[Seite 126↓]

Experimentelle Bedingungen und Durchführung

6.1 Allgemeines

Lösungsmittel

Alle verwendeten Lösungsmittel wurden in der angegebenen Qualität ohne weitere Reinigung eingesetzt:

Acetonitril (Gradient grade, J.T. Baker); Dichlormethan (zur Synthese, Merck Eurolab); Diethylether (zur Synthese, Merck Eurolab); N,N-Dimethylformamid (LAB, Merck Eurolab); Dioxan (zur Synthese, Aldrich); Methanol (zur Synthese, Merck Eurolab).

Wasser wurde unter Verwendung einer Vollentsalzungsanlage (Milli-Q Plus, Millipore) entmineralisiert.

Die Lösungsmittel für Reagenzien, die zur SPOT-Synthese verwendet wurden, wurden über Molsieb gelagert: N‑Methylpyrrolidon und Dimethylsulfoxid (beide: Fluka).

Reagenzien

Die verwendeten Reagenzien wurden von den Firmen Advanced ChemTech (Bamberg, Deutschland), Sigma-Aldrich-Fluka (Deisenhofen, Deutschland), Bachem (Heidelberg, Deutschland), J.T. Baker (Phillipsburg, USA), Lancaster (Mühlheim/Main, Deutschland), Merck Eurolab (Darmstadt, Deutschland), Neosystem (Strassburg, Frankreich) oder Novabiochem (Bad Soden, Deutschland) bezogen und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Das TentaGel-S-RAM-Harz wurde bei der Firma RAPP Polymere (Tübingen, Deutschland) bezogen.

Zur SPOT-Synthese wurden Whatman 50 Zellulosemembranen (Whatman Maidstone, UK) verwendet, die auf die benötigte Grösse zurechtgeschnitten wurden. Die PP-Membranen wurden carbonsäure- und carbonsäuremethylestermodifiziert von PolyAn GmbH (Berlin, Deutschland) erhalten.

Bei den Konzentrationen der Reagenzien in Prozent handelt es sich, wenn nicht anders angegebenen, um Volumenprozent (v/v).

RP-HPLC (präparativ) erfolgte mit einem System der Firma Merck/Hitachi (Quaternäre Pumpe L-6250, Variabler UV-Detektor L-7400, Interface D-7000, Software: HPLC Systemmanager D-7000 für NT 4.0) unter Verwendung einer Säule der Firma Merck Eurolab (LiChrospher 100, RP18, 10 x 250 mm) bei einem Lösungsmittelfluss von 6,0 ml/min; Die Laufmittel-Gradienten wurden aus einem analytischen Probe-Chromatogramm abgeleitet. Das verwendete Lösungsmittelsystem setzte sich aus den Komponenten A (H2O/0,1 % TFA) und B (CH3CN/0,1 % TFA) zusammen.

RP-HPLC-MS-Analysen wurden durch Chromatographie unter Verwendung eines Hewlett Packard Serie 1100-Systems (Entgaser G1322A, Quaternäre Pumpe G1311A, Automatischer Probengeber G1313A, thermostatiertes Säulenfach G 1316A, Variabler UV-Detektor G1314A) und gekoppelter ESI-MS (Finnigan LCQ Ion-Trap-Massenspektrometer) durchgeführt. Dazu wurde eine Steuersoftware der Firma Finnigan verwendet (Navigator Ver 1.1 sp1). Als Stossgas in der Ionenfalle diente Helium. Die Trennung erfolgte an RP-18-Säulenmaterial (Vydac 218 TP5215, 2,1 x 150 mm, 5 µm, C18, 300 A mit Vorsäule (Merk)) bei 30°C und einem Fluss von 0,3 ml/min unter Anwendung eines linearen [Seite 127↓]Gradienten für alle Chromatogramme (5‑95 % B innerhalb von 25 min, wobei A: 0,05 % TFA in Wasser und B: 0,05 % TFA in CH3CN). Die UV-Detektion erfolgte bei λ = 220 nm. Retentionszeiten (Rt) sind im Dezimalsystem angegeben (z.B. 1,9 min = 1 min 54 sec) und beziehen sich auf die Detektion im Massenspektrometer. Die Totzeit zwischen Injektion und UV-Detektion (HPLC) betrug 1,65 min, zwischen UV-Detektion und Massendetektion 0,21 min. Es wurden zwei MS-Methoden zur Identifizierung der Syntheseprodukte innerhalb eines Laufes verwendet. Bei erwarteten Massen unter 1000 erfolgte die Massenanalyse mittels einer Abfolge verschiedener Spektren-Typen: (a) Standardspektren in den Massenbereichen 50-2000 und 50-1000, (b) MS2-Spektrum des intensivsten Iones im Bereich 50-1000 mit einer Kollisionsenergie von 24 % und (c) Collision-Induced-Dissociation-(CID-)Spektren im Bereich 50-900 bei 35 % Kollisionsenergie. Für Produkte mit einer Masse 1000 ≤ M bzw. bei Auffälligkeiten im 50-2000 Segment vorangegangener HPLC-MS-Läufe wurde die Massenanalyse mittels der Abfolge dieser Spektren-Typen: (a) Standardspektren in den Massenbereichen 50-2000, (b) MS2-Spektren der intensivsten Ionen im Bereich 50-2000 mit einer Kollisionsenergie von 24 %, (c) erneute MS2-Spektren des intensivsten Ionen vom vorherigen MS2-Spektrum (MS3-Spektren der ursprünglichen Ions aus (a)) mit einer Kollisionsenergie von 24 % und (d) Collision-Induced-Dissociation-(CID-)Spektren im Bereich 50-2000 bei 35 % Kollisionsenergie durchgeführt. Die Zuordnung der Reaktionsprodukte zu den Signalen des UV-Detektors der HPLC wurde durch Anwendung von Massenfiltern für die gesuchte(n) Masse(n) durchgeführt. Die theoretischen Massen sind mit den exakten Massen der Hauptisotope berechnet. Die angegebenen Werte beschreiben die beobachtete Masse m/z, wobei im Massenbereich m/z < 1000 gewöhnlich das M+H+ bzw. M+Na+-Ion die intensivsten Signale ergeben. Die Beschreibung der Massenspektren wurde auf Signale mit einer Intensität > 15 % sowie auf charakteristische Signale > 5 % beschränkt (die Signal­intensität in % ist in Klammern angegeben). Die Genauigkeit des Massenspektrometers beträgt ca. ± 0,2.

Hochaufgelösete Massenspektren (HRMS) wurden an einem MAT 95ST (Trap) mit einer „CS-gun“ und an einem Micromass Autospec mittels LSIMS-FAB Technik direkt von den auf Zellulosemembran synthetisierten Verbindungen erhalten.

Kernspinresonanz-(NMR-)Spektren wurden an den Geräten Varian Unity-plus 300 und Unity-plus 500 aufgenommen. Als interner Standard diente in 1H-NMR-Spektren Tetramethylsilan (δH = 0,00 ppm) oder Signale der Restprotonen aus CDCl3H = 7,24 ppm) oder [D6]-DMSO (δH = 2,50 ppm). Die 13C-NMR-Spektren wurden breitband-entkoppelt und, wenn nicht anders angegeben, mittels internem Standard referenziert (CDCl3: δC = 77,0 ppm, [D6]‑DMSO: δC = 39,4 ppm). Alle Verschiebungen (δ) sind in ppm, alle Kopplungskonstanten (J) in Hz angegeben. Bei den Kopplungen handelt es sich, wenn nicht anders angegeben, um H,H-Kopplungen. Alle Spektren wurden bei 25°C aufgenommen.

SPOT-Synthese

Die automatische SPOT-Synthese erfolgte mit dem Gerät Autospot Robot AMS 222 (Abimed, Langenfeld, Deutschland) unter Anwendung der Steuersoftware Autospot XL Ver. 2.02. Die benötigten Steuerdateien, in denen Ort und Sequenzen der SPOTs festgelegt wurden, wurden mit den Programmen LISA und DIGEN (beide: Jerini Bio Tools GmbH, Berlin, Deutschland) angefertigt. Die Waschschritte erfolgten in Edelstahlschalen (Merck Eurolab), die auf einem Wipptisch (Labortechnik Fröbel, Lindau/Bodensee, Deutschland) bewegt wurden. Für Reaktionen bei erhöhter Temperatur wurde die Membran in einer Edelstahlschale auf einer regelbaren Heizmatte (Merck Eurolab) erwärmt oder in einer mit einem Glasdeckel verschlossenen Glasschale in einem Haushaltsmikrowellenofen bei 810 [Seite 128↓]W Mikrowellenleistung behandelt. Einzelne SPOTs wurden mit einem Bürolocher ausgestanzt und zur Weiterbehandlung in eine Mikrotiterplatte oder 2,0 ml Eppendorf-Reaktionsgefässe überführt. Thermomixer 5437, Zentrifuge 5475C und Vakuumzentrifuge 5301 der Firma Eppendorf wurden zur Behandlung von ausgestanzten SPOTs in Eppendorf-Gefässen verwendet. Zur Beschleunigung des Lösungsvorganges von Reagenzien für die SPOT-Synthese wurde ein Ultraschallbad verwendet (Sonomatic 300 PC). Zur Spaltung des Photolinkers 51 wurde UV-Licht verwendet, welches mit dem Gerät Vilber Lourmat TFX 20 LC (7 mW/cm2 bei 320-390 nm, Bestrahlungsfläche: 20 x 20 cm) erzeugt wurde. Bei der angegebenen UV-Energiedichte handelt es sich um Herstellerangaben.

Bindungsstudien

Der monoklonale Antikörper TAB-2 wurden von Prof. Dr. W. Höhne (Institut für Biochemie, Charité, Humboldt-Universität, Berlin) zur Verfügung gestellt.

Die Bestimmung von Bindung an zellulosegebundenen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken erfolgte mit dem LumiImager™ der Firma Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland), bei der auch die Reagenzien Blocking Reagent und Luminescence Substrate Solution A und B erworben wurden. Die verwendete TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) war 10 mM und auf pH = 8,0 eingestellt. Der anti-Maus IgG Nachweisantikörper wurde von Sigma (Taufkirchen, Deutschland) bezogen.

Agardiffusions-Assay

Die Reporterhefen wurden von der Firma Jerini Bio Tools GmbH zur Verfügung gestellt.

6.2 Synthesen an polymeren Harzkugeln

6.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften

AAV 1: Synthese von Peptiden am Syntheseharz

Fmoc-Rinkamid-Harz (0,41 mmol/g) wird in einen Kunststoffreaktor mit Fritte (10 ml) eingewogen und mit 2,0 ml DMF versetzt. Nach Filtration wird die Fmoc-Gruppe durch Behandlung mit Piperidin (2,0 ml, 20 % in DMF, 1 x 1 min, 1 x 15 min) abgespalten. Im Anschluss wird das Harz mit DMF (3 x 5,0 ml) MeOH (3 x 5,0 ml) und DCM (2 x 5,0 ml) gewaschen.

Beschreibung am Beispiel der Aktivierung von Fmoc‑Gly-OH für 100 mg Harz: Fmoc‑Gly-OH (0,3 mmol) wird in 0,50 ml NMP gelöst und mit DIC (0,15 mmol) versetzt. Nach 30 min wird ggf. gebildeter Niederschlag mittels Zentrifugation abgetrennt. Die so erhaltende Lösung wird zum Harz gegeben. Nach 30 min Reaktionszeit wird das Harz gewaschen (DMF; 3 x 5,0 ml, MeOH; 3 x 5,0 ml, DCM; 2 x 5,0 ml) und durch einen leichten Luftstrom getrocknet. Zur Abspaltung der Fmoc-Gruppe wird wie oben beschrieben verfahren.

[Seite 129↓]AAV 2: Synthese von 2,4,6-Triamino-[1,3,5]-triazine am Syntheseharz

Fmoc-Rinkamid-Harz (0,41 mmol/g) oder Fmoc-Peptid-Rinkamid-Harz wird in einen Kunststoffreaktor mit Fritte (10 ml) eingewogen und mit 2,0 ml DMF versetzt. Nach Fil-tration wird die Fmoc-Gruppe durch Behandlung mit Piperidin (2,0 ml, 20 % in DMF, 1 x 1 min, 1 x 15 min) abgespalten. Im Anschluss wird das Harz gewaschen (DMF; 3 x 5,0 ml, MeOH; 3 x 5,0 ml, DCM; 3 x 5,0 ml) und durch einen leichten Luftstrom getrocknet. Man gibt eine 2 M Lösung von Cyanurchlorid 5 in DCM mit 1 % DIEA zu dem Harz und lässt 30 Minuten reagieren. Der Überschuss an Reagenzlösung wird entfernt, das Harz gewaschen (DCM; 2 x 5 ml; DMF; 2 x 5,0 ml, MeOH; 1 x 5,0 ml, DCM; 3 x 5,0 ml) und durch einen leichten Luftstrom getrocknet. Zur Substitution des zweiten Chloratoms am Dichlor-[1,3,5]-triazinrest wird das Harz mit einer 5 M (bzw. eine gesättigte) Lösung in NMP des entsprechenden Amines für 30 min bei Raumtemperatur versetzt. Anschliessend wird der Amin-Überschuss entfernt, das Harz gewaschen (DMF; 3 x 5,0 ml, MeOH; 3 x 5,0 ml, DCM; 3 x 5,0 ml) und getrocknet. Das verbleibende Chloratom wird durch Tränken des Harzes mit einer 5 M (bzw. eine gesättigte) Lösung in NMP des entsprechenden Amines durch dreiminütige Mikrowellenbestrahlung substituiert, wobei diese Prozedur einmal wiederholt wird. Hierbei ist zu beachten, dass das Harz gerade gut befeuchtet ist, da ein zu grosser Überschuss an Aminlösung in der Mikrowelle explosionsartig verdampfen kann (trotz Harzkügelchen kann es zu Siedeverzügen kommen). Anschliessend wird das Harz intensiv gewaschen (DMF; 5 x 5,0 ml, MeOH; 5 x 5,0 ml, DCM; 5 x 5,0 ml). Zur Abspaltung des Triazins vom Harz und ggf. gleichzeitiger Entfernung von Seitenkettenschutzgruppen wird das Harz mit TFA (95 % TFA in wässrigem DCM, 5,0 ml) versetzt. Nach 20 Minuten wird die Lösung in einen Kolben überführt und das Harz mit TFA (95 % in H2O, 1,0 ml) gewaschen. Es wird Wasser (6,0 ml) zugesetzt und die Lösungsmittel durch Gefriertrocknung entfernt. Das Produkt wird zweimal in 10 ml Acetonitril:Wasser oder Dioxan:Wasser (1:1) aufgenommen und gefriergetrocknet. Man erhält das Produkt als Salz der TFA in Form eines weissen Pulvers.

Das Rohprodukt wird mittels HPLC-MS analysiert und ggf. mittels präp. HPLC gereinigt.

6.2.2 Spezielle Synthesen

6.2.2.1 Modellverbindungen

4,6-Di-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamin 53

53 wurde nach AAV 2 (200 mg Tentagel™ Rinkamid-Harz; 0,41 mmol/g) dargestellt. In Verkürzung der Vorschrift wurde das Dichlor-[1,3,5]-triazin derivatisierte Harz direkt mit einer 5 M Lösung von Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung umgesetzt.

Es wurden 12,3 mg 53 in Form eines weissen Pulvers erhalten.


[Seite 130↓]

53: C13H22N6; Rt = 11,98 min; ber. (M+H+): 263,3 gef.: 263,1 (100)

1 H-NMR (300MHz, CDCl3): δ = 1,48 (m 10H); 1,59 (m 6H); 3,64 (m 4H); 5,18 (s 2H).

13 C-NMR (75,45 MHz, CDCl3): δ = 24,78; 25,77; 44,34; 127,32; 128,60; 131,98.

2-(6-Benzyl-15-chlor-3-methyl-4,7-dioxo-2,5,8,12,14,16,17-heptaaza-bicyclo[11.3.1]heptadeca-1(16),13(17),14-trien-8-yl)-acetamid 130- 8

Die Synthese des trimeren Peptomers erfolgte an 300 mg Tentagel™ Rinkamid-Harz (0,41 mmol/g). Die freie Aminogruppen des Harzes werden mit 4 ml einer 0,4 M Lösung von Bromessigsäureanhydrid in DCM acyliert (2 x 15 min). Das Harz wurde gewaschen (DMF; 3 x 5,0 ml, MeOH; 3 x 5,0 ml, DCM; 3 x 5,0 ml) und für 2 x 30 min mit 4 ml einer 5 M Lösung von Mono-Boc-1,3-diaminopropan versetzt. Nach Waschen des Harzes (DMF; 3 x 5,0 ml, MeOH; 3 x 5,0 ml, DCM; 3 x 5,0 ml) erfolgte die Synthese des Dipeptidteil nach AAV 1. Nach Entfernen der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe mit 20 %-iger Piperidin-Lösung in DMF und Waschen des Harzes (DMF; 3 x 5,0 ml, MeOH; 3 x 5,0 ml, DCM; 3 x 5,0 ml) erfolgte die Immobilisierung durch 30 min Inkubation des Syntheseharzes mit einer 50 %-igen Lösung von Cyanurchlorid in DCM (v/v) mit 1 % DIEA. Die Überschüsse wurden durch Waschen des Harzes (DMF; 3 x 5,0 ml, MeOH; 3 x 5,0 ml, DCM; 3 x 5,0 ml) entfernt. Zur Abspaltung der Verbindung vom Harz und gleichzeitiger Entfernung der Boc-Gruppe an der ε-Gruppe des Lysins wird das Harz mit TFA (95 % TFA in wässrigem DCM, 5,0 ml) versetzt. Nach 20 Minuten wird die Lösung in einen Kolben überführt und das Harz mit TFA (95 % in H2O, 1,0 ml) gewaschen. Es wird H2O (6,0 ml) zugesetzt und die Lösungsmittel durch Gefriertrocknen entfernt. Die Cyclisierung erfolgte durch Behandlung einer 1 mMol Lösung der linearen Verbindung in Acetonitril mit 10 % DIEA für 45 min. Anschliessend wird im Vakuum zur Trockenen eingeengt. Nach HPLC-chromatographischer Aufreinigung erhält man 7,9 mg 130- 8 Form weissen Pulvers.

130- 8 : C20H25ClN8O3; Rt = 9,59 min; ber. (M+H+): 461,3 gef.: 461,2 (100)

1 H-NMR (300MHz, CDCl3): δ = 7,88 (d 7Hz, 1H), 7,58 (m 2H), 7,46 (d 8 Hz, 1H), 7,28-7,13 (m ), 4,73 (d 18Hz, 1H), 4,28 (m 1H), 4,31 (m 1H), 3,8-3,5 (m 6H), 2,97 (t 8Hz, 2H), 2,76 (d 11 Hz, 2H), 1,72 (m 1H), 1,61 (m 1H), 1,10 (d 8Hz, 3H).

13 C-NMR (75,45 MHz, CDCl3): δ = 173,86; 172,67; 170,67; 167,37; 164,65; 139,14; 127,81; 125,96; 52,79; 49,89; 35,20; 34,28; 18,06; 16,85.


[Seite 131↓]

6-Amino-2-{2-[2-(2,6-dichloro-pyrimidin-4-ylamino)-propionylamino]-3-phenyl-propionylamino}-hexansäureamid 138c und 6-Amino-2-{2-[2-(4,6-dichloro-pyrimidin-4-ylamino)-propionylamino]-3-phenyl-propionylamino}-hexansäureamid 138d

Die Synthese des Tripeptides erfolgte an 500 mg Tentagel™ Rinkamid-Harz (0,41 mmol/g) nach AAV 1. Nach Entfernen der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe mit 20 %-iger Piperidin-Lösung in DMF und Waschen des Harzes (DMF; 3 x 5,0 ml, MeOH; 3 x 5,0 ml, DCM; 3 x 5,0 ml) erfolgte die Immobilisierung durch zweistündiger Inkubation des Syntheseharzes mit einer 50 %-igen Lösung von 2,4,6-Trichlorpyrimidin in NMP (v/v) mit 10 % DIEA bei 80°C. Die Überschüsse wurden durch Waschen des Harzes (DMF; 3 x 5,0 ml, MeOH; 3 x 5,0 ml, DCM; 3 x 5,0 ml) entfernt. Zur Abspaltung Regioisomer vom Harz und gleichzeitiger Entfernung der Boc-Gruppe an der ε-Gruppe des Lysins wird das Harz mit TFA (95 % TFA in wässrigem DCM, 5,0 ml) versetzt. Nach 20 Minuten wird die Lösung in einen Kolben überführt und das Harz mit TFA (95 % in H2O, 1,0 ml) gewaschen. Es wird H2O (6,0 ml) zugesetzt und die Lösungsmittel durch Gefriertrocknen entfernt. Nach HPLC-chromatographischer Aufreinigung erhält man 21 mg 138c und 18 mg 138d Form weissen Pulvers.

138c : C22H29Cl2N7O3; Rt = 9,23 min; ber. (M+H+): 510,3 gef.: 510,2 (100)

1 H-NMR (500MHz, [D6]-DMSO): δ = 8,34 (d 8Hz, 1H), 8,26 (d 8Hz, 1H), 7,95 (d 8Hz, 1H), 7,69 (s, 2H), 7,22 (m, 5 H), 7,17 (m 2H), 6,62 (s, 1H), 4,51 (m, 2H), 4,18 (m, 1H), 4,05-3,80 (s, 1H), 3,03 (m, 1H), 2,84 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 1,66 (m, 1H), 1,51 (m, 2H) 1,31-1,22 (m, 5H)

13 C-NMR (125,68 MHz, [D6]-DMSO): δ = 173,14; 171,51; 170,51; 163,31; 158,82; 156,89; 137,58; 129,10; 127,96; 126,21; 103,00; 53,89; 52,01; 49,24; 37,17; 31,51; 26,64; 22,08; 18,21

138d : C22H29Cl2N7O3; Rt = 10,33 min; ber. (M+H+): 510,3 gef.: 510,2 (100)

1 H-NMR (500MHz, [D6]-DMSO): δ = 8,18 (d 8Hz, 1H), 8,04 (d 8Hz, 1H), 7,97 (d 8Hz, 1H), 7,69 (s, 3H), 7,20 (m, 5 H), 7,16 (m 2H), 6,92 (s, 1H), 4,52 (m, 1H), 4.31 (q 8H, 1H), 4,16 (m, 1H), 3,03 (m, 1H), 2,84 (m, 1H), 2,76 (m, 2H), 1,66 (m, 1H), 1,51 (m, 2H) 1,28-1,20 (m, 5H)

13 C-NMR (125,68 MHz, [D6]-DMSO): δ = 173,08; 171,94; 170,43; 160,52; 137,19; 128,92; 128,87; 127,69; 125,92; 108,4; 53,76; 51,85; 50,17; 38,62; 37,06; 31,09; 26,33; 21,83; 17,63


[Seite 132↓]

6.2.2.2  Verbindungen für ELISA Experimente

Die Synthesen der jeweiligen Dipeptide erfolgte nach AAV 1 unter Einsatz der entsprechenden Aminosäurederivate.

N-Carbamoylmethyl-2-[4-(3-chlorobenzylamino)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-3-methyl-butyramid 18-6-19

18-6-19 wurde nach AAV 2 dargestellt; die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Gly-Leu-derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). 3-Chlorbenzylamin wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 16 mg 18-6-19 als weisses Pulver erhalten.

18-6-19: C22H31ClN8O2; Rt = 13,44 min; ber. (M+H+): 475,2 gef.: 475,2 (100), 359,1 (20)

1 H-NMR (500MHz, [D6]-DMSO): δ = 8,36 (d 8Hz, 1H), 7,97 (sb, 2H), 7,50 (s, 1H), 7,45-7,30 (m, 3H), 7,11 (d 10Hz, 1H), 4,50 (sb, 2H), 4,20 (m, 1H), 4,16 (m, 1H), 3,63 (s, 2H), 3,01 (sb, 2H), 2,03 (m, 1H), 1,64 (m, 1H), 1,56 (m, 1H), 1,43 (m, 1H), 0,95- 0,70 (m, 6H)

13 C-NMR (125,68 MHz, [D6]-DMSO): δ = 172,70; 172,391; 167,89; 165,88; 158,16; 157,91; 131,20; 130,23; 128,19; 127,43; 126,17; 57,52; 43,72; 43,63; 43,13; 30,48; 25,36; 23,58; 22,19; 21,61; 19,23; 17,71

3-(4-Hydroxy-phenyl)-2-(2-{4-piperidin-1-yl-6-[(pyridin-3-ylmethyl)-amino]-[1,3,5]-triazin-2-ylamino}-acetylamino)-propionamid 19-6-10

19-6-10 wurde nach AAV 2 dargestellt; die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Tyr-Gly derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). 3-Picolylamin wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 16 mg 19-6-10 als weisses Pulver erhalten.

19-6-10: C25H31N9O3; Rt = 8,01 min; ber. (M+H+): 506,3 gef.: 506,1 (100)


[Seite 133↓]

2-{3-(1H-Imidazol-4-yl)-2-[4-(2-morpholin-4-yl-ethylamino)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-propionylamino}-pentansäurediamid 14-7-6

14-7-6 wurde nach AAV 2 dargestellt; die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Gln-His derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). 4-(2-Aminoethyl)-morpholin wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 12 mg 8-7-6 als weisses Pulver erhalten.

14-7-6: C25H40N12O4; Rt = 6,14 min; ber. (M+H+): 573,3 gef.: 573,3 (100), 436,3 (20), 419,2 (20), 287,3 (20)

N-[1-Carbamoyl-2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-3-[4-(2-morpholin-4-yl-ethylamino)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-bernsteinsäure 3-7-6

3-7-6 wurde nach AAV 2 dargestellt; die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Asp-His derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). 4-(2-Aminoethyl)-morpholin wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 20 mg 3-7-6 als weisses Pulver erhalten.

3-7-6: C24H37N11O5; Rt = 6,49 min; ber. (M+H+): 560,3 gef.: 560,2 (100), 406,2 (20), 280,8 (35)


[Seite 134↓]

3-{2-[4-(Cyclohexylmethyl-amino)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-acetylamino}-Bernsteinsäure 6-3-1

6-3-1 wurde nach AAV 2 dargestellt, die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Asp-Gly derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). Aminomethylcyclohexan wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 18 mg 6-3-1 als weisses Pulver erhalten.

6-3-1: C21H34N8O4; Rt = 12,76 min; ber. (M+H+): 463,3 gef.: 463,2 (100), 331,1 (20)

1 H-NMR (500MHz, [D6]-DMSO): δ = 12,6-12,2 (sb, 1H), 7,1 (d 8Hz, 2H), 4,5 (m, 1H), 3,8-3,6 (m, 5H), 3,1 (t 6H, 2H), 2,7-2,6 (m 1H), 1,7-1,4 (m, 6H), 1,2-1,1 (m, 2H), 0,8 (sb, 1H)

2-[4-(2-Morpholin-4-yl-ethylamino)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-pentansäure 5-amid 1-{[1-carbamoyl-2-(1H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid} 7-14-6

7-14-6 wurde nach AAV 2 dargestellt; die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–His-Gln derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). 4-(2-Aminoethyl)-morpholin wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 20 mg 7-14-6 als weisses Pulver erhalten.

7-14-6: C25H40N12O4; Rt = 6,30 min; ber. (M+H+): 573,3 gef.: 573,2 (100), 419,2 (40)


[Seite 135↓]

2-{2-[4-(Cyclohexylmethyl-amino)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-acetylamino}-3-methyl-butyramid A1

A1 wurde nach AAV 2 dargestellt; die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Val-Gly derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). Aminomethylcyclohexan wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 14 mg A1 als weisses Pulver erhalten.

A1: C22H38N8O2; Rt = 14,25 min; ber. (M+H+): 447,3 gef.: 447,2 (100), 331,1 (20)

3-Methyl-2-{2-[4-(2-morpholin-4-yl-ethylamino)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-acetylamin-butyramid A6

A6 wurde nach AAV 2dargestellt, die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Val-Gly derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). 4-(2-Aminoethyl)-morpholin wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 16 mg A6 als weisses Pulver erhalten.

A6: C21H37N9O3; Rt = 8,54 min; ber. (M+H+): 464,3 gef.: 464,0 (100)

2-{2-[4-(4-Formyl-phenoxy)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-acetylamino}-3-methyl-butyramid A9

A9 wurde nach AAV 2 dargestellt; die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Val-Gly derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). Das Cäsiumsalz von p-Hydroxybenzaldehyd wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 14 mg A9 [Seite 136↓]als weisses Pulver erhalten.

A9: C22H29N7O4; Rt = 12,47 min; ber. (M+H+): 456,2 gef.: 455,9 (100), 419,1 (90), 340,1 (20)

2-{2-[4-(3-Hydroxyphenoxy)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-acetylamino}-3-methyl-butyramid A10

A10 wurde nach AAV 2 dargestellt; die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Val-Gly derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). Das Cäsiumsalz von Resorcin wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 12 mg A10 als weisses Pulver erhalten.

A10: C21H29N7O4; Rt = 11,50 min; ber. (M+H+): 444,2 gef.: 443,9 (100), 328,1 (10)

3-[2-[4-(3-Chlorobenzylamino)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-hexansäure-6-amid 1-{[1-carbamoyl-3-(3H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid} D4

D4 wurde nach AAV 2 dargestellt; die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Asp-His derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). 3-Chlorbenzylamin wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 12 mg D4 als weisses Pulver erhalten.

D4: C25H31ClN10O4; Rt = 11,36 min; ber. (M+H+): 571,2 gef.: 570,9 (100)


[Seite 137↓]

3-[2-[4-(Pyridin-3-ylmethyl)-amino)-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamino]-bernsteinsäure-4-amid 1-{[1-carbamoyl-3-(3H-imidazol-4-yl)-ethyl]-amid} D5

D5 wurde nach AAV 2 dargestellt, die Immobilisierung von 5 erfolgte an einem Rink-Linker–Asp-His derivatisiertem Syntheseharz (200 mg). 3-Picolylamin wurde zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, Piperidin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt. Nach Abspaltung vom Syntheseharz wurden 10 mg D5 als weisses Pulver erhalten.

D5: C24H31N11O4; Rt = 6,81 min; ber. (M+H+): 538,3 gef.: 538,0 (100), 269,6 (60)

6.3 Synthesen an planaren Oberflächen

6.3.1  Allgemeine Arbeitsvorschriften

AAV 3: Bestimmung des Derivatisierungsgrades von aminoderivatisierten Zellulose­membranen modifiziert nach J. Eichler et al.[92]

Der Derivatisierungsgrad lässt sich zuverlässig durch Messung der UV-Absorption des Dibenzofulven-Piperidin Adduktes C nach Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe einer membrangebundenen Aminosäure bestimmen.

Methode A: Quantifizierung freier Aminofunktionen

Ein SPOT (0,23 cm2) wird ausgestanzt und in einem 2,0 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss mit 50 µl Fmoc-β-Ala-OPfp (0,6 M in DMF) versetzt. Nach 30 Minuten wird die Lösung entfernt und der SPOT mit DMF gewaschen (5 x 1,0 ml). In einem zweiten 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss wird der SPOT mit 1,0 ml Piperidin (20 % in DMF) versetzt. Nach 20 Minuten wird die UV-Absorption der unverdünnten Lösung bei λ = 301 nm bestimmt [Vergleichszelle: Stammlösung Piperidin (20% in DMF)]. Aus der Extinktion (E) wird der Derivatisierungsgrad nach der unten dargestellten Formel berechnet (ε301 = 8100). Bei hohen Derivatisierungsgraden (Extinktion > 1,5) muss die Messlösung verdünnt werden.


[Seite 138↓]

mit E = Extinktion bei 301 nm; V = Reagenzvolumen, mit dem der SPOT versetzt wurde; F = Fläche des SPOTs (typischerweise 0,23 cm2).

Methode B: Quantifizierung einer membrangebundenen Fmoc-Aminosäure

Ein SPOT (0,23 cm2) wird ausgestanzt und in einem 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss mit 1,0 ml Piperidin (20% in DMF) versetzt. Zur Quantifizierung wird wie unter Methode A beschrieben verfahren.

AAV 4: Aminoderivatisierte Zellulose (3-[3-{2-(2-[3-Aminopropoxy]-ethoxy)-ethoxy}-propylamino]-2-hydroxy-propyl- Zellulose) 27 nach N. Heine[51]

A.) Hochbeladungsprotokoll (600 - 1400 nmol/cm 2 )

In eine leere Instrumentenschale gibt man nacheinander Epibromhydrin 24 (4,0 ml), eine Lösung von Perchlorsäure (0,40 ml einer 60 %-igen Lösung in H2O) in Dioxan (35,6 ml) und die vorbereitete Membran und verschliesst das Gefäss. Nach 3 h bei 25°C gibt man Methanol (100 ml) zu. Nach 30 min. dekantiert man ab und wäscht mit Methanol (2 x 50 ml). Die an der Luft getrocknete Membran gibt man in 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin 26 (40 ml), welches zuvor auf 80°C erwärmt wurde. Nach 1 h dekantiert man und inkubiert anschliessend bei 25°C nacheinander mit MeOH (2 x 50 ml, 5 min.), NaOMe (5 M in MeOH, 2 h), MeOH (50 ml, 5 min.) H2O (4 x 100 ml, 5 min.), MeOH (3 x 50 ml) und lässt die Membran trocknen.

Der Derivatisierungsgrad wird durch Inkubieren von drei SPOTs (jeweils 0,23 cm2) mit einer Lösung von Fmoc‑β‑Ala-OPfp (0,6 M, 30 min) in DMF, waschen mit DMF (3 x 2,0 ml), getrenntem versetzten der SPOTS mit 20 % Piperidin/DMF und Bestimmung der Absorbtion des DBF-Piperidin Adduktes (ε301=8100) erhalten. Die Derivatisierung beträgt 500 ‑ 1500 nmol/cm2.

B.) Niedrigbeladungsprotokoll (100-500 nmol/cm2)

Die Präparation erfolgt wie bei A.) mit den folgenden Unterschieden:

  1. Man lässt die Epibromhydrin-Lösung 1 Stunde einwirken.
  2. Man wendet das Diamin 26 als Lösung in DMF (20%) bei 25°C an.

Die Derivatisierung beträgt 100 ‑ 500 nmol/cm2.

[Seite 139↓]AAV 5: Glycin-Ester-derivatisierte Zellulosemembran 95

Diese Methode liefert gleichzeitig eine aminoderivatisierte Zellulosemembran und ein basenlabiles Linkersystem. Die Veresterung erfolgt in Anlehnung an Wenschuh et al.[99] In eine leere Instrumentenschale gibt man eine Zellulosemembran und inkubiert diese mit 40 ml einer Lösung aus 2,38 g (8,0 mmol) Fmoc-Gly-OH, 1,27 ml (16,0 mmol) NMI und 1,56 ml (9,6 mmol) DIC in wasserfreiem DMF für drei Stunden. Anschliessend wird die Membran gewaschen (DMF, 3 x 10 min; MeOH, 2 x 5 min; DCM, 1 x 2min; Et2O, 1 x 2 min) In einem erweiterten Waschschritt werden freie Aminogruppen durch Acetylierung blockiert (DMF, 2 x 2 min; DMF/Ac2O/DIEA [70:10:20 (v/v), 2 x 15 min], und erneut gewaschen (DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und anschliessend an der Luft getrocknet. Anhand von drei SPOTs, die nur zu diesem Zweck vorgesehen wurden, wird der Derivatisierungsgrad nach AAV 3B bestimmt.

AAV 6: Anbringen von Linkermolekülen an planare Oberflächen durch SPOT-Synthese

Die Membran wird stets in einer Edelstahl-Instrumentenschale behandelt. Die Waschschritte werden unter Bewegung des Lösungsmittels auf einem Wipptisch durchgeführt. Beim Abgiessen des Lösungsmittels wird die Membran mit einer Pinzette vorsichtig angehoben, um unter der Membran befindliches Lösungsmittel ablaufen zu lassen (Ausnahme: Waschschritte mit wässrigen Lösungen).

Zunächst wird eine Lösung des gewünschte Linkers in aktivierter Form bereitgestellt:

Rink: 0,3 mmol von 4-[(2,4-Dimethoxy-phenyl)-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-methyl]-phenoxy}-essigsäurewerden in 900 µl einer 0,33 M Lösung von Pentafluorphenol in NMP gelöst und mit 0,3 mmol DIC versetzt. Nach ca. 30 min ist die Umsetzung zum Pentafluorphenylester beendet und die Lösung von 35 einsatzbereit.

Photolinker: 0,5 mmol von 4-[4-(2,4-Dimethoxy-phenyl)-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl)-2-Methoxy-5-Nitrophenoxy]-buttersäure werden in 900 µl einer 0,55 M Lösung von Pentafluorphenol in NMP gelöst und mit 0,5 mmol DIC versetzt. Nach ca. 30 min ist die Umsetzung zum Pentafluorphenylester beendet und die Lösung einsatzbereit.

Die Lösung der aktivierten Linker wird an einer esterfrei aminoderivatisierten planaren Oberfläche durch Pipettieren aufgetragen (Dreifachkopplung, 3 x 20 min; eine Markierung der Positionen kann zuvor mit einem Bleistift erfolgen). Dabei wird hier und in allen folgenden Schritten stets das gleiche Volumen (2,0 µl an der Zellulose bzw. 1,0 µl an der PP-Membran) angewendet. Die Überschüsse werden durch Waschen entfernt (DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min). In einem erweiterten Waschschritt werden freie Aminogruppen durch Acetylierung blockiert (DMF, 2 x 2 min; DMF/Ac2O/DIEA [70:10:20 (v/v), 2 x 15 min], die Membran gewaschen (DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2min; Et2O, 1 x 2 min) und anschliessend an der Luft getrocknet. Anhand von drei SPOTs, die nur zu diesem Zweck vorgesehen wurden, wird der [Seite 140↓]Derivatisierungsgrad nach AAV 3B bestimmt. Die Membran wird den Bedingungen einer Fmoc-Abspaltung unterzogen (Piperidin (20 % in DMF), 2 x 10 min), gewaschen (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

Carbamatlinker: Auf eine aminoderivatisierte PP-Membran wird mit Bleistift ein 1 x 1 cm Raster aufgezeichnet Die PP-Membran wird durch Inkubation in einer 2 M Lösung von Bromessigsäurebromid in DCM mit 0,3 M DABCO innerhalb von 30 min acyliert. Die Membran wird gewaschen (DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2min; Et2O, 1 x 2 min) und anschliessend an der Luft getrocknet. Eine 1 M Cäsiumphenolat-Lösung in DMSO wird aus p-Hydroxy-Benzaldehyd und 0,5 Äq. Cs2CO3, durch Rühren bei 60°C für 2 h hergestellt. Nach Abkühlen der Lösung werden jeweils 1 µl in das Raster gespottet. Nach 30 min Reaktionszeit wird das Spotten zwei Mal wiederholt. Die Membran wird gewaschen (DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet. Die Reduktion der Aldehydfunktion erfolgt durch Inkubation der Membran mit einer 2 M Natriumborhydridlösung in MeOH für 15 min. Anschliessend wird die Membran gewaschen (MeOH, 2 x 2 min; DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet. Das aktivierte Carbonat wird durch Inkubation der Membran in einer 1 M Lösung von 4-Nitrochloroformiat in DCM mit 0,01 Äq. NEM für eine Stunde gebildet. Nach Waschen der Membran (DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und trocknen an der Luft, kann die Umsetzung mit dem entsprechenden Diamin (Tabelle 3 Seite 22) erfolgen.

AAV 7: Manuelle Peptidsynthese an planaren Oberflächen unter SPOT-Bedingungen

Auf eine aminoderivatisierte planare Oberfläche wird mit Bleistift ein 1 x 1 cm Raster aufgezeichnet. Die Membran wird stets in einer Edelstahl-Instrumentenschale behandelt. Die Waschschritte werden unter Bewegung des Lösungsmittels auf einem Wipptisch durchgeführt. Mittels einer Eppendorf Multi-Step-Pipette wird in die Mitte der Rasterkreuze 2 µl (auf Zellulose) oder 1 µl (auf PP-Membran) einer 0,6 M Aminosäure-Pentafluor-phenolesterlösung in NMP gespottet. Das Spotten der Reagenzien wird nach jeweils 20 min zweimal wiederholt. Nach beendeter Kopplung wird der Überschuss durch Waschen der Membran entfernt (DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und anschliessend an der Luft getrocknet. Nicht acylierte freie Aminogruppen werden durch Baden mit einer 20 %-igen Acetanhydrid-Lösung mit 10 % DIEA in DMF acetyliert, um den Aufbau von Fehlsequenzen zu vermeiden. Anschliessend wird die Membran erneut gewaschen. Die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe der Peptide wird durch Inkubation mit einer 20 % Piperidin-Lösung in DMF für 20 min entfernt. Nach Waschen (DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft trocknen ist die Membran für die Kopplung der nächsten Aminosäure bereit, so dass die Synthesecyclen solange durchlaufen werden können, bis die gewünschte Peptidsequenz erreicht ist.

Eine Unterbrechung der Synthese kann nach der Kopplung der Aminosäuren oder Acetylierung erfolgen.

[Seite 141↓]AAV 8: Halbautomatische SPOT-Synthese von Peptiden

Die halbautomatische Synthese einer Peptid-Bibliothek erfolgt in Analogie zu der manuellen SPOT-Synthese (AAV 7). Folgende Unterschiede sind jedoch zu beachten:

-

Die Pipettierschritte werden unter Verwendung eines Pipettierroboters (Autospot Robot AMS 222) durchgeführt. Die Steuerdateien, in denen Ort und Sequenzen der SPOTs festgelegt ist, wurden mit dem Programm LISA erzeugt. In einer Synthese können gleichzeitig 40 Bausteine verwendet werden. Die Acetylierung mit Acetanhydrid und die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgt nicht am Pipettierroboter, sondern durch Inkubation der Membran in einer Metallschale mit der entsprechenden Lösung (AAV 7).

-

Um die Repositionierung der Membran nach den Waschschritten zu ermöglichen werden freie Aminogruppen nach Schritt A) (SPOT-Definition) durch zusätzliches Waschen mit einer 0,01%igen Lösung von Bromphenolblau in MeOH angefärbt und ausgewählte SPOTs (z.B. Ecken der Membran) mit Bleistift markiert.

-

Es ist dafür zu sorgen, dass im ersten Schritt (SPOT-Definition) ein um 10% geringeres Pipettiervolumen als in den übrigen Schritten gewählt wird, um Fehlsequenzen am Rand des SPOTs vermeiden.

-

Zur parallelen Synthese von „kleinen“ SPOTs für Festphasen-Bindungsstudien und „grossen“ SPOTs für analytische Zwecke auf einer Membran unter Verwendung von einer Synthese-Steuerdatei hat es sich bewährt, an der Stelle der „grossen“ SPOTs mehrere identische Sequenzen zu definieren. Das führt zur Mehrfachpipettierung kleiner Volumina an derselben Stelle und damit zu grösseren SPOTs.

-

Zur Dokumentation der Synthese hat sich die Aufnahme von Lichtbildern mit einer Digitalkamera nach den Schritten A) und C) bewährt.

-

Niederschläge aus Diisopropylharnstoff, die bei der Aktivierung von Amino­säuren (Linker, Monomere) auftreten, werden zusätzlich zur Zentrifugation durch Filtration (Spritzenfilter aus PTFE, 0,45 µm) abgetrennt, um einen Verschluss der Nadeln zu vermeiden.

-

Alle Reagenzien müssen vor jedem Synthesecyclus frisch bereitgestellt werden, da die Gefässe während der Synthese geöffnet sind und flüchtige Bestandteile langsam verdampfen. Es hat sich bewährt, die Reagenzien für jeden Schritt vor Beginn der gesamten Synthese in entsprechende Gefässe abzufüllen und bei 4°C zu lagern. Vor den einzelnen Cyclen wird der benötigte Satz an Reagenzien entnommen. Monomere werden unter Beachtung der Voraktivierungszeit erst kurz vor der Synthese aktiviert.

AAV 9: Manuell SPOT-Synthese von Peptoiden

Die SPOT-Synthese von Peptoiden folgt den Grundzügen der Peptoidsynthese nach Figliozzi et al. [161] nach einem für die SPOT-Synthese modifizierten Protokoll (zu den Methoden der SPOT-Synthese vergl. AAV 7). Die Synthese kann zwischen den Schritten – vorzugsweise nach der Einführung des Aminbausteines – unterbrochen werden. Dazu wird die getrocknete Membran in Kunststoffolie eingeschweisst und bei -26°C gelagert. Die verwendeten Amine können in Stammlösungen (2 ml Gefässe) bei 4°C mindestens 12 Monate unzersetzt gelagert werden.

Bei Synthesen am Photolinker müssen besondere Vorkehrungen getroffen werden, um eine vorzeitige Abspaltung zu verhindern: Bei allen Operationen, bei denen die Membran der [Seite 142↓]Einwirkung von Licht ausgesetzt ist, wird Tageslicht durch Raumabdunklung ausgeschlossen. Desgleichen wird die Raumbeleuchtung im Umkreis von ca. 4 m ausgeschaltet, so dass die Membran nur indirekt beleuchtet wird.

A)Peptoidsynthese 1:

 

Sub-Monomerschritt 1: Bromacetylierung

Alle SPOTs werden durch Pipettieren einer Lösung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenyl­ester (1 M in NMP, Doppelkopplung, 2 x 15 min) acyliert. Die Membran wird gewaschen (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

B.)Peptoidsynthese 2:

 

Sub-Monomerschritt 2: Bromsubstitution

In Abhängigkeit von der gewünschten Peptoid-Sequenz werden verschiedene Amin-Lösungen auf die SPOTs pipettiert (Konzentrationen je nach Amin: Feststoffe: 5 M in NMP oder H2O bzw., falls diese Konzentration nicht erreicht werden kann, verdünnen einer gesättigten Lösung mit etwas Lösungsmittel (10 %), um eine Kristallisation bei der Anwendung zu verhindern – die Konzentration sollte jedoch nicht geringer als 0,8 M sein; wässrigen Lösungen wird 0,05 % Tween® 20 zugesetzt; Flüssigkeiten: 50 %-ig in NMP; jeweils Dreifachkopplung, 3 x 15 min). Die Membran wird gewaschen (DMF, 4 x 2 min; MeOH, 1 x 2 min; 0,5 M wässrige NaOH, 1 x 1 min; H2O, 5 x 2 min; bei pH > 8, weitere Waschschritte mit H2O; MeOH, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

C.)Wiederholung der Schritte A.) und B.) bis die endgültige Oligomerenlänge erreicht ist.

AAV 10: Manuelle SPOT-Synthese von Peptomeren

Die Synthese der Peptomere gliedert sich in Peptidsynthese- und Peptoidsyntheseabschnitte. Die Durchführung der jeweiligen Teile der Synthese erfolgt nach AAV 7 (Peptidteil) und AAV 9 (Peptoidteil). Bei der Kopplung von Aminosäuren auf die sek. Amine des Peptoidbausteins werden hierbei jedoch nicht die Pentafluorphenylester, sondern die Anhydride der Aminosäuren eingesetzt.

AAV 11: Halbautomatische SPOT-Synthese von Peptomeren

Die halbautomatische SPOT-Synthese von Peptomeren verläuft analog der manuellen Synthese (AAV 10). Unterschiede werden im folgenden aufgelistet:


[Seite innerhalb Tabelle 143↓]

-

Die Pipettierschritte werden unter Verwendung eines Pipettierroboters (Autospot Robot AMS 222) durchgeführt. Die Steuerdateien, in denen Ort und Sequenzen der SPOTs festgelegt ist, wurden mit dem Programm LISA erzeugt, welches speziell an die Synthese nach der Sub-Monomer-Methode angepasst wurde. In einer Synthese können gleichzeitig 40 Sub-Monomer und 40 Monomer-Bausteine verwendet werden.

-

Um die Repositionierung der Membran nach den Waschschritten zu ermöglichen werden freie Aminogruppen nach Schritt A) (SPOT-Definition) durch zusätzliches Waschen mit einer 0,01 %-igen Lösung von Bromphenolblau in MeOH angefärbt und ausgewählte SPOTs (z.B. Ecken der Membran) mit Bleistift markiert.

-

Es ist dafür zu sorgen, dass in Schritt A) (SPOT-Definition) ein um 20 % geringeres Pipettiervolumen als in den übrigen Schritten gewählt wird, um Fehlsequenzen am Rand des SPOTs vermeiden.

-

Zur parallelen Synthese von „kleinen“ SPOTs für Festphasen-Bindungsstudien und „grossen“ SPOTs für analytische Zwecke auf einer Membran unter Verwendung von einer Synthese-Steuerdatei hat es sich bewährt, an der Stelle der „grossen“ SPOTs mehrere identische Sequenzen zu definieren. Das führt zur Mehrfachpipettierung kleiner Volumina an derselben Stelle und damit zu grösseren SPOTs.

-

Zur Dokumentation der Synthese hat sich die Aufnahme von Lichtbildern mit einer Digitalkamera nach den Schritten A) und C) bewährt.

-

Niederschläge aus Diisopropylharnstoff, die bei der Aktivierung von Amino­säuren (Linker, Monomere) auftreten, werden zusätzlich zur Zentrifugation durch Filtration (Spritzenfilter aus PTFE, 0,45 µm) abgetrennt, um einen Verschluss der Nadeln zu vermeiden.

-

Die Vorratsgefässe für Aminlösungen werden erst direkt vor der Synthese geöffnet, um eine Verflüchtigung von Lösungsmittel und Reagenzien zu vermindern.

-

Alle Reagenzien müssen vor jedem Synthesecyclus frisch bereitgestellt werden, da die Gefässe während der Synthese geöffnet sind und flüchtige Bestandteile langsam verdampfen. Es hat sich bewährt, die Reagenzien für jeden Schritt vor Beginn der gesamten Synthese in entsprechende Gefässe abzufüllen und bei 4°C zu lagern. Vor den einzelnen Cyclen wird der benötigte Satz an Reagenzien entnommen. Monomere werden unter Beachtung der Voraktivierungszeit erst kurz vor der Synthese aktiviert.

AAV 12: Immobilisierung von Cyanurchlorid 5 an aminoderivatisierter Zellulose

Es wird eine 2 M Lösung Cyanurchlorid 5 in DCM hergestellt. Eine trockene aminoderivatisierter Zellulosemembran wird 30 min mit der Lösung in einer Metallschale inkubiert, hierbei richtet sich die benötigte Menge an Lösung nach der Grösse der Membran und der Schale. Das Volumen sollte so bemessen sein, dass die Membran gut bedeckt ist. Zur besseren Reaktion wird die Schale vorsichtig während der 30 min auf einem Wipptisch bewegt. Anschliessend werden die Überschüsse an 5 durch Waschen mit 2 x DCM, 2 x DMF und 2 x DCM für je 5 min entfernt und die Membran an der Luft getrocknet.

[Seite 144↓]AAV 13: Immobilisierung von Cyanurchlorid 5 an aminoderivatisierter PP-Membran

Es wird eine 2 M Lösung 5 in DCM hergestellt und mit 10 % DIEA (v/v) versetzt. Eine trockenen aminoderivatisierter PP-Membran wird 30 min mit der Lösung in einer Metallschale inkubiert, hierbei richtet sich die benötigte Menge an Lösung nach der Grösse der Membran und der Schale. Das Volumen sollte so bemessen sein, dass die Membran gut bedeckt ist. Zur besseren Reaktion wird die Schale vorsichtig während der 30 min auf einem Wipptisch bewegt. Anschliessend werden die Überschüsse an 5 durch Waschen mit 2 x DCM, 2 x DMF und 2 x DCM für je 5 min entfernt und die Membran an der Luft getrocknet.

AAV 14: Monochlorsubstitution an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen durch Amine

Die gewünschte Amin-Lösungen wird auf die SPOTs pipettiert 2 µl (auf Zellulose) oder 1 µl (auf PP-Membran). Die Konzentrationen ist je nach Amin unterschiedlich: Feststoffe:5 M in NMP oder H2O bzw., falls diese Konzentration nicht erreicht werden kann, verdünnen einer gesättigten Lösung mit etwas Lösungsmittel (10 %), um eine Kristallisation bei der Anwendung zu verhindern – die Konzentration sollte jedoch nicht geringer als 0,8 M sein; wässrigen Lösungen wird 0,05 % Tween® 20 zugesetzt; Flüssigkeiten: 50 %-ig in NMP), wobei eine Reaktionszeit von 30 min so genau wie möglich eingehalten werden muss. Die Membran wird gewaschen (DMF, 4 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

AAV 15: Monochlorsubstitution an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen durch Phenolate


[Seite 145↓]

Die Cäsiumphenolate werden durch Lösen der entsprechenden Phenole in DMSO und Zugabe von 0,5 Äq. Cs2CO3 hergestellt. Die Suspension wird zwei Stunden bei 60°C gerührt, wobei am Ende verbleibender Niederschlag durch langsame Zugabe von DMSO aufgelöst wird. Die Phenolatlösung wird auf die SPOTs pipettiert 2 µl (auf Zellulose) oder 1 µl (auf PP-Membran), wobei eine Reaktionszeit von 30 min so genau wie möglich eingehalten werden muss. Die Membran wird gewaschen (DMF, 4 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

AAV 16: Intramolekulare Monochlorsubstitution an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen durch Aminogruppen

Die Entschützung der Boc-Gruppe von der Aminfunktion erfolgt durch Behandlung der Membran mit 90 %-iger TFA in DCM für eine Stunde. Nach Waschen der Membran mit DCM (2 x 3 min) wird die Membran für zwei Stunden mit einer 1 M wässrigen HCl-Lösung inkubiert, um eventuell entstandenes Trifluoracetylierungsprodukte zu hydroliseren. Anschliessend wird die Membran gewaschen (H2O, 3 x 2 min; DMF, 4 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

Die Entschützung im Fall der Mtt-Gruppe erfolgt durch Behandlung der Membran mit einer 1 %-igen TFA-Lösung in DCM mit 5 % TIPS für eine Stunde. Im Anschluss wird die Membran gewaschen (DMF, 4 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

Zur Cyclisierung wird die Membran für 30 min mit einer 10 %-igen DIEA-Lösung in NMP inkubiert, gewaschen (DMF, 4 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

AAV 17: Chlorsubstitution an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazinen durch Amine

Die Membran wird in eine Glasschale (z.B. Petrischale) gelegt, und die Amin-Lösungen (vgl. AAV 14) wird auf die SPOTs pipettiert 2 µl (auf Zellulose) oder 1 µl (auf PP-[Seite 146↓]Membran). Die Schale wird mit einem Glasdeckel abgedeckt und für 3 min einer Mikrowellenbestrahlung (810 W) ausgesetzt. Anschliessend wird die Membran gewaschen (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

AAV 18: Chlorsubstitution an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazinen durch Phenolate

Die Cäsiumphenolate werden durch Lösen der entsprechenden Phenole in DMSO und Zugabe von 0,5 Äq. Cs2CO3 hergestellt. Die Suspension wird zwei Stunden bei 60°C gerührt, wobei am Ende verbleibender Niederschlag durch langsame Zugabe von DMSO aufgelöst wird. Die Membran wird in eine Glasschale (z.B. Petrischale) gelegt, und die Phenolatlösungen wird auf die SPOTs pipettiert 2 µl (auf Zellulose) oder 1 µl (auf PP-Membran). Die Schale wird mit einem Glasdeckel abgedeckt und für 3 min einer Mikrowellenbestrahlung (810 W) ausgesetzt. Anschliessend wird die Membran gewaschen (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

AAV 19: Abspaltung der Syntheseprodukte von den verschiedenen Linkersystemen

Ester- und Photolinker: Zur Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung wird die Membran mit TFA behandelt [TFA/H2O/TIPS [95/3/2 (v/v)] unter Zusatz von Phenol (1 g/100ml), 2 x 15 min; TFA/CH2Cl2/H2O/TIPS [50/45/3/2 (v/v)] unter Zusatz von Phenol (1 g/100ml), 1 x 2 h. Die verwendete Instrumentenschale wird dabei nicht geschüttelt. Im Anschluss wird die Membran gewaschen (CH2Cl2, 2 x 5 min; DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

Die Verbindungen an dem Esterlinker werden durch Methylamin in einem Exsiskkator innerhalb von 14 h abgespalten.

Vom Photolinker-derivatisierten Membranen 51 werden die Substanzen durch Belichtung der trockenen Membran mit UV-Licht (Vilber Lourmat TFX 20 LC, Einstellung 365 nm, 100 %, 180 min je Seite) abgespalten.

Die SPOTs werden ausgestanzt und können in einem geeigneten Lösungsmittel abgelöst für Assays in Lösung eingesetzt oder analysiert (HPLC, HPLC-MS) werden.

Rink- und Carbamatlinker: Bei diesen beiden Linkersystemen erfolgt die Abspaltung der Seitenschutzgruppen und der Verbindungen von der planaren Oberfläche gleichzeitig. In einen Exsiskkator wird eine Schale mit 3 ml einer 90 %-igen TFA-Lösung in DCM gestellt, und dieser 2 Stunden ist der Gasraum mit TFA-Dampf gesättigt, und die Membranen mit dem Rink- oder Carbamatlinker können für 30 min in den Exikator gelegt werden, wobei darauf zu achten ist, dass die Membranen nicht direkt in die Schale mit verbliebener TFA-Lösung gelangen. Nach Beendigung der Abspaltung wird die Membran an der Luft oder ggf. im Vakuum von anhaftender TFA befreit und die SPOTs mit den adsorbierten Verbindungen können ausgestanzt werden.


[Seite 147↓]

Alternativ können die Produkte auch „in Lösung“ abgespalten werden. Hierzu werden die SPOTs ausgestanzt, in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefässe überführt und mit TFA (95 % in DCM, 100 µl) versetzt. Nach 30 Minuten wird das Lösungsmittel bei 45°C in einer Vakuumzentrifuge entfernt.

Die adsorbierten Syntheseprodukten werden direkt im Anschluss mit Acetonitril (50 % in H2O mit 0,1 % TFA, 100 µl) abgelöst und analysiert (HPLC, HPLC-MS, 10 µl Injektionsvolumen).

6.3.2 Membranfunktionalisierung

6.3.2.1 Aminofunktionalisierte Zellulosemembran

Die Bedingungen zur Derivatisierung von esterfrei aminofunktionalisierten Zellulosemembran 27 und zur Glycin-Ester-derivatisierten Membran 95 sind in Kapitel 6.3.1 (AAV 4 und AAV 5) beschrieben.

6.3.2.2 Aminofunktionalisierte PP-Membran

6.3.2.2.1 Ausgehend von carbonsäurefunktionalisierten PP-Membranen 28

Eine carbonsäurefunktionalisierte PP-Membran 28 wird in einer Metallschale mit einer 2 M Lösung von PCl5 in DCM übergossen, so dass die Membran gut bedeckt ist (die genaue Menge hängt von der Grösse der verwendeten Membran und Metallschale ab). Die Schale wird auf einem Inkubationsschüttler 2 h leicht bewegt. Anschliesssend wird die PCl5-Lösung zügig abgegossen (Vorsichtig, stechender Chlorgeruch) und die Membran direkt mit einer 5 M Lösung von 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin 26 in DCM übergossen, und erneut für 2 h leicht bewegt. Die Membran wird mit DMF, Wasser, Acetonitril, MeOH und DCM je 3 mal à 5 min gewaschen, wobei das Volumen der Waschlösung so bemessen seine muss, dass die Membran beim Schwenken der Schale leicht beweglich ist.

Der Derivatisierungsgrad wird durch Inkubieren von drei SPOTs (jeweils 0,23 cm2) mit einer Lösung von Fmoc‑β‑Ala-OPfp (0,6 M, 30 min) in DMF, Waschen mit DMF (3 x 2,0 ml), getrenntem Versetzten der SPOTS mit 20 % Piperidin/DMF und Bestimmung der Absorbtion des DBF-Piperidin Adduktes (ε301=8100) bestimmt. Die Derivatisierung beträgt 500 ‑ 1500 nmol/cm2. Man erreicht Beladungen an Aminofunktionen in Abhängigkeit von der ursprünglichen Carbonsäurefunktionalisierung von 100-800 nmol/cm2.

Die Untersuchungen bzgl. verschiedener Aktivierungsbedingungen von 28 erfolgte in Analogie, wo bei die Art und Konzentration der Reagenzien in Tabelle 1 inklusive der Ergebnisse angegeben sind.


[Seite 148↓]

6.3.2.2.2  Ausgehend von methylesterfunktionalisierten PP-Membranen 29

Eine methylesterfunktionalisierte PP-Membran 29 wird in einer Metallschale mit 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin 26 übergossen, so dass die Membran gut bedeckt ist (die genaue Menge hängt von der Grösse der verwendeten Membran und Metallschale ab). Anschliessend wird die Schale auf 80°C erwärmt und die Methylesterfuntionen im Verlauf von 48 h aminolysiert. Die Membran wird mit DMF, Wasser, Acetonitril, MeOH und DCM je 3 mal à 5 min gewaschen, wobei das Volumen der Waschlösung so bemessen sein muss, dass die Membran beim Schwenken der Schale leicht beweglich ist.

Der Derivatisierungsgrad wird durch Inkubieren von drei SPOTs (jeweils 0,23 cm2) mit einer Lösung von Fmoc‑β‑Ala-OPfp (0,6 M, 30 min) in DMF, Waschen mit DMF (3 x 2,0 ml), getrenntem Versetzen der SPOTS mit 20 % Piperidin/DMF und Bestimmung der Absorbtion des DBF-Piperidin Adduktes (ε301=8100) erhalten. Die Derivatisierung beträgt 500 ‑ 1500 nmol/cm2. Man erreicht Beladungen an Aminofunktionen in Abhängigkeit von der ursprünglichen Methylesterfunktionalisierung von 200-600 nmol/cm2.

Die Untersuchungen bzgl. verschiedener Aminolysebedingungen von 29 erfolgte unter den in Tabelle 2 angegebenen Bedingungen. Das Entfernen von Aminüberschüssen und die Bestimmung der Aminoderivatisierung erfolgte wie oben beschrieben.

6.3.3  Spezielle Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an Zellulosemembranen

Untersuchung von Alkylaminen zur Chlorsubstitution unter SPOT-Bedingungen

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Rink-Linkerderivat 35 acyliert und nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen wurde Cyanurchlorid 5 nach AAV 12 immobilisiert. Zur Darstellung des Triazins 60 wurden die Amine mit denen in der Tabelle angegebenen Konzentrationen nach AAV 14 am Rink-Linker umgesetzt. Nicht substituierte Chloratome wurden durch Inkubation der Membran bei 80°C (4 h) mit einer 5 M Lösung von Piperidin zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen des Piperidinüberschusses (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) wurde das Syntheseprodukt nach AAV 19 abgespalten.

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Triazine 60 aufgeführt (die Nummern entsprechen den jeweiligen Tabelleneinträgen).

Tabelle 9

Seite 33

60- 1 : Propylamin; Rt = 11,32 min; ber. (M+H+): 237,2 gef.: 237,1 (100), 195,1 (6)

60- 2 : Butylamin; Rt = 12,41 min; ber. (M+H+): 251,2 gef.: 251,2 (100), 183,2 (16), 127,2 (6)


[Seite 149↓]

60- 3 : Pentylamin; Rt = 13,48 min; ber. (M+H+): 265,2 gef.: 265,0 (100)

60- 4 : Octylamin; Rt = 16,54 min; ber. (M+H+): 307,3 gef.: 307,4 (100), 196,0 (6)

60- 5 : 3-Methylbutylamin; Rt = 13,35 min; ber. (M+H+): 265,2 gef.: 265,3 (100), 195,3 (6)

60- 6 : Cyclopropylmethylamin; Rt = 11,62 min; ber. (M+H+): 249,2 gef.: 249,1 (100)

60- 7 : Cyclohexylmethylamin; Rt = 14,25 min; ber. (M+H+): 291,2 gef.: 291,2 (100), 223,1 (14).

60- 8 : Allylamin; Rt = 11,15 min; ber. (M+H+): 235,3 gef.: 253,2

60- 9 : Propargylamin; Rt = 9,95 min; ber. (M+H+): 233,2 gef.: 233,4

60- 10 : Isopropylamin; Rt = 11,34 min; ber. (M+H+): 237,2 gef.: 237,0 (100), 195,1 (12)

60- 11 : Isobutylamin; Rt = 12,49 min; ber. (M+H+): 251,3 gef.: 251,3 (100), 195,6 (14).

60- 13 : Cyclohexylamin; Rt = 13,29 min; ber. (M+H+): 277,2 gef.: 277,3 (100), 195.4 (14)

60- 14 : 1-Adamantylamin; Rt = 15,78 min; ber. (M+H+): 329,3; gef.: 329,4 (100), 135 (8)

60- 15 : Dibutylamin; Rt = 15,47 min; ber. (M+H+): 307,2 gef.: 307,1 (100), 251,2 (8)

60- 16 : Dihexylamin; Rt = 18,92 min; ber. (M+H+): 363,3 gef.: 363,1 (100)

60- 17 : 2,2,6,6-Tetrametylpiperidin; ber. (M+H+): 318,3 gef.: nicht nachweisbar

Tabelle 10

Seite 36

60- 18 : Hydroxylamin; Rt = 7,15 min; ber. (M+H+): 211,1 gef.: 211,2

60- 19 : Ethanolamin; Rt = 8,17 min; ber. (M+H+): 239,2 gef.: 239,7 (100), 221,6 (18)

60- 20 : 3-Amino-1-propanol; Rt = 8,74 min; ber. (M+H+): 253,2 gef.: 253,3 (100).

60- 21 : 4-Amino-1-butanol; Rt = 9,18 min; ber. (M+H+): 267,2 gef.: 267,2 (100), 199,2 (18)

60- 22 : 5-Amino-1-pentanol; Rt = 9,82 min; ber. (M+H+): 281,2 gef.: 281,3 (100), 223,7 (10)

60- 23 : 6-Amino-1-hexanol; Rt = 10,56 min; ber. (M+H+): 295,2 gef.: 295,6 (100)

60- 24 : rac-4-Amino-2-butanol; Rt = 9,89 min; ber. (M+H+): 267,2 gef.: 267,0 (100), 195,1 (10)

60- 25 : 2-Amino-1,3-propandiol; Rt = 7,24 min; ber. (M+H+): 269,2 gef.: 269,0 (100)

Tabelle 11

Seite 37

60- 26a : Ethylendiamin; Rt = 6,15 min; ber. (M+H+): 238,2 gef.: 238,1 (100), 221,2 (18), 153,3 (8).

60- 27 : 1,3-Diaminopropan; Rt = 6,91 min; ber. (M+H+): 252,2 gef.: 252,2 (100), 235,3 (26), 207,2 (6)

60- 28 : 1,4-Diaminobutan; Rt = 7,34 min; ber. (M+H+): 266,2 gef.: 266,0 (100), 249,1 (22)


[Seite 150↓]

60- 29 : 1,5-Diaminopentan; Rt = 8,26 min; ber. (M+H+): 280,2 gef.: 280,2 (100), 263,3 (12), 195,2 (6)

60- 30 : 1,6-Diaminohexan; Rt = 8,70 min; ber. (M+H+): 294,2 gef.: 294,1 (100), 277,2 (8), 167,7 (20)

60- 26b : Mono-Boc-ethylendiamin; Rt = 6,15 min; ber. (M+H+): 238,2 gef.: 238,1 (100), 221,2 (22), 153,3 (10).

60- 31 : Piperazin; Rt = 5,79 min; ber. (M+H+): 264,2 gef.: 264,1 (100), 173,2 (10)

Tabelle 12

Seite 38

60- 32 : 2-Methoxyethylamin; Rt = 9,51 min; ber. (M+H+): 253,2 gef.: 253,1 (100), 185,1 (18), 153,3 (14).

60- 33 : Isopropoxypropylamin; Rt = 11,86 min; ber. (M+H+): 295,2 gef.: 295,0 (100), 253,3 (8)

60- 34 : Tetrahydrofurfurylamin; Rt = 10,39 min; ber. (M+H+): 279,2 gef.: 279,2 (100), 223.4 (22), 195.4 (16)

60- 35 : 4-(2-Aminoethyl)-morpholin; Rt = 6,75 min; ber(M+H+): 308,2 gef.: 3308,1 (100), 221,2 (36)

60- 36 : 4-(3-Aminopropyl)-morpholin; Rt = 7,29 min; ber. (M+H+): 322,2 gef.: 322,1 (100), 235,2 (88), 167,2 (12)

60- 37 : 1-(3-Aminopropyl)-pyrrolidin; Rt = 7,88 min; ber. (M+H+): 306,2 gef.: 306,2 (44), 235,2 (100), 207 (6).

60- 38 : 1-(2-Aminoethyl)-piperidin; Rt = 7,70 min; ber. (M+H+): 306,2 gef.: 306,0 (100), 221,3 (34), 173,8 (16)

60- 39 : 1-(3-Aminopropyl)-4-methylpiperazin; Rt = 7,03 min; ber. (M+H+): 335,3 gef.: 335,0 (100), 235,2 (48), 188,3 (32), 168,2 (12).

60- 40 : 1-Methylpiperazin; Rt = 6,52 min; ber. (M+H+): 278,2 gef.: 278,1 (100), 221,1 (26), 153,1 (12).

60- 41 : (S)-(-)-1-Amino-2-(methoxymethyl)-pyrrolidin; Rt = 10,30 min; ber. (M+H+): 308,2 gef.: 308,1 (100), 276,1 (16).

60- 42 : 2-Aminoacetaldehyd-diethylacetal; gefunden 2-Aminoaldehyd-Substituent; Rt = 6,96 min; ber. (M+H+): 237,1 gef.: 237,1 (100)

60- 43 : 2-Aminoethyl-hydrogensulfat; Rt = 7,82 min; ber. (M+H+): 319,2 gef.: 318,9 (100), 239,1 (34)

60- 44 : 2-(Ethylthio)-ethylamin; Rt = 11,88 min; ber. (M+H+): 283,2 gef.: 283,0 (100), 221,2 (12)

60- 45 : Glycinamid; Rt = 6,72 min; ber. (M+H+): 252,1 gef.: 252,0 (100), 235,1 (16), 207,1 (18)

60- 46 : β-Alaninamid; Rt = 8,87 min; ber. (M+H+): 266,2 gef.: 266,2 (100), 207.3 (16)


[Seite 151↓]

60- 47 : Glycinethyester; Rt = 8,21 min; ber. (M+H+): 253,1 (C-terminale Säure) gef.: 253,3 (56), 195,2 (100)

60- 48 : Isoeucinethyester; Rt = 11,45 min; ber. (M+H+): 309,2 (C-terminale Säure) gef.: 309,1 (100), 283,1 (25), 263,1 (34).

60- 49 : Glutaminsäure(tert.butyl)methylester; gefunden freie Säuren Rt = 8,26 min; ber. (M+H+): 325,1 gef.: 325,0 (100), 279,1 (12)

Untersuchung von Arylaminen zur Chlorsubstitution unter SPOT-Bedingungen

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Rink-Linkerderivat 35 acyliert und nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen wurde Cyanurchlorid 5 nach AAV 12 immobilisiert. Zur Darstellung des Triazins 66 wurden die Amine mit denen in der Tabelle angegebenen Konzentrationen nach AAV 14 am Rink-Linker umgesetzt. Nicht substituierte Chloratome wurden durch Inkubation der Membran bei 80°C (4 h) mit einer 5 M Lösung von Benzylamin zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen des Benzylaminüberschusses (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) wurde das Syntheseprodukt nach AAV 19 abgespalten.

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Triazine 66 aufgeführt (die Nummern entsprechen den jeweiligen Tabelleneinträgen).

Tabelle 13

Seite 41

67: Benzylamin (Kontrolle mit 3-Chlorbenzylamin); Rt = 13,40 min; ber. (M+H+): 341,2 gef.: 341,1 (100)

66- 1 : 2-Chlorbenzylamin; Rt = 13,61 min; ber. (M+H+): 341,2 gef.: 341,1 (100)

66- 2 : 3-Chlorbenzylamin; Rt = 13,40 min; ber. (M+H+): 341,2 gef.: 341,1 (100)

66- 3 : 4-Chlorbenzylamin; Rt = 13,28 min; ber. (M+H+): 341,2 gef.: 341,1 (100), 125,2 (10)

66- 4 : 2,4-Dichlorbenzylamin; Rt = 14,08 min; ber. (M+H+): 375,1 gef.: 375,1 (100), 159,1 (16), 91,1 (10)

66- 5 : 4-Methoxybenzylamin; Rt = 12,26 min; ber. (M+H+): 337,2 gef.: 337,1 (100), 229,3 (14), 121,3 (36).

66- 6 : 1-Methylnaphtylamin; Rt = 13,14 min; ber. (M+H+): 357,2 gef.: 357,1 (100)

66- 7 : α,α-Diamino-p-xylol; Rt = 8,57 min; ber. (M+H+): 336,2 gef.: 336,1 (100), 319,2 (46), 221,1 (12).

66- 8 : 2-Phenylethylamin; Rt = 12,97 min; ber. (M+H+): 321,1 gef.: 321,0 (100)


[Seite 152↓]

66- 9 : Homoveratrylamin; Rt = 11,97 min; ber. (M+H+): 381,2; gef.: 381,2 (100), 165,3(22).

66- 10 : Tyramin; Rt = 10,97 min; ber. (M+H+): 337,2 gef.: 337,1 (100).

66- 11 : (1S,2S) 2-Amino-1-(4-nitrophenyl)-1,3-propandiol; Rt = 10,58 min; ber. (M+H+): 412,2 gef.: 412,0 (100), 394,2 (12), 245,2 (10).

66- 12 : 3-Phenylpropylamin; Rt = 13,65 min; ber. (M+H+): 335,2 gef.: 335,0 (100)

66- 13 : 3,3-Diphenylpropylamin; Rt = 15,09 min; ber. (M+H+): 411,2 gef.: 411,5 (100)

66- 14 : Dehydroabiethylamin; Rt = 19,04 min; ber. (M+H+): 485,3 gef.: 485,7 (100)

66- 15 : Furfurylamin; Rt = 11,45 min; ber. (M+H+): 297,1 gef.: 297,0 (100), 229,1 (14)

66- 16 : Thiophenmethylamin; Rt = 11,80 min; ber. (M+H+): 313,1 gef.: 313,0 (100), 229,1 (16)

66- 17 : 2-Picolylamin; Rt = 7,06 min; ber. (M+H+): 308,2; gef.: 308,1 (100)

66- 18 : 3-Picolylamin; Rt = 6,97 min; ber. (M+H+): 308,2; gef.: 308,1 (100)

66- 19 : 4-Picolylamin; Rt = 6,60 min; ber. (M+H+): 308,2; gef.: 308,0 (100), 175,0 (14)

66- 20 : Nicotinhydrazin; Rt = 7,21 min; ber. (M+H+): 337,1 gef.: 337,1 (100), 217,1 (50), 195,2 (26).

66- 21 : Imidazol; Rt = 8,84 min; ber. (M+H+): 268,1 gef.: 282,2 (100), 91,3 (8)

Tabelle 14

Seite 43

66- 22 : Anilin; Rt = 12,04 min; ber. (M+H+): 293,2 gef.: 293,2 (100), 271,7 (48), 91,3 (16).

66- 23 : 2,4,6-Trimethylanilin; Rt = 13,30 min; ber. (M+H+): 335,2 gef.: 335,7

66- 24 : 3-Fluoranilin; Rt = 12,34 min; ber. (M+H+): 311,1 gef.: 311,2 (100), 91,1 (16)

66- 25 : 3-Chlor-4-fluoranilin; Rt = 13,31 min; ber. (M+H+): 345,1 gef.: 345,4 (100), 347,2 (32), 91,4 (14).

66- 26 : p-Anisidin; Rt = 11,86 min; ber. (M+H+): 323,2 gef.: 323,1 (100), 232,2 (24)

66- 27 : p-Phenoxyanilin; Rt = 14,26 min; ber. (M+H+): 385,2 gef.: 385,1 (100), 294,3 (8)

66- 28 : 4-Nitroanilin; ber. (M+H+): 338,2 gef.: nicht nachweisbar

66- 29 : 2-Amino-4-chlorphenol; Rt = 12,26 min; ber. (M+H+): 343,1 gef.: 343,1

66- 30 : 4-Aminobenzylalcohol; Rt = 9,84 min; ber. (M+H+): 323,2 gef.: 323,2 (100), 256 (26), 201 (14)

66- 31a,b : 1-Naphtylamin; Rt = 13,05 min; ber. (M+H+): 343,2 gef.: 343,6 (100), 252,8 (16).

66- 32 : 2-Aminopyridin; Rt = 9,81 min; ber. (M+H+): 294,3 gef.: 294,2 (100), 120.3 (12)

66- 34 : 2-Aminothiazol; Rt = 8,45 min; ber. (M+H+): 300,1 gef.: 300,1 (100), 283,1 (94), 243,2 (32), 192,2 (12)


[Seite 153↓]

Untersuchung von Phenolen zur Chlorsubstitution unter SPOT-Bedingungen

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Rink-Linkerderivat 35 acyliert und nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen wurde Fmoc-Glutaminsäure (Seitenketten tBu-geschützt) nach AAV 7 gekoppelt. Nach entfernen der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe Cyanurchlorid 5 wurde nach AAV 12 immobilisiert Zur Darstellung des Triazins 70 wurden die Phenole mit denen in der Tabelle angegebenen Konzentrationen nach AAV 15 umgesetzt. Nicht substituierte Chloratome wurden durch Inkubation der Membran bei 80°C (4 h) mit einer 5 M Lösung von Benzylamin zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen des Benzylaminüberschusses durch Waschen der Membran (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) wurde das Syntheseprodukt nach AAV 19 abgespalten.

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Triazine 70 aufgeführt (die Nummern entsprechen den jeweiligen Tabelleneinträgen).

Tabelle 15

Seite 48

70- 1 : Phenol; Rt = 11,66 min; ber. (M+H+): 423,1 gef.: 423,0 (100), 405,9 (14), 378,1 (16)

70- 2 : 2,4,6-Trimethylphenol; Rt = 13,49 min; ber. (M+H+): 465,2 gef.: 465,0 (100), 420,1 (26)

70- 3 : 4-Fluorphenol; Rt = 12,08 min; ber. (M+H+): 441,1 gef.: 441,0 (100), 424,1 (22), 396,1 (41), 378,1 (8)

70- 4 : Pentafluorphenol; Rt = 14,01 min; ber. (M+H+): 513,1 gef.: 513,2 (100), 496,1 (12), 468,4 (26)

70- 5 : 4-Nitrophenol; Rt = 12,38 min; ber. (M+H+): 468,1 gef.: 468,0 (100), 451,1 (18), 423,1 (38)

70- 6 : 4-Hydroxybenzotrifluorid; Rt = 13,70 min; ber. (M+H+): 491,1 gef.: 491,0 (100), 474,1 (16), 446,1 (22)

70- 7 : 4-Hydroxybenzonitril; Rt = 11,72 min; ber. (M+H+): 448,1 gef.: 448,0 (100), 431,6 (32), 404,4 (44)

70- 8 : Resorcin; Rt = 10,40 min; ber. (M+H+): 439,1 gef.: 439,0 (100), 422,1 (18), 394,1 (38)

70- 9 : (±)-1,1‘-Bi-(2-naphtol); Rt = 14,73 min; ber. (M+H+): 615,1 gef.: 615,1 (100), 598,2 (24), 570,2 (12)

70- 10 : 4-Hydroxybenzaldehyd; Rt = 11,09 min; ber. (M+H+): 451,1 gef.: 450,9 (100), 434,1 (24), 406,1 (38)

70- 11 : Vanilin; Rt = 11,34 min; ber. (M+H+): 481,1 gef.: 481,0 (100), 464,1 (18), 436,1 [Seite 154↓](38), 418,1 (6)

70- 12 : 8-Hydroxychinolin; Rt = 9,75 min; ber. (M+H+): 474,2 gef.: 474,3 (100), 457,3 (12) 429,9 (20)

Untersuchung von Alkylaminen zur Chlorsubstitution unter SPOT-Bedingungen und Mikrowellenbestrahlung

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Rink-Linkerderivat 35 acyliert und nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen wurde Cyanurchlorid 5 nach AAV 12 immobilisiert. Die Modellverbindung wurde durch Umsetzung von n-Butylamin mit dem membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazin nach AAV 14 erhalten. Zur Darstellung des Triazins 74 wurden die Amine mit denen in der Tabelle angegebenen Konzentrationen nach AAV 17 umgesetzt. Nicht substituierte Chloratome wurden durch Inkubation der Membran bei 80°C (4 h) mit einer 5 M Lösung von Butylamin zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen des Butylaminüberschusses (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) wurde das Syntheseprodukt nach AAV 19 abgespalten.

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Triazine 74 aufgeführt (die Nummern entsprechen den jeweiligen Tabelleneinträgen).

Tabelle 17

Seite 52

74- 1 : Pentylamin; Rt = 13,07 min; ber. (M+H+): 253,2 gef.: 253,1 (100)

74- 2 : Allylamin; Rt = 10,45 min; ber. (M+H+): 223,2 gef.: 223,2 (100),

74- 3 : Cyclohexylmethylamin; Rt = 13,02 min; ber. (M+H+): 265,2 gef.: 265,2 (100), 183,2 (20)

74- 4 : 1-Adamantylamin; Rt = 15,67 min; ber. (M+H+): 317,2 gef.: 317,1 (100), 239,0 (20)

74- 5 : Piperidin; Rt = 14,98 min; ber. (M+H+): 251,2 gef.: 251,0 (100)

74- 6 : 2,2,6,6-Tetrametylpiperidin; ber. (M+H+): 307,3 gef.: nicht nachweisbar

Tabelle 18

Seite 53

74- 7 : Hydroxylamin; Rt = 6,52 min; ber. (M+H+): 199,1 gef.: 199,0 (100)

74- 8 : Ethanolamin; Rt = 7,67 min; ber. (M+H+): 227,2 gef.: 227,3 (100)

74- 9 : 3-Amino-1-propanol; Rt = 8,08 min; ber. (M+H+): 241,2 gef.: 241,2 (100).


[Seite 155↓]

74- 10 : 6-Amino-1-hexanol; Rt = 10,22 min; ber. (M+H+): 283,2 gef.: 283,2 (100),265,1 (26)

74- 11 : Mono-Boc-ethylendiamin; freies Amin erhalten: Rt = 5,91 min; ber. (M+H+): 225,1 gef.: 226,0 (100), 209,1 (20)

74- 12 : 1,3-Diaminopropan; Rt = 6,43 min; ber. (M+H+): 240,2 gef.: 240,1 (100), 223,2 (18)

74- 13 : 1,4-Diaminobutan; Rt = 7,14 min; ber. (M+H+): 254,2 gef.: 254,2 (100), 237,2 (22)

74- 14 : 1,5-Diaminopentan; Rt = 7,75 min; ber. (M+H+): 268,2 gef.: 268,1 (100)

74- 15 : 1,6-Diaminohexan; Rt = 8,44 min; ber. (M+H+): 282,2 gef.: 282,2 (100)

74- 16 : Piperazin; Rt = 6,37 min; ber. (M+H+): 252,2 gef.: 252,0 (100), 167,1 (20)

74- 17 : 2-Methoxyethylamin; Rt = 9,68 min; ber. (M+H+): 241,2 gef.: 241,0 (100)

74- 18 : 4-(3-Aminopropyl)-morpholin; Rt = 7,01 min; ber. (M+H+): 310,2 gef.: 310,1 (100), 223,3 (38)

74- 19 : 1-(3-Aminopropyl)-pyrrolidin; Rt =7,38 min; ber. (M+H+): 294,2 gef.: 294,1 (98), 223,2 (100)

74- 20 : 2-Aminoacetaldehyd-diethylacetal; gefunden 2-Aminoaldehyd-Substituent; Rt = 6,30 min; ber. (M+H+): 225,2 gef.: 225,2 (100)

74- 21 : Glycinamid; Rt = 5,89 min; ber. (M+H+): 240,2 gef.: 240,1 (100), 223,2 (24), 195,2 (24)

74- 22 : β-Alaninamid; Rt = 7,46 min; ber. (M+H+): 254,2 gef.: 254,1 (95), 241,1 (38), 195,1 (100), 183,2 (44)

74- 23 : Glycinethylester; Rt = 10,18 min; ber. (M+H+): 269,1 gef.: 269,1 (100), 223,1 (14), 195,3 (20)

74- 24 : Glutaminsäure(tert.butyl)methylester; (gef. freie Säuren) Rt = 7,75 min; ber. (M+H+): 313,2 gef.: 313,1 (100), 267,1 (18)

Untersuchung von Arylaminen zur Chlorsubstitution unter SPOT-Bedingungen und Mikrowellenbestrahlung

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Rink-Linkerderivat 35 acyliert und, nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen wurde Cyanurchlorid 5 nach AAV 12 immobilisiert. Die Modellverbindung wurde durch Umsetzung von Benzylamin mit dem membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazin nach AAV 14 erhalten. Zur Darstellung des Triazins 76 wurden die Amine mit denen in der Tabelle angegebenen Konzentrationen nach AAV 17 umgesetzt. Nicht substituierte Chloratome wurden durch Inkubation der Membran bei 80°C (4 h) mit einer 5 M Lösung von Butylamin zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen des Benzylaminüberschusses (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) wurde [Seite 156↓]das Syntheseprodukt nach AAV 19 abgespalten.

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Triazine 76 aufgeführt (die Nummern entsprechen den jeweiligen Tabelleneinträgen), wobei lediglich die Syntheseprodukte auf-geführt sind, die nicht bereits bei den Untersuchungen bei Raumtemperatur erhalten wurden.

Tabelle 19

Seite 55

76- 10 : 1-(3-Aminopropyl)imidazol; Rt = 7,53 min; ber. (M+H+): 325,2 gef.: 325,0 (100), 257,2 (52).

Untersuchung von Phenolaten zur Chlorsubstitution unter SPOT-Bedingungen und Mikrowellenbestrahlung

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Rink-Linkerderivat 35 acyliert und nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen wurde Cyanurchlorid 5 nach AAV 12 immobilisiert. Die Modellverbindung wurde durch Umsetzung von Benzylamin mit dem membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazin nach AAV 14 erhalten. Zur Darstellung des Triazins 80 wurden die Phenolate mit denen in der Tabelle angegebenen Konzentrationen nach AAV 18 umgesetzt. Nicht substituierte Chloratome wurden durch Inkubation der Membran bei 80°C (4 h) mit einer 5 M Lösung von Benzylamin zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen des Benzylaminüberschusses (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) wurde das Syntheseprodukt nach AAV 19 abgespalten. Die Syntheseprodukte entsprachen deren von der Untersuchung zur Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, so dass die analytischen Daten nicht erneut aufgeführt sind.

Testsynthese am Glycin-Esterlinker

Eine Glycin-derivatisierte Zellulosemembran wird nach AAV 5 erhalten. Cyanurchlorid wird nach AAV 12 an die Aminogruppe des membrangebunden Glycins immobilisiert. Die Chlorsubstitution erfolgt nach AAV 14 mit A-01: Butylamin, A-02: 3-Amino-1-propanol, A-03: 1,3-Diaminopropan, A-04: 3-Chlorbenzylamin und A-05: 3-Fluoranilin.

Die Abspaltung unter gleichzeitiger Substitution verbleibender Chloratome am [1,3,5]-Triazinrest erfolgt durch Inkubation der Membran mit gasförmigem Methylamin für 16 h. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 10 % des Rohproduktes eines SPOTs (0,23 cm2) untersucht (Injektionsmenge 10 µl).

100- 1 : Rt = 8,27 min; ber. (M+H+): 268,2 gef.: 268,0 (92), 237,1 (82), 209,2 (100)

100- 2 : Rt = 9,08 min; ber. (M+H+): 270,2 gef.: 268,0 (92), 236,1 (82), 209,2 (100)


[Seite 157↓]

100- 3 : Rt = 9,08 min; ber. (M+H+): 269,2 gef.: 269,0 (100), 238,1 (75), 210,2 (30)

100- 4 : Rt = 9,94 min; ber. (M+H+): 336,1 gef.: 336,0 (100), 305,1 (52), 277,1 (40), 125,1 (12)

100- 5 : Rt = 8,95 min; ber. (M+H+): 306,1 gef.: 306,0 (72), 285,2 (48), 247,1 (100), 176,1 (18)

6.3.3.1 Halbautomatische Synthese einer Peptomer-[1,3,5]-Triazin-Bibliothek 91

Die Synthese erfolgte an einer Zellulosemembran mit einem Aminoderivatisierungsgrad von 830 nmol/cm2. Die Kopplung des Rink-Linkers und die Synthese des Peptomerteils wurden nach AAV 11 unter Einsatz eines Pipettierroboters vorgenommen. Als Amine zur Darstellung des Peptoidteil wurden hierbei; A-01: Benzylamin, A-02: 2,4-Dichlor-benzylamin, A-03: n-Butylamin, A-04: Mono-Boc-1,3-diaminopropan und A-05: 4-Amino-1-butanol verwendet. Insgesamt wurden von jedem Peptomer 2 Zeilen à 25 SPOTs synthetisiert.

Die Immobilisierung von Cyanurchlorid erfolgte nach AAV 12. Das Spotten der Amine zur Monochlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazinrest erfolgte mittels des Pipettierroboteres, wobei folgende Amine zum Einsatz kamen; B-01: 2-Aminoacetaldehyddiethylacetal, B-02: (1S,2S) 2-Amino-1-(4-nitrophenyl)-1,3-propandiol, B-03: 1-(3-Aminopropyl)-4-methylpiperazin, B-04: Cyclohexylmethyamin, B-05: 2-Methoxyethylamin, B-06: Histamin, B-07: Cyclohexylamin, B-08: 3-Aminophenol, B-09: Allylamin, B-10: Imidazol, B-11: 3-Fluoranilin, B-12: 2-Amino-1,3-propandiol, B-13: 3-Chlorbenzylamin, B-14: 5-Amino-1-pentanol, B-15: Glutaminsäure(tert.butyl)methylester, B-16: 4-Phenoxyanilin, B-17: Piperazin, B-18: p-Anisidin, B-19: 1,3-Diaminopropan, B-20: 1,5-Diaminopentan, B-21: β-Alaninamid, B-22: 3,3-Diphenylpropylamin, B-23: 3-Picolylamin, B-24: Aminoethylathiophen und B-25: Homoveratrylamin.

Nach 30 min Reaktionszeit wurde die Membran gewaschen (DMF, 4 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet. Die Chlorsubstitution durch Amine unter Mikrowellenbestrahlung erfolgte nach AAV 17 unter Einsatz von C-1: Benzylamin und C-2: Piperidin.

Die Abspaltung der Triazinderivate vom Rink-Linker erfolgte durch TFA in der Gasphase nach AAV 19. Die Numerierung der Verbindungen 91 erfolgte durch die Codierung der eingesetzten Amine 91- A-B-C ; so bedeutet 91- 1-1-1 , dass im Peptoidschritt Benzylamin, für die Chlorsubstitution bei Raumtemperatur2-Aminoacetaldehyddiethylacetal und Benzylamin unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt wurde. Zur Vereinfachung ist im Folgenden nur die Codierung für die entsprechenden Bausteine angegeben.


[Seite 158↓]

1-1-1;Rt = 11,81 min (81 %); ber. (M+H+): 521,0 gef.: 520,8 (100), 389,0 (10)

1-2-1;Rt = 13,37 min (76 %); ber. (M+H+): 674,1 gef.: 673,8 (100)

1-3-1;Rt = 11,74 min (92 %); ber. (M+H+): 619,1 gef.: 618,9 (100)

1-4-1;Rt = 14,95 min (90 %); ber. (M+H+): 575,1 gef.: 575,1 (100)

1-5-1;Rt = 12,34 min (93 %); ber. (M+H+): 537,1 gef.: 537,0 (100), 405,1 (10)

1-6-1;Rt = 11,32 min (89 %); ber. (M+H+): 573,1 gef.: 572,9 (100), 441,1 (10)

1-7-1;Rt = 14,32 min (87 %); ber. (M+H+): 561,1 gef.: 561,0 (100), 429,0 (10)

1-8-1;Rt = 12,84 min (86 %); ber. (M+H+): 571,1 gef.: 571,0 (100), 439,0 (10)

1-9-1;Rt = 12,86 min (91 %); ber. (M+H+): 519,1 gef.: 518,9 (100), 387,0 (20)

1-10-1;Rt = 12,58 min (85 %); ber. (M+H+): 539,1 gef.: 530,0 (100)

1-11-1;Rt = 14,36 min (65 %); ber. (M+H+): 573,1 gef.: 573,0 (100), 441,0 (10)

1-12-1;Rt = 11,47 min (89 %); ber. (M+H+): 553,1 gef.: 553,0 (100), 405,0 (10)

1-13-1;Rt = 14,47 min (91 %); ber. (M+H+): 603,1 gef.: 603,1 (100), 407,0 (10)

1-14-1;Rt = 12,26 min (92 %); ber. (M+H+): 565,1 gef.: 564,0 (100), 433,1 (20)

1-15-1;Rt = 11,70 min (40 %); ber. (M+H+): 609,1 gef.: 609,0 (100), Nebenprodukt; Rt = 13,98 min (50 %); Dibenzyl-[1,3,5]-triazinderivat

1-16-1;Rt =15,84 min (93 %); ber. (M+H+): 647,1 gef.: 647,0 (100)

1-17-1;Rt = 8,84 min (53 %); ber. (M+H+): 548,1 gef.: 548,1 (100) Nebenprodukt; Rt = 7,36 min (20 %); Dipiperazinyl-[1,3,5]-triazinderivat

1-18-1;Rt = 11,55 min (92 %); ber. (M+H+): 585,1 gef.: 585,1 (100),

1-19-1;Rt = 9,94 min (68 %); ber. (M+H+): 536,1 gef.: 536,1 (100)

1-20-1;Rt = 9,81 min (78 %); ber. (M+H+): 564,1 gef.: 564,0 (100)

1-21-1;Rt = 10,03 min (43 %); ber. (M+H+): 556,1 gef.: 556,0 (100)

1-22-1;Rt = 13,43 min (83 %); ber. (M+H+): 673,1 gef.: 673,0 (100)

1-23-1;Rt = 9,33 min (87 %); ber. (M+H+): 570,1 gef.: 570,1 (100)

1-24-1;Rt = 11,83 min (93 %); ber. (M+H+): 589,1 gef.: 589,0 (100)

1-25-1;Rt = 11,45 min (81 %); ber. (M+H+): 643,1 gef.: 643,2 (100)

2-1-1;Rt = 13,40 min (83 %); ber. (M+H+): 589,1 gef.: 559,0 (100), 456,9 (10)

2-2-1;Rt = 14,57 min (76 %); ber. (M+H+): 742,1 gef.: 742,0 (100)

2-3-1;Rt = 13,18 min (87 %); ber. (M+H+): 687,1 gef.: 687,1 (100)

2-4-1;Rt = 16,47 min (72 %); ber. (M+H+): 643,1 gef.: 643,0 (100)

2-5-1;Rt = 13,79 min (93 %); ber. (M+H+): 605,1 gef.: 604,9 (100)

2-6-1;Rt = 12,64 min (90 %); ber. (M+H+): 641,1 gef.: 641,0 (100), 509,0 (10)

2-7-1;Rt = 15,65 min (86 %); ber. (M+H+): 629,1 gef.: 628,9 (100), 496,9 (10)


[Seite 159↓]

2-8-1;Rt = 14,27 min (88 %); ber. (M+H+): 639,1 gef.: 639,2 (100)

2-9-1;Rt = 12,84 min (77 %); ber. (M+H+): 587,1 gef.: 587,2 (100)

2-10-1;Rt = 14,11 min (88 %); ber. (M+H+): 598,1 gef.: 598,0 (100)

2-11-1;Rt = 13,48 min (86 %); ber. (M+H+): 641,1 gef.: 641,2 (100)

2-12-1;Rt = 11,52 min (76 %); ber. (M+H+): 621,1 gef.: 621,2 (100)

2-13-1;Rt = 13,25 min (74 %); ber. (M+H+): 671,1 gef.: 671,1 (100)

2-14-1;Rt = 11,66 min (80 %); ber. (M+H+): 633,1 gef.: 633,1 (100)

2-15-1;Rt = 11,22 min (30 %); ber. (M+H+): 677,1 gef.: 677,1 (100)

2-16-1;Rt = 14,36 min (88 %); ber. (M+H+): 715,1 gef.: 715,1 (100)

2-17-1;Rt = 8,69 min (47 %); ber. (M+H+): 616,1 gef.: 616,2 (100)

2-18-1;Rt = 12,63 min (90 %); ber. (M+H+): 553,1 gef.: 553,1 (100)

2-19-1;Rt = 10,88 min (46 %); ber. (M+H+): 604,1 gef.: 604,1 (100)

2-20-1;Rt = 10,91 min (80 %); ber. (M+H+): 632,1 gef.: 632,1 (100)

2-21-1;Rt = 11,21 min (48 %); ber. (M+H+): 618,1 gef.: 618,2 (100)

2-22-1;Rt = 14,35 min (78 %); ber. (M+H+): 741,1 gef.: 741,2 (100)

2-23-1;Rt = 10,44 min (84 %); ber. (M+H+): 638,1 gef.: 638,1 (100)

2-24-1;Rt = 12,83 min (89 %); ber. (M+H+): 657,1 gef.: 657,1 (100)

2-25-1;Rt = 12,37 min (71 %); ber. (M+H+): 711,1 gef.: 711,3 (100)

3-1-1;Rt = 10,11 min (78 %); ber. (M+H+): 487,1 gef.: 487,1 (100)

3-2-1;Rt = 11,17 min (81 %); ber. (M+H+): 640,1 gef.: 640,1 (100)

3-3-1;Rt = 9,98 min (80 %); ber. (M+H+): 585,1 gef.: 585,1 (100)

3-4-1;Rt = 12,78 min (83 %); ber. (M+H+): 541,1 gef.: 541,1 (100)

3-5-1;Rt = 10,61 min (84 %); ber. (M+H+): 503,1 gef.: 503,1 (100)

3-6-1;Rt = 9,56 min (74 %); ber. (M+H+): 539,1 gef.: 539,1 (100)

3-7-1;Rt = 12,12 min (79 %); ber. (M+H+): 527,1 gef.: 527,2 (100)

3-8-1;Rt = 10,71 min (82 %); ber. (M+H+): 537,1 gef.: 537,1 (100)

3-9-1;Rt = 10,80 min (79 %); ber. (M+H+): 485,1 gef.: 485,1 (100)

3-10-1;Rt = 10,59 min (78 %); ber. (M+H+): 496,1 gef.:496,2 (100)

3-11-1;Rt = 11,93 min (76 %); ber. (M+H+): 539,1 gef.: 539,1 (100)

3-12-1;Rt = 9,73 min (84 %); ber. (M+H+): 519,1 gef.: 519,1 (100)

3-13-1;Rt = 12,40 min (91 %); ber. (M+H+): 569,1 gef.: 569,1 (100)

3-14-1;Rt = 10,46 min (74 %); ber. (M+H+): 531,1 gef.: 531,2 (100)

3-15-1;Rt = 9,88 min (20 %); ber. (M+H+): 575,1 gef.: 575,2 (100)


[Seite 160↓]

3-16-1;Rt = 13,14 min (88 %); ber. (M+H+): 613,1 gef.: 613,1 (100)

3-17-1;Rt = 9,84 min (36 %); ber. (M+H+): 514,1 gef.: 514,1 (100)

3-18-1;Rt = 11,43 min (92 %); ber. (M+H+): 551,1 gef.: 551,2 (100)

3-19-1;Rt = 9,43 min (68 %); ber. (M+H+): 502,1 gef.: 502,2 (100)

3-20-1;Rt = 9,66 min (79 %); ber. (M+H+): 530,1 gef.: 530,1 (100)

3-21-1;Rt = 9,77 min (38 %); ber. (M+H+): 516,1 gef.: 516,1 (100)

3-22-1;Rt = 13,51 min (77 %); ber. (M+H+): 639,1 gef.: 639,1 (100)

3-23-1;Rt = 9,15 min (89 %); ber. (M+H+): 536,1 gef.: 536,1 (100)

3-24-1;Rt = 11,77 min (91 %); ber. (M+H+): 555,1 gef.: 555,1 (100)

3-25-1;Rt = 11,36 min (82 %); ber. (M+H+): 609,1 gef.: 609,2 (100)

4-1-1;Rt = 7,56 min (74 %); ber. (M+H+): 488,1 gef.: 488,1 (100)

4-2-1;Rt = 8,31 min (68 %); ber. (M+H+): 641,1 gef.: 641,1 (100)

4-3-1;Rt = 7,28 min (84 %); ber. (M+H+): 586,1 gef.: 586,1 (100)

4-4-1;Rt = 9,78 min (75 %); ber. (M+H+): 542,1 gef.: 542,1 (100)

4-5-1;Rt = 7,06 min (75 %); ber. (M+H+): 504,1 gef.: 504,1 (100)

4-6-1;Rt = 6,44 min (68 %); ber. (M+H+): 540,1 gef.: 540,1 (100)

4-7-1;Rt = 8,88 min (73 %); ber. (M+H+): 528,1 gef.: 528,1 (100)

4-8-1;Rt = 7,88 min (70 %); ber. (M+H+): 538,1 gef.: 538,2 (100)

4-9-1;Rt = 7,41 min (71 %); ber. (M+H+): 486,1 gef.: 486,1 (100)

4-10-1;Rt = 7,41 min (65 %); ber. (M+H+): 497,1 gef.: 497,1 (100)

4-11-1;Rt = 9,34 min (79 %); ber. (M+H+): 540,1 gef.: 540,1 (100)

4-12-1;Rt = 6,03 min (78 %); ber. (M+H+): 520,1 gef.: 520,1 (100)

4-13-1;Rt = 9,35 min (74 %); ber. (M+H+): 570,1 gef.: 570,2 (100)

4-14-1;Rt = 7,26 min (83 %); ber. (M+H+): 532,1 gef.: 532,2 (100)

4-15-1;Rt = 8,57 min (84 %); ber. (M+H+): 576,1 gef.: 576,1 (100)

4-16-1;Rt = 10,82 min (87 %); ber. (M+H+): 614,1 gef.: 614,1 (100)

4-17-1;Rt = 6,01 min (64 %); ber. (M+H+): 515,1 gef.: 515,1 (100)

4-18-1;Rt = 8,44 min (85 %); ber. (M+H+): 552,1 gef.: 552,1 (100)

4-19-1;Rt = 6,08 min (51 %); ber. (M+H+): 503,1 gef.: 503,1 (100)

4-20-1;Rt = 6,62 min (79 %); ber. (M+H+): 531,1 gef.: 531,2 (100)

4-21-1;Rt = 6,62 min (53 %); ber. (M+H+): 517,1 gef.: 517,1 (100)

4-22-1;Rt = 10,77 min (77 %); ber. (M+H+): 640,1 gef.: 640,1 (100)

4-23-1;Rt = 6,16 min (83 %); ber. (M+H+): 537,1 gef.: 537,1 (100)


[Seite 161↓]

4-24-1;Rt = 8,72 min (83 %); ber. (M+H+): 556,1 gef.: 556,2 (100)

4-25-1;Rt = 8,52 min (72 %); ber. (M+H+): 610,1 gef.: 610,2 (100)

5-1-1;Rt = 7,53 min (68 %); ber. (M+H+): 503,1 gef.: 503,1 (100)

5-2-1;Rt = 9,22 min (49 %); ber. (M+H+): 656,1 gef.: 656,0 (100)

5-3-1;Rt = 8,03 min (73 %); ber. (M+H+): 601,1 gef.: 601,1 (100)

5-4-1;Rt = 10,99 min (75 %); ber. (M+H+): 557,1 gef.: 557,1 (100)

5-5-1;Rt = 8,22 min (68 %); ber. (M+H+): 519,1 gef.: 519,1 (100)

5-6-1;Rt = 7,56 min (86 %); ber. (M+H+): 555,1 gef.: 555,1 (100)

5-7-1;Rt = 10,05 min (71 %); ber. (M+H+): 543,1 gef.: 543,1 (100)

5-8-1;Rt = 8,87 min (71 %); ber. (M+H+): 553,1 gef.: 553,1 (100)

5-9-1;Rt = 8,63 min (80 %); ber. (M+H+): 501,1 gef.: 501,3 (100)

5-10-1;Rt = 8,40 min (74 %); ber. (M+H+): 512,1 gef.: 512,1 (100)

5-11-1;Rt = 7,45 min (75 %); ber. (M+H+): 555,1 gef.: 555,1 (100)

5-12-1;Rt = 10,32 min (72 %); ber. (M+H+): 535,1 gef.: 535,1 (100)

5-13-1;Rt = 10,38 min (73 %); ber. (M+H+): 585,1 gef.: 535,1 (100)

5-14-1;Rt = 8,29 min (64 %); ber. (M+H+): 547,1 gef.: 547,1 (100)

5-15-1;Rt = 9,71 min (68 %); ber. (M+H+): 591,1 gef.: 591,1 (100)

5-16-1;Rt = 11,61 min (79 %); ber. (M+H+): 629,1 gef.: 629,1 (100)

5-17-1;Rt = 7,15 min (72 %); ber. (M+H+): 530,1 gef.: 530,2 (100)

5-18-1;Rt = 9,52 min (74 %); ber. (M+H+): 567,1 gef.: 567,2 (100)

5-19-1;Rt = 7,39 min (81 %); ber. (M+H+): 518,1 gef.: 518,1 (100)

5-20-1;Rt = 7,74 min (72 %); ber. (M+H+): 546,1 gef.: 546,1 (100)

5-21-1;Rt = 7,59 min (46 %); ber. (M+H+): 532,1 gef.: 532,1 (100)

5-22-1;Rt = 11,76 min (78 %); ber. (M+H+): 655,1 gef.: 655,2 (100)

5-23-1;Rt = 7,24 min (79 %); ber. (M+H+): 552,1 gef.: 552,1 (100)

5-24-1;Rt = 9,81 min (74 %); ber. (M+H+): 571,1 gef.: 571,1 (100)

5-25-1;Rt = 9,61 min (78 %); ber. (M+H+): 625,1 gef.: 625,2 (100)


[Seite 162↓]

6.3.3.2 Cyclisierungen durch intramolekulare Substitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin an der Zellulosemembran

Variation der Ringgrösse

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurden die entsprechenden linearen Peptidsequenzen nach AAV 7 synthetisiert und Cyanurchlorid 5 am freien N-Terminus der Peptide nach AAV 12 immobilisiert. Die Cyclisierung durch nucleophile Substitution der temporär Boc-geschützten Lysinseitenkette erfolgte nach AAV 16. Die Syntheseprodukte wurden nach AAV 19 abgespalten.

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Triazine 106 aufgeführt.

Tabelle 23

Seite 70

106- 1 : GAFGAFGAFK; Rt = 12,69 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,9 (100), 1066,1 (10)

106- 2 : GAFGAFGAKF; Rt = 12,52 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,3 (100), 1068,0 (20)

106- 3 : GAFGAFGKAF; Rt = 12,53 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,4 (100), 1065,9 (30)

106- 4 : GAFGAFKGAF; Rt = 12,60 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,7 (100), 1065,9 (10)

106- 5 : GAFGAKFGAF; Rt = 12,76 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,7 (100), 1065,9 (15), 918,7 (15), 643,7 (15)

106- 6 : GAFGKAFGAF; Rt = 12,68 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,5 81009, 1065,6 (209, 981,5 8359, 964,6 (30), 643,6 (25), 572,5 (15)

106- 7 : GAFKGAFGAF; Rt = 13,05 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,4 (100), 1065,1 (15)

106- 8 : GAKFGAFGAF; Rt = 12,33 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,2 (100), 1065,1 (15)

106- 9 : GKAFGAFGAF; Rt = 11,30 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,2 (100), 1065,1 (15), 829,0 (20)

106- 10 : KGAFGAFGAF; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: nicht nachweisbar


[Seite innerhalb Tabelle 163↓]

Tabelle 24

Seite 72

Nach Beendigung der Synthese der jeweiligen linearen Peptide wurde die entsprechenden SPOTs von der restlichen Membran abgetrennt. Die Immobilisierung des Cyanurchlorids 5 und Cyclisierung erfolgte durch gemeinsame Inkubation in den entsprechenden Lösungen.

109- 1 : GAFGAFGAFK; Rt = 12,69 min; ber. (M+H+): 1082,4 gef.: 1082,7 (1009, 1065,9 (20)

109- 2 : AFGAFGAFK; Rt = 12,71 min; ber. (M+H+): 1025,4 gef.: 1025,7 (100), 1008,8 (20)

109- 3 : FGAFGAFK; Rt = 13,64 min; ber. (M+H+): 954,4 gef.: 954,4 (100), 794,2 (50), 647,3 (50), 576,3 (30), 263,2 (60)

109- 4 : GAFGAFK; Rt = 11,36 min; ber. (M+H+): 807,3 gef.: 807,5 8100), 790,6 (30)

109- 5 : AFGAFK; Rt = 11,47 min; ber. (M+H+): 750,3 gef.: 750,4 (100), 733,5 (25), 714,7 (20), 705,5 (10)

109- 6 : FGAFK; Rt = 12,41 min; ber. (M+H+): 679,3 gef.: 679,3 (100), 662,4 (35), 634,5 (20), 470,1 (15), 314,4 (10)

109- 7 : GAFK; Rt = 8,62 min; ber. (M+H+): 532,2 gef.: 532,1 (100), 514,9 (50), 487,0 (30), 322,9 (60)

109- 8 : AFK; Rt = 9,01 min; ber. (M+H+): 475,2 gef.: 475,0 (100), 458,2 (15), 439,1 (60)

109- 9 : FK; Rt = 8,82 min; ber. (M+H+): 404,2 gef.: 404,0 (100), 386,9 (30), 376,1 (35), 359,0 (30), 314,1 60

109- 10 : K; ber. (M+H+): 257,1 gef.: nicht nachweisbar

Zur Strukturuntersuchung wurde die Synthese des Tripeptides AFK an einer 5 x 5 cm grossen Membran 51 nach AAV 7 (je 1 ml der Lösung der jeweiligen aktivierten Aminosäure pro Kopplung) wiederholt. Nach Entfernen der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe mit 20 %-iger Piperidin-Lösung in DMF und Waschen der Membran (DMF; 3 x, MeOH; 3 x, DCM; 3 x 5,0 ml) erfolgte die Immobilisierung durch 30 min Inkubation des Syntheseharzes mit einer 50 %-igen Lösung von Cyanurchlorid in DCM (v/v) mit 1 % DIEA. Die Überschüsse wurden durch Waschen (DMF; 3 x, MeOH; 3 x, DCM; 3 x) entfernt. Zur Abspaltung der Boc-Gruppe an der ε-Gruppe des Lysins wurde die Membran mit TFA (95 % TFA in wässrigem DCM) eine Stunde inkubiert, gewaschen (DMF; 3 x, MeOH; 3 x, DCM; 3 x) und an der Luft getrocknet. Die Cyclisierung erfolgte nach AAV 16. Nach Abspaltung von der Membran nach AAV 19 wird 109- 8 in 10 ml Wasser:Acetonitril (1:1) erhält man 1,6 mg 109- 8 in Form beigen Pulvers.


[Seite 164↓]

109- 8 : C21H27ClN8O3; Rt = 9,01 min; ber. (M+H+): 475,2 gef.: 475,0 (100), 458,2 (15), 439,1 (60)

1 H-NMR (300MHz, CDCl3): δ = 7,88 (d, J= 8 Hz, 1H), 7,77 (d, J= 6 Hz, 1H), 7,66 (d, J= 9 Hz, 1H). 7,3-7,1 (m, 6H), 6,62 (d, J= 28 Hz, 21H), 4,58 (t, J= 8 Hz, 1H), 4,10 (dd, J= 4 Hz, J= 9 Hz, 1H), 3,99 (m, 1H), 3,31 (m, 1H), 2,91 (d, J= 9 Hz, 2H), 2,18 (t, J= 8 Hz, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,08 (d, J= 8 Hz, 3H),

HRMS von 109- 8 : ber. (M+H+): 475,1972 gef.: 475,1976

Tabelle 26

Seite 74

112- 1 : X = NH, n = 4; Rt = 8,96 min; ber. (M+H+): 404,2 gef.: 404,2 (100), 389,2 (10)

112- 2 : X = NH, n = 4; Rt = 8,01 min; ber. (M+H+): 390,2 gef.: 390,1 (100), 362,2 (20)

112- 3 : X = NH, n = 4; Rt = 8,93 min; ber. (M+H+): 376,2 gef.: 376,1 (100) 347,9 (40)

112- 4 : X = NH, n = 4; ber. (M+H+): 362,1 gef.: nicht nachweisbar

113- 1 : X = NHCH(CH3)CONH, n = 4; Rt = 9,44 min; ber. (M+H+): 475,2 gef.: 475,2 (100), 458,3 (20), 425,2 (50)

113- 2 : X = NHCH(CH3)CONH, n = 4 Rt = 9,75 min; ber. (M+H+): 461,2 gef.: 461,1 (100), 444,1 (20), 425,1 (60)

113- 3 : X = NHCH(CH3)CONH, n = 4; Rt = 8,54 min; ber. (M+H+): 447,2 gef.: 447,0 (100), 411,2 (40)

113- 4 : X = NHCH(CH3)CONH, n = 4; Rt = 8,49 min; ber. (M+H+): 433,1 gef.: 433,1 (100), 416,1 (40)


[Seite 165↓]

Kompatibilität mit proteinogen Aminosäuren

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurden die entsprechenden linearen Peptidsequenzen nach AAV 7 synthetisiert und Cyanurchlorid am freien N-Terminus der Peptide nach AAV 12 immobilisiert. Die Cyclisierung durch nucleophile Substitution der temporär Mtt-geschützten Lysinseitenkette erfolgte nach AAV 16. Nach erfolgter Cyclisierung wurden weitere im Molekül enthaltenden Seitenschutzgruppen entfernt und die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten.

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Triazine 119 aufgeführt (die Buchstaben entsprechen den jeweiligen Aminosäuren wie in Abb. 15 gezeigt).

X = A;Rt = 7,08 min; ber. (M+H+): 399,2 gef.: 399,0 (100), 381,8 (12), 363,2 (30)

X = D;Rt = 7,13 min; ber. (M+H+): 443,2 gef.: 443,0 (100), 407,2 (14)

X = E;Rt = 7,18 min; ber. (M+H+): 457,1 gef.: 456,9 (100), 412,2 (34)

X = F;Rt = 9,47 min; ber. (M+H+): 475,2 gef.: 475,0 (100), 458,2 (16), 439,1 (66)

X = G;Rt = 6,92 min; ber. (M+H+): 385,2 gef.: 385,0 (100), 349,1 (22)

X = H;Rt = 6,99 min; ber. (M+H+): 465,3 gef.: 465,0 (100), 429,0 (20)

X = I;Rt = 8,54 min; ber. (M+H+): 441,2 gef.: 441,0 (100), 405,2 (18)

X = K;Rt = 6,99 min; ber. (M+H+): 456,2 gef.: 456,1 (100), 420,2 (16)

X = L;Rt = 8,88 min; ber. (M+H+): 441,2 gef.: 441,0 (100), 424,2 (16), 405,1 (68)

X = M;Rt = 8,23 min; ber. (M+H+): 459,1 gef.: 458,9 (100), 423,2 (30)

X = N;Rt = 6,86 min; ber. (M+H+): 442,2 gef.: 441,9 (100), 424,9 (34), 406,1 (32), 379,8 (16)

X = P;Rt = 8,82 min; ber. (M+H+): 425,2 gef.: 424,9 (100), 389,1 (72)

X = Q;Rt = 6,87 min; ber. (M+H+): 456,1 gef.: 455,9 (100), 420,2 (38)

X = R;Rt = 7,18 min; ber. (M+H+): 484,2 gef.: 484,1 (100)

X = S;Rt = 6,84 min; ber. (M+H+): 415,2 gef.: 414,9 (100), 379,1 (26)

X = T;Rt = 6,85 min; ber. (M+H+): 429,2 gef.: 429,0 (100), 393,1 (48)

X = V;Rt = 7,75 min; ber. (M+H+): 427,3 gef.: 427,0 (100), 391,2 (62), 365,0 (16)

X = W;Rt = 9,75 min; ber. (M+H+): 514,1 gef.: 513,9 (96), 478,2 (100), 299,9 (14), 266,0 (20), 283,2 (12)

X = Y;Rt = 8,05 min; ber. (M+H+): 491,0 gef.: 491,0 (100), 455,1 (30)


[Seite 166↓]

Einfluss der N -terminalen Aminosäure auf die Cyclisierungseffizienz

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran 27 wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurden die entsprechenden linearen Peptidsequenzen nach AAV 7 synthetisiert und Cyanurchlorid am freien N-Terminus der Peptide nach AAV 12 immobilisiert. Die Cyclisierung durch nucleophile Substitution der temporär Mtt-geschützten Lysinseitenkette erfolgte nach AAV 16. Nach erfolgter Cyclisierung wurden weitere im Molekül enthaltenden Seitenschutzgruppen entfernt und die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten. Im Folgenden sind die analytischen Daten der Cyclen aufgeführt (die Buchstaben entsprechen den jeweiligen Aminosäuren wie in Abb. 16 gezeigt).

X = A;Rt = 9,26 min; ber. (M+H+): 475,2 gef.: 475,3 (100), 457,9 (20), 439,6 (34)

X = D;Rt = 7,94 min; ber. (M+H+): 519,2 gef.: 518,9 (100), 501,9 (18), 483,2 (68) 310,0 (22)

X = E;Rt = 8,35 min; ber. (M+H+): 533,1 gef.: 532,9 (100), 497,2 (72), 471,0 (16)

X = F;Rt = 12,58 min; ber. (M+H+): 551,2 gef.: 551,0 (100), 515,2 (62)

X = G;Rt = 8,51 min; ber. (M+H+): 461,2 gef.: 461,0 (100), 444,0 (46), 425,1 (62)

X = H;Rt = 7,31 min; ber. (M+H+): 541,1 gef.: 541,1 (100), 5050,2 (72)

X = I;Rt = 12,31 min; ber. (M+H+): 517,2 gef.: 517,0 (100), 481,2 (70)

X = K;Rt = 7,28 min; ber. (M+H+): 532,2 gef.: 532,1, 515,0 (12), 496,3 (18)

X = L;Rt = 12,32 min; ber. (M+H+): 517,2 gef.: 517,0 (100), 481,2 (84)

X = M;Rt = 11,15 min; ber. (M+H+): 535,2 gef.: 534,9 (100), 499,2 (84)

X = N;Rt = 7,41 min; ber. (M+H+): 518,1 gef.: 518,0 (100), 482,2 (62)

X = P;Rt = 11,26 min; ber. (M+H+): 501,1 gef.: 501,0 (100), 465,3 (28)

X = Q;Rt = 7,49 min; ber. (M+H+): 532,1 gef.: 532,0 (100), 515,1 (46), 496,1 (88), 459,4 (28)

X = R;Rt = 7,67 min; ber. (M+H+): 560,2 gef.: 560,2 (100)

X = S;Rt = 7,66 min; ber. ((M+H+): 491,2 gef.: 491,0 (100), 455,1 (86)

X = T;Rt = 8,39 min; ber. (M+H+): 505,2 gef.: 504,9 (100), 469,2 (96)

X = V;Rt = 11,38 min; ber. (M+H+): 503,2 gef.: 503,0 (96), 467,2 (100)

X = W;Rt = 12,25 min; ber. (M+H+): 590,1 gef.: 590,0 (100), 554,2 (54),


[Seite 167↓]

X = Y;Rt = 10,41 min; ber. (M+H+): 567,2 gef.: 567,0 (100), 531,1 (60)

Cyclisierungsrichtung

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran 27 wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurden die entsprechenden linearen Peptidsequenzen nach AAV 7 synthetisiert und die N-Termini der jeweiligen Sequenzen acetyliert. Die Mtt-Schutzgruppe wurde durch Inkubation der Membran mit 1 % TFA und 5 % TIPS in DCM für eine Stunde entfernt. Die Membran wird gewaschen (2 % DIEA in DMF, 3 x 2 min, DMF, 3 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 1 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und anschliessend an der Luft getrocknet. Cyanurchlorid wurde an der freien Amino-seitengruppe der Peptide nach AAV 12 immobilisiert. Die Cyclisierung durch nucleophile Substitution der temporär Boc-geschützten Lysinseitenkette erfolgte nach AAV 16. Die Syntheseprodukte wurden nach AAV 19 abgespalten.

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Verbindungen 122-124 aufgeführt.

Tabelle 27

Seite 79

122: Ac-Lys-Lys; X = NH; Rt = 8,15 min; ber. (M+H+): 427,2 gef.: 427,1 (100), 340,2 (30), 278,2 (25)

123: Ac-Lys-Phe-Lys; X = NH-Phe-; Rt = 8,96 min; ber. (M+H+): 574,3 gef.: 574,1 (100), 559,2 (40), 529,2 (15), 365,1 (15)

124: Ac-Lys-Ala-Phe-Lys; X = NH-Phe-Ala; Rt = 10,18 min; ber. (M+H+): 645,3 gef.: 645,1 (100), 628,2 (20), 600,3 (15)


[Seite 168↓]

Nucleophile Substitution an cyclischen Monochlor-[1,3,5]-triazinderivaten

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran 27 wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurde das Peptid Ala-Phe-Lys(Boc) nach AAV 7 synthetisiert und Cyanurchlorid am freien N-Terminus der Peptide nach AAV 12 immobilisiert. Die Cyclisierung durch nucleophile Substitution der temporär Boc-geschützten Lysinseitenkette erfolgte nach AAV 16. Die verbleibenden Chloratome nach erfolgter Substitution wurde nach AAV 17 bzw. AAV 18 mit den jeweiligen Nucleophilen umgesetzt. Die Syntheseprodukte wurden nach AAV 19 abgespalten.

125- 1 : Butylamin; Rt = 16,21 min; ber. (M+H+): 512,3 gef.: 512,2 (100)

125- 2 : Piperidin; Rt = 9,92 min; ber. (M+H+): 524,3 gef.: 524,2 (100)

125- 3 : 4-Amino-1-butanol; Rt = 8,71 min; ber. (M+H+): 528,3 gef.: 528,0 (100)

125- 4 : 1,3-Diaminopropan; Rt = 7,64 min; ber. (M+H+): 513,3 gef.: 513,0 (100)

125- 5 : N-Methylpiperazin; Rt = 7,83 min; ber. (M+H+): 539,3 gef.: 539,2 (100)

125- 6 : Benzylamin; Rt = 11,01 min; ber. (M+H+): 546,3 gef.: 546,0 (100)

125- 7 : Anilin; Rt = 10,62 min; ber. (M+H+): 532,3 gef.: 532,0 (100)

125- 8 : p-Anisidin; Rt = 10,64 min; ber. (M+H+): 562,3 gef.: 562,2 (100), 534,3 (10)

125- 9 : Phenol; Rt = 10,94 min; ber. (M+H+): 533,2 gef.: 533,0 (100)

125- 10 : 4-Fluorphenol; Rt = 11,31 min; ber. (M+H+): 551,3 gef.: 551,2 (100), 523,1 (10)

Peptomere

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurde die entsprechenden linearen Peptomere nach AAV 10 synthetisiert. Cyanurchlorid wurde am freien N-Terminus der Peptomere nach AAV 12 immobilisiert. Die Cyclisierung durch nucleophile Substitution der temporär Boc-geschützten Aminoseitenkette erfolgte nach AAV 16. Nach erfolgter [Seite 169↓]Cyclisierung wurden die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten.

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Triazine 129 / 130 aufgeführt.

Tabelle 29

Seite 83

129- 1 : X = NH, 1,6-Diaminohexan; Rt = 11,71 min; ber. (M+H+): 432,2 gef.: 432,1 (100), 404,2 (15)

129- 2 : X = NH, 1,5-Diaminopentan; Rt = 11,27 min; ber. (M+H+): 418,2 gef.: 418,0 (100), 401,0 (25), 390,1 (30)

129- 3 : X = NH, 1,4-Diaminobutan; Rt = 10,41 min; ber. (M+H+): 404,2 gef.: 404,0 (100), 387,0 (35), 376,2 (35)

129- 4 : X = NH, 1,3-Diaminopropan; Rt = 9,66 min; ber. (M+H+): 390,1 gef.: 390,0 (100), 361,9 (35), 288,2 (30)

129- 5 : X = NH, Ethylendiamin; ber. (M+H+): 376,1 gef.: nicht nachweisbar

130- 1 : X = NHCH(CH3)CONH, 1,6-Diaminohexan; Rt = 10,57 min; ber. (M+H+): 503,2 gef.: 503,1 (100), 467,3 (20)

130- 2 : X = NHCH(CH3)CONH, 1,5-Diaminopentan; Rt = 9,81 min; ber. (M+H+): 489,2 gef.: 489,1 (100), 474,0 (90), 453,3 (30), 256,1 (25)

130- 3 : X = NHCH(CH3)CONH, 1,4-Diaminobutan; Rt = 9,29 min; ber. (M+H+): 475,2 gef.: 475,1 (100), 460,1 (35), 439,1 (55), 327,9 (20), 300,0 (20), 242,2 (20)

130- 4 : X = NHCH(CH3)CONH, 1,3-Diaminopropan; Rt = 8,64 min; ber. (M+H+): 461,2 gef.: 461,0 (100), 425,2 (40), 314,1 (15), 286,0 (20)

130- 5 : X = NHCH(CH3)CONH, Ethylendiamin; Rt = 8,13 min; ber. (M+H+): 447,2 gef.: 447,0 (100), 300,1 (30), 272,1 (15)

HRMS von Nr. 9: ber. (M+H+): 461.1816, gef. = 461.1800.

Peptoide

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurden die entsprechenden linearen Peptoide nach AAV 9 synthetisiert. Cyanurchlorid wurde am freien N-Terminus nach AAV 12 immobilisiert. Die Cyclisierung durch nucleophile Substitution der temporär Boc-geschützten Aminoseitenkette erfolgte nach AAV 16. Nach erfolgter Cyclisierung wurden die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten.


[Seite 170↓]

Im Folgenden sind die analytischen Daten der Cyclen 135 aufgeführt.

Tabelle 30

Seite 85

135- 1 : R = Butyl; Rt = 11,71 min; ber. (M+H+): 503,2 gef.: 502,9 (84), 467,2 (100)

135- 2 : R = 4-Hydroxybutyl; Rt = 11,71 min; ber. (M+H+): 519,2 gef.: 518,9 (92), 483,2 (100)

135- 3 : R = 5-Aminopentyl; Rt = 11,71 min; ber. (M+H+): 532,2 gef.: 532,1 (100), 496,2 (30)

135- 4 : R = Benzyl; Rt = 11,71 min; ber. (M+H+): 537,2 gef.: 536,9 (100), 501,2 (82),

135- 5 : R = p-Methoxyphenyl; Rt = 11,71 min; ber. (M+H+): 553,2 gef.: 553,0 (100)

2,4,6-Trichlorpyrimidin 136

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurde das Peptid Ala-Phe-Lys(Boc) nach AAV 7 synthetisiert. 2,4,6-Triclorpyrimidin 136 wurde durch Inkubation der Membran in einer 50 %-igen Lösung von 136 in NMP mit 10 % DIEA für zwei Stunden bei 80°C immobilisiert. Nach Waschen der Membran (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und Trocknen an der Luft wurden die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten und mittels HPLC-MS Technik analysiert.

Nr. 138a: R = H; Rt = 11,12 min; ber. (M+H+): 510,2 gef.: 510,1 (100), 218,0 (60), 190,1 (30)

Nr. 138c: R = H; Rt = 12,03 min; ber. (M+H+): 510,2 gef.: 510,2 (100) 218,0 (40),

Nr. 138b: R = Boc; Rt = 13,98 min; ber. (M+H+): 610,2 gef.: 610,0 (30), 510,2 (100), 129,5 (30)

Nr. 138d: R = Boc; Rt = 14,86 min; ber. (M+H+): 610,2 gef.: 610,0 (100), 510,2 (90)

Vor der Cyclisierung wurde die Boc-Seitenkettenschutzgruppe durch Behandlung mit 80 %-iger TFA für eine Stunde und Waschen der Membran (DMF, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min) entfernt. Für den Fall einer Trifluoracetylierung der ε-Aminogruppe des Lysins, wurde die Membran zwei Stunden mit einer 1 M wässrigen HCl-Lösung behandelt, um diese ε-Aminogruppe zu entschützen. Die HCl-Lösung wurde im Anschluss durch Waschen (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) entfernt, und die Membran an der Luft getrocknet. Für die Cyclisierung wurde die Membran mit 20 %-iger DIEA Lösung in NMP inkubiert, und zwei Mal für jeweils drei Minuten einer Mikrowellenstrahlung ausgesetzt, wobei zwischen den Bestrahlungen erneut Base [Seite 171↓]zugegeben wurde. Nach Waschen der Membran (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und Trocknen an der Luft wurden die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten und mittels HPLC-MS Technik analysiert.

Nr. 140: Rt = 8,87 min; ber. (M+H+): 474,2 gef.: 474,1 (100), 438,3 (20)

HRMS: ber. (M+H+): 474,2020 gef.: 474,2028

4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin 141

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurde das Peptid Ala-Phe-Lys(Boc) nach AAV 7 synthetisiert. 4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin 141 wurde durch Inkubation der Membran in einer 1 M Lösung von 141 in NMP mit 1 % DIEA für zwei Stunden bei 80°C immobilisiert. Nach Waschen der Membran (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und Trocknen an der Luft wurden die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten und mittels HPLC-MS Technik analysiert.

Nr. 143a: R = H; Rt = 10,44 min; ber. (M+H+): 521,2 gef.: 521,2 (100)

Nr. 143b: R = Boc; Rt = 14,08 min; ber. (M+H+): 621,2 gef.: 621,0 (40), 510,2 (100)

Vor der Cyclisierung wurde die Boc-Seitenkettenschutzgruppe durch Behandlung mit 80 %-iger TFA für eine Stunde und Waschen der Membran (DMF, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2min) entfernt. Für den Fall einer Trifluoracetylierung der ε-Aminogruppe des Lysins, wurde die Membran zwei Stunden mit einer 1 M wässrigen HCl-Lösung behandelt, um diese ε-Aminogruppe zu entschützen. Die HCl-Lösung wurde im Anschluss durch Waschen (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2min; Et2O, 1 x 2 min) entfernt, und die Membran an der Luft getrocknet. Für die Cyclisierung wurde die Membran eine Stunde mit einer 1 %-igen DIEA Lösung in NMP inkubiert. Nach Waschen der Membran (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und Trocknen an der Luft wurden die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten und mittels HPLC-MS Technik analysiert.

Nr. 144: Rt = 10,98 min; ber. (M+H+): 484,2 gef.: 484,2 (100), 467,3 (20)

HRMS: ber. (M+H+): 484,2183 gef.: 484,2187


[Seite 172↓]

2,6,8-Trichlor-7-methyl-7 H -purin 145

Eine aminoderivatisierte Zellulosemembran wurde nach AAV 6 mit dem Photolinker acyliert. Nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe wurde das Peptid Ala-Phe-Lys(Boc) nach AAV 7 synthetisiert. 2,6,8-Trichlor-7-methyl-7H-purin 145 wurde durch Inkubation der Membran in einer 50 %-igen Lösung von 145 in NMP mit 10 % DIEA für zwei Stunden bei 80°C immobilisiert. Nach Waschen der Membran (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und Trocknen an der Luft wurden die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten und mittels HPLC-MS Technik analysiert.

Nr. 147: R = Boc; Rt = 12,54 min; ber. (M+H+): 664,2 gef.: 664,1 (40), 564,2 (100)

Nr. 147: R = Boc; Rt = 13,46 min; ber. (M+H+): 664,2 gef.: 664,0 (30), 607,1 (40), 564,2 (100)

Nr. 147- 1 : R = H; Rt = 8,89 min; ber. (M+H+): 564,2 gef.: 564,2 (100), 528,2 (10)

Nr. 147- 1 : R = H; Rt = 9,96 min; ber. (M+H+): 564,2 gef.: 564,2 (100) 528,2 (20)

Vor der Cyclisierung wurde die Boc-Seitenkettenschutzgruppe durch Behandlung mit 80 %-iger TFA für eine Stunde und Waschen der Membran (DMF, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min) entfernt. Für den Fall einer Trifluoracetylierung der ε-Aminogruppe des Lysins, wurde die Membran zwei Stunden mit einer 1 M wässrigen HCl-Lösung behandelt, um diese ε-Aminogruppe zu entschützen. Die HCl-Lösung wurde im Anschluss durch Waschen (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) entfernt, und die Membran an der Luft getrocknet. Für die Cyclisierung wurde die Membran mit 20 %-iger DIEA Lösung in NMP inkubiert, und drei Mal für jeweils drei Minuten einer Mikrowellenbestrahlung ausgesetzt, wobei zwischen den Bestrahlungen erneut Base zugegeben wurde. Nach Waschen der Membran (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) und Trocknen an der Luft wurden die Syntheseprodukte nach AAV 19 abgespalten und mittels HPLC-MS Technik analysiert.

Nr. 148: Rt = 8,78 min; ber. (M+H+): 528,2 gef.: 528,2 (100)

HRMS: ber. (M+H+): 528,2238 gef.: 528,2254


[Seite 173↓]

6.3.3.3 [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken für das Festphasen-Screening

[1,3,5]-Triazin-Bibliothek 149

Die Darstellung der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzelverbindungen erfolgte auf einer aminoderivatisierten Zellulosemembran 27 (AAV 4, 20 x 30 cm, 220 nmol/cm2). Die Synthese der Dipeptide erfolgte nach AAV 8 (0,1 µl Volumen an Aminosäurelösung pro SPOT), wobei alle 20 proteinogenen Aminosäuren eingesetzt wurden. Auf die freien N-Termini der Dipeptide wurde Cyanurchlorid nach AAV 12 immobilisiert, die Substitution des zweiten Chloratomes erfolgte nach AAV 14, allerdings wurden die Quadrate auf der Zellulosemembran durch Pipettieren von 300 µl der entsprechenden Aminlösung benetzt. Als Amine wurden eingesetzt; A01 = Cyclohexylmethylamin, A02 = Cyclohexylamin, A03 = Cyclopropylmethylamin, A04 = α-Naphtylmetylamin, A05 = Benzylamin, A06 = 4-(2-Aminoethyl)-morpholin, A07 = 1-(3-Aminopropyl)-4-methylpiperazin, A08 = 1-(3-Amino-propyl)-pyrrolidin, A09 = Tyramin, A10 = 3-Picolylamin, A11 = Tetrahydrofurfurylamin, A12 = 3-Amino-1-propanol, A13 = Isopropoxypropylamin, A14 = Homoveratrylamin, A15 = Tryptamin, A16 = n-Octylamin, A17 = Ethylendiamin, A18 = 3-Chlor-4-fluoranilin, A19 = 3-Chlorbenzylamin und A20 = Thiophenamin. Nach Entfernen der Überschüsse wurden verbliebene Chloratome am [1,3,5]-Triazinring durch Inkubation der Membran mit einer 50 %-igen Piperidinlösung bei 80°C für 4 h substituiert. Überschüssiges Piperidin wurde durch Waschen (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) entfernt und die Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten nach AAV 19 abgespalten.

[1,3,5]-Triazin-Bibliothek 153-Zellulose

Die Darstellung der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 60 Einzelverbindungen erfolgte auf einer [Seite 174↓]aminoderivatisierten Zellulosemembran 27 (AAV 4, 8 x 12 cm, 260 nmol/cm2). Die Synthese der Dipeptide erfolgte nach AAV 7. Auf die freien N-Termini der Dipeptide wurde Cyanurchlorid nach AAV 12 immobilisiert, die Substitution des zweiten Chloratomes durch Amine erfolgte nach AAV 14, die Substitution mit Phenolaten nach AAV 15. Hierbei wurden folgende Nucleophile eingesetzt: A01 = Cyclohexylmethylamin, A02 = Cyclohexylamin, A03 = 1,4-Diaminobutan, A04 = 3-Chlorbenzylamin, A05 = 3-Picolylamim, A06 = 4-(2-Aminoethyl)-morpholin, A07 = 4-Fluorphenol, A08 = 8-Hydroxychinolin, A09 = 4-Hydroxybenzaldehyd, A10 = Resorcin. Nach Entfernen der Überschüsse wurden verbliebene Chloratome am [1,3,5]-Triazinring mit einer 50 %-igen Piperidinlösung nach AAV 17 substituiert. Überschüssiges Piperidin wurde durch Waschen (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) entfernt und die Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten nach AAV 19 abgespalten.

6.3.3.4 [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken für das Agardiffusions-Assay

Die Darstellung der untersuchten Bibliotheken erfolgte an einer Glycin-Ester-modifizierten Zellulosemembran. Die Synthese der entsprechenden Peptidsequenzen erfolgte nach AAV 7, wobei jeweils drei Replika synthetisiert wurden. Ein Replika wurde N-terminal acetyliert, die beiden verbleibenden Peptide wurden nach AAV 12 mit Cyanurchlorid 5 umgesetzt. Einer dieser beiden Replika wurde dann nach Entfernen der Mtt-Schutzgruppe von der Seitengruppe des Lysins nach AAV 16 cyclisiert. Anschliessend wurden alle Seitenkettenschutzguppen entfernt, und die Verbindungen von der Membran abgespalten (AAV 19), wobei bislang nicht umgesetzte Chloratome am Triazinring durch Methylamin substituiert wurden.

Zusätzlich wurde ein weiteres Replika von einigen ausgewählten Sequenzen synthetisiert, welches nach Cyclisierung durch Cyanurchlorid 5 für eine HPLC-MS Analytik verwendet wurde. Es wurden die cyclischen [1,3,5]-Triazin-Peptide(C) analysiert, da sich aus dem auftreten von Fehl- bzw. Abbruchsequenzen auch auf die Reinheit der Peptide schliessen lies. Angegeben sind die Nummern der Verbindungen aus den jeweiligen Tabellen. Die Reinheiten der Verbindungen wurde nach UV-Absorption der Rohprodukte bei 220 nm bestimmt. Alle Verbindungen wurden ohne weiter Aufreinigung im Assay eingesetzt.

Tabelle 39

Seite 114

1-5C; Rt = 10,32 min (40 %); ber. (M+H+): 1002,5 gef.: 1002,5 (100), 874,3 (20), 773,4 (20)

1-6C; Rt = 11,31 min (42 %); ber. (M+H+): 1149,6 gef.: 1149,6 (100), 1048,5 (35)

1-9C; Rt = 12,02 min (23 %); ber. (M+H+): 1538,6 gef.: 1538,4 (80), 770,1 (1002M+2H+)

1-12C; Rt = 11,31 min (26 %); ber. (M+H+): 1680,8 gef.: 1680,7 (400), 1246,6 (30), 841,3 (1002M+2H+)

1-14C; Rt = 11,31 min (31 %); ber. (M+H+): 1563,8 gef.: 1563,5 (90), 1462,6 (50), 782,7 (1002M+2H+)

1-17C; Rt = 11,52 min (39 %); ber. (M+H+): 1187,6 gef.: 1187,5 (100), 1046,4 (10), 594,6 (30)


[Seite 175↓]

1-20C; Rt = 6,90 min (78 %); ber. (M+H+): 707,4 gef.: 707,3 (100), 579,4 (20)

Tabelle 40

Seite 116

2-1C; Rt = 7,11 min (70 %); ber. (M+H+): 536,3 gef.: 536,3 (100)

2-3C; Rt = 9,20 min (66 %); ber. (M+H+): 797,5 gef.: 797,3 (100)

2-5C; Rt = 11,61 min (68 %); ber. (M+H+): 1130,6 gef.: 1130,5 (90), 739,7 (1002M+2H+)

2-7C; Rt = 11,01 min (49 %); ber. (M+H+): 1359,7 gef.: 1359,6,3 (30), 968,3 (50), 680,4 (1002M+2H+)

2-9C; Rt = 12,30 min (44 %); ber. (M+H+): 1607,8 gef.: 1607,5 (30), 804,5 (1002M+2H+), 608,9 (30)

2-10C; Rt = 12,06 min (32 %); ber. (M+H+): 1695,5 gef.: 1695,3 (20), 1303,7 (100), 848,9 (80), 803,9 (70), 652,7 (40)

2-12C; Rt 11,86 min (44 %); ber. (M+H+): 1664,8 gef.: 1664,7 (35), 833,1 (1002M+2H+)

2-15C; Rt = 12,66 min (41 %); ber. (M+H+): 1394,4 gef.: 1394,4 (60), 698,1 (1002M+2H+)

2-18C; Rt = 10,31 min (48 %); ber. (M+H+): 986,5 gef.: 986,3 8100), 862,2 (30)

2-20C; Rt = 8,06 min (63 %); ber. (M+H+): 672,4 gef.: 674,2 (100)

Tabelle 41

Seite 117

3-1C; Rt = 12,65 min (43 %); ber. (M+H+): 1394,4 gef.: 1394,5 (60), 698,1 (1002M+2H+)

3-2C; Rt = 12,14 min (55 %); ber. (M+H+): 1293,6 gef.: 1293,5 (100), 647,6 (85)

3-5C; Rt = 13,03 min (42 %); ber. (M+H+): 1266,6 gef.: 1266,5 (100), 1088,4 (40), 633,9 (20)

3-6C; Rt = 9,94 min (18 %); ber. (M+H+): 1208,6 gef.: 1208,6 (90), 1195,3 (25), 605,1 (100 2M+2H+)

3-7C; Rt = 10,20 min (23 %); ber. (M+H+): 1247,6 gef.: 1247,4 (100), 1146,5 (25), 624,5 (80)

3-8C; Rt = 12,69 min (30 %); ber. (M+H+): 1280,6 gef.: 1280,4 (100), 1267,2 (40), 641,1 (70)

Tabelle 42

Seite 118

4-1C; Rt = 12,26 min (53 %); ber. (M+H+): 1293,6 gef.: 1293,1 (100), 647,4 (30)

4-2C; Rt = 10,87 min (43 %); ber. (M+H+): 1146,5 gef.: 1146,1 (100), 10900,1 (35)


[Seite 176↓]

4-3C; Rt = 11,69 min (46 %); ber. (M+H+): 1192,6 gef.: 1192,1 (100), 1179,2 (35), 763,0 (30), 596,7 (30)

4-4C; Rt = 12,79 min (45 %); ber. (M+H+): 1165,5 gef.: 1165,1 (100), 987,1 (40)

4-5C; Rt = 9,94 min (38 %); ber. (M+H+): 1107,5 gef.: 1107,1 (100)

4-6C; Rt = 10,28 min (38 %); ber. (M+H+): 1146,5 gef.: 1146,2 (100), 573,8 (40)

4-7C; Rt = 12,84 min (40 %); ber. (M+H+): 1179,5 gef.: 1179,2 (100), 590,1 (20)

6.3.4 Spezielle Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an PP-Membranen

Untersuchung von Alkylaminen zur Chlorsubstitution unter SPOT-Bedingungen

Eine aminoderivatisierte PP-Membran wurde nach AAV 6 mit dem Rink-Linkerderivat 35 acyliert und nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen wurde Cyanurchlorid 5 nach AAV 13 immobilisiert. Zur Darstellung des Triazins 60 wurden die Amine mit denen in der Tabelle angegebenen Konzentrationen nach AAV 14 am Rink-Linker umgesetzt. Nicht substituierte Chloratome wurden durch Inkubation der Membran bei 80°C (4 h) mit einer 5 M Lösung von Piperidin zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen des Piperidinüberschusses (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) wurde das Syntheseprodukt nach AAV 19 abgespalten.

Die Syntheseprodukte entsprachen derer von der Zellulosemembran, so dass im folgenden nur solche aufgeführt sind, die nicht bereits in Kapitel 6.3.3 beschreiben sind.

Tabelle 9

Seite 33

60- 12 : Cyclopentylamin; Rt = 12,70 min; ber. (M+H+): 263,2 gef.: 263,2 (100), 195,2 (20)

Untersuchung von Arylaminen zur Chlorsubstitution unter SPOT-Bedingungen

Eine aminoderivatisierte PP-Membran wurde nach AAV 6 mit dem Rink-Linkerderivat 35 acyliert und nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen wurde Cyanurchlorid 5 nach AAV 13 immobilisiert. Zur Darstellung des Triazins 66 wurden die Amine mit denen in der Tabelle angegebenen Konzentrationen nach AAV 14 am Rink-Linker umgesetzt. Nicht substituierte Chloratome wurden durch Inkubation der Membran bei 80°C (4h) mit einer 5 M Lösung von Benzylamin zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen des Benzylaminüberschusses (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) wurde das Syntheseprodukt nach AAV 19 abgespalten.

Die Syntheseprodukte entsprachen deren von der Zellulosemembran, so dass in Folgenden nur solche aufgeführt sind, die nicht bereits von der Zellulosemembran erhalten wurden.

Tabelle 14

Seite 43

66- 33 : 3-Aminopyridin; Rt = 12,87 min; ber. (M+H+): 263,2 gef.: 263,3 (100), 195,2 (26)


[Seite 177↓]

Untersuchung von Phenolen zur Chlorsubstitution unter SPOT-Bedingungen

Eine aminoderivatisierte PP-Membran wurde nach AAV 6 mit dem Rink-Linkerderivat 35 acyliert und nach Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen wurde Fmoc-Glutaminsäure (Seitenketten tBu-geschützt) nach AAV 13 gekoppelt. Nach Entfernen der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppen wurde Cyanurchlorid 5 nach AAV 12 immobilisiert. Zur Darstellung des Triazins 76 wurden die Phenole mit denen in der Tabelle angegebenen Konzentrationen nach AAV 15 umgesetzt. Nicht substituierte Chloratome wurden durch Inkubation der Membran bei 80°C (4 h) mit einer 5 M Lösung von Benzylamin zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen des Benzylaminüberschusses (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) wurde das Syntheseprodukt nach AAV 19 abgespalten.

Da die Syntheseprodukte den Untersuchungen an der Zellulose entsprachen sind die analytischen Daten nicht erneut aufgeführt.

Testsynthese am Carbamatlinker 41

Die Synthese des Carbamatlinkers erfolgte nach AAV 6, wobei das Aktivcarbonat mit Ethylendiamin (5 M in NMP) 4 h bei 50°C umgesetzt wurde. Die Immobilisierung von Cyanurchlorid 5 erfolgte nach AAV 13 und die Substitution des Chloratoms bei Raumtemperatur am Dichlor-[1,3,5]-triazin nach AAV 14. Die Substitution unter Mikrowellenbestrahlung wurde mit Benzylamin nach AAV 17 durchgeführt. Die Syntheseprodukte wurden nach AAV 19 abgespalten.

103- 1 : 5-Amino-1-pentanol; Rt = 9,10 min; ber. (M+H+): 446,2 gef.: 446,1 (100), 329,2 (20)

103- 2 : 1,4-Diaminobutan; Rt = 7,45 min; ber. (M+H+): 331,2 gef.: 331,1 (100), 314,2 (18), 186,2 (28)

103- 3 : 2-Methoxyethylamin; Rt = 8,89 min; ber. (M+H+): 318,2 gef.: 318,1 (100), 301,2 (25)

103- 4 : 3-Phenylpropylamin; Rt = 12,28 min; ber. (M+H+): 378,2 gef.: 378,1 (100), 361,2 (35)

103- 5 : p-Anisidin; Rt = 10,91 min; ber. (M+H+): 366,2 gef.: 366,1 (100), 349,2 (30)

[1,3,5]-Triazin-Bibliothek 153-PP

Die Darstellung der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 60 Einzelverbindungen erfolgte auf einer aminoderivatisierten PP-Membran 31 (8 x 12 cm, 180 nmol/cm2). Die Synthese der Dipeptide erfolgte nach AAV 7. Auf die freien N-Termini der Dipeptide wurde Cyanurchlorid nach AAV 13 immobilisiert, die Substitution des zweiten Chloratomes durch Amine erfolgte nach AAV 14, die Substitution mit Phenolaten nach AAV 15. Hierbei wurden folgende Nucleophile eingesetzt: A01 = Cyclohexylmethylamin, A02 = Cyclohexylamin, A03 = 1,4-Diaminobutan, A04 = 3-Chlorbenzylamin, A05 = 3-[Seite 178↓]Picolylamim, A06 = 4-(2-Aminoethyl)-morpholin, A07 = 4-Fluorphenol, A08 = 8-Hydroxychinolin, A09 = 4-Hydroxybenzaldehyd, A10 = Resorcin. Nach Entfernen der Überschüsse wurden verbliebene Chloratome am [1,3,5]-Triazinring mit einer 50 %-igen Piperidinlösung nach AAV 17 substituiert. Überschüssiges Piperidin wurde durch Waschen (DMF, 4 x 2 min; Wasser, 2 x 2min; MeOH, 2 x 2 min; DCM, 2 x 2 min; Et2O, 1 x 2 min) entfernt und die Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten nach AAV 19 abgespalten.

6.4 Durchführung der biologischen Assays

6.4.1 Bindungsstudien mit mAk TAB-2 an Triazin-Bibliotheken

Die zellulosegebundene [1,3,5]-Triazin-Bibliothek wurde mit Methanol (1 x 5 min) und TBS (3 x 10 min) gewaschen. Zur Unterdrückung unspezifischer Bindung wurde mit Blockierungs-Lösung (aus 10 ml Blocking Reagent und 90 ml TBS, 1 h) inkubiert. Es schloss sich eine Inkubation mit mAk TAB-2 an (1 µg/ml in Blockierungs-Lösung, 100 ml, 2 h). Die Membran wurde mit TBS/0,05 % Tween® 20 gewaschen (3 x 1 min). Gebundener Antikörper wurde durch Inkubation mit einem zweiten, Peroxidase-markierten anti-Maus IgG Antikörper nachgewiesen (1 µg/ml in Blockierungs-Lösung, 100 ml, 2 h). Nach Waschen mit TBS/0,05 % Tween® 20 (6 x 4 min) wurde die enzymatische Aktivität unter Verwendung eines Chemolumineszenz-Substrats (Luminescence Substrate Solution A und B: 100:1, 40 ml, 1 min) mittels Chemolumineszenz am Gerät LumiImager™ nachgewiesen (Belichtungszeit 1-10 min je nach Signalintensität, so dass eine Aufnahme mit hohem Signal/Rausch Verhältnis zustande kommt). Für die Bibliothek aus 8000-Triazinderivaten war eine Belichtungszeit von 10 min, bei den kleinen Zellulose und PP-Membran gebundenen Bibliothek waren bereits 5 min ausreichend, um ein klares Signal/Rausch-Verhältnis des Bildes zu erhalten.

6.4.2 Kompetitiver ELISA am mAk TAB-2

Die Inhibitionseffekte der am Harz synthetisierten Triazine wurden in Lösung bestimmt. Hierzu wurden Mikrotiterplatten (Maxisorb, 96 Reaktionskammern, Nunc) über Nacht mit 50 µl einer Lösung von VVSHFNDCPDSHTQFAF (1µg/ml) in wässrigem Carbonat-Puffer (pH 9,6) bei 4° inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS/0,1 % Tween® 20 wurden in die Reaktionskammern die wässrige Triazin-Lösungen verschiedener Konzentrationen pipettiert. Zu den Triazin-Lösungen wurde eine Lösung (0,2 mg/ml) Peroxidase[162] markierter mAk TAB-2 in PBS/0,1 % Tween® 20 mit 6 % GelifundolS gegeben und 4h inkubiert. Anschliessend wurde dreimal mit PBS/0,1 % Tween20 gewaschen. Die enzymatische Aktivität des immobilisierten TAB-2 wird durch Zusatz von 5,5 mM o-Phenylendiamin-Hydrochlorid und 8,5 mM Wasserstoffperoxid in 0,1 M Citratpuffer bei pH 5,0 bestimmt bei erreichen einer optischen Dichte von 1,0 (10 min) und nachfolgender Zugabe von 1 M Schwefelsäure mit 0,05 M Natriumsulfit. Die Absorbtion wurde mittels eines ELISA-Readers bei 490 nm bestimmt. Diese Bestimmung wurde insgesamt zweimal durchgeführt und aus den erhaltenden Messdaten wurden die IC50 Werte durch graphische Auftragung nach Koltz (100 % /(100 %*OD) gegen 1/c; mit 100% = Ø OD ohne Bindungspartner, c = Inhibitor-Konzentration)[145] erhalten.


[Seite innerhalb Tabelle 179↓]

Verbindung

IC50-Wert [ µmol]

 

Verbindung

IC50-Wert [ µmol]

18-6-19

600 ± 300

 

A1

500 ±100

19-6-10

> 104

 

A6

>103

8-7-6

> 104

 

A9

90 ± 10

3-7-6

> 104

 

A10

>103

6-3-1

400 ± 300

 

D4

850 ± 50

7-8-6

> 104

 

D5

400 ± 100

6.4.3 Agardiffusions-Assay mit rSSTR2-enthaltenden Reporterhefen

Das Screening wird in einer 12 x 12 cm Schale durchgeführt. Zur ausreichenden Bedeckung des Bodens mit dem Agar-Reporterhefen-Gemisch werden 30 ml benötigt. Für das Agargemisch werden 8,5 ml einer 3,6 %-igen wässrigen Agarlösung (w/w), 3,0 ml einer 20 %-igen wässrigen Glucoselösung (w/w), 3,0 ml 6,7 %-iger wässriger „Yeast Nitrogen Base“ (DIFCO, USA) in 13,5 ml Wasser suspendiert kurz erhitzt bis zum Entstehen einer klaren Lösung (ca. 2 min in eine 810 W Mikrowelle) und auf 50°C abgekühlt. Anschliessend gibt man 1,5 ml Phosphat-Puffer (pH 7,2), 0,3 ml 2 M wässriger 3­Aminotriazol Lösung (w/w), 0,15 ml 10 %-iger X-Gal-Lösung in DMF (w/w) und 0,03 ml einer 5 M wässrigen Ampicilin-Lösung (w/w) zu. In einem Zentrifugenröhrchen mit Schraubdeckel werden ca. 15 Millionen Hefezellen als Startkultur vorgelegt und mit 30 ml des Agargemisches bei 30°C versetzt. Nach gutem Durchmischen wird die Schale vorsichtig unter Vermeidung von Luftblasen mit der Suspension ausgegossen und gewartet bis der Agar aushärtet. Nach ca. 30 min können pro 12 x 12 cm Schale ca. 30 SPOTs aufgelegt werden. Die Auswertung erfolgt nach einer Inkubationszeit von drei Tagen bei 30°C.

Es empfiehlt sich die jeweiligen Resultate durch Fotografie oder elektronischer Speicherung zu sichern, da die Schalen nicht unbegrenzt lagerfähig sind.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
09.11.2004