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Einleitung und Aufgabenstellung

1.1  Einleitung

Die Chemie der Heterocyclen stellt ein bedeutendes Teilgebiet der organischen Chemie dar. Von besonderem Interesse sind dabei die Stickstoff-Heterocyclen, da sie die physiologisch wichtigsten Verbindungen der belebten Natur umfassen. Diese Heterocyclen sind zentrale Strukturelemente in z.B. den Basen der Nukleinsäuren, den Aminosäuren Prolin, Histidin und Tryptophan, sowie einigen Vitaminen. Darüberhinaus findet man diese Substanzklasse in den am häufigsten eingesetzten pharmakologischen Wirkstoffen wie Zovirax (antivirale Wirkung), Adalat (Calciumantagonist) oder Ofloxazin (Gyrase-Hemmer), um nur einige Beispiele zu nennen.[1] Zu den ältesten bekannten Heterocyclen gehören die [1,3,5]-Triazine, deren Nomenklatur sich von der Numerierung der Atome in der Stammverbindung 1 ableitet.[2-4] Bereits 1834 wurde 2,4,6-Trisamino-[1,3,5]-triazin (Melamin, 2) als eines der ersten Derivate von 1 dargestellt.[5]

Synthetisch zugänglich sind Trisamino-[1,3,5]-triazine 4 entweder durch Cyclotrimerisierung N-substituierter Cyanamide 3 oder mittels Substitution der Chloratome des 2,4,6-Trichlor-[1,3,5]-triazins (Cyanurchlorid, 5) durch Amine bei erhöhten Temperaturen(Schema 1). [6]

Schema 1: Synthetischer Zugang zu Trisamino-[1,3,5]-triazinen.

Die abgestufte Reaktivität der Chloratome des Cyanurchlorids 5 gegenüber nucleophilem Angriff durch Amine wurde von Thurston et al. untersucht.[7] So zeigen die verbleibenden Chloratome nach schrittweisem Austausch durch elektronenschiebende Reste an 5 eine abnehmende Reaktivität. Das erste Chloratom lässt sich selektiv bei Temperaturen um 0°C durch Amine substituieren. Zur Substitution des zweiten Chloratoms bedarf es erhöhter Temperaturen von 30-45°C.[8] Um das verbleibende dritte Chloratom zu substituieren, sind Temperaturen von über 100°C nötig (Schema 2).


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Schema 2: Temperaturabhängige Chlorsubstitution am Cyanurchlorid 5 durch Amine nach Thurston et al. [7]

Aufgrund dieser Reaktivitätsabstufung der Chloratome am Cyanurchlorid sind sowohl symmetrisch als auch unsymmetrisch substituierte [1,3,5]-Triazine zugänglich. Beide Gruppen werden als Herbizide[9] und Stabilisatoren von Polymeren[10] eingesetzt. Darüber hinaus sind sie von hoher pharmakologischer Relevanz. So wird z. B. N,N,N‘,N‘,N‘‘,N‘‘-Hexamethyl-2,4,6-triamino-[1,3,5]-triazin 8 in der Behandlung von Brust-[11] und Eierstocktumoren[12] und Almitrin 9 bei Atemnot[13] eingesetzt (Abb. 1). 6-Methyltriazin 10 ist ein hoch aktiver Corticotropin-Releasing-Hormon-(CRH)-Antagonist (Ki = 6 nM gegen hCRH1)[14] für die Behandlung von Depressionen und Angstzuständen.

Abb. 1: Beispiele für pharmakologisch relevante [1,3,5]-Triazine.

In Anbetracht dieser Beispiele ist zu erwarten, dass auch weitere unsymmetrisch substituierte [1,3,5]-Triazinderivate bedeutsame pharmakologische Eigenschaften aufweisen. Aufgrund der drei selektiv zu substituierenden Positionen am [1,3,5]-Triazinring liesse sich eine nahezu unbegrenzte Anzahl unsymmetrischer Derivate darstellen, vorausgesetzt, es stehen geeignete Hochdurchsatz-Synthesesysteme und entsprechende Screeningmethoden zur Verfügung. Während die Voraussetzung zur Untersuchung vieler tausend Verbindungen hinsichtlich pharmakologischer Wirkung in kurzer Zeit (Hochdurchsatz-Screening) durch die Fortschritte in der Entwicklung von biologischen Testsystemen (Assays) geschaffen wurden,[15] sind die Möglichkeiten der klassischen [Seite 3↓]organischen Synthese zur Darstellung entsprechend hoher Zahlen an Verbindungen begrenzt.

Eine Lösung für dieses Problem stellen die Synthesemethoden der kombinatorischen Chemie dar. Die kombinatorische Chemie umfasst viele Bereiche, wie neue analytische Methoden und Techniken, computergestützte Datenverwaltung, Assay-Gestaltung sowie Syntheseplanung und Automatisierung der Synthesedurchführung. Die Synthesen in der kombinatorischen Chemie zeichnen sich dadurch aus, dass für eine Synthesestufe die Reaktion an einer funktionellen Gruppe des Eduktes nicht nur mit einem Reaktanden, sondern mit vielen Analoga des jeweiligen Reaktanden (parallel oder in Mischungen) durchgeführt wird.[16] In jedem Syntheseschritt werden alle möglichen Kombinationen gebildet, so dass aus anfänglich nur wenigen Bausteinen (building blocks) in den einzelnen Syntheseschritten eine grosse Zahl an Produkten, eine sogenannte „Verbindungsbibliothek“, entsteht.[17-21] Ein geradezu ideales Beispiel für die erreichbare Vielfalt (Diversität) stellt die Synthese von Peptiden dar. Für die Darstellung eines Hexapeptids aus den 20 proteinogenen Aminosäuren ergeben sich durch Kombination aller Möglichkeiten in fünf Synthesecyclen bereits 64 Millionen verschiedene Produkte.

Die Synthesemethoden der kombinatorischen Chemie können in die Bereiche der Synthese in Lösung und der Synthese an fester Phase aufgeteilt werden. Da das Ziel der Synthese in der raschen Bereitstellung grosser Substanzbibliotheken liegt, stellt die Automatisierung einen Schlüsselschritt bei der Planung und Durchführung dar. Eine solche Automatisierung ist für die kombinatorische Chemie in Lösung mit einem enormen apparativen Aufwand bei der Durchführung der Reaktionen und der anschliessenden Aufarbeitung verbunden. Als Beispiel sei hier die Synthese einer Bibliothek aus ca. 40000 Trisamino-[1,3,5]-triazinen 11 in Lösung (Abb. 2a), genannt.[22] Ohne eine Automatisierung wurde lediglich eine kleine Bibliothek in Lösung aus 39 Amino-dioxy-[1,3,5]-triazinen 12 (Abb. 2b) synthetisiert.[23]

Abb. 2: In Lösung synthetisierte kombinatorische [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken. [22, 23]

Aufgrund der Probleme der kombinatorischen Chemie in Lösung, wie etwa bei der Automatisierung, hat sich mehr und mehr die Festphasensynthese zur Darstellung grosser Substanzbibliotheken durchgesetzt. Den Grundstock für die Synthese an fester Phase legte Merrifield bereits 1963.[24] Er stellte ein Konzept zur Peptidsynthese an Polystyrolharz als feste Phase vor, bei dem der C-Terminus des Peptides kovalent an kleinen Harzkügelchen verankert wurde. Diese Methode erlaubte erstmals, Reagenzienüberschüsse einzusetzen, die sich nach Reaktionsende durch einfaches Wegwaschen vom Harz entfernen liessen. Mit der Synthese an fester Phase eröffnete sich auch eine völlig neue Art des biologischen Screenings. So können mit den kovalent am Harz gebundenen Substanzen z.B. direkt Bindungsstudien an fluoreszenzmarkierten Proteinen durchgeführt werden.[18]

Bei der kombinatorischen Festphasensynthese gibt es zwei grundlegende Strategien, um zu einer grossen Anzahl an Verbindungen zu gelangen; die sogenannte „split-and-mix“- und [Seite 4↓]die „parallel“-Methode. Das Grundprinzip der „split-and-mix“-Methode[25] besteht aus der Aufteilung der Synthese-Harzkügelchen vor den Synthesestufen, der Vereinigung nach dem jeweiligen Reaktionsschritt und dem Durchmischen der Harzkügelchen. Am Ende einer solchen Synthese erhält man eine Substanzbibliothek, in der sich auf jedem Harzkügelchen (bead) genau eine Verbindung in vielfacher Kopie befindet („one-bead-one-compound“).[26] Dieses Vorgehen bietet eine Möglichkeit zur raschen Darstellung einer grossen Anzahl von Verbindungen. Da die synthetisierten Substanzmengen jedoch sehr gering sind (wenige pmol pro Harzkügelchen), ist eine ausreichende Analytik nicht immer möglich. Deswegen bedient man sich spezieller Markierungen (tagging) der Harzkügelchen. Dabei wird ein Teil der funktionellen Gruppen eines Harzkügelchens genutzt, um neben der Zielverbindung einen speziellen Code, z.B. aus Nukleotiden, zu synthetisieren.[27, 28] Hierfür muss eine orthogonale Schutzgruppenstrategie entworfen werden und für jede Zielverbindung in der Substanzbibiliothek muss genau eine spezifische Nukleotidsequenz enthalten sein. Diese Technik ermöglicht es, ein Harzkügelchen aus der Menge herausgreifen und die jeweilige Zielstruktur anhand der Erkennungssequenz zu bestimmen.

Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass neben dem doppelten Syntheseaufwand, funktionelle Gruppen der Erkennungssequenz unter den Bedingungen der Synthese der Zielstruktur zu Nebenreaktionen führen können. Werden die Substanzen direkt nach dem letzen Syntheseschritt vom Trägerharz abgespalten, ist eine Codierung einzelner Verbindungen nicht möglich und es werden Substanzgemische erhalten, wie im Fall der Synthese der Trisamino-[1,3,5]-triazin-Bibliotheken 13 (Abb. 3).[29, 30] In solchen Fällen bleibt nach massenspektrometrischer Analyse lediglich eine „ja/nein“ Aussage über die Existenz einzelner Produkte in dem Gemisch, falls die Harzkügelchen nicht einzeln behandelt werden.

Abb. 3: Am Polystyrolharz nach der „split-and-mix“-Methode synthetisierte [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken 13 . [29, 30]

Die Hauptnachteile der „split-and-mix“-Methode liegen im hohen Aufwand im Verlauf der Synthese (zusätzliche Reaktionen für die Codierungssequenz) und bei der Auswertung der analytischen Daten von Substanzbibliotheken nach der Abspaltung von Gemischen unterschiedliche derivatisierter Harzkügelchen.

Anders ist dies bei der ortsadressierten parallelen Synthese von Einzelverbindungen. Hierbei kann die Substanz durch ihre Position während der Synthese z.B. in einem Reaktorgefäss identifiziert werden (Abb. 4a). Eine weitere Strategie zur Festlegung der Position von Substanzen stellt die PIN-Methode dar.[31] Hierbei werden kleine Stäbchen mit harzähnlich derivatisierten „Köpfen“ auf einer Platte fixiert (Abb. 4b) und zur Durchführung der Reaktionen in Mikrotiterplatten getaucht, die die jeweiligen Reagenzien enthalten. Die erreichbaren Substanzmengen pro „Synthese-PIN“ liegen bei max. 30 µmol – relativ wenig im Vergleich zu den in Reaktoren erzielbaren Mengen (mehrere mmol).


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Bei der Darstellung von Verbindungen in festen Bereichen (Arrays) auf planaren Oberflächen (Abb. 4c) wird auf die Verwendung von traditionellen Reaktionsgefässen komplett verzichtet.[32] Die Synthese der Zielverbindungen erfolgt durch direktes Aufbringen der Reagenzien auf eine funktionalisierte Oberfläche wie z.B. Glas.[33] Die Substanzmengen am Ende der Synthese an Glasoberflächen sind sehr gering (ca. 10 pmol), so dass ein Screening in Lösung nicht und eine Analytik meist nur schwerlich möglich sind.

Abb. 4: Verschiedene Techniken zur parallelen Synthese an fester Phase; a) Synthesereaktoren, b) PIN-Methode, c) Arrays auf planaren Oberflächen.

Die Synthese an Zellulosemembranen als planarem Träger wurde erstmals von Frank[34] am Beispiel der parallelen Peptidsynthese beschrieben und als „SPOT-Synthese“ bezeichnet. Bei der SPOT-Synthese werden Lösungen der Reagenzien direkt auf die Zellulose pipettiert, so dass sich auf der Membran „Muster“ (SPOTs) mit verschiedenen Substanzen bilden. Die Grösse der SPOTs wird durch das Volumen von einigen µl bis zu wenigen nl eingestellt. Auf einer 20 x 30 cm Membran lassen sich so bis zu 8000 Peptide darstellen, wobei nur einige Milligramm an Aminosäuren benötigt werden.[35, 36] Für eine Visualisierung der SPOTs können die basischen N-Termini mit Bromphenolblau reversibel angefärbt werden.[37] Mit den kovalent auf der Zellulose gebundenen Peptiden können direkt Bindungsstudien mit z.B. fluoreszenzmarkierten Proteinen durchgeführt werden, um so neue Bindungspartner von pharmakologisch relevanten Rezeptoren zu finden.[35, 36, 38-41]

Im Vergleich zur Glasoberfläche kann an Zellulosemembranen bis zu 100-mal mehr Substanz pro Fläche synthetisiert werden, was u.a. an dem fasrigen Netzwerk der Zellulose und der damit verbundenen vergrösserten „inneren Oberfläche“ liegt. Man erhält nach Abspaltung von der Zellulose ausreichend Substanz für z.B. HPLC-MS Analytik oder für Tests in Lösung(Schema 3). [42]

Schema 3: Definition der SPOTs und Anfärben der Aminogruppen (i). Nach schrittweiser ortsadressierter Synthese der Peptide (ii) können direkt Bindungsstudien mit markierten Proteinen (iii) oder Abspaltung der SPOTs für Analytik bzw. Tests in Lösung (iv) folgen.


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Das Verteilen von Reagenzien auf der planaren Oberfläche kann durch einen Pipettierroboter automatisiert werden,[43] was neben einer Zeitersparnis auch ein präziseres Arbeiten (kleinere SPOTs mit geringerem Abstand zueinander) bei der Synthese ermöglicht. Hierzu werden die Bausteine aus Vorratsgefässen von einem Roboter angesaugt und auf die Zellulosemembran pipettiert (gespottet). Die jeweilige Sequenz der Oligomere mit der dazugehörigen Position wird zuvor mittels einer speziellen Software (LISA, Vers. 1.53) festgelegt. Die SPOT-Synthese bietet eine Kombination aus effizienter Darstellung von Substanzen in Hinblick auf benötigtes Material und Zeit und den Möglichkeiten eines schnellen, hochparallelen Screenings der dargestellten Verbindungen. Im Vergleich zu Synthesen an Harzen ist man bei der SPOT-Synthese bzgl. der eingesetzten Reagenzien und Reaktionsbedingungen deutlich eingeschränkt, da es sich hier um ein offenes System handelt. Luft- oder wasserempfindliche Reaktionen sind ebenso problematisch wie die Steuerung der Reaktionszeit (die wenigen verwendeten µl verdampfen bei Raumtemperatur in sehr kurzer Zeit) oder der Reaktionstemperatur. Trotzdem gelang es, mit der SPOT-Synthese lineare Oligomere wie z.B. Peptide[44, 45] 15, PNAs[46, 47] 16, Peptoide 17 und Peptomere[48-52] (Hybride aus Peptiden und Peptoiden[53]) darzustellen, da deren Synthese kompatibel mit den Rahmenbedingungen der SPOT-Synthese ist (Schema 4).

Schema 4: Darstellung von Peptiden 15 PNAs, 16 und Peptoiden 17 mittels SPOT-Synthese.

Der Einsatz von Peptiden als Therapeutika ist aufgrund ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften wie z.B. mässige orale Verfügbarkeit oder teilweise geringer Serumstabilität problematisch.[54, 55] Aus diesem Grund ist man in der pharmazeutischen Forschung an Peptidmimetika interessiert.[56, 57] Ursprünglich wurden Verbindungen als Peptidmimetika bezeichnet, die im Stoffwechsel die Funktion von Peptiden erfüllen, sich jedoch strukturell von ihnen unterscheiden.[58-61] Mittlerweile gelten allgemein auch Verbindungen als [Seite 7↓]Peptidmimetika, die sich durch den Austausch einzelner Atome oder Gruppen [62] bzw. den Einbau nicht-natürlicher Strukturen oder Abstandshalter[63, 64] von Peptiden ableiten,[65] ohne Berücksichtigung der biologischen Aktivität.

Einige Probleme wie z.B. die biologische Verfügbarkeit des Wirkstoffes kann man jedoch mit oligomeren Peptidmimetika wie z.B. Peptoiden oder PNAs nicht vollständig lösen.[66, 67] Der Schwerpunkt der kombinatorischen Chemie für die Wirkstoffforschung liegt deswegen momentan in der Entwicklung von kleineren, meist heterocyclischen Verbindungen mit einer Molmasse bis ca. 500 g/mol.[68-70]

1.2 Aufgabenstellung

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Potential der SPOT-Synthese auch für die hochparallele Darstellung und das Screening von Heterocyclen am Beispiel der [1,3,5]-Triazine nutzbar zu machen. Die Darstellung der Substanzbibliotheken sollte auf Zellulose- und Polypropylenmembranen erfolgen. Die Verwendbarkeit der erhaltenden Substanzbibliotheken für Screening-Zwecke sollte in Modellsystemen zur Findung bioaktiver [1,3,5]-Triazine getestet werden.

Es galt folgende Aufgaben zu bearbeiten und zu lösen:

(1) Membranderivatisierung und Linkersysteme

Für die Synthese an Zellulosemembranen standen sowohl eine Aminoderivatisierung als auch jeweils ein basisch, sauer und photolytisch spaltbares Linkersystem zur Verfügung, die für die SPOT-Synthese von Peptiden[45] und Peptoiden[49, 52] bereits erfolgreich eingesetzt wurden. Im Gegensatz dazu mussten an der Polypropylenmembran (PP-Membran) erst eine geeignete Derivatisierung und die Synthesen verschiedener Linkersysteme erarbeitet werden. Besonderen Wert sollte bei der Derivatisierung der PP-Membran auf eine Verringerung der hydrophoben Eigenschaften der Oberfläche gelegt werden, um im Verlauf des Screenings in wässrigen Puffersystemen unspezifische Wechselwirkungen mit den entsprechenden Proteinen zu unterdrücken.

(2) Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intermolekulare S N Ar am Cyanurchlorid unter SPOT-Bedingungen

Für die Synthese von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken sollten Bedingungen zur Immobilisierung von Cyanurchlorid an aminoderivatisierten planaren Oberflächen gefunden werden. Zur Erhöhung der Diversität der späteren Bibliotheken sollte diese Anknüpfung nicht nur direkt an der Aminogruppe der Linker, sondern zusätzlich an den N-Termini von Peptiden und Peptoiden erfolgen. Anschliessend waren Synthesekonzepte zur Darstellung von unsymmetrisch amino- und amino/oxy-substituierten [1,3,5]-Triazinen durch schrittweise intermolekulare Substitution der verbleibenden Chloratome des Cyanurchlorids durch Amine und Alkohole zu entwickeln und zu untersuchen. Unter den Rahmenbedingungen der SPOT-Synthese waren diese Methoden zu optimieren und im Anschluss für die Synthesen von Bibliotheken anzuwenden.

(3) Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intramolekulare S N Ar an Dichlor-[1,3,5]-triazinderivaten unter SPOT-Bedingungen

Desweiteren sollte untersucht werden, ob durch schrittweise intramolekulare SNAr an 4,6-Dichlor-[1,3,5]-triazin-2-ylaminen auch makrocyclische [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken [Seite 8↓]erhalten werden können. Hierfür galt es, eine geeignete Schutzgruppenstrategie zu entwickeln, um selektiv unterschiedliche nucleophile Gruppen z.B. eines Peptides zur Chlorsubstitution einsetzen zu können. Im Rahmen der Untersuchungen sollten Fragen wie z.B. die erreichbaren Ringgrössen oder die Kompatibilität mit den proteinogenen Aminosäuren und deren Schutzgruppen geklärt werden.

(4) Untersuchung der [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken in verschiedenen Assayformaten

Die allgemein verwendeten Assay-Systeme lassen sich in zwei Gruppen aufteilen; Festphasen-Assays und Assays in Lösung. Zur Demonstration, dass die mittels SPOT-Synthese erhaltenden [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken in beiden Assayformaten eingesetzt werden können, wurde jeweils ein Modellsystem gewählt. Als Modellsystem für das Festphasen-Screening sollte der Bindungs-Assay mit dem gut charakterisierten monoklonalen Antikörper (mAk) TAB-2 verwendet werden.[35, 36, 38, 71] Mit Hilfe einer zellulosegebundenen Bibliothek aus 8000 Verbindungen sollten de novo [1,3,5]-Triazine identifiziert werden, die an den Antikörper binden. Die Affinitäten der Verbindungen zum Antikörper sollten mittels kompetitivem ELISA in Lösung quantitativ bestimmt werden. Zusätzlich sollten im Festphasen-Assay mit dem mAk TAB-2 die Screening-Eigenschaften der Zellulose- und der PP-Membran verglichen werden.

Als Modell für Screeningsysteme in Lösung diente ein Agardiffusions-Assay mit einer modifizierten Hefe, die den Somatostatin Rezeptor Typ II (SSTR2) trägt. Im Gegensatz zu Bindungsstudien handelt es sich hierbei um ein funktionelles Assay, in dem die Testsubstanzen in gelöster Form eingesetzt werden und ggf. zu einer Vermehrung der Hefezellen führen. Der natürliche Ligand S14 des SSTR2, ein 14-meres Peptid mit einer Disulfidbindung (AG-c[CKNFFWKTFTSC]-COOH), ist ein Inhibitor der Sekretion von z.B. Wachstumshormonen. Das S14 sollte gezielt durch [1,3,5]-Triazineinheiten modifiziert werden. Aktive Verbindungen dieses Typs sind für die Entwicklung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe zur Tumorbekämpfung und –diagnostik von grossem Interesse.[72-74]


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09.11.2004