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Zusammenfassung und Ausblick

Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, das Anwendungsgebiet der SPOT-Synthese von Peptiden auf [1,3,5]-Triazine auszudehnen und diese in biologischen Tests zu untersuchen. Es ist gelungen, mit einer funktionalisierten PP-Membran eine weitere planare Oberfläche für die SPOT-Synthese nutzbar zu machen, und diese neben einer derivatisierten Zellulosemembran für die Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken mit anschliessendem Festphasen-Screening einzusetzen. Die Etablierung geeigneter Linker-systeme ermöglichte die Erarbeitung und Optimierung von Synthesebedingungen für die Zielbibliotheken an planaren Oberflächen. Es gelang Bedingungen für eine Immobilisierung von Cyanurchlorid an Aminogruppen der Linker, Peptide, Peptomeren oder Peptoiden zu finden. Die gewünschten Bibliotheken waren sowohl durch intermolekulare Reaktion von immobilisierten 4,6-Dichlor-[1,3,5]-triazinen mit Aminen oder Phenolaten als auch durch intramolekulare Reaktion mit weiteren Aminogruppen in dem jeweiligen Oligomer zugänglich. Die mittels SPOT-Synthese erhaltenen Triazinderivate lieferten sowohl im Festphasen-Screening als auch im Screening in Lösung neue, biologisch aktive Substanzen.

Die Ergebnisse des schrittweisen Vorgehens sind nachfolgend aufgeführt:

(1) Membranderivatisierung und Linkersysteme

Zellulosemembranen erwiesen sich bereits als gut geeignete Träger für die SPOT-Synthese von Peptiden. Bei einer Erweiterung des Repertoires an Verbindungen, die mittels SPOT-Synthese zugänglich sind, können die Hydroxylgruppen der Zellulose die Möglichkeiten der durchführbaren Syntheseoperationen jedoch einschränken. Um diese etwaige Limitation durch die Beschaffenheit der Oberfläche zu vermeiden wurden bereitgestellte acrylsäure- und acrylsäuremethylesterfunktionalisierte PP-Membranen im Rahmen dieser Arbeit für die SPOT-Synthese derivatisiert. Es konnte eine Aminofunktionalisierung der PP-Membran erreicht werden, die die Anforderungen der SPOT-Synthese hinsichtlich Derivatisierungs-grad und Homogenität erfüllt. Dies gelang durch Umsatz der carbonsäurefunktionalisierten Membran 28 mit Phosphorpentachlorid zum entsprechenden Säurechlorid und anschliessender Reaktion mit 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin 26. Die carbonsäure-methylesterfunktionalisierte Membran 29 konnte direkt durch Umsatz mit 26 in die entsprechende aminoderivatisierte Membran 32 überführt werden (Schema 45).

Schema 45: Aminoderivatisierung der PP-Membranen.

Neben den bereits an der Zellulosemembran verwendeten Photo- 51 und Rink-Linker- 37 Derivatisierungen konnten mit dem Carbamatlinker 41 derivatisierte PP-Membranen für eine Erhöhung der Diversität der [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken eingesetzt werden.


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(2) Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intermolekulare S N Ar am Cyanurchlorid unter SPOT-Bedingungen

An die Derivatisierung der PP-Membran und der Anbringung unterschiedlicher Linkersysteme schloss sich die Immobilisierung des Cyanurchlorids an. Dies gelang durch die Inkubation der planaren Oberflächen in einer 2 M Lösung von Cyanurchlorid in DCM, wobei im Fall der PP-Membran ein Zusatz von 10 % DIEA (v/v) notwendig war. Hierbei zeigte sich, dass die Art der Aminoderivatisierung, also ob es sich um die Aminogruppe eines Linkers, einer Aminosäure oder eines Peptoids handelte, keinen Einfluss auf die Vollständigkeit der Reaktion besass.

Die Kernaufgabe der folgenden Untersuchungen bestand in der Bestimmung der Reaktionszeit, die notwendig war, um selektiv eines der verbliebenen Chloratome durch Nucleophile zu substituieren. Dieses Ziel konnte mit einer Reaktionszeit von 30 min für viele unterschiedliche Amine erreicht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 84 Amine bezüglich dieser Monochlorsubstitution unter SPOT-Synthese-Bedingungen an den Modellen 60 bzw. 66 untersucht, wobei 70 Amine einen Umsatz von mindestens 80 % zeigten. Zwischen den beiden planaren Oberflächen zeigten sich lediglich geringe Unterschiede bzgl. Umsatz und Reinheit der Verbindungen zu Gunsten der PP-Membran.

Bei Untersuchungen zur Substitution an Dichlor-[1,3,5]-triazinderivaten durch O-Nucleophile zeigte lediglich die Gruppe der Phenolate ausreichende Umsätze. Bei den zwölf verwendeten Phenolaten kam es bei fünf Derivaten an der PP-Membran zu Umsätzen von mindestens 80 %. An der Zellulosemembran zeigte lediglich Phenol 80 % Umsatz, alle anderen Tests verliefen mit geringeren Umsätzen.

Für die Substitution des letzten Chloratoms am [1,3,5]-Triazinring konnte Mikrowellen-bestrahlung als Energiequelle erfolgreich eingesetzt werden. Diese Art des Energietransfers zeigte sich für die SPOT-Synthese als gut geeignet. So konnten bei 38 der 46 untersuchten Amine Umsätze von ≥ 80 % erreicht werden. Einen signifikanten Unterschied zwischen der Zellulose- und der PP-Membran gab es bei den Aminen nicht. Mit Hilfe der Mikrowellenbestrahlung gelang es bei sechs der Phenolate an der Zellulose und zehn der insgesamt zwölf Phenolate an der PP-Membran Umsätze von ≥ 80 % zu erzielen und so Reaktivitätsunterschiede an den planaren Oberflächen anzugleichen.

Mit Hilfe der im Anschluss durchgeführten Synthesen von Peptomer-Triazin- und Peptid-Triazin-Bibliotheken konnte eine Automatisierbarkeit der Darstellungen demonstriert werden. Für die Synthese von diversen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken steht somit ein modulares System zur Verfügung bei dem verschiedene Bausteine miteinander kombiniert werden können (Abb. 38).


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Abb. 38: Modulares System bei der Synthese von diversen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken.

(3) Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intramolekulare S N Ar an 2,4-Dichlor-[1,3,5]-triazinderivaten unter SPOT-Bedingungen

Nach den erfolgreichen Synthesen der [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intermolekulare Substitution konnte der Anwendungsbereich von Cyanurchlorid für die Synthesen cyclischer Peptidmimetika erweitert werden. Es gelang, die jeweiligen linearen Oligomere mit mindestens zwei Aminogruppen, durch schrittweise Substitution der Chloratome am Cyanurchlorid zu cyclisieren.

Als Modellpeptid wurde das Dekapeptid GAFGAFGAFK gewählt, Cyanurchlorid am N-Terminus immobilisiert und nach Entschützung die Aminogruppe der Lysinseitenkette für die Substitution des nächsten Chloratoms am Dichlor-[1,3,5]-triazinrest eingesetzt. Es wurden unterschiedliche Ringgrössen durch einen Lysin-Scan und durch die schrittweise Verkürzung der Peptidsequenz beginnend vom N-Terminus synthetisiert. Hierbei wurde gefunden, dass sich Makrocyclen mit einer Grösse von 13 bis 37 Ringatomen in sehr guten Reinheiten erhalten lassen. Mittels Einbau von nicht-natürlichen Aminosäuren mit ver-kürzter Alkylkette an der Aminoseitengruppe konnte eine minimal erreichbare Ringgrösse von elf Atomen bestimmt werden. Untersuchungen zur Kompatibilität der Cyclisierungs-methode mit den proteinogenen Aminosäuren an den Modellen Ala-Xxx-Lys und Xxx-Phe-Lys ergaben, dass die 19 verwendeten Aminosäuren sich erfolgreich in der Cyclisierung vom jeweiligen N-Terminus zur Seitenkette des Lysins einsetzen liessen. Der Ringschluss durch nucleophile Substitution kann jedoch auch im Sinne einer „Seitenkette-zu-Seitenkette“-Cyclisierung erfolgen, falls das Cyanurchlorid nicht am N-Terminus, sondern an einer Lysinseitenkette immobilisiert wurde. Dies konnte anhand der Peptide Ac-Lys-Lys, Ac-Lys-Phe-Lys und Ac-Lys-Ala-Phe-Lys gezeigt werden. Die nach der Cyclisierung verbliebenen Chloratome am Triazinring konnten in Analogie zu den „linearen“ Derivaten durch verschiedene Nucleophile unter Mikrowellenbestrahlung substituiert werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden ferner Peptomere und Peptoide als lineare Vorläufer für die Cyclisierung eingesetzt. Im Fall des Peptomere wurden C-terminal Peptoidbausteine mit unterschiedlich langer Aminoalkylkette eingesetzt und gefunden, dass auch hier die kleinste erreichbare Ringgrösse elf Atome umfasste. Bei den trimeren Peptoiden wurde der N-terminale Baustein variiert und in allen untersuchten Fällen sehr gute Umsätze bei der [Seite 124↓]Cyclisierung beobachtet. Diese Ergebnisse deuten auf eine allgemeine Anwendbarkeit der Cyclisierungsmethode unabhängig von der Art oder Sequenz der linearen Oligomere hin, vorausgesetzt eine minimale Ringgrösse von elf Atomen wird nicht unterschritten.

Zusätzlich zum Cyanurchlorid konnten 2,4,6-Trichlorpyrimidin, 4,6-Dichlor-5-nitro-pyrimidin und 2,6,8-Trichlor-7-methyl-7H-purin unter Bedingungen, die mit der SPOT-Synthese kompatibel sind, an dem N-Terminus eines Modellpeptides immobilisiert werden. Ferner gelang es in allen Fällen eine intramolekulare nucleophile Substitution verbleibender Chloratome am Stickstoff-Heterocyclus durch eine Aminogruppe durchzuführen, um eine prinzipielle Anwendbarkeit zur Cyclisierung von Oligomeren durch halogenierte Heteroaromaten zu demonstrieren.

Schema 46: Variabilität in der neuen Cyclisierungsmethode; es können unterschiedliche Oligomere mit verschiedenen halogenierten Stickstoff-Aromaten umgesetzt werden.

(4) Untersuchung der [1,3,5]-Triazin–Bibliotheken in verschiedenen Assayformaten

An einer aminoderivatisierten Zellulosemembran wurde eine Dipeptid-Triazin-Bibliothek bestehend aus 8000 Einzelverbindungen synthetisiert. Die Bibliothek beinhaltete alle möglichen 400 proteinogenen Dipeptide mit einem [1,3,5]-Trazinrest am N-Terminus. Um zu überprüfen, ob sich die auf diesem Weg Proteinliganden auffinden lassen, wurden die Verbindungen auf Bindung zum monoklonalen Antikörper TAB-2 untersucht. Aus den als bindend identifizierten Triazinderivaten wurden fünf ausgewählt und am Syntheseharz resynthetisiert. In kompetetitiven ELISA-Experimenten konnte gezeigt werden, dass drei von diesen Verbindungen am Paratop des Antikörpers binden. Die Ergebnisse des Screenings an der Zellulosemembran konnten an der PP-Membran zum grössten Teil bestätigt werden. Zusätzlich wurde ein weiteres phenolatsubstituiertes Triazinderivat A9 mit höherer Bindungsaffinität (90 ± 10 [µmol]) identifiziert. Somit konnte gezeigt werden, dass auch die PP-Membran für das Festphasen-Screening mit markierten Proteinen und immobilisierten kleinen Verbindungen verwendet werden kann.

Der Einsatz in der neuen Cyclisierungsmethode konnte erfolgreich in der begonnenen Transformation des agonistischen Peptides S14 demonstriert werden. Hierbei wurde (unter anderem) die unter physiologischen Bedingungen instabile Disulfidgruppe des nativen Peptides gegen eine [1,3,5]-Triazineinheit ausgetauscht. Eine schrittweise Verkürzung der Peptidsequenz lieferte ein neun Aminosäuren enthaltenes Peptidmimetikum mit [Seite 125↓]agonistischer Aktivität (Abb. 39). Diese Verbindung kann durch Austausch der Amino-säuren im Peptidteil oder Substitution des an der Cyclisierung nicht beteiligten Chloratome durch geeignete Amine oder Phenolate vermutlich bzgl. ihres pharmazeutischen Profils optimiert werden.

Abb. 39: Kleinster im Verlauf dieser Arbeit gefundener SSTR2-Agonist 4-1C.

Ausblick

Mit den Synthesen der [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken auf Zellulose- und PP-Membranen konnte gezeigt werden, dass die SPOT-Synthese auch zur Darstellung von kleinen heterocyclischen Verbindungen geeignet ist. Der Einsatz der membrangebundenen Triazinderivate im Festphasen-Screening zum mAk TAB-2 zeigte ferner, dass die so erhaltenden Verbindungen geeignet sind, um biologisch aktive kleine organische Moleküle de novo zu identifizieren. Hieraus ergeben sich neue Möglichkeiten der parallelen Synthese und des raschen Screenings von vielen tausenden Verbindungen. Es gilt nun, nach dem 2,4,6-Trichlor-[1,3,5]-triazin, weitere Template für die Synthese von heterocyclischen Substanzbibliotheken auf planaren Oberflächen zu finden. Hierbei bieten sich die halogenierten Heteroaromaten, die bereits für die Cyclisierung von Peptiden eingesetzt wurden, an. Bindungsstudien der bereits synthetisierten [1,3,5]-Triazin-Bibliothek (oder solche die weiterer Template enthalten) mit anderen Antikörpern oder allgemein Proteinen könnten für die Findung neuer Verbindungen mit pharmakologisch interessanten Eigenschaften genutzt werden.

Die hier entwickelte Cyclisierungsmethode kann an weiteren Oligomeren wie z.B. Oligocarbamaten oder –harnstoffen untersucht werden, wobei auch zusätzliche halogenierte Heterocyclen getestet werden können.

Die Transformation des Peptides S14 in das cyclische Peptidmimetikum 4-1C kann durch den Austausch der Aminosäuren gegen z.B. Peptoide fortgeführt werden. Durch die Synthese der Peptidsequenzen am Photo-Linker kann der Einfluss des C-terminalen Glycins für die biologische Aktivität untersucht werden und so ggf. eine weitere Verkleinerung des Agonisten erreicht werden. Der Einsatz verschiedener Amine oder Phenolate zur Substitution des nach der Cyclisierung verbleibenden Chloratomes kann ebenso in die Untersuchungen mit einbezogen werden, wie die Verwendung anderer halogenierter Heteroaromaten. Interessant ist auch die Frage, ob die Methode der Cyclisierung bei weiteren biologisch aktiven (Cyclo-)Peptiden eingesetzt werden kann, um eine strukturelle und pharmakologische Stabilisierung zu erreichen.


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09.11.2004