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Einsatz von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken in biologischen Assay-Systemen

Im Anschluss an die Darstellung verschiedener [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an planaren Oberflächen sollte untersucht werden, ob die erhaltenden Substanzbibliotheken zur Findung biologisch aktiver [1,3,5]-Triazine genutzt werden können. Biologische Assay-Systeme lassen sich bezüglich ihrer Durchführung in zwei Gruppen einteilen; Festphasen-Assays und Assays in Lösung. Im Fall der Festphasen-Assays werden entweder die zu testenden Substanzen oder der Bindungspartner z.B. ein Rezeptor an einer festen Phase immobilisiert, wobei die Bindung der Substanzen an den Rezeptor oder eine Verdrängung nativer Liganden gemessen wird. Bei Assays in Lösung hingegen befinden sich beide Komponenten, die Testsubstanzen und das biologische Material z.B. isolierte Säugetierzellen in einer „Lösung“ bzw. Suspension. Man beobachtet hierbei eine Vermehrung der Zellen oder die Produktion bestimmter Substanzen durch die Zellen.

Die Untersuchungen zur Einsetzbarkeit der mittels SPOT-Synthese erhaltenden [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken wurde an je einem Modellsystem beider Assayformate durchgeführt. Für die Durchführung eines Festphasen-Screenings an der Zellulosemembran sollte der bereits gut etablierte monoklonale Antikörper (mAk) TAB-2 verwendet werden.[35, 36, 38, 71] Neben der Verfügbarkeit des jeweiligen Systems spielte im Fall des Assays in Lösung auch die pharmakologische Bedeutung eine Rolle. So wurde für diese Untersuchungen ein Assay zur Auffindung von agonistischen Somatostatinanaloga gewählt. Da es sich bei der Stammverbindung, dem Somatostatin S14, um ein 14-meres cyclisches Peptid handelt, sollte für die Entwicklung von Analoga zusätzlich die neue Methode zur Darstellung cyclischer Peptidmimetika eingesetzt werden.

4.1 Bindungsassays an Festphasen-gebundenen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken mit einem monoklonalen Antikörper

Bindungsassays an fester Phase sind ein häufig eingesetztes Werkzeug zur raschen Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und immobilisierten Peptiden.[18, 33, 35, 40, 88] Im Fall des im Rahmen dieser Arbeit verwendeten monoklonalen Antikörpers (mAk) TAB-2 für Festphasenbindungsstudien erfolgte der Nachweis der an die jeweiligen Peptide gebundenen Antikörper durch einem zweiten, Peroxidase(POD)-markierten Antikörper mittels einer Chemolumineszenzreaktion (Abb. 21).[41]

Abb. 21: Nachweis von Peptid-mAk-TAB-2-Wechselwirkung an einer Zellulosemembran durch einen zweiten POD-markierten Antikörper (POD = Peroxidase, Substrat: Chemolumineszenz-Substrat auf Luminol-Basis).

Die membrangebundene Peptid-Bibliothek wurde mit einer Lösung des mAk TAB-2 inkubiert. Nach Entfernen des überschüssigen Antikörpers durch Waschschritte, wurden die [Seite 100↓]gebundenen Antikörper mit einem POD-markiertem Antikörper und einem Chemolumineszenz-Substrat nachgewiesen. Bei einer digitalen Detektion (LumiImager™) erscheinen die SPOTs mit gebundenem Antikörper dunkel, wobei die Signalintensitäten (Schwarzfärbung) eine quantitative Abschätzung der Bindungsstärke ermöglicht. Als Kontrolle ging der Inkubation mit mAk TAB-2 eine Behandlung der Membran mit dem zweiten Antikörper voraus, die keine Signale zeigte. Diese Kontrollinkubation stellt sicher, dass der Nachweisantikörper nicht die membrangebundenen Peptide direkt bindet, und so falsch positive Werte liefern würde.[35]

Der mAk TAB-2 erkennt die lineare Sequenz VVSHFND aus dem N‑Terminus des transforming growth factor(TGF)-α.[36, 71] Mittels einer sog. Substitutionsanalyse konnte die Bindung des Peptides genauer untersucht werden. Dazu wurden alle 140 Peptide (20 Aminosäuren in sieben Positionen) synthetisiert, die sich in einer Aminosäure von der Ausgangs­sequenz („Wildtyp“) VVSHFND unterscheiden. Nach der Synthese wurde die Membran mit dem Antikörper inkubiert und die Bindung als dunkle Färbung visualisiert.[36, 102] An Zeilen, die viele bindende SPOTs aufweisen, erkennt man Positionen des Ausgangspeptids, die verschiedene Aminosäuren tragen können, ohne dass die Bindung zum Antikörper verloren geht (in Abb. 22, die oberen beiden Zeilen, die eine Austausch-barkeit der N‑terminalen Valin-Bausteine signalisieren).[36, 102] Im Gegensatz dazu zeigen Zeilen, die nur wenige bindende SPOTs aufweisen, nicht oder nur eingeschränkt substituierbare Schlüsselpositionen an (im gezeigten Beispiel die fünf C‑terminalen Positionen SHFND).[36, 71] Synthese und Screening der gezeigten Peptid-Bibliothek erforderte dabei den geringen Zeitaufwand von drei Tagen für diese Substitutionsanalyse.

Abb. 22: Substitutionsanalyse des Hepta-Peptids VVSHFND: 140 (7 x 20) Peptide zzgl. 7 Kopien des Wildtyps (wt) wurden an einer Zellulosemembran (6 x 13 cm) synthetisiert und mit mAk TAB-2 inkubiert. Dunkle SPOTs zeigen Bindung des Antikörpers, und unter-scheiden sich in einer Aminosäure (hervorgehoben in den angegeben Sequenzen). [35, 102]

Es zeigt sich, dass die Bindung im C‑terminalen Bereich des Peptides (SHFND) durch Kontakte zu den Seitenketten charakterisiert ist, während an den Positionen der beiden N-terminalen Valin-Bausteine Kontakte zum Rückgrat bestehen.[35] Durch kombinatorische Peptid-Bibliotheken an Zellulose und unter Verwendung der phage-display-Technik konnte das Bindungsmotiv auch de novo identifiziert werden.[38]

Bei der Suche nach Bindungspartner mittels de novo Strategien in der Peptidchemie an Zellulose wurde im allgemeinen mit Peptiden aus 6-14 Aminosäuren gearbeitet, die in zwei bis drei Positionen eine definierte Aminosäure besitzen, während die anderen Positionen als Gemische vorliegen. Ein SPOT einer solchen Bibliothek kann beispielsweise eine Sequenz des Typs XXB1B2XX besitzen, in der die mittleren Positionen zwei bestimmte Aminosäuren B1 und B2 tragen, während an den übrigen Positionen Mischungen aus 20 Aminosäuren zur Synthese eingesetzt werden, so dass letztlich eine sehr grosse Zahl an Sequenzen pro SPOT vorliegt.[40, 41, 102]


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Im Gegensatz zu den oben beschriebenden Peptiden wurde für die [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aufgrund der geringen Molekülgrösse eine relativ schwache Bindung erwartet, so dass keine Mischungen sondern einzelne, definierte Verbindungen auf jedem SPOT synthetisiert werden sollten. Bei der Verwendung einer 20 x 30 cm Zellulosemembran lassen sich 8000 Einzelverbindungen mit einer „Dichte“ von ca. 25 SPOTs pro cm2 synthetisieren.[45, 102]

Die Planung einer kombinatorischen Substanzbibliothek ist eine komplizierte Aufgabe. Für die de novo Entdeckung von Bindungspartnern zu vorgegebenen Proteinen ist meist das Ziel eine Bibliothek mit möglichst grosser Diversität zu entwerfen. Die Beurteilung der Diversität wurde von vielen Arbeitsgruppen bearbeitet, ist jedoch noch nicht abschliessend gelöst.[135-140] Da viele Pharmaka durch Bindung an ein grosses Protein wie z.B. einen Rezeptor ihre Wirkung entfalten,[141] bietet ein Vergleich der Zielbibliothek mit bereits eingesetzten Pharmaka ein Kriterium zur Beurteilung der Erfolgsaussicht für die geplante Bibliothek.[142] Generell haben sich folgende Kriterien als besonders wichtig erwiesen; die Anzahl an H-Akzeptor- und H-Donor-Gruppen, das Molekulargewicht und der logP-Wert. Die Anzahl der H-Akzeptor-Gruppen sollte ungefähr 5, die der H-Donor-Gruppen ca. 8-10 betragen, beide sind u.a. für Bindungseigenschaften sehr wichtig.[141] Die Molekülgrösse hat einen entscheidenden Einfluss auf die Bioverfügbarkeit der Verbindung, wobei kleinere Moleküle in der Regel besser im Organismus verfügbar sind als grosse. Als Mass wurde hier das Molgewicht herangezogen, das unter 500 g/mol liegen sollte. Der logP-Wert der zu synthetisierenden Verbindungen gibt den Verteilungskoeffizienten der Verbindung zwischen n-Octanol und Wasser an, wobei hohe Werte bedeuten, dass die Verbindung unpolar ist. Der logP-Wert sollte unter 5 liegen, um eine gute Membrangängigkeit der Verbindung zu gewährleisten.[67]

Die Beurteilung der Diversität konnte hier nur sehr subjektiv erfolgen, da das zentrale Strukturelement durch den [1,3,5]-Triazinring vorgegeben war. Für den Entwurf der Bibliothek an Zellulose waren zwei Punkte zu beachten; es sollten die Auswahlkriterien speziell die Anzahl an H-Akzeptor- und H-Donor-Gruppen möglichst gut erfüllt werden, und es sollten nur die Bausteine eingesetzt werden, die in den Testsynthesen gute Ergebnisse geliefert haben. Da die Synthese an einer Zellulosemembran erfolgen sollte, wurde die Auswahl der Bausteine zur Substitution der Chloratome am membrangebunden Di- und Monochlor-[1,3,5]-triazin auf die Amine beschränkt, die in vorherigen Untersuchungen (vgl. Kapitel 2.4.1 und 2.5.1) gute bis sehr gute Ergebnisse geliefert haben.

Bei der Gestaltung der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek musste bedacht werden, dass eine Schwierigkeit im Auftragen der Amine im 8000-er Format für die Substitution des letzten Chloratoms am Triazinring besteht, da hier ca. 0,1 µl/SPOT verwendet werden. Bis der letzte SPOT mit Aminlösung benetzt werden kann, sind die ersten schon fast wieder eingetrocknet, bevor eine Erwärmung erfolgen konnte. Ferner war eine homogene Bestrahlung der Membran durch Mikrowellen in dem zur Verfügung stehenden Mikrowellenofen nicht gewährleistet. Aus diesen beiden Gründen wurde die Chlorsubstitution an den Monochlor-[1,3,5]-triazinen mit einem Amin für die gesamte Membran unter Verwendung einer Heizmatte als Heizquelle durchgeführt.

Der Einbau von Aminosäuren bietet die Möglichkeit, eine möglichst grosse Anzahl an biologisch relevanten funktionellen Gruppen einzusetzen. Zur Kombination dieser Gruppen wurde eine virtuelle Bibliothek aus 400 Dipeptiden bestehend aus den 20 proteinogenen Aminosäuren (R1 und R2) entworfen. Am N-Terminus wurde Cyanurchlorid immobilisiert und das zweite Chloratom mit 20 unterschiedlichen Aminen (R3) substituiert. Das verbleibende dritte Chloratom wurde mit Piperidin substituiert (Abb. 23).


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Abb. 23: Entwurf der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzelverbindungen.

Abb. 24: Verteilung der Häufigkeit der a) H-Akzeptor-, b) H-Donor Gruppen, c) des Molgewichtes und d) einzelner logP-Wert in der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzelverbindungen ermittelt mit dem Programm ChemX.


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Die virtuelle Bibliothek wurde mit dem Programm ChemX[143] erstellt und die Anzahl an H-Akzeptor- und H-Donor-Gruppen, Molekulargewicht und logP-Wert jeder der 8000 Ver-bindungen berechnet. Die Verteilungen bzgl. der Häufigkeit der einzelnen Parameter ist in Abb. 24 graphisch dargestellt.

Da es vor Beginn der Untersuchungen unklar war, ob prinzipiell durch diese Art von Festphasen-Screening mit [1,3,5]-Triazinen Bindungspartner für den mAk TAB-2 gefunden werden können, war es wichtig eine Bibliothek zu entwerfen, die eine möglichst optimale Anzahl von H-Donor- und H-Akzeptor-Gruppen aufwies. Die Berechnungen ergaben, dass die Parameter der meisten geplanten Verbindungen sich in den optimalen Bereichen (bezogen auf[67]) befinden. Leichte Abweichungen sind allerdings tolerierbar.[144] Die Aussage über den logP-Wert ist bezogen auf das Festphasen-Screening von geringer Bedeutung, bietet jedoch einen Anhaltspunkt für die Löslichkeit und Membrangängigkeit der Verbindungen in nachgeschalteten Untersuchungen. Aufgrund der positiven Ergebnisse der Berechnungen der wichtigen Parameter (bezogen auf mögliche Bindungspartner) der Verbindungen wurde mit der Synthese der Bibliothek an einer Zellulosemembran begonnen. Den Anfang stellte die Synthese aller möglichen Dipeptide aus proteinogenen Aminosäuren dar. Die Synthese erfolgte auf einer 20 x 30 cm grossen aminoderivatisierten Zellulosemembran. Die Verteilung der Aminosäure-Pentafluorphenylesterlösung konnte durch einem Pipettierautomaten automatisiert werden. Die jeweilige Sequenz der Peptide mit der dazugehörigen Position der zu spottenden Aminosäurelösung wurde mittels einer speziellen Software (LISA, Vers. 1.53) festgelegt. Die 400 Dipeptide wurden blockweise in 20 Replika (5 x 4 Blöcke) auf der Zellulosemembran synthetisiert. Nach Reaktion des Cyanurchlorids mit dem jeweiligem N-Terminus der Dipeptide wurde jeweils ein Amin auf einen der 20 Blöcke aufgetragen. Das letzte Chloratom am [1,3,5]-Triazinring wurde mit Piperidin substituiert (Schema 43).

Schema 43: Syntheseschritte für die [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzel-verbindungen.


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Die Position der verwendeten Amine zur Chlorsubstitution auf der Zellulose entspricht der Position in der schematischen Darstellung der fertigen Membran in Abb. 25.

Abb. 25: Verteilung der Amine in der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek. Jeder Block der Amine repräsentiert 400 Verbindungen bestehend aus einer Dipeptid- und einer Triazin-Hälfte (vgl. Schema 23 ).

Um falsch-positive Resultate durch Bindung des POD-markierten Nachweisantikörpers an den [1,3,5]-Triazinen auszuschliessen, erfolgte vorab eine Kontrollinkubation der membrangebundenen Bibliothek. Nachdem keine signifikante Bindung detektiert wurde, konnte die eigentliche Untersuchung mit dem mAk TAB-2 durchgeführt werden. Der Nachweis der Bindung des mAk TAB-2 an die einzelnen Verbindungen der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek erfolgte durch den zweiten POD-markierten Antikörper (vgl. Abb. 21) in Form dunkler SPOTs (Abb. 26). Zur Positivkontrolle der Bindungsstudien (Bestätigung der Funktionalität des Antikörpers an der Zellulosemembran) wurde das sechsmere VSHFND (Kontrolle) auf der Zellulosemembran immobilisiert.


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Abb. 26: Bindung des mAk TAB-2 an einzelnen SPOTs der Bibliothek aus 8000 [1,3,5]-Triazinderivaten 149 . Die Visualisierung erfolgte durch einen POD-markierten Nachweisantikörper, Umsatz mit einem Chemolumineszenz-Substrat und digitale Detektion der Lumineszenz (LumiImager™).

Die Bindungsstudie zeigte, dass sowohl eine Präferenz des mAk TAB-2 gegenüber dem Cyclohexylmethyl-Rest (Block 1, Abb. 26 links oben) bestand, als auch einige sequenzspezifische Bindungen des Antikörpers (einzelne SPOTs z. B. in den Blöcken 14, 15 und 19) detektiert werden konnten. Die Numerierung der einzelnen SPOTs auf der Zellulose erfolgte in Anlehnung an die Synthese der Verbindungen. So wurde die erste Aminosäure von dem Pipettierautomaten in Spalten gespottet. Die erste Zahl jedes Dreier-Codes (vgl. Kapitel 2.6) der SPOTs gibt die C-terminale Aminosäure an, wobei die Nummer der alphabetischen Reihenfolge im „Ein-Buchstaben-Code“ entspricht (1 für A, 2 für C, 3 für D usw.). Die zweite Zahl entspricht der N-terminalen Aminosäure des Dipeptides in gleicher Numerierung. Die letzte Zahl des dreier Codes steht für das verwendete Amin des Blockes wie in Abb. 25 gezeigt, also 1 für Cyclohexylmethyamin oder 5 für Benzylamin. Der markierte SPOT 149-( 18-6-19 ) in Abb. 26 (spezifische Bindung durch den Antikörper TAB-2) trägt somit die folgende Sequenz C-terminales Valin, dann Glycin und zur Substitution des zweiten Chloratomes 3-Chlorbenzylamin.

Die Bindung des mAk TAB-2 an den zellulosegebundenen [1,3,5]-Triazinen muss nicht an dem Paratop (der für eine Bindungsspezifität verantwortliche Oberflächenbereich), sondern kann auch unspezifisch an einem konstanten Bereich erfolgen. Zur Untersuchung der Bindungsspezifität wurde ein kompeptitiver ELISA[145] durchgeführt. Hierbei wurde in den Reaktionskammern einer Mikrotiterplatte ein Teil des nativen Bindungspartners des mAk TAB-2 kovalent verankert (VVSHFNDCPDSHTQFAF; der N-terminale Teil des TGF­-α). In die derart modifizierten Reaktionskammern wurden nun die zu testenden Verbindungen (einzeln in unterschiedlichen Konzentrationen) und eine konstante Menge des markierten [Seite 106↓]mAk TAB-2 gegeben. Nach Waschen der Kammern wurde die Enzymaktivität und damit die Menge an gebundenem Antikörper in den einzelnen Kammern mittels eines chromogenen Substrates gemessen. Eine geringe Menge an detektierbarem Antikörper TAB-2 signalisiert eine gute Bindung der zugegebenen Testsubstanz an das Paratop, da dann wenig TAB-2 an den derivatisierten Reaktionskammern gebunden hat. Aus der Konzentrationsreihe der einzelnen Verbindungen ergeben sich die Inhibitionskonstanten IC (IC50 entspricht einer Konzentration mit halb-maximalen Inhibierung).

Um die Bindungsspezifität der identifizierten Verbindungen der SPOTs zu überprüfen wurden exemplarisch einige Sequenzen für ELISA-Experimente ausgewählten. Die sechs Verbindungen (vgl. Abb. 26, alle eingekreisten SPOTs) wurden am Rink-Harz synthetisiert, um für weitere Untersuchungen ausreichend Substanzmengen zur Verfügung zu haben. Die Auswahl erfolgte nicht nur nach Signalstärke, sondern es wurde auch auf den Einfluss der Aminosäuren. So wurden aus Block 6 (4-(2-Aminoethyl)morpholin) SPOTs mit anderen Aminosäureresten gewählt, als die, die schon im Block 1, 10 oder 19 vertreten waren. Der SPOT 149-( 7-14-6 ) hingegen zeigte keine signifikante Bindung des Antikörpers und wurde als Negativkontrolle gewählt, um event. falsch-negative Ergebnisse zu untersuchen. Zur besseren Unterscheidung sind diese Verbindung nur mit dem Dreier-Code bezeichnet, also 149 -(18-6-19) für die zellulosegebundenen und 18-6-19 für die vom Harz abgespaltene Verbindung.

Zwei der sechs Verbindungen zeigten in kompetitiven ELISA-Experimenten eine deutliche Inhibierung der Bindung des mAk TAB-2 an das immobilisierte Peptidepitop. Die Detektion des Antikörpers in Abhängigkeit der Konzentration an zugesetzten [1,3,5]-Triazinderivaten ist in Abb. 27 gezeigt.

Abb. 27: Inhibition der Bindung des mAk TAB-2 an das festphasengebundene Peptidepitop VVSHFNDCPDSHTQFAF durch die Verbindungen 18-6-19 , 6-3-1 und das Peptid VVSHFND in ELISA-Experimenten. Die Negativkontrolle 7-14-6 zeigt keine Inhibition.

Die sechs ausgewählten Verbindungen, die Ergebnisse aus dem Festphasen-Screening und dem kompetitiven ELISA sind in Tabelle 37 zusammengefasst. Die angegebenen IC50-Werte aus dem ELISA-Experimenten entsprechen dem jeweiligen Mittelwert aus drei Bestimmungen.

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Tabelle 37: Ausgewählte mAk-TAB-2 bindende Trisamino-[1,3,5]-triazine 149 in Festphasen-Screening und in ELISA-Experimenten.

a BLU = Boeringer light units

Drei der Verbindungen zeigten im Festphasen-Screening eine Bindung des mAk TAB-2 im ELISA-Experiment jedoch keine Inhibition der Bindung zu dem immobilisiertem Epitop, was folgende Gründe haben kann; Zum Einen kann die Bindung der [1,3,5]-Triazine nicht zum Paratop des Antikörpers erfolgen, zum Anderen ist die Sensitivität des Festphasen-Screenings sehr hoch,[45] so dass eine Inhibition aufgrund von nicht erreichbaren Konzentrationen im ELISA nicht detektierbar ist. Ferner besteht die Möglichkeit, dass die Zellulose oder der Spacer (4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin) zwischen der Oberfläche der Membran und den [1,3,5]-Triazinen zu der Bindung des Antikörpers einen Beitrag liefert. Die zwei weiteren Verbindungen (18-6-19 und 6-3-1) zeigten jedoch eine signifikante Inhibition im ELISA-Experiment. Trotz der geringen Affinität konnte gezeigt werden, dass sich mittels SPOT-Synthese und Festphasen-Screening kleine organische Moleküle finden lassen, die immerhin ein 17-meres Peptid an der Bindungsstelle verdrängen.


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Als nächstes wurde die Verwendbarkeit der derivatisierten PP-Membran hinsichtlich des Festphasen-Screenings mit dem mAk TAB-2 untersucht. Hierzu wurde eine kleine eingeschränkte (fokusierte) Bibliothek entworfen, die sowohl Verbindungen aus der ersten [1,3,5]-Triazin-Bibliothek, als auch für eine Optimierung zusätzlich einige bislang noch nicht eingesetzte amino-oxy-substituierte [1,3,5]-Triazine enthielt. Die Kernstruktur der Bibliothek und die verwendeten Bausteine sind in Schema 44 dargestellt.

Schema 44: Gestaltung der Folgebibliothek. 6 Dipeptidsequenzen (A-F) wurden in Zeilen synthetisiert, nach Immobilisierung von Cyanurchlorid wurden 10 Nucleophile (1-10) zur Monochlorsubstitution eingesetzt. Das verbleibende Chloratom jeder Verbindung wurde mit Piperidin umgesetzt.

Die Synthese der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek erfolgte sowohl auf einer aminoderivatisierten Zellulose- als auch auf einer PP-Membran. Der Einsatz der PP-Membran ermöglichte die [Seite 109↓]Verwendung von vier Phenolen (Nucleophile 7-10), da diese zuvor an dieser planaren Oberfläche gute Ergebnisse lieferten (vgl. Kapitel 2.4.2). Die Kontrollinkubation der Membran mit dem POD-Nachweisantikörper, die Inkubation mit dem mAk TAB-2 und dem POD-Nachweisantikörper mit anschliessender digitaler Detektion an dem LumiImager™ sind in Abb. 28 gezeigt (a und c mit POD, b und d mit TAB-2 und POD-Kontrollinkubationen).

Abb. 28: Bindungsstudien an [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken 153 synthetisiert an Zellulose- (a und b) und PP-Membran (c und d). Die Kontrollinkubation (a und c) zeigt an der Zellulose geringe, an der PP-Membran keine Bindung des POD-markierten Antikörpers. Die Zahlen in der Abbildung codieren die jeweiligen Reste von 153 .

Die beiden festphasengebundenen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken in Abb. 28 enthaltenden die selben Verbindungen. Lediglich das Material der planaren Oberfläche und der Derivatisierungsgrad unterscheiden sich (150 nmol/cm2 an der Zellulosemembran zu 90 nmol/cm2 an der PP-Membran). Zur besseren Orientierung sind die SPOTs, die zuvor aus der ersten Bibliothek, bestehend aus 8000 Verbindungen, ausgewählt wurden auf der Zellulosemembran durch Pfeile gekennzeichnet. Diesmal zeigen die SPOTs 153-( 19-6-10 ) und 153-( 14-7-6 ), die im ELISA-Experiment keine Inhibition aufwiesen, eine deutlich geringere Bindung zum mAk TAB-2. Im Vergleich zu dem Bindungsmuster auf der Zellulose fallen auf der PP-Membran einige weitere SPOTs auf. Die auf der Zellulose als bindend detektierten SPOTs 153-( 3-7-6 ) und 153-( 18-6-19 ) erschienen heller, der SPOT 153-( 6-3-1 ) zeigte keine Bindung zum mAk TAB-2 und blieb weiss. Diese Beobachtung kann durch die Art der Auswertung der Bindung der SPOTs zum Antikörper mittels digitaler Auswertung bedingt sein. Die Auswertung mit dem LumiImager™ liefert immer nur relative Werte, d.h. die SPOTs in der oberen Zeilen in den letzten beiden Spalten können die anderen „überstrahlen“. Ferner ist der Einfluss der planaren Oberfläche bei der Bindung des Antikörpers nicht klar. Neben einer unterschiedlichen Benetzbarkeit können z.B. Hydroxylgruppen der Zellulose einen Einfluss ausüben.


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Zur Beurteilung der Ergebnisse wurden sechs SPOTs ausgewählt, um die entsprechenden Verbindungen am Syntheseharz zu synthetisieren. Die ausgewählten SPOTs sind in Abb. 28 an der PP-Membran markiert, wobei sich die Benennung nach den Koordinaten richtet. Der SPOT 153- A6 wurde hierbei als Negativkontrolle gewählt, da er weder auf Zellulose, noch auf der PP-Membran eine Bindung zum mAk TAB-2 zeigte. Die Verbindungen wurden nach Aufreinigung mittels HPLC in dem gleichen kompetitiven ELISA[145] getestet wie die zuvor aus der anfänglichen Bibliothek ausgewählten Verbindungen. Die Ergebnisse der Bindungsstudien an den planaren Oberflächen im Vergleich zu den ELISA-Experimenten sind in Tabelle 38 zusammengestellt.

Tabelle 38: Ausgewählte mAk-TAB-2 bindende Trisamino-[1,3,5]-triazine im Festphasen-Screening an Zellulose- und PP-Membran sowie im kompetitiven ELISA.

a BLU = Boeringer light units

Die Ergebnisse in Tabelle 38 zeigen, dass sowohl einige SPOTs, die auf der Zellulose- und der PP-Membran als mAk TAB-2 bindend identifiziert wurden, eine Kompetition im ELISA-Experiment mit dem Epitop (VVSHFNDCPDSHTQFAF) aufweisen. Drei (A6, D4 und D5) der sechs Verbindungen lieferten die gleichen Ergebnisse auf beiden planaren Oberflächen, die mit den Ergebnissen der ELISA-Experimente im Einklang stehen. Die SPOTs A9 und A10 zeigten eine Bindung des mAk TAB-2 an der PP-Membran, wobei die Ergebnisse an der Zellulose auf eine schlechtere Produktqualität zurückzuführen sind (vgl. [Seite 111↓]Kapitel 2.4.2). Von diesen beiden Verbindungen zeigte A9 die beste Kompetition mit dem Epitop in allen ELISA-Experimenten mit einem IC50 Wert von 90 ± 10 [µmol]. Die Verbindung des SPOTs A1, die nur an der Zellulosemembran eine Bindung zum Antikörper zeigte, koordinierende ebenfalls an das Paratop des mAk TAB-2. Die hydrophobe Verbindung A1 kann durch Wechselwirkungen mit der ebenfalls hydrophoben PP-Membran für dem mAk TAB-2 an dieser Membran schlechter zugänglich sein. Das würde das Ausbleiben einer Bindung von TAB-2 an A1 dem SPOT der PP-Membran erklären. Auf eine weitere Optimierung der Bindung der [1,3,5]-Triazinderivate, durch Einsatz von weiteren Aminen oder Phenolen zur Chlorsubstitution wurde aus Zeitgründen verzichtet.

Zusammenfassend konnten durch die Bindungsstudien an de novo [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken einige Bindungspartner für den mAk-TAB-2 identifiziert werden. Untersuchungen zur Verwendbarkeit der planaren Oberfläche haben ergeben, dass sich Bindungsstudien mit dem Antikörper TAB-2 und [1,3,5]-Triazinen sowohl an der Zellulosemembran als auch an der modifizierten PP-Membran durchführen lassen. Abgesehen von der synthetischen Zugänglichkeit der Verbindungen stimmten die Bindungsstudien an beiden Membranen mit den [1,3,5]-Triazinen und dem mAk TAB-2 tendenziell überein. In nachfolgenden ELISA-Experimenten konnte gezeigt werden, dass sechs der zuvor an den planaren Oberflächen identifizierten Bindungspartner (18-6-19 und 6-3-1 aus Tabelle 37 sowie A1, A9, D4 und D5 aus Tabelle 38) mit dem Epitop des Antikörpers kompetitieren und somit mit hoher Wahrscheinlichkeit am Paratop des Antikörpers binden.

4.2 Lösliche [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken in einem Agardiffusions-Assay

Als Modell für das Screening in Lösung diente ein Agardiffusions-Assay mit einer modifizierten Hefe, die einen Somatostatin-Rezeptor enthält. Bislang sind fünf humane Somatostatin-Rezeptor Subtypen bekannt (hSSTR1-5).[146] Diese Rezeptoren sind an vielen Prozessen wie etwa bei der Ausschüttung von Glukagon und Insulin, bei der Muskelkontraktion und der Neurotransmission beteiligt. Der hier eingesetzte Subtyp war der, dem humanen homologe, Ratten-SSTR2-Rezeptor. Der agonistische Ligand zu dem SSTR2 ist das Peptidhormon Somatostatin S14, welches von Brazeau et al. aus 500000 Schafs-Hypothalimi isoliert wurde.[147] S14 ist ein disulfidverbrücktes 14-meres Peptid (Abb. 29) mit inhibitorischer Wirkung bzgl. der Sekretion von Hormonen, wie etwa dem Wachstumshormon der Hypophyse, Glukagon und Insulin.

Abb. 29: Primärstruktur von S14 und dem Derivat Sandostatin ® . Im Gegensatz zu S14 enthält Sandostatin ® D-Aminosäuren und trägt C-terminal einen Alkohol. Die Schlüsselpositionen für die Aktivität von S14 sind rot hervorgehoben.

Im Gegensatz zu Bindungsstudien handelt es sich bei dem Agardiffusions-Assay um ein funktionelles Assay, in dem die Testsubstanzen in gelöster Form eingesetzt werden und ggf. [Seite 112↓]zu einer Vermehrung der Hefezellen führen. Die Hefe tragen den rSSTR2-Rezeptor, so dass bei Zugabe des Agonisten S14 eine Signalkaskade aktiviert wird, was nicht nur zu einer Vermehrung der Hefe führt, sondern es auch zu einer Bildung von LacZ kommt (Abb. 30a). Die Expression von LacZ konnte, durch die Zugabe von 5-Chlor-4-Brom-3-indolyl-β-D-galactosid (X-GAL) ins Medium, das zu einem Indigoderivat umgesetzt wird, über eine Blaufärbung sichtbar gemacht werden. Der Radius der Blaufärbung sowie deren Intensität ist proportional zu der Menge an zugegebenen Agonist S14 (Abb. 30b).

Abb. 30: Prinzip des Assays; a) Zugabe von S14 zur modifizierten Hefe löst eine Signalkaskade aus und LacZ wird gebildet, das im Nähragar mit X-Gal durch eine Blaufärbung nachgewiesen wird. Die Menge an zugegebenen S14 ist proportional zum Radius der Blaufärbung (b).

Die Sensitivität des Assays zeigt, dass noch 20 pmol von S14 eine ausreichende Expression von LacZ bewirken, um ein deutliches Signal zu erhalten. Da ein SPOT ca. 10-50 nmol an gewünschtem Syntheseprodukt enthält, sollten selbst schwache Agonisten mit einem Tausenstel der Aktivität von S14 noch detektierbar sein. Zur Durchführung des Screenings wurden flache Schalen mit einem Gemisch aus modifizierten Hefen, Nähragar und X-Gal beschichtet. Anschliessend wurden die SPOTs mit den adhäsiv gebundenen Testsubstanzen aufgelegt. Nach drei Tagen bei 37°C zeigten gewachsene Hefekolonien und eine Blaufärbung die agonistische Aktivität einiger Verbindungen an (Abb. 31).

Abb. 31: Durchführung des Agardiffusions-Assays mit ausgestanzten SPOTs und Auswertung nach drei Tagen.


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S14 besitzt nur eine sehr gering Stabilität im humanen Serum, und kann daher weder zu Therapie- noch zu Diagnostikzwecken eingesetzt werden.[148] Das Analogon Octreotid (Sandostatin®; Abb. 29) wird aufgrund der biologischen Verfügbarkeit und Stabilität im Blutkreislauf[149] sowohl zur Diagnostik[74, 150] als auch in besonderen Fällen zur Tumorbekämpfung[151] eingesetzt. Die weiten Indikationsbereiche von Somatostatin-Analoga waren und sind Anlass zur Entwicklung immer neuer Verbindungen mit verbesserter Serumstabilität, Rezeptorspezifität oder sogar oraler Verfügbarkeit.[73, 152-159]

Eine Disulfidbindung stabilisiert zwar einige Konformationen im S14, jedoch ist sie nicht vollständig serumstabil. Ein Ansatz zur Modifikation des S14 hinsichtlich besserer Serumstabilität ist der Austausch der Disulfidbrücke gegen andere Strukturelemente wie z.B. Lanthionine[156] oder Amid-Gruppen.[152]

Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob der Austausch der Disulfidbrücke gegen eine 2,4-Diamino-[1,3,5]-triazineinheit (Abb. 32) eine weitere Methode zur Darstellung von biologisch aktiven S14–Analoga bietet.

Abb. 32: Austausch der Disulfidbrücke im S14 gegen eine 2,4-Diamino-[1,3,5]- triazineinheit.

Zusätzlich zu der Stabilisierung, die durch den Ersatz der Disulfidbrücke durch ein heteroaromatisches System erreicht wird, eröffnet sich eine weitere Möglichkeit. Das nach erfolgtem Ringschluss verbleibende Chloratoms am [1,3,5]-Triazinring kann gegen spezielle Reste (Z in Abb. 32) ausgetauscht werden, um so eventuell eine höhere Aktivität zu generieren oder eine Rezeptorspezifität für den SSTR2 zu erreichen.

Im Gegensatz zu der de novo Bibliothek im Fall von TAB-2, sollte hier ein bekanntes Peptid in ein Peptidmimetikum mit ähnlicher Aktivität transformiert werden. Im Rahmen der Transformation wurde das C-terminale Cystein gegen ein Lysin mit Mtt-Schutzgruppe an der ε-Aminogruppe ausgetauscht. Um Nebenreaktionen mit der freien Mercaptogruppe des zweiten Cysteins zu vermeiden, wurde dieses durch eine Aminosäure mit ähnlicher Raumerfüllung (Aminobuttersäure; Abu) ersetzt. Der Einfluss der [1,3,5]-Triazineinheit auf die biologische Wirkung der S14-Derivate war nicht bekannt, deswegen wurden zur Kontrolle nicht nur die cyclischen Verbindungen (Abb. 33 C) synthetisiert, sondern auch die lineare Sequenz mit acetyliertem N-Terminus (Abb. 33 A) und mit einem Triazinylrest am N-Terminus (Abb. 33 B). Als Linker wurde der Ester-Linker gewählt, da so grössere Substanzmengen pro SPOT erreichbar sind als beispielsweise mit dem Photolinker.


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Abb. 33: Ansatz zur Transformation von S14 und zusätzliche lineare Kontrollen A und B der cyclischen Verbindungen C für das Assay.

Neben dem Austausch der Disulfidbrücke sollte ferner die Ursprungspeptidsequenz systematisch verkürzt werden. Durch eine schrittweise Verkürzung können wichtige Schlüsselpositionen in der Sequenz detektiert werden, da nach deren Entfernen der entsprechenden Aminosäure(n) die agonistische Wirkung der Verbindungen im Screening verloren geht. Eine solche Verkürzung kann auf viele verschiedene Arten erfolgen: Entfernen einzelner oder mehrerer Aminosäuren vom N- oder C-Terminus, gleichzeitige Verkürzungen vom Kopf und Ende sowie aus der Mitte, um nur einige Beispiele zu nennen. Hier wurde die getrennte Verkürzung der Ausgangssequenz vom C- und vom N-Terminus gewählt. Die verkürzten Sequenzen sind in Tabelle 39 zusammengestellt. Dabei entspricht die Sequenz mit den Nummern 1-12 der Ursprungssequenz, die ersten 11 Sequenzen der Verkürzungen von N-Terminus und die Nummern 13-23 der Verkürzungen von C-Terminus, wobei das C-terminale Lysin jedoch als Cyclisierungsanker konstant gehalten wurde.

Tabelle 39: Peptidsequenzen für den ersten Transformationsschritt von S14.

K* = Lys (Mtt)

Die Synthese der maximal 14-meren Peptide erfolgte in drei Replika auf einer Zellulosemembran. Neben den beiden linearen Verbindungen (vgl. Abb. 33 A und B) wurden an der planaren Oberfläche die cyclischen Peptidmimetika (Abb. 33 C) dargestellt, wobei von einigen ausgewählten Verbindungen eine zusätzliche Kopie für die Analytik synthetisiert wurde. Die Synthese der Peptidsequenzen erfolgte an einem Glycin-Esterlinker mit den jeweiligen Pentafluorphenylester der Aminosäuren. Zur Gasphasen-Abspaltung der Verbindungen von der Zellulose wurde Methylamin verwendet, da es parallel zur Ester-spaltung im Verlauf von 14 Stunden in der Lage ist alle an den [1,3,5]-Triazinderivaten verbliebenen Chloratome zu substituieren (vgl. Kapitel 2.2.1). Anhaftendes überschüssiges Amin wurde anschliessend im Vakuum entfernt und die ausgestanzten SPOTs auf das Agar-Hefezellen-Gemisch gelegt (Abb. 34). Die Nummern 1 bis 12 und 13 bis 23 über den Spalten der SPOTs entsprechen den Sequenznummern in Tabelle 39. Die Zeilen A repräsentieren die linearen Peptide mit acetyliertem N-Terminus, B enthalten SPOTs mit linearen Peptide-Triazinderivaten und C die SPOTs mit den cyclischen Peptidmimetika. Als Positivkontrolle des Testsystems wurden mit S14 getränkte SPOTs verwendet.


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Abb. 34: Ergebnis des ersten Screenings mit cyclischen Peptid-Triazinderivaten; eine Blaufärbung zeigt aktive Verbindungen auf den SPOTs an.

Nach drei Tagen bei 37°C zeigten sich erste Resultate (Abb. 34). Insgesamt wiesen elf Verbindungen der SPOTs eine agonistische Aktivität zu dem rSSTR2-Rezeptor auf, wobei einige Sequenzen sowohl die linearen als auch die cyclischen Derivate biologisch aktiv waren. Für die nachfolgende Untersuchung zur weiteren Verkürzung der Peptidsequenz wurden zwei SPOTs ausgewählt; 1-10C (cyclo-AbuKNFFWKTFTSK*G; Abb. 34 dritte Zeile, dritter SPOT von links) und 1-13C (cyclo-AGAbuKNFFWKTFTK*G; Abb. 34 sechste Zeile, erster SPOT von rechts). Zwar zeigte 1-9C ebenfalls eine agonistische Wirkung im Assay, jedoch war hier auch die lineare, acetylierte Verbindung 1-9A aktiv. Es bestand die Möglichkeit, dass die beobachtete agonistische Aktivität auf Spuren einer Verunreinigung durch das lineare Peptid beruht. Die Verkürzung der beiden Peptid-sequenzen erfolgte in nächsten Schritt von der jeweils entgegengesetzten Seite; die Sequenz von 1-10C wurde vom C-Terminus, die von 1-13C vom N-Terminus verkürzt (Tabelle 40). Als Kontrolle der vorangegangenen Ergebnisse wurde 1-10C und 1-13C erneut synthetisiert und getestet (vgl. 2-10 und 2-11 ).

Tabelle 40: Peptidsequenzen für den zweiten Transformationsschritt von S14.

K* = Lys(Mtt)

Die Durchführung der Synthesen und des Screenings erfolgte in Analogie zum ersten Transformationsschritt. Hierbei konnten im Assay die cyclischen Triazinderivate mit den Peptidsequenzen AbuKNFFWKTFKG (2-8C) und NFFWKTFTKG (2-15C) als kleinste Agonisten detektiert werden. Die kürzere der beiden Sequenzen (2-15C) wurde gewählt, um eine weitere Verkleinerung des Peptidmimetikums zu untersuchen.

Nach der Verkürzungen der Sequenz vom N- und C-Terminus folgte in dem dritten Transformationsschritt ein systematisches Entfernen jeweils einer Aminosäure in der verbliebenen Sequenz 2-15. Die Synthese erfolgte unter den selben Bedingungen wie zuvor. Die Ausgangssequenz 2-15 wurde als Kontrolle erneut synthetisiert und getestet. Die Sequenzen sind in Tabelle 41 gezeigt.

Tabelle 41: Peptidsequenzen für den dritten Transformationsschritt von S14.

K* = Lys(Mtt)


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Das Screening der Verbindungen zeigte eine deutliche agonistische Aktivität der cyclischen Verbindungen 3-1C und 3-2C. Aus diesem Ergebnis lässt sich ableiten, dass aus der Mitte und vom N-Terminus der Sequenz keine Aminosäuren entfernt werden können, ohne dass die Aktivität im Screening-Assay verloren geht. Dieses Resultat steht im Einklang mit Literaturdaten, über die Beschreibung der Schlüsselpositionen (speziell die Aminosäuren F-W-K-T-F) im S14.[73, 146, 155, 160] Dennoch besteht die Möglichkeit, dass sich aus der kürzesten Sequenz 3-2 eine oder sogar mehrere Aminosäuren entfernen lassen, ohne dass die biologische Aktivität vollständig verloren geht. Eine weitere Verkürzung der Sequenz 3-2 wurde in dem vierten Transformationsschritt durchgeführt (Tabelle 42).

Tabelle 42: Peptidsequenzen für den vierten Transformationsschritt von S14.

K* = Lys(Mtt)

Die Sequenzen wurden, wie in den vorangegangenen Untersuchungen auf einer Zellulosemembran am Glycin-Esterlinker in drei Replika synthetisiert. Die linearen Ver-bindungen ohne (A) und mit N-terminalem Triazinring B, als auch die cyclischen Peptid-mimetika wurden im Assay getestet. Zur Kontrolle der Synthesequalität wurden erneut von einigen Sequenzen Replika für analytische Zwecke angefertigt. Die Ergebnisse des Assays zeigten, dass lediglich die cyclische Verbindung 4-1C, die aus dem vorangegangenen Test (vgl. 3-2C) ausgewählt wurde, agonistische Aktivität besass (Abb. 35).


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Abb. 35: Screening der Substanzen nach der letzten Verkürzung der Peptidsequenz. Nur die cyclische „Ausgangssequenz“ zeigte, neben den Kontrollen, eine agonistische Aktivität.

Die Aktivitätsabnahme war nicht auf geringere Substanzmengen bzw. Reinheit zurück-zuführen. So waren Menge und Reinheit von 4-1C und z.B. 4-4C auf den jeweiligen SPOTs nahezu gleich, wie eine HPLC-MS Analytik der zusätzlichen Replika zeigte (Abb. 36).

Abb. 36: HPLC-MS Analytik von 4-1C (a) und 4-4C (b); gezeigt sind die UV-Spur bei 220 nm (oben) und der entsprechende Massenbereich der Zielverbindung (unten).

Das Ergebnis des Screenings bzgl. der Aktivität von z.B. 4-4C stimmt mit den bekannten Schlüsselpositionen für biologische Aktivität im S14 überein.[146, 148, 155, 160] Als Vergleich sind die bekannten Schlüsselpositionen des S14 (vgl. Abb. 29) in dem hier gefundenen kleinsten aktiven Cyclus dargestellt (Abb. 37).


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Abb. 37: Kleinster aktiver SSTR2-Agonist 4-1C aus der Transformation von S14. Die im S14 bekannten Schlüsselpositionen sind gelb hervorgehoben.

Insgesamt konnte durch Austausch der Disulfidbrücke und sukzessive Verkürzung der Peptidsequenz das 14-mere Peptid S14 mit einem Molekulargewicht von 1635 g/mol in das 9-mere Peptidmimetikum 4-1C mit einem Molgewicht von 1293 g/mol systematisch transformiert werden. Das Molekulargewicht von 4-1C liegt zwar nicht im optimalen Bereich für pharmakologische Wirkstoffe (< 650 g/mol),[55, 67] aber durch den Ersatz der Disulfidbindung gegen den [1,3,5]-Triazinring besteht die Möglichkeit einer erhöhten Proteolysestabilität.

Im Rahmen dieser Arbeit ist eine vollständige Transformation vom agonistischen Peptid S14 in eine potentielle Leitstruktur nicht möglich. Die Screeningergebnisse zeigten jedoch eine signifikante Aktivität der Verbindung 4-1C. Durch Variation der Reste am [1,3,5]-Triazinring nach erfolgtem Ringschluss und Austausch einzelner Aminosäurebausteine z. B. gegen Peptoidbausteine besteht die Aussicht die Aktivität dieser Verbindung zu steigern. Somit könnte die Verbindung 4-1C als neuer Ansatzpunkt für die Entwicklung von Leitstrukturen für die Findung neuer SSTR2-Agonisten betrachtet werden.


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09.11.2004