorliegt, scheint nicht das entscheidende Molekül zur Terminierung der Schichtenspezifität zu sein. Im Hippocampus der Reeler Maus, der das Reelin kodierende Gen fehlt, liegt weiterhin eine korrekte entorhino-hippocampale Faserverbindung vor, mit diskreten Veränderungen von vereinzelt missgeleiteten Fasern und Formationen von abnormalen Patches (Del Rio et al., 1997; Borrell et al., 1999; Deller et al., 1999). Evidenzen für die Vermittlung der Axonwegfindung durch Cajal-Retzius Zellen selbst ergaben Experimente mit hippocampalen [Seite 49↓]Schnittkulturen, denen diese Zellen entfernt wurden. Diese Kulturen zeigten das Fehlen von normotypischen entorhinalo-hippocampalen Verbindungen (Del Rio et al., 1997; Frotscher et al., 2001).

5.3 Myelin und axonale Elongation

Die Experimente mit hippocampalen Membranen verschiedener Entwicklungsstadien ergaben, dass maturationsabhängige Faktoren die Schichtenspezifität für entorhinale Axone determinieren. Eine immunocytochemische Analyse der Myelin Marker (MBP und MAG) ergab, dass es im Laufe der Adoleszenz zu einer drastischen Zunahme von Myelin im Hippocampus kommt. Es lag daher nahe, das veränderte axonale Auswachsverhalten mit der Zunahme der Myelinisierung zu erklären. In den Längenauswachstests zeigte sich zudem ein drastischer wachstumsinhibitorischer Effekt von Myelin sowie von myelinhaltigen Membranen auf Axonen. Die wachstumsinhibitorische Komponente konnte mit dem monoklonalen Antikörper IN-1, der das myelin-spezifische Nogo-A bindet, bzw. durch physikalische Separation von Myelin aufgehoben werden (Chen et al., 2000; Huber & Schwab, 2000). Interessanterweise zeigte sich im Streifenassay, in dem man Auswachspräferenzen elongierender Axone beobachtet, dass Myelin und seine Komponenten die zielgerichtete Auswachsrichtung entorhinaler Axone nicht beeinflusste, also keine Lenkungseigenschaft besitzt. Dies ist um so erstaunlicher, da das axonale Wachstum auf Myelin im Vergleich zu postnatalen Membranen mehr als siebenfach vermindert war. Eine Erklärung für diese Befunde wäre, dass Myelin einen ganz allgemeinen wachstumsinhibitorischen Effekt mit der Eigenschaft besitzt, axonales Wachstum zu inhibieren oder zu verlangsamen, jedoch ohne die Eigenschaft, Axonen eine direktionale Information zu geben. Da Myelin für eine Vielzahl von neuronalen Fasern wachstumsinhibitorisch wirkt, ist es weiterhin möglich, dass alle auswachsenden Neuriten Myelin bzw. Nogo-spezifische Rezeptoren, wie den Nogo-66 Rezeptor, auf ihren Wachstumskolben tragen. Durch eine solche ubiquitäre Verteilung würde es keine region-spezifische Rezeptor-Liganden Interaktion im Falle von Myelin geben (Raineteau & Schwab, 2001; Fournier et al., 2001; Bandtlow & Schwab, 2000; Schwab et al., 1993). Eine Interaktion von Myelinkomponenten und axonalen Lenkungsmolekülen ist möglich, jedoch zeigen die Arbeiten von Isacson & Deacon (1996) sowie Zhou et al. (1989), dass embryonale Explantate unabhängig von Myelin spezifisch in ihr normales Zielgebiet projizieren und synaptische Kontakte bilden. Diese Daten lassen demnach die Hypothese zu, dass das adulte Hirn über die Entwicklung hinaus axonale Lenkungsmoleküle latent exprimiert.


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5.4  Zielgerichtetes axonales Auswachsen nach Läsion

Verschiedene Mechanismen der axonalen Zielfindung, nach denen das Neuritenwachstum geleitet wird, sind unter 1.4 vorgestellt worden (Püschel, 1996; Tessier-Lavigne & Goodman, 1996; Castellani et al., 1998, Mueller, 1999). Nach einer Läsion im ZNS steht als erste Notwendigkeit das neuronale Überleben im Vordergrund, das u. a. durch die Reexpression von neurotrophen Faktoren vermittelt wird (Conner et al., 1994; Eagle et al., 1995; Tomac et al., 1995). Nach dieser Überlebensphase folgt die Expression von attraktiven, wachstums- fördernden Molekülen, die das axonale Wachstum fördern. Um die funktionelle Restitutio ad integrum wiederzuerlangen, benötigen regenerierende Axone lokale Information, die ihnen die Innervation ihres Zielgebiets ermöglicht (Aubert et al., 1995). Nach einer entorhinalen Läsion zeigte sich, dass möglicherweise axonales Längenwachstum fördernde Moleküle und axonale Lenkungsmoleküle in Membranen von deafferenzierten Hippocampi vorhanden sind. Interessanterweise sind diese nicht oder nicht wesentlich PI-PLC sensitiv, so dass PI-PLC sensitive GPI-verankerte Moleküle für diesen Effekt ausgeschlossen werden können. Dies ist überraschend, wenn man bedenkt, dass verschiedene Zelladhäsionsmoleküle mit auswachsverstärkender Aktivität GPI-verankert sind. Dies gilt sowohl für verschiedene Isoformen von NCAM als auch für F11; TAG-1, BIG-1, ApCAM, LAMP, Kilon, und reggie-1 & 2 (Zhukarev & Levitt, 1995; Inoue & Sanes, 1997; Cremer et al., 1997; Schulte et al., 1997; Bräuer et al., 2000; für eine Übersicht siehe Brümmendorf & Rathjen, 1995). Es muss aber bedacht werden, dass auch einige repulsive Faktoren GPI-verankert sind, wie z. B. die Ephrin-A Subklasse (Zhou, 1998). Dies bedeutet, dass durch die PI-PLC Behandlung nicht nur attraktive, sondern auch repulsive membran-assoziierte Moleküle entfernt werden. Zusammengenommen lassen also die Daten vermuten, dass in Membranen von deafferenzierten Hippocampi auswachsverstärkende Moleküle und weiterhin dass in Membranen 10 dal zusätzlich Wegweisermoleküle exprimiert sind. Es könnte auch angenommen werden, dass in adulten Kontrollmembranen eine Reihe von repulsiven Faktoren vorliegen, die nach einer Läsion transient verschwinden bzw. maskiert sind. Die Evidenzen jedoch für das Vorliegen eines oder mehrerer attraktiver Faktoren nach Läsion geben die Experimente, bei denen frühpostnatalen Membranen und Membranen 10 dal ein ebenbürtiges Auswachssubstrat für auswachsende entorhinale Axone bilden. Die zugrundeliegenden Moleküle könnten bei dem schichtenspezifischen Sprouten regenerierender Fasern nach Deafferenzierung im Hippocampus beteiligt sein. Inwieweit diese Moleküle auch während der Entwicklung des entorhino-hippocampalen Systems eine Rolle spielen, muss in weiterfolgenden Untersuchungen analysiert werden.


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5.5 Reaktive Astrozyten und Extrazelluläre Matrix Moleküle nach Läsion

Nach Schädigung im adulten ZNS kommt es zum Einwandern reaktiver Astrozyten und meningealer Zellen an den Ort der Läsion und manifestiert sich als Glianarbe (Hirsch & Bähr, 1999; Norton et al., 1992; Rose et al., 1976). Die klassische Hypothese ging davon aus, dass reaktive Astrozyten ein wachstumsinhibitorisches Milieu schaffen (Rudge & Silver, 1990; McKeon et al., 1991). In jüngeren Arbeiten zeigte sich jedoch, dass reaktive Astrozyten Moleküle reexprimieren, die sie auch in der Embryonalentwicklung transient exprimierten, so z. B. Vimentin und PSA-NCAM (Nomura et al., 2000; Abb. 16 A). Dies wurde als Reiteration von Entwicklungsprozessen nach Läsion diskutiert (Cotman et al., 1990). Weiterhin zeigten Patch Clamp Ableitungen von reaktiven Astrozyten immature elektrophysiologische Eigenschaften (einwärtsgerichtete K+ Leitfähigkeit, Ruhemembranpotential, Eingangswiderstand), was die Hypothese der De-Differenzierung von reaktiven Astrozyten unterstützt (Schröder et al., 1999). Weitere Arbeiten geben Evidenzen, dass reaktive Astrozyten ein permissives Substrat für axonales Wachstum sind ( Kawaja & Gage, 1991; Eagle et al., 1995). In neueren Arbeiten wurden von der läsionsinduzierten Expression von Tenascin-C, Neurocan und Brevican berichtet (Deller et al., 1997; Haas et al., 1999; Thon et al., 2000). Alle drei Moleküle werden von reaktiven Astrozyten schichtenspezifisch in die extrazelluläre Matrix (ECM) sezerniert, wobei die funktionelle Charakterisierung dieser Moleküle auf axonales Auswachsen noch aussteht (Deller et al., 2000). Ein weiterer Aspekt der molekularen Mechanismen schichtenspezifischen Aussprossens stellt die post-translationale Modifikation von membran-verankerten und ECM Molekülen ( Abb. 16 B). Das prominenteste Beispiel für die Wirkung post-translationaler Modifikation auf das Auswachsverhalten von Neuriten ist NCAM. Erst die Polysialisierung von NCAM (auch als embryonale Form des NCAM bekannt) verstärkt das Auswachsen von Axonen (Zhang et al., 1992; Bruses & Rutishauer, 2001). Der Prozess des Lösens von Membranproteinen wird Ectodomain Shedding genannt und von Proteasen vermittelt. Die Spaltung von Laminin-5, ein Molekül der extrazellulären Matrix, durch Metalloproteasen führt zur Präsentation von Neoepitopen mit verstärkender Wirkung auf die Zellmigration (Giannelli et al., 1997; Koshikawa et al., 2000). Dieser proteaseabhängige Ectodomain Shedding Prozess wurde jüngst auch für die Modifizierung der axonalen Lenkungsmoleküle Ephrin-A2 und Netrin-1 beschrieben (Hattori et al., 2000; Galko & Tessier-Lavigne, 2000). Obwohl die Rolle des Ectodomain Sheddings im Prozess des reaktiven Sproutings nicht bekannt ist, muss man annehmen, dass nicht nur allein die Expression eines repulsiven oder [Seite 52↓]attraktiven axonalen Leitmoleküls, sondern auch deren räumlich-zeitliche Kombination und ihre post-translationale Modifikation essentiell für die Regulation aussprossender Fasern sind.

Abb. 16:

Hypothetisches Modell zur Erklärung des schichtenspezifischen Sprouting im ZNS. Stark vereinfacht dargestellt ist der Gyrus dentatus mit der Körnerzellschicht (GCL) und den apikal abgehenden Dendriten. Man unterteilt die dendritische Zone in die proximal gelegende innere Molekularschicht (IML) und weiter distal die äussere Molekularschicht (OML). Das Modell beschränkt sich auf membran-assoziierte Moleküle, die nur eine mögliche Klasse von beteiligten Molekülen darstellt. A Nach einer Läsion des Tractus perforans kommt es zu einer partiellen Deafferenzierung im Gyrus dentatus, und zwar in der äusseren Molekularschicht. Ein zeitlich feinregulierter Prozess der Aktivierung von Mikroglia (MG) und Astroglia (AG) folgt daraufhin mit einer schichten-spezifischen Migration in die denervierte Zone. Diese Zelltypen exprimieren verschiedene membran-assoziierten Moleküle im aktivierten Status. Es wird diskutiert, dass vor allem

5.6 Axonales Aussprossen und Regeneration?

Seit den bahnbrechenden Arbeiten von Ramon y Cajal zur Entwicklung und Regeneration des adulten ZNS stellt sich die Frage, welche funktionelle Konsequenz das axonale Aussprossen nach einer Schädigung für den verletzten Organismus hat (Ramon y Cajal, 1929). Ist das reaktive Aussprossen ein Prozess, der ein notwendiger Kompensatiosmechanismus für den Organismus ist und zu einer Restitutio ad integrum führt? Oder führt das Aussprossen gar zur atypischen Konnektion mit nachteiligen Folgen für den Organismus über das Maß des primären axonalen Verlusts hinaus? Im Fall der Alzheimer Krankheit zeigt sich, dass die Frage der Konsequenz der Axonaussprossung eng mit der Frage der Spezifität des axonalen Aussprossens verknüpft ist. Im Verlauf dieser Erkrankung kommt es zu einem langsam fortschreitenden Nervenzellverlust mit subsequenten Verlust von Synapsen in nachgeschalteten Hirnarealen (Braak & Braak, 1990). Überlebende Nervenzellen kompensieren diesen Nervenzellverlust durch das Aussprossen neuer Axonkollateralen. Interessanterweise zeigte sich, dass es in der direkten Umgebung der extrazellulären Amyloidablagerung zu aberranten, pathologischen axonalen Wachstumsprozessen kommt (Geddes et al., 1986; Arendt, 2001). Diese Befunde des aberranten Axonwachstums fanden sich auch in transgenen Mäusen, die ein mutiertes humanes Amyloid Precursor Protein (APP23) überexprimieren (Phinney et al., 1999). Ein weiteres Beispiel für atypische, pathologische Verschaltungen durch Axonsprossung zeigte die Arbeit von Woolf et al. (1992). Nach Verletzung eines peripheren Nerven kommt es zu Aussprossung sensibler Fasern im Rückenmark mit fehlgeschalteten Anschluss an Schmerzbahnen, was zu starken Schmerzen bei leichten Berührungen führt.

Die Zielspezifität aussprossender Axone ist also eine notwendige Voraussetzung für eine funktionelle Regeneration.

Ein trauriges Beispiel für die Folgen von verlorengegangenen Nervenverbindungen stellen Schädel-, Hirn- und Rückenmarksverletzungen dar, die mit einer Inzidenz von 250-300 pro


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100 000 Fällen pro Jahr auftreten. Durch den Einsatz von sogenannten genetic forward approaches, wie das Differential Display oder die Subtraktive Hybridisierung, wird zukünftig die Identifizierung und Charakterisierung der an dem schichten-spezifischen Sprouting beteiligten Moleküle im Vordergrund stehen. Mit der Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen der axonalen Wegfindung und der Zielspezifität ist die Hoffnung verknüpft, das von diesen Erkenntnissen diese Patienten zukünftig profitieren werden.


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08.06.2005