Darstellung und Screening  von kombinatorischen  [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken  an planaren Oberflächen  DISSERTATION Dirk Scharn 1 1 1.1 228#115 2 500#279 565#187 3 515#165 4 378#156 5 479#102 585#245 6 586#421 7 1.2 8 2 9 540#312 2.1 10 2.1.1 11 593#131 512#131 12 512#131 2.1.2 13 593#163 14 586#221 586#121 15 16 428#127 17 2.2 2.2.1 18 585#106 2.2.2 19 593#363 20 572#287 233#111 21 586#294 22 2.2.3 23 593#302 586#304 24 2.3 375#114 25 140#116 586#309 26 27 28 29 2.4 2.4.1 30 593#207 31 32 593#322 33 35 586#309 585#420 36 37 38 40 585#331 41 43 45 585#241 2.4.2 46 585#239 47 593#369 48 2.5 50 2.5.1 51 496#207 52 53 55 56 58 2.5.2 585#289 59 61 2.6 593#455 62 566#651 63 64 585#126 585#173 65 593#219 66 585#219 2.7 67 3 68 3.1 69 3.1.1 70 593#282 71 3.1.2 72 73 3.1.3 74 593#167 75 3.2 593#375 76 585#401 77 585#404 3.3 78 570#364 79 3.4 80 586#377 3.5 3.5.1 82 586#404 83 84 3.5.2 585#519 85 3.6 3.6.1 86 89#115 586#241 87 88 440#330 89 585#350 90 410#332 3.6.2 91 89#97 585#121 92 93 3.6.3 121#109 94 593#385 95 96 593#376 97 417#287 3.7 98 4 99 4.1 578#134 100 585#188 101 102 586#381 103 585#346 104 593#289 105 583#395 106 322#257 107 108 555#665 109 586#376 110 111 4.2 585#128 112 567#291 593#182 113 114 585#216 116 585#227 118 119 338#320 433#257 120 315#269 5 121 122 231#104 343#109 123 415#300 124 592#293 125 248#148 6 126 6.1 127 128 6.2 6.2.1 129 6.2.2 6.2.2.1 127#89 130 172#193 131 539#187 6.2.2.2 132 190#154 198#143 133 175#201 181#195 134 174#140 180#205 135 223#104 242#132 241#132 136 234#132 244#117 137 225#117 6.3 6.3.1 138 376#44 246#106 139 586#142 140 576#107 141 142 143 375#114 144 375#114 391#112 466#124 145 585#146 391#128 146 471#128 147 6.3.2 6.3.2.1 6.3.2.2 218#103 6.3.2.2.1 6.3.2.2.2 148 6.3.3 110#108 149 150 151 143#109 152 153 159#134 154 110#108 155 143#108 156 131#107 157 6.3.3.1 158 159 160 161 162 6.3.3.2 218#137 163 164#120 164 169#146 165 175#146 166 178#164 167 172#190 168 189#171 169#139 169 178#181 170 539#187 171 248#166 172 257#166 173 6.3.3.3 230#205 230#205 174 6.3.3.4 175 176 6.3.4 177 173#109 178 6.4 6.4.1 6.4.2 179 6.4.3 Verwendete Abkürzungen 180 61#28 51#26 51#26 Literaturverzeichnis 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 Selbständigkeitserklärung 191 192 Danksagung 193 194 Lebenslauf 195 de Inhaltsverzeichnis Hilfe Entwicklung einer SPOT-Synthesestrategie für [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intermolekulare SNAr

Ein wichtiger Punkt für die geplante Entwicklung von kombinatorischen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an planaren Oberflächen ist die Auswahl eines geeigneten Trägermaterials für die Synthese. Die verwendeten Oberflächen müssen sich in derart funktionalisieren lassen, dass eine stabile Verankerung verschiedenster Linker gegenüber Nucleophilen möglich ist (A in Schema 5). Eine Aminofunktionalisierung der eingesetzten Linker ist von Vorteil, da so eine möglichst hohe Diversität der späteren [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch den „Einbau“ linearer Oligomere wie Peptide oder Peptoide erreicht werden kann (B in Schema 5). Die Anknüpfung des [1,3,5]-Triazinringes kann durch Reaktion der membrangebundenen Aminogruppen mit Cyanurchlorid 5 erfolgen (C in Schema 5).

Schema 5: Geplante Vorgehensweise zur Erzeugung von diversen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an planaren Oberflächen; ein Linker wird auf einer planaren Oberfläche verankert ( A ), Reaktion der Aminofunktion des Linkers mit geeigneten Reagenzien zur Diversitätssteigerung ( B ) mit anschliessender Immobilisierung von Cyanurchlorid ( C ) und schrittweisem Austausch der verbleibenden Chloratome ( D ) sowie Abspaltung vom polymeren Träger ( E ).

Eine Erhöhung der Diversität der [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken sollte durch Verwendung von N- und O-Nucleophilen zur schrittweisen Substitution der Chloratome erreicht werden (D in Schema 5). Die Reaktion von 5 mit Alkoholen wurde bislang nur in Lösung bei erhöhten Temperaturen[7, 8, 23, 75, 76] beschrieben. Im Verlauf dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob spezielle Bedingungen für die SPOT-Synthese gefunden werden können. Um den erforderlichen Arbeitsaufwand deutlich zu minimieren, sollte die Abspaltung der [1,3,5]-Triazine von dem polymeren Träger parallel und unter Erhalt der örtlichen Adressierung erfolgen (E in Schema 5). Die SPOTs mit den einzelnen Verbindungen können dann im Nachhinein in Mikrotiterplatten ausgestanzt werden, um sie für Analytik oder Screening einzusetzen.

Planare Oberflächen in der SPOT-Synthese

Mit voranschreitender Entwicklung in der Festphasensynthese wurden eine Vielzahl von Materialien als Träger verwendet. Anfänglich beschränkte man sich auf polymere Harze und deren Derivatisierung. Polymere Membranen wurden hingegen erst später als Trägermaterial für die Festphasensynthese entdeckt.[77, 78] Glas wurde als flächiger Träger in der Peptidsynthese unter Lichtbestrahlung beschrieben, wobei ca. 600 Peptide pro cm2 synthetisiert werden konnten.[33, 79] Allerdings sind die erhaltenen Mengen der Peptide an der Glasoberfläche sehr gering (ca. 10 pmol), was zu Problemen bei der Analytik der Produkte führen kann. Kürzlich konnte eine Glasoberfläche für die kovalente Verankerung von nicht-peptidischen Strukturen genutzt werden.[80] Diese Mengen sind lediglich ausreichend für Bindungsstudien mit Proteinen in Festphasen-Assays, jedoch nicht für Assays in Lösung.

Allgemein haben poröse Membranen gegenüber Harzen einige Vorteile wie z.B. höhere mechanische Belastbarkeit und ein besseres Verhältnis von Oberfläche zu Funk-tionalisierungsgrad.[81] So konnten Zellulosemembranen als planaren Oberflächen für die Synthese von Peptiden etabliert werden.[35, 45, 49, 52, 82-89]

Es sollte untersucht werden, ob Zellulosemembranen trotz des Überschusses an Hydroxylgruppen ebenso gut für die Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken geeignet sind, wie die bereits verwendeten Syntheseharze. Als Alternative galt es, eine Polypropylenmembran mit unterschiedlichen Modifikationen zu untersuchen und die Derivatisierung für den Einsatz in der SPOT-Synthese zu optimieren.

Zellulosemembranen; etablierte Träger für Oligomersynthesen

Zellulose ist eines der häufigsten Polymere weltweit. Das fasrige Netzwerk von Polysacchariden besteht aus isotaktischen β-1,4-Polyacetalen von 4-O-β-D-Glucopyranosyl-D-glucose. Zellulose ist vollständig inert gegenüber der Behandlung mit typischen Lösungsmitteln der SPOT-Synthese wie DMSO, Wasser, DMF, NMP, und DCM, aber auch gegenüber Toluol und verschiedenen Ethern. Bezüglich vieler Basen ist Zellulose weitgehend stabil, mehrstündige Behandlungen mit methanolischer Natriummethylat-Lösung in hoher Konzentration oder mit konzentrierten Aminen bei erhöhten Temperaturen (70°C und mehr), selbst Mikrowellenbestrahlung, sind möglich. Einige Basen wie Hydrazin-Lösungen hingegen zersetzen Zellulose jedoch, genauso wie Behandlung mit Säuren in Abhängigkeit von Konzentration, Wassergehalt, Temperatur und Zeit.[90] Die glycosidischen Bindungen der Zellulose werden durch starke Säuren gespalten, so dass es zu einem Verlust der Struktur der Zellulose im Verlauf der Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung in der Peptidsynthese (z.B. 95 % TFA, 5 % Wasser oder DCM) kommen kann. Um dies zu vermeiden, wird auf mechanische Beanspruchung (z.B. Schütteln) und lange Reaktionszeiten (> 1 Stunde) verzichtet.[45] Die Abspaltung der Seitenschutzgruppen wird in der Regel wiederholt, da unter den trägerbedingten Einschränkungen die Entschützung unvollständig sein kann. Diese Einschränkungen, sowie der Überschuss von ständig präsenten Hydroxylgruppen sind vermutlich dafür verantwortlich, dass Zellulosemembranen in der kombinatorischen Chemie als Trägermaterial weitgehend unüblich sind. Merrifield untersuchte Zellulosegranulat auf die Verwendbarkeit als Träger für die Festphasensynthese von Peptiden bereits 1963.[24] Seine negativen Ergebnisse sind vermutlich auf die (damals übliche) schwache Aktivierung der Aminosäuren als p-Nitrophenylester zurückzuführen, da Zellulosescheiben (∅ = 1,5 cm) 1988 als Harzersatz in Reaktoren erfolgreich zur Peptidsynthese verwendet wurden.[91] Für die Synthese von Peptiden an grösseren Zelluloseoberflächen (10 x 14 cm) veresterte Frank die Hydroxylgruppen der Zellulose direkt mit Aminosäuren.[34] Hierzu inkubierte er vorgetrocknete Zellulose in einer 0,2 M Lösung von Fmoc-geschütztem β-Ala-Anhydrid in DMF unter Zusatz von 1,2 Äq. NMI. Anschliessend wurden die N-terminalen Fmoc-Schutzgruppen durch Behandlung der Membran mit einer 20 %-igen Piperidin-Lösung abgespalten (Schema 6). Nach Entfernen des Piperidins wurden auf die getrocknete Zellulosemembran aktivierte Fmoc-Aminosäure-Lösungen pipettiert.

Schema 6: Aminoderivatisierung der Zellulosemembran 18 durch Veresterung mit 19 nach Frank. [34]

Der Derivatisierungsgrad kann direkt durch quantitative Bestimmung der UV-Absorption des Piperidin/DBF-Adduktes (ε301=8100)[92] bei der Fmoc-Abspaltung (Fmoc-Quantifizierung) bestimmt werden.

Eine Verankerung von Peptiden oder anderen Substanzen direkt mit den Hydroxylgruppen der Zellulose führt jedoch zu einigen Einschränkungen. So kann die wachsende Peptidkette auf der Dipeptidstufe 22 durch Bildung eines 6-Ringes 23 ( Diketopiperazin) unter Spaltung von der Zellulosemembran abgelöst werden (Schema 7).[93]

Schema 7: Abspaltung von Peptiden von der Zellulose durch Diketopiperazin-Bildung.

Eine vorzeitige Spaltung der Esterbindung direkt zur Zellulose während der Synthese unter stark basischen Bedingungen (wie etwa bei der Fmoc-Abspaltung) kann mit einer esterfreien Aminoderivatisierung der Zellulose verhindert werden. Die erste Methode wurde von Volkmer-Engert et al. erarbeitet, wobei die Zellulosemembran mit aminogeschützen Epoxiden umgesetzt wurden.[84] Nach Öffnung des Epoxidringes durch die Hydroxyl-gruppen erfolgt die Entschützung der Aminogruppe. Hierbei ist eine relativ geringe Aminoderivatisierung im Bereich von 70‑85 nmol/cm2 ( 7,7‑9,3 µmol/g) erreicht worden, verglichen mit typischen Syntheseharzen mit Derivatisierungsgraden von 200‑1000 µmol/g.

Einen höheren Derivatisierungsgrad von bis zu 1,5 µmol/cm2 gemessen an der Beladung an Aminofunktionen erreicht man durch eine Alkylierung der Zellulose 18 mit Epibromhydrin 24 im Sauren und anschliessender Bromsubstitution mit einer 1 M Lösung von 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin 26 in DMF (Schema 8)[52] oder Diaminopropan.[86]

Schema 8: Optimierte esterfreie Aminoderivatisierung von Zellulosemembranen. [52]

Als Quantifizierung der esterfreien Aminoderivatisierung diente die Umsetzung der erhaltenen Aminogruppen mit Fmoc-β-Ala-OPfp. Hierzu wurden drei SPOTs aus der Zellulosemembran ausgestanzt und mit einer 0,6 M Lösung von Fmoc-β-Ala-OPfp in NMP für eine Stunde inkubiert. Die Vollständigkeit der Acylierung wurde durch Ausbleiben der Blaufärbung mit Bromphenolblau bestätigt. Die SPOTs wurden gewaschen und eine Fmoc-Quantifizierung durchgeführt.

Eine Untersuchung der Homogenität der Derivatisierung wurde bislang noch nicht vorgenommen. Für die Durchführung von z.B. Bindungsassays ist eine homogene Derivatisierung jedoch wichtig. Bei Bindungsassays wird die Stärke der Bindungen eines Proteins an verschiedene Verbindungen an der Zellulosemembran bestimmt. Somit muss sichergestellt werden, dass Unterschiede bei der Bindung nicht auf unterschiedliche Mengen von Zielprodukten an der Membran beruhen. Im Folgenden wurde deswegen die Homogenität an Aminoderivatisierung einer Zellulosemembran bestimmt. Die Quantifizierung wurde an einer 3 x 5 cm grossen Membran durch Inkubation mit einer 0,6 M Lösung von Fmoc-β-Ala-OPfp in NMP und anschliessendem Waschen der Membran und Ausstanzen einzelner SPOTs durchgeführt. Das Raster der Auflösung ist bedingt durch die SPOT-Fläche (ca. 0,23 cm2) zwar recht gross, eine feinere Auflösung kann durch Ausstanzen kleinerer Flächen erreicht werden, vergleichbar der Beladungsunterschiede einzelner Harzkugelgrössen. Die Fmoc-Quantifizierung ergab einen durchschnittlichen Wert von 1470 nmol/cm2. Hierbei wurden Schwankungen von ca. 7,5 % um den Mittelwert beobachtet. Dieser Wert ist etwas grösser als der einer Quantifizierung dreier direkt nebeneinander liegender SPOTs. Solche Schwankungen sind für spätere Festphasen- und Lösungs-Assays tolerabel, da bei der Beurteilung der Assays ohnehin Variationen in den chemischen Ausbeuten der einzelnen Produkte bedacht werden müssen.

Die Verwendung von 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin bringt zwei Vorteile mit sich. Zum Einen lassen sich an der erhaltenden Aminofunktion Linker anbringen, dessen Bindungen zur Membran nicht durch starke Basen oder Säuren gespalten werden können. Desweiteren bildet das Diamin einen Abstandshalter (spacer) zwischen Zellulose und den zu testenden Substanzen. Somit wird deren sterische Zugänglichkeit für die Proteine während eines Festphasen-Bindungsassays erhöht.[20]

Polypropylenmembranen; neue Träger in der SPOT-Synthese

Es ist nahezu unmöglich an der Zellulosemembran mit dem inhärenten Überschuss an Hydroxylgruppen selektiv benzylische oder phenolische Hydroxylgruppen immobilisierter Reagenzien zu alkylieren oder acylieren. Um diesen Nachteil der Zellulosemembranen, und die eingeschränkte Säurestabilität zu umgehen, sollte eine Alternative gefunden werden. Da bereits Synthesen von Peptiden an polymeren Filmen in Reaktoren beschrieben wurden,[77, 94, 95] fiel die Wahl auf eine Polypropylen-Filtermembran. Im Gegensatz zu einer bereits durch die Hydroxylgruppen funktionalisierte Zellulosemembran musste an dieser PP-Membran eine Funktionalisierung erst erzeugt werden. Eine Funktionalisierung von PP-Pellets wurde durch Oxidation der Oberfläche mittels Crom(III)-Oxid zur Carbonsäure erreicht.[96] Eine Alternative stellt die „Pfropf-Polymerisation“ dar, bei der unter radioaktiver[97] oder UV-Bestrahlung[98] ein zweites Polymer auf dem Basispolymer aufgebracht wird. Die Initiierung der Polymerisation unter UV-Bestrahlung ist aufgrund der einfacheren und ungefährlicheren Arbeit von Vorteil. Hierfür wird die PP-Membran in einer Lösung von Benzophenon und Pfropfmonomer behandelt. Benzophenon dient unter UV-Bestrahlung als Radikalstarter und initiiert eine Polymerisation ausgehend von der PP-Oberfläche, allerdings erfolgt die Polymerisation zum Teil auch in Lösung. Die in Lösung gebildeten Homopolymere können durch Waschen entfernt werden. An den Fasern der PP-Membran verbleiben die kovalent gebundenen Copolymerstränge (Schema 9).

Schema 9: Aufbringen eines funktionalisierten Pfropfpolymers an den Fasern der PP-Membran durch photoinitiierte Copolymerisation.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden derivatisierte Filtermembranen der Firma Millipore verwendet, die von der Firma PolyAn GmbH durch photoinitiierte Copolymerisation modifiziert wurden. Dies gelang durch die Aufpolymerisation von Acrylsäure und Acrylsäuremethylester mittels photoinitiierter „Pfropf-Polymerisation“. Die erhaltenen kovalent gebundenen Polymerstränge verringern die Hydrophobizität der Membran-oberfläche, was für Tests mit Proteinen in wässrigen Puffersystemen von Vorteil ist, da so ein unspezifisches Binden der Proteine minimiert wird. Zur gravimetrischen Bestimmung des Derivatisierungsgrades wurde die PP-Membran mit Methanol und n-Hexan extrahiert, getrocknet und gewogen. Nach der Copolymerisation wurde die Membran erneut extrahiert, um anhaftendes Homopolymer aus den Acrylbausteinen zu entfernen, getrocknet und gewogen. Aus dem Massenzuwachs ergibt sich ein mittlerer Derivatisierungsgrad des eingesetzten Monomerbausteins, wobei bis zu 10 µmol pro cm2 erreicht werden können.[83, 99] Dieser Deckungsgrad ist kein direktes Mass für den Abstand der funktionellen Gruppen pro Fläche, da die gemittelte Funktionalitätsdichte nicht von der Länge der Acrylketten auf der Oberfläche abhängt. Sie wird lediglich rein rechnerisch aus der Bestimmung einer kompletten Membran mit der Grösse von ca. 22 x 32 cm ermittelt. Die Funktionalitätsdichte liefert keinerlei Aussage über die Homogenität der Funktionalisierung einer gegebenen Fläche (Abb. 5). Eine entsprechende Untersuchung der Homogenität der Derivatisierung der Oberflächen konnte an dieser Stelle nicht durchgeführt werden.

Abb. 5: Mögliche Realisierungen einer gravimetrisch bestimmten Beladung von sechs Acrylsäuremolekülen pro Flächeneinheit. Im Fall a) würde eine geringere Homogenität pro Flächeneinheit erreicht als bei der gleichmässigeren Reaktion im Fall b).

Um eine unter den späteren Synthesebedingungen stabile Verankerung der Linkersysteme zu gewährleisten war eine Aminofunktionalisierung der PP-Membranen notwendig. Diese sollte durch Umsetzung der derivatisierten PP-Filtermembranen 28 und 29 mit einem geeigneten Diamin erreicht werden. Zuerst wurde die Aktivierung der Carboxylgruppe der Carbonsäure-Derivatisierung, mit anschliessender Umsetzung mit 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin 26 als Spacermolekül untersucht (Schema 10).

Schema 10: Umsetzung der carbonsäure- zu einer aminoderivatisierten PP-Membran 31 .

Zur Bestimmung der optimalen Kombination aus Aktivierungsreagenz, Konzentration und Zeit wurden DIN-A4-grosse säurefunktionalisierte PP-Membranen mit einer gravimetrisch bestimmten Beladung von 4 µmol/cm2 zerteilt und unter verschiedenen Bedingungen umgesetzt (Tabelle 1). Die aktivierten Carbonsäurederivate 30 wurden mit einer 5 M Lösung von 26 in DCM zur Reaktion gebracht und die erhaltenen Aminogruppen mit Fmoc-β-Ala-OPfp acyliert.

a Mittelwert aus sechs Fmoc-Quantifizierungen nach Umsetzung mit Fmoc-β-Ala-OPfp

Nr.

Aktivierungs-

reagenz

Konzentration

[M]

Zeit

[min]

Aminoderivatisierung

[nmol/cm2]a

1

DIC/HOBt

1 in NMP

30

43±5

2

DIC/PfpOH

1 in NMP

60

107±5

3

SOCl2

2 in DCM

60

32±6

4

SOCl2

4 in DCM

120

46±5

5

(COCl)2

2 in DCM

120

193±5

6

(COCl)2/DMF

2 in DCM

120

223±5

7

CO(OCCl3)2

1 in DCM

120

121±5

8

PCl3

2 in DCM

60

108±8

9

PCl5

2 in DCM

60

296±8

10

PCl5

2 in DCM

120

561±10
Tabelle 1: Aminoderivatisierung der säurederivatisierten PP-Membran 28 nach verschiedenen Aktivierungsbedingungen zu 30 und Reaktion mit 26.

Die Ausbeuten der Aminoderivatisierung der PP-Membran lagen, bezogen auf die gravimetrische Bestimmung der Beladung, bei max. 15 % (Nr. 10). Die Beladung an Aminofunktionen wurde in allen Fällen durch Fmoc-Quantifizierung als Summenausbeute nach Aktivierung, Umsetzung mit Diamin 26 und Acylierung mit Fmoc-β-Ala-OPfp bestimmt. Eine Aufschlüsselung an aktivierungsspezifischen Nebenreaktionen, wie etwa die unterschiedliche Hydrolysegeschwindigkeit der Pentafluorphenol-Aktivester (Nr. 2) und der Aktivierung über das Säurechlorid (Nr. 3-10), wurde nicht vorgenommen, da letztendlich ein möglichst hoher Umsatz von Säure zum Amid, gemessen an maximaler Amino-funktionalisierung, erreicht werden sollte. Die als Nebenreaktion auftretende Quer-vernetzung durch die Aminolyse von zwei aktivierten Carbonylgruppen durch die beiden Aminogruppen eines 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiaminmoleküls konnte in keinem der Fälle untersucht werden. Die Aktivierung zum entsprechenden Säurechlorid mit PCl5 stellte sich als effektivste Methode (Nr. 8-10) heraus. Auf eine längere Aktivierung als zwei Stunden wurde verzichtet, um eine Hydrolyse bereits entstandener Säurechloride zu vermeiden.

Bei der Übertragung der Ergebnisse auf andere carbonsäurefunktionalisierte PP-Membranen mit unterschiedlichen Ausgangsderivatisierungsgraden von 1 bis 10 µmol/cm2 wurden ebenfalls nur Ausbeuten an Aminofunktionalisierung von 10-20 % erreicht. Im allgemeinen kann diese relativ geringe Ausbeute an unvollständigen Umsetzungen zur Aktivspezies, Reaktion mit dem Diamin oder einer Quervernetzung durch das Diamin gelegen haben. Darüberhinaus besteht die Möglichkeit, dass nicht alle Carbonsäuren sterisch zugänglich sind. Insgesamt war die erzielbare Ausbeute jedoch ausreichend, um genügend Substanz für Analytik und Screening von einem SPOT zu erhalten.

Die Homogenität der Aminoderivatisierung der Membran wurde mittels Fmoc-Quantifizierung einzelner SPOTs bestimmt. Hierzu wurde eine 3 x 5 cm grosse, mit einer Ausgangsderivatisierungsgraden von 2 µmol/cm2 verwendet. Diese Membran wurde mittels PCl5-aktivierte und anschliessend die aminoderivatisierte PP-Filtermembran durch Behandlung mit einer 0,6 M Fmoc-β-Ala-OPfp Lösung in NMP vollständig acyliert. Nach Waschen der Membran wurden 13 SPOTs ausgestanzt. Abspaltung der Fmoc-Gruppe und Messung der UV-Absorption des Piperidin/DBF-Addukts lieferten Werte an Aminoderivatisierung von durchschnittlich 382 nmol/cm2, wobei zwei maximale Werte von 420±5 nmol/cm2 und drei minimale Werte von 352±5 nmol/cm2 erhalten wurden. Die restlichen acht Werte streuten um weniger als drei Prozent um den Mittelwert, was vorangegangene Beobachtungen (Abweichungen der Werte vgl. Tabelle 1) bei der Quantifizierung von Derivatisierungsgraden entsprach. Die Schwankungen liegen mit zehn Prozent im Bereich derer der Zellulose (vgl. Kapitel 2.1.1).

Diemethylestermodifizierte PP-Membran 29 sollte durch Aminolyse mit dem Diamin 26 ebenfalls in eine aminoderivatisierte Membran 32 überführt werden (Schema 11).

Schema 11: Umsetzung einer methylester- zu einer aminoderivatisierten PP-Membran 32 .

Hierzu mussten verschiedene Bedingungen untersucht werden, um eine möglichst effiziente Methode in Hinblick auf Ausbeute, Zeit und Reagenzieneinsatz zu finden. Eine DIN-A4-grosse methylestermodifizierte PP-Membranen wurde in 8 Teile zerschnitten und jeder Teil wurde einer verschiedenen Aminolysezeit und –temperatur ausgesetzt sowie mit ver-schiedenen Konzentrationen an 26 behandelt. Die Teile der Membran wurden so gewählt, dass sich sechs SPOTs aus der Mitte ausstanzen liessen, um Inhomogenitäten während der Reaktionsführung auszumitteln (Tabelle 2).

a Mittelwert aus 6 Fmoc-Quantifizierung nach Umsetzung mit Fmoc-β-Ala-OPfp

Nr.

Konzentration

an Diamin 26

Temperatur

[°C]

Zeit

[h]

Aminoderivatisierung

[nmol/cm2] a

1

1 [M] in NMP

25

1

11±5

2

1 [M] in NMP

80

1

43±5

3

1 [M] in NMP

80

8

107±5

4

2 [M] in NMP

80

8

122±6

5

Pur

80

8

178±6

6

Pur

80

24

263±5

7

Pur

100

48

341±5

8

Pur

100

72

481±6
Tabelle 2: Aminolysebedingungen der methylesterfunktionalisierten PP-Membranen 29 mit dem Diamin 26 und resultierende Aminoderivatisierung.

Zur Quantifizierung der Aminolyse wurde erneut die Umsetzung der erhaltenen Aminogruppen mit Fmoc-β-Ala-OPfp und anschliessender Fmoc-Quantifizierung (wie sie bereits an der Zellulose- und der anderen PP-Membran durchgeführt wurden) eingesetzt. Die Optimierung der Aminolyse ergab, dass hohe Temperaturen und Konzentrationen an Diamin nötig sind, um eine maximale Aminoderivatisierung der Membran zu erreichen. Allerdings konnte selbst nach drei Tagen bei 100°C (Nr. 8) nicht der Derivatisierungsgrad an Aminogruppen erreicht werden, der nach der gravimetrischen Bestimmung der Copolymerisation zu erwarten wäre (ca. 4 µmol/cm2). Eine längere Umsetzung mit 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin 26 wurde nicht vorgenommen, da die PP-Membran bereits eine Gelbfärbung zeigte, die sich auch durch intensives Behandeln mit verschiedenen Lösungsmitteln nicht entfernen liess.

Die geringe Ausbeute an Aminoderivatisierung (ca. 12 %) kann mehrere Gründe haben. Die gravimetrische Beladung kann als zu hoch bestimmt worden sein, z.B. durch anhaftende nicht kovalent gebundene Polyacrylmethylester-Stränge. Ferner können die dicht an der Membranoberfläche befindlichen Methylester sterisch derart abgeschirmt sein, dass diese nicht mit dem Diamin reagieren. Schliesslich kann es auch an der Bestimmung der Aminoderivatisierung liegen. So liefert die Fmoc-Quantifizierung lediglich die Summe der verfügbaren Aminogruppen nach der Aminolyse. Die als Nebenreaktion auftretende Quervernetzung durch die Aminolyse von zwei Methylestergruppen durch die beiden Aminogruppen eines 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiaminmoleküls kann so allerdings nicht nachgewiesen werden. Ferner kann es zur basischen Verseifung der Methylester durch Spuren von Wasser in/auf der PP-Membran oder im 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin kommen. Da mit der Methode jedoch eine für weitere Synthesen ausreichende Aminoderivatisierung erreicht werden konnte, wurden die Bedingungen der Aminolyse nicht weiter optimiert.

Linkersysteme für die SPOT-Synthese

Als Linkersysteme werden funktionelle Gruppen oder bifunktionelle Moleküle bezeichnet, die die Aufgabe haben, das Zielmolekül während der einzelnen Syntheseschritte an der polymeren Oberfläche zu immobilisieren. Die Bindung zwischen Substrat und Träger muss so beschaffen sein, dass sie alle trägergebundenen Syntheseschritte unbeschadet übersteht, nach beendeter Synthese jedoch quantitativ gespalten werden kann, ohne dass die synthetisierte Verbindung dabei Schaden nimmt. Es wurden eine Vielzahl verschiedener Linkersysteme entwickelt,[100, 101] die sich durch die unterschiedlichsten, manchmal sehr speziellen, Bedingungen spalten lassen.

Ein Ziel der vorliegenden Arbeit, Bedingungen zur Verwendung der SPOT-Synthese für die Darstellung kombinatorischer [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken zu finden und diese zu optimieren, erfordert mindestens ein Linkersystem, welches die oben genannten Bedingungen erfüllt. Ein Repertoire an sowohl basen-, säure- und photolabilen Linkeren sollte getestet werden, um ggf. die einzelnen Vor- und Nachteile für die Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken zu evaluieren.

Basisch spaltbare Linkersysteme

Durch die Veresterung der Hydroxylgruppen der Zellulose mit aktivierten Aminosäuren wurde gleichzeitig ein basisch spaltbares Linkersystem erzeugt. Dieser so erhaltende Ester-Linker wird häufig in der SPOT-Synthese von Peptiden eingesetzt.[34, 36, 42, 45, 102] Es hat es sich als zweckmässig erwiesen, die ganze Zellulosemembran durch Veresterung mit einer Aminosäure zu derivatisieren.[34, 36] Hierbei erfolgt die Aktivierung der Aminosäurederivate durch DIC und NMI zum entsprechenden Anhydrid. Mit der Verwendung von Fmoc-geschütztem Glycin sind Beladungen von bis zu 2000 nmol/cm2 realisierbar. Durch optimierte SPOT-Synthese-Bedingungen sind 10-15-mere Peptide an Zellulosemembranen mit Reinheiten von 60 bis über 85% erreichbar.[45, 103] Dies zeigt, dass der Ester-Linker gut für die Synthese von Peptiden an Zellulose geeignet ist. Ein weiterer Vorteil dieses Linkers ist es, dass der C-Terminus des Peptides 33 nach der Synthese, während der Abspaltung modifiziert werden kann. In Abhängigkeit davon, welches Amin zur Spaltung der Esterbindung verwendet wird, können C-terminale unterschiedliche (Alkyl-) Amide 34 erhalten werden (Schema 12).

Schema 12: Spaltung der Esterbindung durch verschiedene Amine. [104]

Die Abspaltung kann sowohl in Lösung, als auch in der Gasphase, also z.B. mit einem möglichst flüchtigem Amin, erfolgen.[104, 105] Die Vorteile der Gasphasen-Abspaltung liegen zum einem im Erhalt der örtlichen Adressierbarkeit der synthetisierten Verbindungen und zum anderen im leichteren Entfernen des Abspaltreagenzes, da geringere Mengen verwendet werden. Die notwendige Einwirkzeit des Amines für eine möglichst vollständige Spaltung hängt nicht nur von der jeweiligen Nucleophilie ab, sondern auch ganz entscheidend vom Dampfdruck.

Die Esterbindung schränkt die Auswahl von Aminen bei der SNAr an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen allerdings ein, da hier kleine, sehr nucleophile Amine als Nebenreaktion das (Ziel-)Molekül von der Zellulose abspalten können. Bei einer beabsichtigten gleichzeitigen Substitution und Abspaltung eröffnet sich jedoch ein Anwendungsgebiet dieses Linkers. Für einen allgemeineren Einsatz sollten jedoch weitere Linkersysteme untersucht werden.

 Sauer spaltbare Linkersysteme

Im Gegensatz zu den basenlabilen Ester-Linkern sind säurelabile Linker wie der Rink-Amid-Linker[106] (im Folgenden kurz Rink-Linker) vollkommen stabil gegenüber Nucleophilen, die zur Substitution der Chloratome des membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazins eingesetzt werden sollen. Der Rink-Linker konnte mit guten Ausbeuten, bezogen auf die Fmoc-Quantifizierung, sowohl an die aminoderivatisierte Zellulose-membran, als auch an die aminofunktionalisierten PP-Membranen gekoppelt werden. Eine Aktivierung der {4-[(2,4-Dimethoxy-phenyl)-(9H-fluoren-9-ylmethoxy-carbonylamino)-methyl]-phenoxy}-essigsäure zum entsprechenden Pentafluorphenylester 35 durch Umsetzung mit Pentafluorphenol und DIC ohne Zusatz von Base erwies sich als besonders günstig, da die Reaktion direkt in NMP erfolgen kann. Auf Zusatz von Base musste verzichtet werden, um im Fall der Zellulosemembran eine Acylierung der Hydroxylgruppen zu vermeiden. Die so erhaltende Lösung von 35 (max. Konzentration 0,3 M) ist ohne signifikanten Aktivitätsverlust eine Woche verwendbar, falls sie zwischen dem Gebrauch eingefroren wird. Vor dem ersten SPOT-Schritt wurde mit einem Bleistift ein 1 x 1 cm Raster auf die Zellulose oder PP-Membran gezeichnet. Dies ist notwendig, um nach Syntheseschritten und Waschprozeduren die Position der Verbindungen (also der SPOTs) auf der Oberfläche wiederzufinden. Als ideales SPOT-Volumen haben sich 2 µl auf der Zellulose- und 1 µl auf der PP-Membran erwiesen, um die Fläche eines SPOTs (0,23 cm2, ø≈ 0,5 mm) ausreichend zu tränken. Hierbei wurde darauf geachtet, dass eine geringfügig grössere Fläche benetzt wird, als eigentlich notwendig ist. Somit wird sicher gestellt, dass auch die Randbereiche der SPOTs ausreichend mit Reagenz benetzt werden. Nach der Kopplung des Rink-Linkers werden nicht erreichte Aminogruppen z.B. zwischen den SPOTs mit Essigsäureanhydrid acetyliert (capping), um so nur die Aminogruppen der SPOTs nach der Fmoc-Abspaltung anzufärben und die SPOTs „sichtbar“ zu machen (Schema 13).

Schema 13: Acylierung von aminoderivatisierten planaren Oberflächen mit aktiviertem Rink-Linker. Nach Acetylierung der nicht umgesetzten Aminofunktionen mit Acetanhydrid und Entschützen der N-Termini können die SPOTs mit Bromphenolblau angefärbt werden ( 38 ). Nach beendeter Synthese werden die Produkte mittels TFA-Dampf von dem Träger gespalten, wobei die roten Rink-Radikale die Position der adhäsiv gebundenen Verbindungen anzeigen ( 39 ).

Die Abspaltung der Verbindungen vom Rink-Linker an Syntheseharzen erfolgt üblicherweise mit einer 50 bis 95 %-igen TFA-Lösung in DCM innerhalb von ein bis zwei Stunden.[100, 106] Bei der Verwendung des Rink-Linkers an planaren Oberflächen ist jedoch eine Abspaltung unter Erhalt der örtlichen Adressierbarkeit möglich. Analog zur Spaltung der Esterbindung mit gasförmigen Aminen bei basenlabilen Linkern, kann hier eine Abspaltung mit TFA-Dampf erfolgen. Hierzu werden die Zellulose- oder PP-Membranen mit dem Rink-Linker zur Abspaltung der Syntheseprodukte unter Erhalt der örtlichen Adressierbarkeit in einen mit TFA-Dampf gesättigten Exsikkator legen. Das Erscheinen des roten Rink-Radikales zeigt nicht nur den Spaltungsvorgang an, sondern ermöglicht auch ein einfach „wiederfinden“ der nun lediglich adhäsiv gebundenen Produkte (Schema 13). Die SPOTs werden z.B. in Mikrotiterplatten ausgestanzt, die adhäsiv am Träger gebundenen Substanzen mit einem Gemisch aus Wasser:Acetonitril (1:1) abgelöst und mittels HPLC-MS-Technik analysiert. Die Vollständigkeit der Spaltung des Rink-Linkers unter den relativ milden Bedingungen innerhalb von 30 min wurde durch Waschen der SPOTs und erneuter Abspaltung mit 95 %-iger TFA Lösung in DCM für zwei Stunden überprüft. Nach Entfernen der TFA wurde kein Zielprodukt (in diesem Fall N-acyl Phe-Phe-Leu 40) mehr detektiert. Die Vollständigkeit der Gasphasen-Abspaltung konnte somit nachgewiesen werden (vgl. Abb. 6).

Abb. 6: HPLC-Spur nach TFA-Dampf-Abspaltung und Ablösen mit Wasser:Acetonitril von 40 an der Zellulosemembran (a) und anschliessender Nachspaltung der selben Membran mit flüssiger TFA (b) zur Überprüfung der Vollständigkeit.

Die chemisch und physikalisch robusteren PP-Membran ermöglichte zusätzlich die Verwendung eines Carbamatlinkers. Dieser Linker erlaubt den Einsatz von bifunktionalen Bausteinen wie Diaminen und liefert somit Zugang zu Strukturen, die mit dem Einsatz des Rink-Linkers nicht erhalten werden können.

Die Synthese von 41 erfolgte in Anlehnung an die Darstellung am Syntheseharz von Ho et al. [107] Dazu musste an der PP-Membran der p-Alkoxy-Benzylalkohol („Wang-Linker“[108]) erst synthetisiert werden (Schema 14). Hierzu wurde zunächst eine aminoderivatisierte PP-Membran mit Bromessigsäurebromid 42 (2 M in DCM) und DABCO (0,3 Äq.) acyliert. Die erhaltende Bromfunktion wurde mit einer ca. 4 M Lösung des Cäsiumsalzes von p-Hydroxybenzaldehyd (zugänglich aus Cäsiumcarbonat und p-Hydroxybenzaldehyd 44in wässrigem DMSO durch Erhitzen auf 80°C) substituiert. Die Reduktion des membrangebunden Aldehyds 45 erfolgte mit Natriumcyanoborhydrid in Methanol. Man erhält eine Wang-Linker modifizierte PP-Membran 46. Zur Darstellung des Aktiv-Carbonates wurde diese Membran in einer 1 M Lösung von p-Nitrochloroformiat 47 in DCM mit 0,1 Äq. NEM 90 min behandelt. Um eine vollständige Umsetzung zu gewährleisten, wurde die Prozedur wiederholt. Für die anschliessende Umsetzung zum membrangebundenen Carbamat wurde als erstes Ethylendiamin (50 %-igen-Lösung in DMF (v/v) für 4 Stunden) wegen seiner hohen Reaktivität gewählt. Ethylendiamin 49 sollte aufgrund der kurzen Alkylkette nur bedingt in der Lage zur Quervernetzung (also der Reaktion beider Aminogruppen mit zwei Carbonaten) sein, ferner lässt es sich in hohen Konzentrationen in DMF oder NMP einsetzen, was zusätzlich eine mögliche Quervernetzung unterdrücken sollte (Schema 14).

Schema 14: Darstellung des Carbamatlinkers 41-1 an PP-Membranen.

Eine Optimierung dieser Reaktionssequenz erwies sich als besonders schwierig, da die Ausbeuten der einzelnen Schritte nicht direkt bestimmt werden konnten. Ein ungefähres Mass über die Gesamtausbeute lieferte lediglich das Verhältnis von Fmoc-Quantifizierung der eingesetzten aminoderivatisierten PP-Membran und der am Ende, durch Umsatz des p-Nitro-Carbonates 48 mit Ethylendiamin, zur Verfügung stehenden Aminogruppen. Gemessen an einer Fmoc-Quantifizierung führten längere Reaktionszeiten als vierStunden des aktivierten Carbonates mit Ethylendiamin zu keiner erhöhten Amino-Carbamat-Funktionalisierung. Nach Acylierung der freien Aminogruppen mit Fmoc-β-Ala-OPfp und Fmoc-Quantifizierung konnte eine Beladung von ca. 55 % der Ausgangsbeladung der PP-Membran an Aminogruppen erreicht werden. Dies entspricht einer durchschnittlichen Ausbeute von 92 % pro Reaktionsschritt. In Anbetracht der recht guten Ausbeuten wurde von einer Optimierung der Reaktionsbedingungen abgesehen.

Zur Erhöhung der Diversität wurden insgesamt zehn verschiedene Diamine zur Reaktion mit dem aktivierten Carbonat 48 gebracht. Die Ausbeuten wurden wie zuvor durch Umsetzung der membrangebundenen Aminogruppen mit 0,6 M Lösung von Fmoc-β-Ala-OPfp in NMP und anschliessender Fmoc-Quantifizierung bestimmt. Die Bedingungen und Ergebnisse dieser Reaktionen sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die Ausbeuten entsprechen den Mittelwerten aus sechs Messungen pro eingesetztem Diamin.

a bezogen auf Aminofunktionalisierung der PP-Membran; Mittelwert aus 6 Messungen

Nr.

Diamin

Konzentration

[M] in NMP

Zeit

[h]

Temperatur

[°C]

Ausbeutea

[%]

41- 1

Ethylendiamin

5

4

50

55

41- 2

1,3-Diaminopropan

5

4

50

53

41- 3

1,4-Diaminobutan

5

4

80

59

41- 4

1,5-Diaminopentan

3

4

80

50

41- 5

1,6-Diaminohexan

3

4

80

50

41- 6

Piperazin

2

4

80

56

41- 7

N,N‘-Dimethylethylendiamin

5

4

60

56

41- 8

N,N‘-Dibenzylethylendiamin

5

4

60

40

41- 9

α,α‘-Diamino-p-xylol

2

4

80

44

41- 10

trans-1,2-Diaminocyclohexan

3

6

80

47
Tabelle 3: Untersuchungen zur Einsatzmöglichkeit verschiedener Diamine für die Darstellung eines Carbamatlinkers 41.

Die Ausbeuten an Aminoderivatisierung bei den eingesetzten Diaminen entsprachen der zuvor für das Ethylendiamin erhaltenden. Bezogen auf die Ausgangsbeladung der Membran verlief die Umsetzung zu 41- 8 mit N,N‘-Dibenzylethylendiamin mit der geringsten Ausbeute. Eine Erklärung könnte der sterische Anspruch der Benzylgruppen sein. Die restlichen Amine lieferten gute Ergebnisse, so dass sie zur Erhöhung der Diversität in den Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken eingesetzt werden können.

 Photolytisch spaltbare Linkersysteme

Photolabile Linker zeichnen sich durch eine besondere Orthogonalität zu einer Vielzahl von Syntheseoperationen aus.[109-111] Dies ist von besonderer Bedeutung bei Synthesen in deren Verlauf es sowohl zu stark basischen (z.B. beim Einsatz von Aminen zur nucleophilen Substitution) als auch sauren (z. B. bei der Verwendung von TFA zur Schutzgruppen-Abspaltung) Bedingungen kommt. Für diese Zwecke haben sich ortho-Nitro-Benzylderivate, wie der von Holmes et al.[112-114] optimierte Linker, als besonders geeignet erwiesen, da die Nitrogruppen durch gezielte UV-Bestrahlung oxidiert werden können und dann in einer Radikalkaskadenreaktion die Benzylstellung oxidieren. Daraufhin kommt es zu einer Abspaltung der Amidkomponente an der aromatenabgewandten Benzylposition (Schema 15).

Schema 15: Immobilisierung des photolabilen Linkers 50 und Spaltungsmechanismus unter Bestrahlung bei 365 nm in Anlehnung an Pillai et al. [115]

Der 5-Nitrophenoxy-Linker modifizierte Zellulosemembran 51a (Schema 15) wurde bereits in der SPOT-Synthese eingesetzt.[52] In Versuchen zur lösungsmittelfreien Spaltung des Linkers („Photolinker“) unter Wahrung der Ortsadressierung der Substanzen zeigte sich die hervorragende Eignung des Linkers für die SPOT-Synthese. Bei Bestrahlung der gesamten Membran auf einen UV-Leuchttisch bei einer Lichtenergie von 7 mW/cm2 ist die Abspaltung nach 90-100 Minuten für Membranen mit niedriger Beladung (ca. 100 nmol/cm2) abgeschlossen. [52] Bei höher beladenen Membranen von ca. 400 nmol/cm2 bedarf es einer deutlich verlängerten Abspaltzeit von ca. 180 min pro Membranseite bei Anwesenheit von [1,3,5]-Triazinresten im Zielmolekül (Abb. 7).

Abb. 7: Abspaltungskinetik des Photolinkers an einer Zellulosemembran 27 (Beladung von 380 nmol/cm 2 ). Die abgespaltene Menge an 2,4,6-Triamino-[1,3,5]-triazin in Abhängigkeit von der Photolysezeit bei 365 nm wurde HPLC-chromatographisch bei 220 nm durch Vergleich mit Werten einer Eichkurve (vgl. Kapitel 2.3) bestimmt.

Das Plateau der abgespaltenen Menge zwischen ca. 60 und 180 min kann auf die starke UV-Absorption des Nitrosoaromaten 52 und die daraus resultierende Abschirmung der noch an die Membran gebundener Substanzen zurückzuführen sein. Darüberhinaus besitzen die im „inneren“ der Zellulose verborgenen Linkermoleküle vermutlich eine langsamere Spaltungskinetik. Falls es nach ca. 180 min zu einer Zersetzung der entstandenen Nitrosoderivat kommt, können die „inneren“-Linkermoleküle gespalten werden. Der Abfall an abgespaltenen Produkt nach 400 min lässt sich durch ein auftretendes Nebenprodukt, vermutlich aus Zersetzung bereits abgespaltener [1,3,5]-Triazine, durch die andauernde Bestrahlung, erklären. Es war im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich, die Art der Zersetzung bzw. das/die entstehende(n) Produkt(e) aufzuklären.

Ein genereller Nachteil des Photolinkers ist seine Lichtempfindlichkeit im Verlauf der Synthese. So kommt es zu unbeabsichtigter Abspaltung der Produkte, sobald man direktes Licht nicht völlig vermeidet. Gerade in der SPOT-Synthese, wo es darauf ankommt bestimmte Positionen punktgenau auf einer planaren Oberfläche in den einzelnen Synthesecyclen wieder und wieder mit Reagenzien zu benetzen, stellt dies mitunter ein Problem dar.

Zusammenfassend kann zur Linkerproblematik festgestellt werden, dass für die Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken unterschiedlich spaltbare Linker zur Verfügung stehen. An der Zellulose ist der basisch spaltbare Ester-Linker, der durch Säuren zu spaltenden Rink-Linker und ein photolabiler Linker einsetzbar. An der PP-Membran sind sowohl zwei unterschiedliche säurelabile Linker (Rink- und Carbamatlinker) sowie der Photolinker für die SPOT-Synthese verwendbar.

Immobilisierung von 2,4,6-Trichlor-[1,3,5]-triazin an aminoderivatisierten planaren Oberflächen

Die Darstellung von linearen Oligomeren wie Peptiden,[34-36, 43, 45, 85, 88, 102] Oligo-N‑alkyl-glycinen (Peptoide)[48, 49] oder Hybride beider Substanzgruppen (Peptomere)[52] auf Zellulosemembranen durch die SPOT-Synthese wurde bereits beschrieben. Den Reaktionssequenzen dieser Verbindungen ist gemein, dass am Ende eines jeden Cyclus eine Aminofunktion generiert wird (vgl. Kapitel 1.1). Diese jeweilige membrangebundene Aminogruppe soll, neben der Aminogruppe der Linker, zum Aufbau von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken eingesetzt werden, da hierdurch die bereits gut etablierten Synthesen der SPOT-Technik für die Erhöhung der Diversität der Zielbibliotheken genutzt werden können. Die Einführung des Triazinringes soll durch nucleophile Substitution eines Chloratoms von 2,4,6-Trichlor-[1,3,5]-triazin (Cyanurchlorid 5) mit den N-Termini der Oligomere bzw. der Aminogruppe des Linkers an der Zellulose- oder PP-Membran erfolgen (Schema 16).

Schema 16: Immobilisierung von Cyanurchlorid an einer aminoderivatisierten Oberfläche.

Die Effizienz der Immobilisierung von Cyanurchlorid an membrangebundenen Aminogruppen wurde an einer Rink-Linker-modifizierten Zellulose untersucht und anschliessend mit den Ergebnissen an der PP-Membran verglichen. Für die Untersuchungen wurde an einem Tentagel-Rink-Harz die Modellverbindung 4,6-Dipiperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2-ylamin 53 synthetisiert, um eine quantifizierbare Substanzmenge für Lösungen mit bekannter Konzentration für Eichkurven zu erhalten. Die verbleibenden Chloratome wurden nach Immobilisierung des Cyanurchlorids 5 aus Stabilitätsgründen des Produktes mit Piperidin gequencht.

Für die Erstellung einer Eichkurve wurden verschiedene Konzentrationen von 0,1-10 mM in wässrigem Acetonitril hergestellt und die Integrale der UV-Absorption bei 220 nm an einer HP-1100 bestimmt (Abb. 8). Durch Kopplung einer Massendetektion an die HPLC konnten die Sensitivitäten des UV- und des Massendetektors verglichen werden (s.u.).

Abb. 8: Integral der UV-Absorption bei 220 nm in Abhängigkeit von der Injektionsmenge an 53 .

Die Untersuchung hat ergeben, dass bei einer Injektionsmenge von mehr als 20 nmol in das HPLC-System eine Sättigung des Signals des UV-Detektors eintritt, dies spiegelt sich im nichtlinearen Teil der Eichkurve (ab ca. 18 nmol) wieder. Eine Injektionsmenge von 0,05 nmol liefert ein noch hinreichend gut zu erkennendes UV-Signal (ca. 85.000 FAU gegenüber 1.631.000 für 1 nmol), wobei selbst 0,01 nmol ein eindeutiges Signal in der Ionenspur der Massenkopplung liefern. Dies ist für die Auffindung und Aufklärung von etwaigen Nebenreaktionen bei so geringen Mengen wie sie durch die SPOT-Synthese anfallen von Bedeutung.

Die Immobilisierung von Cyanurchlorid an aminoderivatisierter Zellulose erfolgte unter verschiedenen Bedingungen (Tabelle 4) mit anschliessender Substitution der verbleibenden Chloratome durch Inkubation der derivatisierten Zellulose in 50 %-iger Piperidin-Lösung bei 60°C für vier Stunden. Es wurden drei SPOTs ausgestanzt und 53 nach TFA-Abspaltung erhalten. Die Fmoc-Quantifizierung der Rink-Linker-modifizierten Zellulose bildete den „100 %“-Wert. 53 wurde in einem definiertem Volumen gelöst und durch Injektion eines Aliquots in die HPLC-Anlage konnte die Ausbeute direkt aus dem Verhältnis der gemessenem HPLC-Peakfläche und dem erwarteten Wert nach Fmoc-Quantifizierung bestimmt werden. Durch eine HPLC-MS Kopplung konnte sichergestellt werden, dass die richtige HPLC-Peakfläche quantifiziert wurde und dass ferner alle verbliebenen Chloratome durch Piperidin substituiert wurden.

a Gesamtausbeute an immobilisiertem Cyanurchlorid und Nebenprodukten (s. Text)

Nr.

Konzentration von 5

[M]

Zeit

[min]

Base

Ausbeute

[%]

1

1 in DCM

15

-

71

2

1 in DCM

30

-

73

3

1 in DCM

15

10 % DIEA

88a

4

1 in DMF

15

-

38a

5

1 in DMF

15

10 % DIEA

45a

6

2 in DCM

15

-

85

7

2 in DCM

30

-

89

8

2 in DCM

15

10 % DIEA

93a

9

2 in DMF

15

-

36a

10

4 in DCM

15

-

90
Tabelle 4: Variation von Zeit, Konzentration und Base bei der Immobilisierung von Cyanurchlorid an einer Rink-Linker-modifizierten Zellulosemembran 38a.

Alle Immobilisierungsversuche wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. In Lösung werden bei Raumtemperatur am Cyanurchlorid zwei Chloratome durch Amine substituiert, folglich musste die Möglichkeit einer Verbrückung von zwei Rink-Aminogruppen mit einer Triazineinheit berücksichtigt werden. Es stellte sich heraus, dass bei niedrigen Konzentrationen und speziell bei Zusatz von DIEA eine solche Verbrückung zu 8 bzw. 6 % auftrat (Nr. 3 und 8), was jedoch durch Verwendung hoher Konzentrationen an Cyanurchlorid in DCM ohne Basenzusatz vermieden werden konnte (Nr. 7 und 10). Zusätzlich konnte eine geringe Menge (3-5 %) an hydrolysiertem Triazinresten bei der Verwendung von DIEA nachgewiesen werden (Nr. 3 und 8). DMF erwies sich als ungeeignetes Lösungsmittel, da hier das N,N-Dimethyl-6-piperidin-1-yl-[1,3,5]-triazin-2,4-diamin als Nebenprodukt auftritt (Nr. 4, 5 und 9), wobei die höchste Menge mit fast 45 % unter Nr. 5 auftrat. Nach mehrfachem Waschen der Dichlor-[1,3,5]-triazin-modifizierten Membranen (Nr. 1, 2, 3, 6, 7, 8 und 10) mit DMF konnte dieses Nebenprodukt hingegen nicht nachgewiesen werden, was auf eine Zersetzung des DMF durch Cyanurchlorid in Lösung hinweist. Die weiteren Synthesen vonmembrangebunden Dichlor-[1,3,5]-triazinen an Zellulosemembranen erfolgten ohne Zusatz von Basen, da so sehr gute Ausbeuten (Tabelle 4, Nr. 7) undweniger Nebenprodukte erhalten werden konnten. Ferner kann so das Problem einer Alkylierung der Zellulose durch Cyanurchlorid minimiert werden. Diese Modifikationen wären bei einem Festphasen-Screening besonders problematisch, da die an der Zelluloseoberfläche entstandenen Nebenprodukte die Proteine binden können. Die Zellulose-Triazinderivate könnten somit „falsch-positive“ Ergebnisse in den Bindungsstudien liefern.

Für die Immobilisierung von Cyanurchlorid an der aminoderivatisierten PP-Membran wurde nicht unter allen Bedingungen untersucht, die bereits an der Zellulose verwendet wurden. DMF als Lösungsmittel wurde zur Kontrolle nur in einem Fall eingesetzt (Tabelle 5).

a Gesamtausbeute inklusive Nebenprodukten (s. Text)

Nr.

Konzentration von 5

[M]

Zeit

[min]

Base

Ausbeute

[%]

1

1 in DCM

15

-

48

2

1 in DMF

15

-

26a

3

2 in DCM

15

-

68

4

2 in DCM

30

-

76

5

2 in DCM

15

10 % DIEA

92a

6

2 in DCM

30

10 % DIEA

93a

Tabelle 5: Variation von Zeit, Konzentration und Base bei der Immobilisierung von Cyanurchlorid 5 an einer Rink-Linker-modifizierten PP-Membran 38b.

Die Verwendung von DMF als Lösungsmittel lieferte interessanterweise erneut die schlechtesten Ergebnisse (Nr. 2). Die Verwendung von Base war notwendig (Nr. 5 und 6), und im Vergleich zur Zellulosemembran war der Anteil von ca. 2 % an hydrolysiertem Triazin deutlich geringer. Eine Erklärung hierfür könnte die Membranoberfläche darstellen, die im Gegensatz zur Zellulose keine protonierbaren Funktionalitäten besitzt, welche die bei der Immobilisierung entstandene HCl abpuffern können. Eine längere Reaktionszeit als 15 min liefert keine signifikante Erhöhung der Ausbeute (Nr. 6). Bei der Verankerung von Cyanurchlorid an der PP-Membran wurde deswegen stets eine Reaktionszeit von 15 min unter Zusatz von 10 % DIEA verwendet. Bei der Verwendung einer 2 M Lösung von Cyanurchlorid konnte keine Überbrückung zweier Aminogruppen durch einen [1,3,5]-Triazinring gefunden werden.

Eine Immobilisierung des Cyanurchlorids an der PP-Membran sollte jedoch nicht nur am Rink-Linker, sondern auch am Carbamatlinker erfolgen. Für den Carbamatlinker wurden Ethylendiamin und Piperazin als Modellamine gewählt. Die Übertragung der am Rink-Linker erarbeiteten Ergebnisse zur Verankerung zeigte, dass es für die Vollständigkeit der Reaktion mit Cyanurchlorid weniger wichtig war, ob es sich hierbei um eine primäre oder sekundäre Aminogruppe handelt (Tabelle 6).

a Gesamtausbeute inklusive Nebenprodukte (s. Text)

Nr.

Amin

Konzentration von 5 [M]

Base

Zeit

[min]

Ausbeute

[%]

1

Ethylendiamin 41- 1

2 in DCM

-

15

66

2

Ethylendiamin 41- 1

2 in DCM

-

30

78

3

Ethylendiamin 41- 1

2 in DCM

10 % DIEA

15

94 a

4

Piperazin 41- 6

2 in DCM

-

15

62

5

Piperazin 41- 6

2 in DCM

-

30

81

6

Piperazin 41- 6

2 in DCM

10 % DIEA

15

96 a

Tabelle 6: Variation von Zeit, Konzentration und Base bei der Immobilisierung von Cyanurchlorid am Carbamatlinker 41 auf einer PP-Membran.

Der Zusatz von DIEA bei der Reaktion von Cyanurchlorid an PP-Membranen erwies sich sowohl bei prim. als auch sek. Aminen als notwendig (Nr. 3 und 6). Wie im Fall der Rink­Linker-modifizierten PP-Membran lag auch hier der Anteil an hydrolisiertem Triazinderivat bei ca. 2 %. Eine Quervernetzung zweier Amine durch einen Triazinring wurde nicht beobachtet.

Um die Immobilisierung von Cyanurchlorid an membrangebunden Aminosäuren zu untersuchen, wurde Leucin als Modellaminosäure gewählt. Hierzu wurde zunächst Fmoc­Leu-OPfp mit den Aminofunktion des Rink-Linkers von 38a umgesetzt und der N-Terminus mit Piperidin entschützt. Es wurden verschiedene Reaktionsbedingungen für das Anbringen von Cyanurchlorid untersucht sowie Ausbeute und Reinheit mittels HPLC-MS Technik bestimmt. Die Ergebnisse sind zusammenfassend in Tabelle 7 dargestellt.

a Gesamtausbeute inklusive Nebenprodukte (s. Text)

Nr.

Konzentration von 5

[M]

Zeit

[min]

Base

Ausbeute

[%]

1

1 in DCM

15

-

88

2

2 in DCM

15

-

92

3

2 in DCM

30

-

93

4

2 in DCM

15

10 % DIEA

98a

5

2 in DCM

15

1 % DIEA

98a

Tabelle 7: Untersuchungen zur Immobilisierung von Cyanurchlorid 5 an einer Leu-Rink­Linker- derivatisierten Zellulosemembran 38a- 1 .

Bei diesen Untersuchungen hat sich erneut gezeigt, dass die Immobilisierung von Cyanurchlorid an der aminoderivatisierten Zellulose auch ohne Base nahezu vollständig verlief. Zwar liess sich durch die Verwendung von DIEA die Effizienz geringfügig steigern (Nr. 4 und 5), jedoch waren bei Zusatz von 1 % DIEA (Nr. 5) ca. 4 % hydrolysierte Triazinderivate nachweisbar. Im Verlauf weiterer Untersuchungen wurde deswegen auf die Zugabe von Base bei der Verankerung von Cyanurchlorid an Zellulosemembranen verzichtet.

Da sich bereits beim Carbamatlinker gezeigt hatte, dass sich auch sek. Amine vollständig mit Cyanurchlorid alkylieren lassen, wurden für die Immobilisierung an Peptoiden keine grösseren Schwierigkeiten erwartet. So liessen sich auch die N-Termini von Peptoiden an einer Zellulosemembran mit einer 2 M Lösung von Cyanurchlorid in DCM im Verlauf von 30 min ohne Zusatz von Base zu 94 % umsetzen.

Die Möglichkeiten zur Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken, die sich nun eröffnen sind enorm. Bei einer Kombination je einer der beiden Monomereinheiten (Aminosäuren und N-Alkylglycine) miteinander ergeben sich vier Subtypen. Setzt man zur Synthese dieser Subtypen die 20 proteinogen Aminosäuren und 40 Amine für die Darstellung der N-Alkylglycine ein, so ergeben sich 3600 Kombinationen. Da diese Synthesen entweder am Rink- bzw. Photolinker oder am Carbamatlinker (zugänglich aus 10 Diaminen) erfolgen kann, erhält man fast 40000 verschiedene Verbindungen als ersten Diversitätspunkt für die Synthese von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken, wobei lediglich ein Drittel der Möglichkeiten des Cyanurchlorids zur Einführung verschiedener Reste ausgenutzt wurde. Im Folgenden sollten die verbleibenden Chloratome am [1,3,5]-Triazinring schrittweise durch Nucleophile substituiert werden.

Nucleophile Substitution an membrangebundenen 4,6-Dichlor-[1,3,5]-triazinen

Ziel der folgenden Untersuchungen war es Bedingungen zu finden, unter denen verschiedene Nucleophile selektiv mit nur einem der beiden Chloratome des membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazines zur Reaktion gebracht werden können. Diese Chemoselektivität ist eine Voraussetzung für die Darstellung möglichst diverser, unsymmetrischer [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken ausgehend von Cyanurchlorid 5.

In Lösung wurde die temperaturabhängige Substitution der Halogene des Cyanurchlorids durch verschiedene Nucleophile untersucht.[2, 3] Es wurden neben einer Reihe von Aminen[3, 7, 116] auch Alkohole[75, 76] und Thiole[117, 118] unter Zusatz von Basen bei erhöhter Temperatur verwendet.Für den Einsatz in der SPOT-Synthese sind Thiole aufgrund ihres meist intensiven Geruches ungeeignet. Die Verwendung von Aminen und Alkoholen ist hingegen prinzipiell möglich. Die spezielle Reaktivität von Dichlor-[1,3,5]-triazinen bei der temperaturabhängigen Substitution der Halogene durch verschiedene Nucleophile, wurde bislang jedoch nur in geschlossenen Systemen (Synthesereaktoren) eingesetzt, wo hohe Temperaturen[22, 29] oder lange Reaktionszeiten (3-4 Tage)[23] problemlos zu erreichen sind.

Diese Bedingungen lassen sich in der SPOT-Synthese allerdings nicht realisieren. Im Folgenden sollten Alternativen gefunden werden, die eine effiziente Synthese von unsymmetrisch substituierten [1,3,5]-Triazinen unter SPOT-Bedingungen ermöglichen.

Verwendung von N-Nucleophilen unter SPOT-Synthese-Bedingungen

Die kommerzielle Verfügbarkeit strukturell sehr unterschiedlicher Amine (über 3700 prim. und sek. Amine allein von der Sigma-Aldrich Firmengruppe)[119] machen sie zu einer bevorzugten Diversitätsquelle in der kombinatorischen Chemie für die Findung und Entwicklung von Leitstrukturen.[19, 120-123] Im Verlauf dieser Arbeit sollten einige repräsentative Vertreter unterschiedlicher Gruppen für die Monochlorsubstitution an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen unter SPOT-Synthese-Bedingungen getestet werden. Dies erfolgte in zwei Abschnitten; Vortests mit fünf Testaminen zur Bestimmung geeigneter Reaktionsbedingungen und anschliessender Evaluierung vieler Amine unter den gefundenen Bedingungen. Als Modell wurde das über einen Rink-Linker an der Zellulose immobilisierte Dichlor-[1,3,5]-triazin gewählt, an dem zunächst fünf Amine getestet wurden (Schema 17). Für die Voruntersuchungen wurden möglichst unterschiedliche Amine, ohne weitere reaktive Funktionen gewählt; n-Butylamin (prim. Alkylamin mit niedrigem Siedepunkt), Cyclohexylamin (prim. Alkylamin am sek. Zentrum, hoher Siedepunkt), Piperidin (sek. Amin, hohe Reaktivität), Benzylamin (Arylamin, hohe Reaktivität) und Anilin (niedrige Reaktivität).

Mit dieser Auswahl an Aminen war es geplant, den Einfluss von Konzentration und Reaktionszeit auf die Effizienz der Chlorsubstitution zu untersuchen. Als Lösungsmittel wurde NMP aufgrund seiner Unflüchtigkeit gewählt. Alle Reaktionen wurden bei Raum­temperatur durchgeführt. Die Untersuchungen wurden mit 2 µl (das benötigte Volumen, um die Fläche eines SPOTs zu tränken) einer 50 %-igen Lösung des jeweiligen Amines in NMP ohne Zusätze von Basen begonnen. Die Bestimmung der optimalen Reaktionszeit bei jeder Synthese an fester Phase ist allgemein ein Problem, da zur Beurteilung des Reaktions-fortschrittes das Edukt/Produkt-Gemisch erst vom polymeren Träger abgespalten werden muss. Die Wahl der Reaktionszeit unter SPOT-Synthese-Bedingungen ist prinzipiell eingeschränkt; es können keine längeren Zeiten, als maximal 45 min gewählt werden, da dann das Lösungsmittel verdampft ist. In dem Fall, dass die Reaktion bis zu dieser Zeit noch nicht vollständig erfolgte, müssen die Reagenzien erneut verteilt (gespottet) werden. Als anfängliche Reaktionszeit wurde 15 min gewählt, eine Zeit in der das NMP nicht komplett verdampft und die SPOTs noch immer feucht wirken. Die Reaktion wurde durch rasches Entfernen der Überschüsse durch Waschen der Membran mit DMF, MeOH und DCM beendet und die Reaktionsprodukte mit TFA von der Zellulose abgespalten (Schema 17).

Schema 17: Umsetzung membrangebundener Dichlor-[1,3,5]-triazine 54 mit unterschiedlichen Aminen und anschliessende Abspaltung für eine Analytik.

Nach Abspaltung der Produkte vom Rink-Linker mit TFA und Analytik der ersten Untersuchungsreihe mittels HPLC-MS zeigte sich, dass Piperidin zwar hoch reaktiv ist, jedoch aufgrund seines hohen Dampfdrucks auch mit den Chloratomen von benachbarten [1,3,5]-Triazin-SPOTs reagiert. Ferner vermag Piperidin selbst bei Raumtemperatur inner-halb von kurzer Zeit ca. 5 % beide Chloratome der membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazine 54 zu substituieren. Es ist somit für die SPOT-Synthese nur bedingt einsetzbar. Bei den anderen untersuchten Amine wurde diese Nebenreaktion nicht beobachtet (Tabelle 8).

a plus Substitution des letzten Chloratoms

Nr.

Amin

Verhältnis 56 : 57

1

n-Butylamin

2 : 1

2

Cyclohexylamin

1 : 1

3

Piperidin

9 : 1a

4

Benzylamin

4 : 1

5

Anilin

1 : 1
Tabelle 8: Erste Untersuchung zur Monochlorsubstitution an 54 mit unterschiedlichen Aminen. Bestimmt wurde das Produkt zu Edukt Verhältnis aus der Peakfläche der HPLC-Spur bei 220 nm nach Abspaltung.

Für weitere Tests bei Raumtemperatur wurde auf die Verwendung von Piperidin verzichtet, um weitere Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Die Reaktionszeit wurde nach dem Spotten der Amine auf 30 min erhöht, bevor die Überschüsse durch Waschen der Zellulose mit DMF, MeOH und DCM entfernt wurden. Diesmal waren die Reaktionen in allen vier Fällen nahezu vollständig, lediglich beim Anilin konnte verbliebenes Dichlor-[1,3,5]-triazin 57 nach der Abspaltung von ca. 5 % detektiert werden. Aufgrund dieser positiven Ergebnisse war eine weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen nicht notwendig. Ein Zusatz von Base wie bei der Synthese am Harz[29] oder in Lösung[22] beschrieben wurde, scheint an Zellulose, zumindest bei der verwendeten Testauswahl an Aminen, nicht notwendig. Dies lässt sich durch den grösseren Überschuss an Amin bezogen auf die Dichlor-[1,3,5]-triazine an der Zellulose erklären. An einer Zellulosemembran mit einer Beladung von ca. 100 nmol/SPOT (400 nmol/cm2) entsprechen 2 µl einer 50 %-igen Lösung von z.B. n-Butylamin (≈ 5 M) einem 100-fachem Überschuss, verglichen mit üblichen 5 bis 20-fachen Überschüssen bei Synthesen am Harz.

Der nächste Schritt bestand aus der Evaluierung der Amine als Bausteine für die Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken mittels SPOT-Synthese. Hierfür erfolgte eine Einteilung der Amine in Gruppen, aus denen dann einige Derivate unter den zuvor bestimmten Bedingungen (ca. 5 M Lösung in NMP, Raumtemperatur, 30 min Reaktionszeit, keine Basenzusätze) getestet wurden. Die Einteilung der grossen Anzahl an den strukturell diversen Aminen ist ein kompliziertes Unterfangen. Allgemein sollten nur wenige Parameter zur Charakterisierung gewählt werden, um eine „überschaubare“ Anzahl von Gruppen zu erhalten. Die Einteilung der Amine erfolgte in die vier folgenden Gruppen;

(A) Alkylamine

(B) mehrfach funktionalisierte Alkylamine

(C) Arylamine

(D) Anilinderivate

Ein generelles Problem bei der Synthese von Monochlor-[1,3,5]-triazinen stellt die Reaktivität des verbleibenden Chloratoms dar. Speziell bei nicht vollständiger Reaktion eines Chloratoms bei Raumtemperatur zu 55 kann es unter Umständen bis zur endgültigen Analytik zur Hydrolyse aller verbliebener Chloratome kommen. Da mittels HPLC die Umsetzungen durch UV-Absorption der Produkte bestimmt wurden, verfälscht die nachträgliche Hydrolyse der Produkte die Reinheit der ursprünglichen Reaktionsprodukte. Sollte hingegen das verwendete Amin ähnlich reaktiv sein wie das Piperidin, so können zum Teil bei Raumtemperatur beide Chloratome von 54 substituiert werden. Im Fall von Aminen mit aromatischen Resten kann es aufgrund der UV-Absorbtion des Arylrestes zu falsch negativen Interpretationen der HPLC-Spuren kommen, da das Nebenprodukt mit zwei aromatischen Resten einen höheren Absorptionskoeffizienten besitzt, als die Monochlor­arylamino-[1,3,5]-triazinverbindung. Umgekehrt kommt es zu falsch-positiven Werten, wenn die Umsetzungunvollständig war, da man das Verhältnis von Dichlor-[1,3,5]-triazin zu Monochlorarylamino-[1,3,5]-triazinverbindung aus den Integralen der HPLC-Peaks bildet. Aus diesen Gründen wurden für alle weiteren Untersuchungen die ver-bleibenden Chloratome mit Piperidin, im Fall von untersuchten Alkylaminen (Gruppe A und B) und Benzylamin im Fall von untersuchten Arylaminen und Anilinderivaten (Gruppe C und D) zur Reaktion gebracht. Dies gelang durch Inkubation der Membran bei 80°C (vier Stunden) mit einer 5 M Lösung des entsprechenden Amines in NMP. Die Bestimmung des Umsatzes des Testamines z.B. n-Butylamin 58 mit Rink-Linker gebundenem Dichlor-[1,3,5]-triazin erfolgte aus dem Verhältnis von Monopiperidintriazin 60 zu Dipiperidintriazin 53 (Schema 18). Durch diese Methode können Reinheiten und Umsätze auch zwischen den Gruppen A-D verglichen werden, da diese jeweils auf einen internen Standard normiert sind.

Schema 18: Bestimmung der Umsetzung von Aminen mit Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 am Beispiel des n-Butylamins 58 .

(A) Alkylamine

Im Folgenden wurden weitere wohlfeile Amine auf ihre Verwendbarkeit zur Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken untersucht. Die erste Gruppe bestand aus verschiedenen prim. Alkylaminen, die keine weiteren funktionellen Gruppen tragen. Bestimmt wurden die Reaktionsumsätze aus dem Verhältnis 60 : 53 und die erzielten Reinheiten unter den Bedingungen der SPOT-Synthese an kontinuierlichen Oberflächen (Tabelle 9). In einigen Fällen physikochemisch sehr ähnlicher Amine (z.B. Cyclohexylamin und Cyclopentylamin) die Tests nur anZellulose- oder PP-Membranen durchgeführt wurden, falls ein Derivat (hier Cyclohexylamin) keinen signifikanten Unterschied zwischen den polymeren Trägern zeigte.

a aus dem Verhältnis 60 : 53
b nach HPLC bei 220 nm
c n.u. nicht untersucht

Tabelle 9: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Alkylamine unter SPOT-Synthese-Bedingungen.

In α-Position unverzweigte Amine (60- 1 bis 60- 9 ) lieferten gute Umsetzungen an beiden Oberflächen. Sogar Propylamin 60- 2 ergab, trotz des niedrigen Siedepunktes und damit schnelleren Verdampfens, einen sehr guten Umsatz zum gewünschten Produkt mit hoher Reinheit. Das ebenfalls leicht flüchtige Isopropylamin 60- 10 lieferte allerdings nur mittelmässige Umsetzung im Gegensatz zu den restlichen Aminen am sek. Zentrum (60- 11 bis 60- 13 ). Sterisch gehinderte Amine wie Dihexylamin und 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin (60- 16 bzw. 60- 17 ) zeigten schlechtere bzw. nahezu keine Umsetzungen und geringe Reinheiten. Für den Fall, dass die angestrebte Konzentration von 5 M in NMP nicht erreicht werden konnte, wie beim 1-Aminoadamantan (60- 14 ), verliefen die Substitutionen nur mit geringen Umsätzen. Bei keinem der untersuchten Amine zeigte sich ein signifikanter Unterschied bzgl. Umsätze an der Zellulose- und der PP-Membran.

(B) mehrfach funktionalisierte Alkylamine

Die nächste Gruppe an untersuchten Aminen, war die der mindestens bifunktionellen Alkylamine wie Ethylendiamin oder 2-Amino-1,3-propandiol. Bei dieser Gruppe stellte sich die Frage, ob weitere im Molekül vorhandene reaktive Gruppen vor der Umsetzung mit den membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen geschützt werden müssen. Für den raschen, unkomplizierten Einsatz vieler verschiedener Bausteine kann dies ein Problem sein, falls vor Beginn einer kombinatorischen Synthese mit 40 Bausteinen erst die geeigneten geschützten Derivate dargestellt werden müssen. Die Reaktivität von aliphatischen Alkoholen in Gegenwart von Aminen wurde an einem einfachen Modell sowohl an der Zellulose- als auch an der PP-Membran getestet. Hierzu wurde über den membrangebundenes Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 mit verschiedenen Mischungen von n-Butylamin und n-Propanol umgesetzt und anschliessend das Verhältnis von N- und O-substituiertem [1,3,5]-Triazin 60- 1 und 63 bestimmt. (Schema 19).

Schema 19: Umsetzung von membrangebundenem Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 mit Mischungen (1:5 bis 5:1) aus n-Propanol 61 und n-Butylamin 58 .

Abb. 9: HPLC-MS-Spuren des abgespaltenen Rohprodukts 60- 1 : 63 bei einem Mischungs-verhältnis von 1 : 5 (n-Butylamin : n-Propanol). Abgebildet ist die UV-Spur (a), der Massenfilter für 60-1 (M+H + ) (b) und 63 (M+H + ) (c).

Nachdem die verbliebenen Chloratome mit Piperidin gequencht wurden, erfolgte die Abspaltung vom polymeren Träger mit TFA-Dampf. Die adhäsiv am Träger gebundenen Substanzen wurden mit wässrigem Acetonitril abgelöst und analysiert (Abb. 9). Die Analytik der erhaltenden Lösungen mittels HPLC-MS zeigte klar, dass selbst bei einem Verhältnis von 1 : 5 (n-Butylamin : n-Propanol) eine selektive Reaktion des Amins erfolgte. (Abb. 9). Somit scheinen Alkohole in Gegenwart von Aminen unter diesen Bedingungen nicht mit 54 zu reagierten. Die Hydroxylgruppen brauchen also während der Reaktion von Aminoalkoholen mit 54 zu Monochlor-[1,3,5]-triazinen nicht geschützt werden.

Im Anschluss wurde eine Reihe von Aminoalkoholen zur Monochlorsubstitution an 30 an der Zellulose- und der PP-Membran untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengefasst.

a aus dem Verhältnis 60 : 53
b nach HPLC bei 220 nm
c n.u. nicht untersucht

Tabelle 10: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Aminoalkohole unter SPOT-Synthese-Bedingungen.

Alle eingesetzten Aminoalkohole lieferten in der SPOT-Synthese sehr gute Ergebnisse. Sowohl an der Zellulose- als auch an der PP-Membran verliefen die Monochlorsub-stitutionen nahezu quantitativ. Bei der wässrigen Hydroxylamin-Lösung (60- 18 ) kam es allerdings zu einer teilweisen Hydrolyse (ca. 5 %) des Triazinderivates 54. Das aufgetretene Hydrolyseprodukt begründet die geringere Reinheit. Bei den Aminoalkoholen mit „zusätzlicher“ Alkylkette wurde keine Hydrolyse von 54 beobachtet.

Bei dem Einsatz von Diaminen ist zu erwarten, dass jede im Molekül befindliche prim. oder sek. Aminogruppe mit den membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazin reagiert. Zur Schützung zusätzlicher Aminogruppen ist die Boc-Gruppe gut geeignet. Der Vorteil dieser Schutzgruppe besteht darin, dass nach der Abspaltung vom Amin nur flüchtige Komponenten (im Gegensatz zu z.B. Trityl) übrig bleiben, was eine „Aufreinigung“ durch evakuieren ermöglicht. Die Entschützung nach der Synthese kann parallel zur Abspaltung der Substanz vom Rink-Linker durch TFA-Dampf erfolgen. Bei der Verwendung von symmetrischen Diaminen wurde dennoch auf eine Mono-Boc-Schützung verzichtet. Es sollte untersucht werden, ob es trotz des grossen Überschusses an Diamin zu einer Verbrückung zweier Triazineinheiten durch Substitution von zwei Chloratomen unterschiedlicher Triazine mit den beiden „Enden“ des gleichen Diamines kommt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle 11 zusammengefasst.

a aus dem Verhältnis 60 : 53
b nach HPLC bei 220 nm
c n.u. nicht untersucht d Boc-Entschützung bei Abspaltung vom planaren Träger

Tabelle 11: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Alkyldiamine unter SPOT-Synthese-Bedingungen.

Die Verwendung von Diamine ohne Mono-Boc-Schützung hat zu keiner Verbrückung zweier Triazineinheiten geführt. Es ist somit problemlos möglich, symmetrische Diamine ungeschützt für die Monochlorsubstitution an Zellulose und PP-Membranen einzusetzen. Ein Vergleich zwischen „freiem“ und Mono-Boc-geschütztem Ethylendiamin (60- 26a und b ) hat keinen Unterschied im Rahmen der Messgenauigkeit (ca. ± 2 %) in Umsatz und Reinheit ergeben. Interessanterweise kam es bei den Synthesen unter Verwendung der sowohl ungeschützten als auch Mono-Boc-geschützten prim. Diamine (60- 26 bis 60- 30 ) im Verlauf der TFA-Abspaltung zu einer Trifluoracetylierung der freien Aminoseitengruppe. Diese Art der Nebenreaktion wurde bereits bei der Peptidsynthese beobachtet.[124] Die Trifluoracetyl-Schutzgruppe ist jedoch gegenüber wässrigen Säuren nicht stabil, so kann sie durch ein Wasser-Acetonitril-Gemisch bei einem pH < 6 innerhalb von zwei Stunden entfernt werden. Die Entschützung wurde durch wiederholte HPLC-MS-Analyse der wässrigen Lösung kontrolliert.

Im Folgenden wurden weitere mehrfach funktionalisierte Alkylamine für die Monochlor­substitution untersucht. Die durchgeführten Reaktionen sollten zeigen, ob Funktionalitäten ohne nucleophile Eigenschaften zu signifikanten Nebenreaktionen bei der Chlorsubstitution führen können. Die Resultate bezüglich Umsätze und Reinheiten an den planaren Oberflächen sind in Tabelle 12 dargestellt.

a aus dem Verhältnis 60 : 53
b nach HPLC bei 220 nm
c n.u. nicht untersucht
d freie Säure nach der TFA-Behandlung

Tabelle 12: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch mehrfach funktionalisierte Alkylamine unter SPOT-Synthese-Bedingungen.

Die Synthesen unter Einsatz von Aminen mit zusätzlichen Etherfunktionen (60- 32 bis 60- 34 ) verliefen problemlos und lieferten die gewünschten Produkte in guten Umsätzen und Reinheiten. Amine mit einer weiteren basischen tert. Aminogruppe hingegen führten in einigen Fällen (60- 35 und 60- 39 ) zum Auftreten von nicht näher zu charakterisierenden Nebenprodukten. Dieses Auftreten von Nebenprodukten wurde nicht bei dem Homologen 4-(3-Aminopropyl)-morpholin (60- 36 ) beobachtet. Das Hydrazinderivat konnte nur mit mässigen Umsätzen und geringer Reinheit für die Monochlorsubstitution zu 60- 41 eingesetzt werden. Ein zu 15 % auftretendes Nebenprodukt mit einer um 16 geringen Masse, deutet auf eine Deaminierung der Hydrazingruppe hin. Die Umsetzung von 54 mit 2-Aminoacetaldehyd-diethylacetal verlief nahezu vollständig. Im Zuge der Abspaltung von der planaren Oberfläche mit TFA kam es wie erwartet zur Entschützung der Aldehyd­funktion (60- 42 ). Die Synthese mit Aminoethylhydrogensulfat lieferte zwar einen guten Umsatz, 60- 43 wies aber aufgrund vieler Nebenprodukte nur eine geringere Reinheit auf. Die auftretenden Nebenprodukte entsprachen jedoch nicht einer Hydrolyse des Di- bzw. Monochlor-[1,3,5]-triazinrestes oder eine Abspaltung des Sulfatrestes. In den Fällen mit vorhandenen Estergruppen im Amin kam es im Verlauf der Synthese, vermutlich bei der Abspaltung vom polymeren Träger mit TFA zur teilweisen Esterhydrolyse, was die etwas geringeren Reinheiten (speziell 60- 47 ) bei diesen Bausteinen (60- 47 bis60- 49 ) erklärt. Die Löslichkeit einiger Aminosäurederivate (60- 45 bis 60- 49 ) war in NMP so gering (unter 0,5 M), dass Wasser als Lösungsmittel eingesetzt wurde, welches ebenfalls sehr gut für die Synthese unter SPOT-Bedingungen geeignet ist. Zur besseren Benetzung der Oberfläche, speziell der PP-Membran, wurden 0,1 % Tween® 20 zugegeben. Zusammenfassend zeigten sich (im Sinne von möglichen Nebenreaktionen) viele verschiedene funktionelle Gruppen kompatibel mit der Monochlorsubstitution mittels SPOT-Synthese an Zellulose- und PP-Membranen.

(C) Arylamine

Die dritte Gruppe der untersuchten Amine war die der Arylamine, wobei hierzu nicht nur die Benzylaminderivate zählten, sondern auch solche Amine, die generell im Molekül einen (Hetero-)Aromaten tragen. Lediglich die Anilinderivate wurden aufgrund ihrer allgemeinen geringeren Reaktivität gesondert untersucht. Die Untersuchungen wurden analog zu dem beiden Gruppen A und B durchgeführt, nur das nach Einsatz des Testamines verbliebene Chloratome durch Benzylamin substituiert wurden (Schema 20).

Schema 20: Bestimmung der Umsetzung von Arylaminen mit Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 am Beispiel des 2-Chlorbenzylamins 64 nach Abspaltung von der planaren Oberfläche.

Die Untersuchungen wurden vergleichend sowohl an der Zellulose- als auch an der PP­Membran durchgeführt. Die Ergebnisse der zur Monochlorsubstitution an membran-gebundenem Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 eingesetzten 21 Arylamine sind in Tabelle 13 zusammengefasst.

a aus dem Verhältnis 66 : 67
b nach HPLC bei 220 nm
c n.u. nicht untersucht
d verbliebene Chloratome mit 3-Chlorbenzylamin substituiert

Tabelle 13: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Arylamine unter SPOT-Synthese-Bedingungen.

Die Reaktionen verliefen im Durchschnitt mit fast 90 % Umsatz an der Zellulose und mit sogar über 90 % an der PP-Membran. Erwartungsgemäss traten bei einfachen Arylaminen (67,66- 6 , und 6- 12 bis 66- 14 )und solchen mit Chlor- (66- 1 bis 66- 4 ) oder Methoxysubstituenten (66- 5 und 66- 9 ) keine Nebenreaktionen auf. Das Diamin (66- 7 ) wurde, wie in der vorherigen Gruppe, ohne Schützung der zweiten Aminofunktion eingesetzt. Auch hier wurde keine Verbrückung zweier Triazineinheiten durch ein Diamin beobachtet. In diesen Fällen wurde keine Trifluoracetylierung nachgewiesen. Bei (1S,2S) 2-Amino-1-(4-nitrophenyl)-1,3-propandiol und Furfurylamin (66- 11 und 66- 15 ) kam es vermutlich im Verlauf der Synthese an der Zellulosemembran zu multiplen Nebenreaktionen, da hier die Syntheseprodukt durch viele, nicht näher charakterisierbare, Substanzen verunreinigt waren. Die Zielverbindungen in den entsprechenden Fällen von der PP-Membran wiesen eine deutlich höhere Reinheit auf. Im Gegensatz hierzu wurde im Fall des Nicotinhydrazins (66- 20 ) eine deutlich geringerer Reinheit an der PP-Membran festgestellt. An beiden Membranen kam es jedoch zu nicht eindeutigen Zersetzungen vor oder nach der Abspaltung der Syntheseprodukte. Die Synthese mit den restlichen Heteroarylaminen (66- 16 bis 66- 19 und 66- 21 ) verlief mit guten Umsätzen ohne Auftreten von signifikanten Nebenreaktionen. Insgesamt sind die Arylamine sowohl aufgrund ihrer geringen Flüchtigkeit und hohen Reaktivität gut für den Einsatz zur Darstellung von [1,3,5]-Triazinen unter SPOT-Synthese-Bedingungen geeignet.

(D) Anilinderivate

Die letzte Gruppe an untersuchten Aminen bestand aus Anilinderivaten und aminosubstituierten Heteroaromaten. Ein Grossteil dieser Verbindungen liegt als Feststoff vor, der sich nur schlecht in NMP oder alternativ in DMSO, Wasser oder DMF löst, so dass nur in zwei von 14 Fällen eine 5 M Lösung erhalten werden konnte. Daher wurden meist nur deutlich geringere Konzentrationen eingesetzt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 14 aufgeführt.

a aus dem Verhältnis 66 : 67
b nach HPLC bei 220 nm
c n.u. nicht untersucht
d Zusatz von 0,1 Äq. TMSCl (bezogen auf die eingesetzte Menge an Amin)

Tabelle 14: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an 54 durch Anilinderivate unter SPOT-Synthese-Bedingungen.

Anilin (66- 22 ) und die rein halogensubstituierten Derivate (66- 24 und 66- 25 ) lieferten gute Ergebnisse unter SPOT-Synthese-Bedingungen. Auch bei dem verwendeten p-Anisidin (66- 26 ) und p-Phenoxyanilin (66- 27 ) wurden gute Umsätze und Reinheiten erzielt. Ansonst verliefen die Synthesen mit Aminen aus dieser Gruppe mit den niedrigsten Umsätzen. Selbst Zusatz von TMSCl zur Aktivierung[125, 126] brachte nur im Fall von α-Naphtylamin (66- 31a und b ) eine deutliche Steigerung, aber keinen vollständigen Umsatz. Bei sterisch gehinderten Anilinderivat (66- 23 ) brachte dieser Zusatz keine Änderung. Allgemein zeigten elektronenärmere Derivate als Anilin schlechte Resultate. Die Derivate der Heteroaromaten (66- 32 bis66- 34 ) lieferten ebenfalls schlechte Umsätze an beiden Membranen. Eine Verlängerung der Reaktionszeit ist im Hinblick auf den späteren parallelen Einsatz mit den Aminen der anderen Gruppen nicht praktikabel, da ungewiss ist, wie es sich auf die Gesamtproduktqualität auswirkt. Es ist daher effizienter sich bei der Synthese grosser Substanzbibliotheken auf solche Bausteine zu beschränken, die im Vortest unter Standardbedingungen gute Ergebnisse geliefert haben.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden 84 Amine zur Monochlorsubstitution am membran­gebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 untersucht. Hierbei hat sich der inhärenter Nachteil der SPOT-Synthese, die geringen Produktmengen, als Problem bei der Identifizierung von einigen aufgetretenen Nebenreaktionen erwiesen. Insgesamt zeigen die Resultate der Unter­suchungen jedoch, dass eine grosse Zahl an strukturell verschiedenen Aminen für die Monochlorsubstitution an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen unter SPOT-Synthese-Bedingungen verwendbar sind. Sowohl an Zellulose als auch an der PP-Membran verliefen die Reaktionen in ca. 80 % aller untersuchter Fälle mit Umsätzen von mehr als 80 % (vgl. Abb. 10).

Abb. 10: Umsatzverteilung der getesteten Amine an der Zellulose- und PP-Membran.

Die Verwendung einer Schutzgruppe für Hydroxylfunktionen bei mehrfach funktionalisierten Alkylaminen ist nicht notwendig. Symmetrische Diamine können direkt eingesetzt werden, da eine Überbrückung zweier Triazineinheiten nicht beobachtet wurde. Besonders gut sind Arylamine für die Monochlorsubstitution an Dichlor-[1,3,5]-triazinen mittels SPOT-Synthese geeignet. Von den 13 getesteten Anilinderivaten sind lediglich sechs mit Umsätzen > 80 % für den Einsatz in grösseren Bibliotheken geeignet, wobei ggf. weitere insbesondere elektronenreiche Derivate verwendbar sind.

Verwendung von O-Nucleophilen unter SPOT-Synthese-Bedingungen

Zusätzlich zur Untersuchung der Verwendbarkeit von N-Nucleophilen sollten auch O-Nucleophile zur Substitution an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen getestet werden. Aus den Ergebnissen von Dudley et al.,[75] Falorni et al. [23] und den Selektivitätsuntersuchungen der Aminoalkohole (Kapitel 2.4.1), zeigte sich, dass Hydroxylgruppen, wenn überhaupt, wesentlich langsamer die Chloratome am [1,3,5]-Triazinring substituieren als Aminogruppen.

Für die ersten Untersuchungen der O-Nucleophile wurde die PP-Membran als planare Oberfläche gewählt, um den Überschuss an Hydroxylgruppen der Zellulosemembran zu vermeiden. Aufgrund der Löslichkeit der verwendeten Reagenzien wurde DMSO eingesetzt. Die Reaktionszeit betrug 30 Minuten bei Raumtemperatur. Es zeigte sich, dass aliphatische und benzylische Alkohole nicht oder nur mit Umsätzen unter 20 % reagierten. Der Umsatz wurde in Analogie zur Untersuchung der Amine nach Reaktion der verbliebenen Chloratome am [1,3,5]-Triazinring mit Butyl- oder Benzylamin aus dem Verhältnis trisamino- zu diamino-oxy-substituiertem Triazin bestimmt (Schema 21).

Schema 21: Untersuchungen zur SPOT-Synthese von diamino-oxy-substituiertem Triazin 69 an einer PP-Membran am Beispiel von Alkoholen mit Arylrest.

Zur Untersuchung der Reaktivität in der SPOT-Synthese wurden fünf O-Nucleophile (Cyclohexanol, 2,2,2-Trifluorethanol, 2-Chlorbenzylalkohol, Phenol und Pentafluorphenol) ausgewählt und unter verschiedenen Bedingungen an der Rink-Linker-modifizierten PP-Membran mit immobilisiertem Dichlor-[1,3,5]-triazin umgesetzt. Der Einsatz einer Hilfsbase ist ein kritischer Punkt; bei dem Einsatz von DBU konnte lediglich das DBU-Triazinyl-Salz nachgewiesen werden. Als Alternative wurde in einigen Fällen DIEA den entsprechenden Lösungen zugesetzt (Abb. 11).

Abb. 11: Umsatz verschiedener O-Nucleophile mit Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 an der PP-Membran.

Der Einsatz verschiedener Konzentrationen mit und ohne Base führte bei keinem der untersuchten O-Nucleophile zu einem befriedigendem Umsatz. Die Überführung der Nucleophile in die entsprechenden Cäsiumsalze[127] in DMSO lieferte unter SPOT-Synthese-Bedingungen keine Verbesserung der Ergebnisse für Cyclohexanol, 2,2,2-Trifluorethanol und 2-Chlorbenzylalkohol. Bei den Phenolaten hingegen kam es zu einem deutlichen Anstieg des Umsatzes, so wurde mit Cäsiumphenolat bei Raumtemperatur über 60 % Umsatz erreicht. Die Verbindungen zeichnen sich durch eine geringere Polarität als die vergleichbar aminosubstituierten [1,3,5]-Trazine aus, was eine Auftrennung der Syntheseprodukte erschwerte. Zur Erhöhung der Polarität der Produkte wurde am Rink-Linker eine Glutaminsäure eingefügt und das Cyanurchlorid am N-Terminus der Aminosäure immobilisiert. Die Untersuchungen von Cäsiumsalzen weiterer Phenole zur Monochlorsubstitution unter SPOT-Synthese-Bedingungen wurden an beiden Membranen durchgeführt (Tabelle 15). Die verbliebenen Chloratome wurden nach den Umsetzungen mit den Phenolaten mit Benzylamin (Analog zu Schema 21) zur Reaktion gebracht.

a aus dem Verhältnis 70 : 71
b nach HPLC bei 220 nm

Tabelle 15: Umsatz und Reinheit nach Monochlorsubstitution an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazinen durch verschiedene Cäsiumphenolate.

Die Cäsiumsalze wurden hierfür als 1 bis 4 M Lösungen (in Abhängigkeit ihrer max. Löslichkeit) in DMSO eingesetzt. Die Reaktionszeit betrug in allen Fällen 30 min. Der Einsatz von Glutaminsäure erleichterte die Analytik bzgl. der Auftrennung. Hierbei zeigte sich eine sehr grosse Varianz in der Reaktivität der Phenolationen. Im Allgemeinen ver-liefen die Umsetzungen an der PP-Membran deutlich besser als an der Zellulosemembran. Dies lag vermutlich an dem Überschuss an Hydroxylgruppen der Zellulose, der zu einer verstärkten Hydrolyse der Phenolate führen kann. Dies hat zur Folge, dass niedrigere Überschüsse oder überhaupt kein Phenolat zur Reaktion mit den Dichlor-[1,3,5]-triazinen zur Verfügung standen. Von den 12 getesteten Phenolen lieferten die Hälfte Umsätze von über 75 % an der PP-Membran. Eine Verlängerung der Reaktionszeit auf über 30 Minuten lieferte keine besseren Ergebnisse. Im Gegenteil, bei längeren Reaktionszeiten konnte zusätzlich das Auftreten des doppelt chlorsubstituierten Diphenoxy-[1,3,5]-triazins zu 10 bis 20 % nachgewiesen werden. Die Untersuchungen haben ergeben, dass Phenolate nur bedingt unter den limitierenden Bedingungen der SPOT-Synthese zur Monochlor­substitution an Dichlor-[1,3,5]-triazinen bei Raumtemperatur einsetzbar sind.
Nucleophile Substitution an membrangebundenen 6-Monochlor-[1,3,5]-triazinen

Die Umsetzung des letzten Chloratomes an den erhaltenden Monochlor-[1,3,5]-triazinen mit Nucleophilen erfordert sehr lange Reaktionszeiten oder erhöhte Temperaturen (vgl. Kapitel 1).[2-4, 7, 22, 23, 75] Beide Parameter sind nur schwer oder gar nicht unter SPOT-Synthese-Bedingungen zu realisieren. Es galt eine Möglichkeit zu finden, die Chlorsubstitution in dem „offenem System“ der SPOT-Synthese durchzuführen.

Verwendung von Aminen unter SPOT-Synthese-Bedingungen

Bei der Realisierung der benötigten erhöhten Temperatur stösst man in der SPOT-Synthese auf zwei Probleme; dem Energietransfer zu den einzelnen SPOTs und das offene System an sich. Die geringen Volumina an Amin-Lösungen (2 µl an der Zellulose bzw. 1 µl an der PP-Membran) die verwendet werden verhindern den Einsatz konventioneller Energie-transfermethoden wie etwa einer Heizplatte, da die Lösungen verdampft sind, bevor die nötigen Reaktionstemperaturen erreicht werden.

Eine Alternative zum herkömmlichem Energietransfer stellt der Einsatz von Mikro-wellenstrahlung (MW) dar. Sie wurde für eine Reihe verschiedener Reaktionen in Lösung eingesetzt,[128, 129] unter anderem auch zur Beschleunigung der SNAr-Reaktion an Aryl-halogeniden durch Amine.[130] Um die Übertragbarkeit dieses Energietransfers auf die vor-liegende Reaktion zu untersuchen wurde der Effekt der Mikrowellenbestrahlung (810 W) im Vergleich zur „traditionellen“ Erwärmung bezogen auf die Chlorsubstitution am Monochlor-[1,3,5]-triazin getestet. Der Vergleich erfolgte sowohl in Lösung, als auch an einem Syntheseharz mit Rink-Linker-Triazin-Einheit (Tabelle 16).

aaus der HPLC-Peak Fläche der Rohprodukte

Nr.

Phase

Amin

Bedingungen

Umsatz [%]a

1

Lösung

Tetrahydrofurfurylamin

140°C, 24 h

50

2

Lösung

Tetrahydrofurfurylamin

Mikrowelle, 3 min

> 95

3

Syntheseharz

Tetrahydrofurfurylamin

80°C, 1 h

75

4

Syntheseharz

Tetrahydrofurfurylamin

80°C, 4 h

> 95

5

Syntheseharz

Tetrahydrofurfurylamin

Mikrowelle, 3 min

> 95

6

Syntheseharz

Cyclohexylamin

80°C, 1 h

50

7

Syntheseharz

Cyclohexylamin

Mikrowelle, 3 min

> 95

8

Syntheseharz

Dibutylamin

Mikrowelle, 3 min

> 95

Tabelle 16: Untersuchungen zur Chlorsubstitution an Monochlor-[1,3,5]-triazinen durch Amine unter Mikrowellenbestrahlung.

Die Analytik der Produktgemische erfolgte im Fall der Synthesen in Lösung (Nr. 1 und 2) direkt aus der Synthesemischung, im Fall der Harzsynthesen (Nr. 3 - 8) aus der Abspaltungslösung vom Rink-Linker, um etwaige Hydrolyse der Chlortriazinderivate durch weitere Aufarbeitungen zu verhindern. Die Analytik zeigt, dass der Einsatz von Mikrowellenbestrahlung die Reaktion der Amine mit den Monochlor-[1,3,5]-triazinen sowohl in Lösung (um den Faktor 500), als auch an der festen Phase (um den Faktor 80) beschleunigt.

Diese sehr guten Ergebnisse galt es nun auf die Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken mittels SPOT-Synthese zu übertragen. Wie schon im Fall der Chlorsubstitutionen am Dichlor-[1,3,5]-triazinen wurden die zu testenden Amine in vier Gruppen unterteilt:

(A) Alkylamine

(B) mehrfach funktionalisierte Alkylamine

(C) Arylamine

(D) Anilinderivate

Die Untersuchung der beiden Gruppen mit den aliphatischen Aminen erfolgte an 72, die der Gruppen aromatischer Amine an 73 (Abb. 12).

Abb. 12: Modellsysteme zur Untersuchung der Substituierbarkeit des Chloratomes von Monochlor-[1,3,5]-triazinen an Zellulose- und PP-Membran in der SPOT-Synthese.

Nach Durchführung der jeweiligen Reaktionen unter Mikrowellenbestrahlung erfolgte eine erneute Umsetzung (zwei h Inkubation bei 80°C) mit n-Butylamin für 72 bzw. Benzylamin für 73, um die zuvor nicht umgesetzten Chloratome zu substituieren.

(A) Alkylamine

Die Untersuchungen erfolgten an einer kleinen Auswahl an Aminen (Tabelle 17). Die Reaktionsumsätze und Reinheiten wurden erneut unter SPOT-Synthese-Bedingungen an kontinuierlichen Oberflächen getestet. Amine mit einem Siedepunkt von weniger als 50°C wurden aufgrund der schlechteren Ergebnisse bei Raumtemperatur und der vermutlich raschen Verdampfung nicht eingesetzt.

Die jeweiligen Amine wurden auf die modifizierten planaren Oberflächen gespottet und im Anschluss sofort einer Mikrowellenbestrahlung ausgesetzt. Hierbei hat sich gezeigt, dass nach einer Bestrahlungszeit von mehr als drei Minuten die Aminlösung verdampft war, und die SPOTs vollständig trocken waren. Aus diesem Grund betrug die Bestrahlungszeit für alle Amine (auch in den anderen Gruppen B-D) drei Minuten.

a aus dem Verhältnis 74 : 75
b nach HPLC bei 220 nm
c n.u. nicht untersucht

Tabelle 17: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazin 72 durch Alkylamine.

Die Ergebnisse der Substitution durch einfache Alkylamine unter Mikrowellenbestrahlung spiegelten die Resultate der Untersuchungen bei Raumtemperatur wieder. Bei der Substitution des Chloratomes in 72 wurden, wie bereits bei den Untersuchungen zur Monochlorsubstitution bei Raumtemperatur, gute Umsetzungen bei in α-Position unverzweigten Aminen (74- 1 und 74- 2 ) erhalten. Das sterische gehinderte 1-Adamantylamin (74- 4 ) hingegen, welches zusätzlich eine geringe Löslichkeit aufweist, lieferte sehr geringe Umsetzungen. Wiederholtes Spotten und Bestrahlen führte zu keiner Steigerung des Reaktionsumsatzes. Cyclohexylamin (74- 3 ) zeigte geringfügig bessere Ergebnisse an der PP-Membran verglichen mit der Zelluloseoberfläche, was insgesamt auf das Auftreten zweier Nebenprodukte zurückzuführen ist. Die Nebenprodukte liessen sich nicht durch MS-Analytik identifizieren. Die Umsetzung mit Piperidin (74- 5 ) verlief an beiden Oberflächen quantitativ. 2,2,6,6-Tetrametylpiperidin (74- 6 ) konnte auch unter Mikrowellenbestrahlung nicht mit dem Monochlor-[1,3,5]-triazinrest zur Reaktion gebracht werden.

(B) mehrfach funktionalisierte Alkylamine

Die zweite Gruppe an untersuchten Aminen, bildeten die mehrfach funktionalisierten Alkylamine wie Ethylendiamin oder 2-Amino-1,3-propandiol. Wie in Kapitel 2.4.1. beschrieben, wurden Alkohole und zusätzliche Aminogruppen in den Aminen nicht geschützt. Eine Ausnahme bildete das Ethylendiamin, welches Mono-Boc-geschützt eingesetzt wurde, da diese Verbindung einen höheren Siedepunkt besitzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 zusammengefasst.

a aus dem Verhältnis 74 : 75
b nach HPLC bei 220 nm
c n.u. nicht untersucht
d Entschützung im Zuge der TFA-Behandlung

Tabelle 18: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an 72 durch mehrfach funktionalisierte Alkylamine.

Der Einsatz von Hydroxylamin (74- 7 ) für die Synthese komplexer [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken unter Mikrowellenbestrahlung ist problematisch, da es eine hohe Flüchtigkeit aufweist. Beim Test von Hydroxylamin konnten so bis zu 5 % Einbau dieses Amines auch bei den auf der Membran benachbarten SPOTs nachgewiesen werden (74- 8 bis74- 10 ). Alle weiteren Amine dieser Gruppe haben in den Tests zur Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung gute bis sehr gute Ergebnisse geliefert. Bei den Umsetzungen mit prim. Diaminen (74- 11 bis 74- 15 ) kam es erneut im Zuge der Abspaltung der Produkte von der planaren Oberfläche mit TFA zu einer reversiblen Trifluoracetylierung. Amine mit Ether und tert. Aminogruppen lieferten bei den Untersuchung ebenso gute Resultate wie die eingesetzten Aminosäuren (74- 21 bis 74- 2 4). Die geringe Reinheit im Fall des Glutaminsäure(tert.butyl)methylester (74- 24 ), bzw. der freien Säure nach TFA-Behandlung im Verlauf der Abspaltung von der Membran, ist auf eine teilweise aufgetretene Decarboxylierung zurückzuführen.

(C) Arylamine

Die dritte Gruppe der untersuchten Amine bildeten die Arylamine, die erneut nicht nur die Benzylaminderivate umfasste, sondern generell alle Amine mit einen (Hetero-)Aromaten einschloss. Die Anilinderivate wurden aufgrund ihrer allgemein geringeren Reaktivität wie bei den Reaktionen bei Raumtemperatur gesondert untersucht. Die Ergebnisse der zur Monochlorsubstitution an membrangebundenen Dichlor-[1,3,5]-triazin 73 eingesetzten 12 Arylamine sind in Tabelle 19 gezeigt. Aufgrund der Symmetrie des [1,3,5]-Triazinringes wurden die gleichen Verbindungen erhalten, wie in Kapitel 2.4.1 beschrieben. Zur Vereinfachung der Diskussion der Ergebnisse wurden jedoch neue Nummern für die folgenden Verbindungen gewählt.

a aus dem Verhältnis 76 : 77
b nach HPLC bei 220 nm
c n.u. nicht untersucht
d verbliebene Chloratome mit 3-Chlorbenzylamin substituiert

Tabelle 19: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazin 73 durch Arylamine.

Für Arylamine stellte die Mikrowellenbestrahlung ebenfalls eine äusserst effiziente Methode dar, um die Chlorsubstitution an der Modellverbindung 73 zu beschleunigen. Die Umsätze der Amine bei erhöhter Temperatur entsprachen denen bei Raumtemperatur. So verliefen die Umsetzungen mit 3,3-Diphenylpropylamin zu 66- 13 (Raumtemperatur) und 76- 6 (MW) zu 99 % an der Zellulosemembran oder die Reaktion mit Homoveratrylamin zu 66- 9 bzw. 76- 4 zu 96 % an der PP-Membran. Alle hier untersuchten Amine zeigten Umsätze von mindest. 89 % (76- 11 ). Allgemein konnte kein deutlicher Unterschied bzgl. der Reaktivität zwischen „einfachen“ substituierten Arylaminen und Aminen mit Heteroaromaten beobachtet werden. Im Vergleich mit der zuvor untersuchten Chlorsubstitution bei Raumtemperatur, wurden somit dieselben hohen Reaktivitäten der Amine und vergleichbare Reinheiten der Zielprodukte unter Mikrowellenbestrahlung beobachtet.

(D) Anilinderivate

Die letzte Gruppe untersuchter Amine bestand aus Anilinderivaten. Im Gegensatz zu der Testreihe zur Monochlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin 54bei Raumtemperatur (vgl. Kapitel 2.4.1) wurde exemplarisch nur ein aminsubstituierter Heteroaromat getestet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 20 aufgeführt. Wie bereits für die Gruppe C wurde auch hier eine neue Numerierung der Verbindungen gewählt.

a aus dem Verhältnis 76 : 77
b nach HPLC bei 220 nm
c Zusatz von TMSCl

Tabelle 20: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazin 73 durch Anilinderivate.

Die Synthesen mit den Anilinderivaten verliefen mit deutlich besseren Ergebnissen als zuvor die Tests bei Raumtemperatur. Bei dem sterisch gehinderten 2,4,6-Trimethylanilin, dem elektronenarmen 4-Nitroanilin und 2-Aminothiazol (76- 13 , 76- 17 und 76- 20 ) wurden erneut die schlechtesten Ausbeuten erhalten. Ein Zusatz von TMSCl (0,1 Äq. bezogen auf die eingesetzte Menge an Amin) zur Aktivierung brachte in keinem dieser Fälle eine deutliche Verbesserung. Bei vielen anderen Aminen wurde hingegen eine deutliche Steigerung (z.B. 76- 14a und b ) beobachtet, wodurch sich ein genereller Zusatz von TMSCl empfielt. Eine Verlängerung der Mikrowellenbestrahlung brachte keine positiven Resultate. Die SPOTs von 2-Amino-4-chlorphenol und 4-Amino-benzylalkohol (76- 18 und 76- 19 ) zeigten eine schwarze Verfärbung und multiple Zersetzungsprodukte nach der Abspaltung vom Rink-Linker. Die Reinheit von 66- 34 und 76- 20 war identisch, so dass die Verwendung des Thiazols zur Substitution an Chlor-[1,3,5]-triazinderivaten ungeeignet scheint. Gleiches gilt für 2,4,6-Trimethyanilin (66- 23 und 76- 13 ) und 4-Nitroanilin (66- 28 und 76- 17 ). Bei der Synthese grosser Substanzbibliotheken sollte man sich auf die Verwendung von Anilin, p-Anisidin, 3-Chlor-4-fluoranilin und 4-Phenoxyanilin unter Zusatz von TMSCl beschränken.

In der SPOT-Synthese bestand bislang ein Problem bei der Durchführung von Reaktionen bei erhöhter Temperatur. Lediglich die gesamte Membran konnte durch Inkubation mit einer Lösung und kompletter Erwärmung behandelt werden. Mit der Mikrowellen-bestrahlung wurde eine Methode gefunden, die einen raschen Energietransfer bietet und den punktuelle Einsatz unterschiedlicher Reagenzien auf den planaren Oberfächen bei erhöhter Temperatur ermöglicht. Die Untersuchungen zur Umsetzung verschiedener Amine mit den Monochlor-[1,3,5]-triazinen 72 und 73 ergaben, dass der Einsatz von Mikrowellen-bestrahlung sowohl an Zellulose- als auch an PP-Membranen in fast allen Fällen zu nahezu vollständigen Umsetzungen geführt hat. An der Zellulosemembran wurden insgesamt 44 Amine getestet, davon lieferten 37 Umsätze von mehr als 85 %. Von den 30 untersuchten Aminen an der PP-Membran zeigten 24 Umsätze über 85 %. Interessanterweise konnte kein Unterschied im Reaktionsverhalten zwischen den beiden planaren Oberflächen bei den verwendeten Aminen festgestellt werden.

Verwendung von Phenolaten unter SPOT-Synthese-Bedingungen

Zusätzlich zu den Aminen wurden Phenole als Diversitätsquelle zur Substitution an Monochlor-[1,3,5]-triazinen für die Synthese entsprechender Bibliotheken verwendet. Aliphatische und benzylische Alkohole wurden aufgrund der schlechten Ergebnisse an dem reaktiveren Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 nicht in weitere Untersuchungen einbezogen. Ein Vor-teil der Chlorsubstitution am Monochlor-[1,3,5]-triazin 78 ist, dass ein genaues Einstellen der richtigen Reaktionszeit wie z.B. bei dem Dichlor-[1,3,5]-triazin 54, wobei einer zu lange Reaktionszeiten das doppelt chlorsubstituierte Diphenoxy-[1,3,5]-triazinprodukt auftrat, nicht notwendig ist. Die Durchführung erfolgte in Analogie zu den Untersuchungen der Arylamine (Schema 22).

Schema 22: Untersuchungen der Cäsiumphenolate zur Chlorsubstitution am Monochlor-[1,3,5]-triazin unter Mikrowellenbestrahlung.

Es wurden die selben Phenolate bzgl. der Chlorsubstitution an 78 untersucht wie zuvor bei den Untersuchungen bei Raumtemperatur (Kapitel 2.4.2). Nach dem Spotten der entsprechenden Lösungen auf die Zellulose- bzw. PP-Membran wurde eine Reaktionszeit von drei Minuten unter Mikrowellenbestrahlung in Analogie zu den Untersuchungen der Amine (Kapitel 2.5.1) gewählt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 21 gezeigt.

a aus dem Verhältnis 80 : 81 b nach HPLC bei 220 nm

Tabelle 21: Umsatz und Reinheit nach Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazin 78 durch Cäsiumphenolaten.

Im Gegensatz zu der Chlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 kam es am untersuchten Monochlor-[1,3,5]-triazin 78 in fast allen Fällen an der PP-Membran zu Umsätzen von über 75 %. An der Zellulosemembran lieferten Pentafluorphenol, 4-Nitrophenol und 8-Hydroxychinolin (80- 4 , 80- 5 und 80- 12 ) Reaktionsumsätze von höchstens 59 %. Das schlechtere Ergebnis von 8-Hydroxychinolin (80- 12 ) an der Zellulose war verglichen mit dem Resultat an der PP-Membran besonders verwunderlich. Insgesamt konnten an der Zellulosemembran jedoch besser Umsätze der Phenolate unter Mikro­wellenbestrahlung als bei Raumtemperatur erreicht werden.

Wie bei der Reaktion von Aminen mit Monochlor-[1,3,5]-triazinen 72 und 73, konnte auch bei den Phenolaten die Mikrowellenbestrahlung als eine Methode zum raschen Energietransfer erfolgreich eingesetzt werden. Dies erlaubt die Synthese von Diaminophenoxy-[1,3,5]-triazinen 80 unter SPOT-Synthese-Bedingungen. Es ist möglich mittels Mikrowellenbestrahlung die Reaktivitätsunterschiede von Phenolaten an der Zellulose- und der PP-Membran aufzuheben, und einen effizienten Einsatz an beiden planaren Oberflächen zu ermöglichen. Der Einsatz von Phenolaten bietet die Möglichkeit funktionelle Gruppen wie z.B. aromatische Aldehyde in die Bibliothek zu integrieren, die nicht ohne weiteres über funktionalisierte Amine zugänglich sind. Über die Aryletherbindung lassen sich darüberhinaus sterisch anspruchsvoll substituierte Aromaten an das [1,3,5]-Triazin anknüpfen, die über das entsprechend funktionalisierte Anilin nicht eingeführt werden können. Ein Beispiel hierfür stellt der Trimethylphenylrest, der als Phenol mit mindestens 59 % Reinheit „eingebaut“ werden kann, wohingegen das entsprechende Anilinderivat lediglich 13 % Reinheit lieferte.
Synthese von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken unter optimierten Bedingungen

Bislang wurden die verschiedenen Amine an vereinfachten Modellsystemen getestet. Die erarbeiteten Bedingungen zur Chlorsubstitution sollten im Folgenden erstmals zur Darstellung einer grösseren Bibliothek eingesetzt werden. Im Gegensatz zu den bisherigen Synthesen sollte die Darstellung der Bibliothek unter Einsatz eines Pipettierroboters zur Verteilung der Reagenzien erfolgen. Als planarer Träger wurde eine aminoderivatisierte Zellulosemembran verwendet. Als Linker wurde der Rink-Linker ausgewählt, da er ein einfaches Arbeiten (die Synthesen müssen nicht unter Lichtausschluss wie bei dem Photo-linker durchgeführt werden vgl. Kapitel 2.2.3) und paralleles, ortsadressiertes Abspalten vieler Verbindungen durch TFA-Dampf ermöglicht. Eine Kompatibilität verschiedener Aminosäuren mit der nucleophilen Substitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin durch Nucleophile konnte bereits am Syntheseharz gezeigt werden.[29] Unter Einsatz der SPOT-Synthese sollte für die Darstellung der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek eine Peptomereinheit, bestehend aus Aspartat an der C-terminalen Position und fünf verschiedenen Peptoid-Bausteinen, eingesetzt werden. Die allgemeine Syntheseabfolge ist in Schema 23 gezeigt.

Schema 23: Halbautomatische SPOT-Synthese der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek mit einer C-terminalen Peptomereinheit.

Für die Synthese der Peptoid-Bausteine nach einer für die SPOT-Synthese modifizierten Sub-Monomer-Methode[49, 51] wurden fünf Amine (R1-NH2 86 in Schema 23) eingesetzt. Durch Inkubation der gesamten Zellulosemembran mit einer 2 M Lösung von Cyanurchlorid 5 in DCM wurde der Stickstoff-Heterocyclus an dem sek. Amin im-mobilisiert. Anschliessend wurden 25 Amine (R2R3-NH 88 in Schema 23) zur Monochlor-substitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin 87 eingesetzt. Das verbliebene Chloratom am Triazinring wurde mit zwei Aminen (R4R5-NH 89 in Schema 23) unter Mikrowellen-bestrahlung umgesetzt. Die Benennung einzelner Verbindungen der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek 91 erfolgt durch Codierung der in den einzelnen Schritten eingesetzten Bausteine. Die Amine der Peptoidsynthese und die Amine für die Monochlorsubstitution bei Raumtemperatur sind in Abb. 13 gezeigt. Die Substitution unter Mikrowellenbestrahlung erfolgte mit Benzylamin 65 (≡ C-01) und Piperidin 59 (≡ C-02). Die Verbindung 91-( 1-1-1 )trägt die Substituenten Benzyl (A-019), Acetaldehyd (B-01) und Benzyl (C-019) (Abb. 13).

Abb. 13: Die eingesetzten Amine in der Peptoidsynthese (R 1 ) und zur Monochlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin bei Raumtemperatur (R 2 / R 3 ).

Insgesamt wurde eine [1,3,5]-Triazin-Bibliothek bestehend aus;

5 (R1NH2) x 25 (R2R3NH) x 2 (R4R5NH) = 250 Verbindungen

erhalten. Der folgende Arbeitsschritt bestand aus der Abspaltung der Verbindungen vom Rink-Linker an der Zellulosemembran. Hier zeigte sich der Vorteil der Gasphasen TFA-Abspaltung; im Gegensatz zur herkömmlichen Methode musste nicht 250-mal ein definiertes Volumen TFA-Lösung pipettiert werden, sondern es konnten bis zu 50 SPOTs (begrenzt durch die Grösse des vorhandenen Exsikkators) parallel mit TFA-Dampf abgespalten werden. Die Aufarbeitung gestaltete sich darüberhinaus deutlich einfacher, ein effizientes Entfernen der TFA von den SPOTs erfolgte innerhalb von ca. 15 Minuten im leichten Vakuum, anders als bei Abspaltungen in Lösung wo mitunter 60 Minuten bei erhöhter Temperatur im Hochvakuum erforderlich sind.

Für die Darstellung der 250 Verbindungen durch die optimierte SPOT-Synthese wurden lediglich drei Tage benötigt. Einen viel grösseren Aufwand erfordert hingegen die Analytik der gesamten Verbindungen. Wird von jeder Verbindung eine HPLC-MS-Analytik à 35 Minuten durchgeführt, so ergeben sich insgesamt über sechs Tage. Aus diesem Grund wurden nur die Hälfte alle Verbindungen analysiert. Aus bisherigen Ergebnissen (Kapitel 2.5.1) war bekannt, dass Benzylamin 65 und Piperidin 59 ähnlich gute Resultate bei der Chlorsubstitution liefern. Da die Amine, die zur Monochlorsubstitution bei Raumtemperatur eingesetzt wurden, sowohl aliphatische als auch aromatische Reste enthielten, wurde die Hälfte ausgewählt, die mit 65 umgesetzt wurde (Kapitel 2.4.1).

Die Analytik ergab für nahezu alle Verbindungen sehr gute Ergebnisse bzgl. Umsatz und Reinheit. Die durchschnittliche HPLC-Reinheit der Produkte betrug 76 %. Dabei wurden die schlechtesten Ergebnisse mit nur rund 40 % Reinheit und ca. 50 % Umsatz bei den Aminosäurederivaten Glutaminsäure(tert.butyl)methylester 88- 15 und β-Alaninamid 88- 21 erhalten. Die Ergebnisse der übrigen 23 Amine zeigten jedoch, dass man mittels SPOT-Synthese eine Vielzahl unterschiedlich substituierter [1,3,5]-Triazine an der Zellulosemembran in sehr guten Reinheiten darstellen kann.

Bei der Analytik der Verbindungen wurde eine unerwartete Nebenreaktion nach der Abspaltung beobachtet. Infolge der grossen Anzahl an Proben, die in einem Gemisch aus Wasser:Acetonitril (1:1) mit 0,1 % TFA gelöst wurden, konnten einige Substanzen erst nach einigen Stunden analysiert werden. So wurde z.B. bei der Analytik von 91-( 1-18-1 ) neben dem erwarteten C-terminalen Amid auch die entsprechende Säure 92-( 1-18-1 ) gefunden (Schema 24).

Schema 24: Hydrolyse des C-Terminus der Peptomereinheit von 91-( 1-18-1 ) vor der HPLC-MS Analytik.

Als Folge der Hydrolyse wurde durch das Auftreten eines zweiten Peaks in dem HPLC-Chromatogramm beobachtet. Die Substanz dieses Peaks hatte eine um eins grössere Masse und zeigte in MS2-Experimenten nicht eine –17 (Abspaltung von Ammoniak am C-terminalen Amid), sondern eine –18 (Abspaltung von Wasser am C-terminale Säure) Fragmentierung. Der Anteil an Säure 92 schwankte von Probe zu Probe, war jedoch bei den Verbindungen mit Anilinresten am [1,3,5]-Triazinring am grössten.

Um diese Beobachtung näher zu untersuchen, wurden einige [1,3,5]-Triazine mit anilinischen Resten am Rink-Linker einer Zellulosemembran synthetisiert. Im Fall der Hydrolyse der Modellverbindung mit zwei anilinischen Resten 93 (Schema 25) konnte eine qualitative kinetische Untersuchung durchgeführt werden (Abb. 14).

Schema 25: Hydrolyse von 93 zu 94 vor der HPLC-MS Analytik.

Abb. 14: Hydrolyse von 93 zu 94 in wässrigem Acetonitril mit 0,1 % TFA nach 30 (a), 120 (b) und 360 (c) min.

Für die Untersuchungen wurde 93 nach Abspaltung vom Rink-Linker in Wasser:Acetonitril (1:1) mit 0,1 % TFA aufgenommen und ein Teil direkt analysiert (Abb. 14a). Die Abb. 14 zeigt unter der UV-Spur den Massenbereich ([M+H]+) des Amids 93 (Mitte, braun) und der Säure 94 (unten, grün). Bereits am Anfang konnte ein Anteil an 94 von ca. 20 % nach-gewiesen werden. Nach zwei und sechs Stunden wurde die Lösung erneut analysiert (Abb. 14b und c) und es zeigte sich, dass der Anteil an 94 auf 40 bzw. 75 % angestiegen war. Im Fall nur eines anilinischen Restes am [1,3,5]-Triazinring wurde ebenfalls eine, wenn auch deutlich langsamerer Hydrolyse des Amids beobachtet. Zwar konnten ebenfalls direkt nach der Abspaltung ca. 24 % Säure nachgewiesen werden jedoch war ein Anteil von 68 % erst nach 18 h erreicht.

Die Untersuchungen der Nebenreaktion haben gezeigt, dass die Hydrolyse erst nach beendeter Synthese auftrat, und abhängig von der Zeit zwischen Auflösen der Probe und Analytik war. Zur Bestimmung des Umsatzes und der erhaltenden Reinheit wurde deswegen die Summe der Signale in der HPLC-MS Analytik von dem C-terminalen Amid und der Säure betrachtet. Insgesamt zeigten die Ergebnisse dass sowohl der Rink-Linker, als auch die Zellulosemembran sehr gut für die Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken mitttels SPOT-Synthese geeignet sind.

Es stellte sich die Frage, ob auch andere Linkersysteme für die Synthese von Trisamino-[1,3,5]-triazinen unter SPOT-Bedingungen einsetzbar sind. Begonnen wurde mit der Synthese an der Glycin-Ester derivatisierten Zellulosemembran. An den N-Terminus des Glycins von fünf SPOTs wurde Cyanurchlorid 5 immobilisiert und im Anschluss wurden fünf Amine 97 zur Monochlorsubstitution eingesetzt. Als Nebenreaktion kann die Abspaltung der Verbindungen durch Aminolyse der Esterbindung mit den Aminen erfolgen. Um die einzelnen Amine auf diese Nebenreaktion hin zu untersuchen, erfolgte nicht wie sonst die Substitution des verbleibenden Chloratoms bei erhöhter Temperatur, sondern die Verbindungen wurden direkt mit gasförmigem Methylamin 99im Verlauf von 14 h von der Zellulosemembran abgespalten. Im Zuge dieses Syntheseschrittes kam es zusätzlich zur Abspaltung zu der Substitution des Chloratomes durch 99 (Schema 26).

Schema 26: Einsatz verschiedener Amine zur Darstellung von fünf Trisamino-[1,3,5]-triazinen am Glycin-Esterlinker.

Die HPLC-MS Analytik zeigte eine geringere Reinheit der Produkte als bei den zuvor vom Rink-Linker erhaltenen Triazinderivaten. Die Reinheit war im Fall von 100- 1 (n-Butylamin) mit fast 75 % am höchsten, gefolgt von 100-5 (3-Fluoranilin; 69 %) und 100- 4 (3-Chlorbenzylamin; 61 %). Im Fall von 100- 3 (1,3-Diaminopropan; 42 %) und 100- 2 (3-Aminopropanol; 24 %) wurden nur sehr geringe Mengen (ca. 10 % im Vergleich zu 100- 1 ) erhalten, die durch multiple nicht identifizierbare Nebenprodukte stark verunreinigt waren. In allen Fällen erfolgte die Substitution der verbliebenen Chloratome durch Methylamin 99 scheinbar quantitativ, da keine Di- oder Monochlor-[1,3,5]-triazinderivate nachgewiesen werden konnten. Jedoch wurde insgesamt eine starke Schwankung der abgespaltenen Menge beobachtet. Die geringsten Mengen wurden bei der Verwendung von 3-Amino-1-propanol, 1,3-Diaminopropan und 3-Chlorbenzylamin erhalten. Die Schwankungen in der Ausbeute der einzelnen Verbindungen ist vermutlich auf die Aminolyse der Esterbindung zur Zellulose im Zuge der Chlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin 96 zurückzuführen. Diese Resultate zeigen, dass der Glycin-Esterlinker nicht mit dem Einsatz von Aminen zur Synthese von [1,3,5]-Triazinderivaten kompatibel ist.

Als nächstes galt es den Carbamatlinker 41 auf seine Verwendbarkeit für die SPOT-Synthese von [1,3,5]-Triazinderivaten an der PP-Membran zu testen. Hierzu wurden exemplarisch fünf Trisamino-[1,3,5]-triazine am ethylendiaminmodifizierten Linker 41- 1 synthetisiert. Nach Immobilisierung des Cyanurchlorids 5 wurden fünf verschiedene Amine zur Monochlorsubstitution verwendet. Bei dieser Untersuchung lag das Hauptaugenmerk nicht in den Umsätzen der Chlorsubstitution mit den entsprechenden Aminen, sondern vielmehr auf der generellen Durchführbarkeit der Synthese. Zur Vereinfachung wurde deswegen lediglich Benzylamin zur Substitution unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt (Schema 27).

Schema 27: Darstellung von Trisamino-[1,3,5]-triazinen unter Einsatz des Carbamatlinkers 41 -1 an der PP-Membran.

Nach beendeter Synthese wurden die Verbindungen durch TFA-Behandlung von der PP-Membran abgespalten und mittels HPLC-MS Technik analysiert. Die Reinheiten der erhaltenden Verbindungen nach Monochlorsubstitution bei Raumtemperatur und Reaktion unter Mikrowellenbestrahlung sind in Tabelle 22 zusammengefasst.

a nach HPLC bei 220 nm

Tabelle 22: Reinheiten der Trisamino-[1,3,5]-triazine 103 nach Darstellung unter SPOT-Synthese-Bedingung und Abspaltung vom Carbamatlinker 41- 1 .

Die Ergebnisse zeigen, dass der Carbamatlinker 41, im Gegensatz zu dem Glycin-Esterlinker, sehr gut für die Synthese von [1,3,5]-Triazinen unter Einsatz diverser Amine geeignet ist. Die Reinheiten der Produkte entsprechen der am Rink-Linker synthetisierten Verbindungen. Durch den Einsatz des Carbamatlinkers ergeben sich weitere Möglichkeiten bzgl. des Substitutionsmusters am Triazinring. Dieses Linkersystem ergänzt somit den Rink-Linker für die Synthesen von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken.

Zusammenfassung; Möglichkeiten und Grenzen der intermolekularen SNAr am 2,4,6-Trichlor-[1,3,5]-triazin unter SPOT-Synthese-Bedingungen

Aufgrund der speziellen Bedingungen der SPOT-Synthese, wie z.B. einer besonderen Reaktionskinetik durch Verdampfung der Lösungsmittel, ergeben sich Unterschiede zur Synthese am Harz. Der Derivatisierungsgrad der aminofunktionalisierten Membranen sollte nicht unter 200 nmol/cm2 liegen, um eine ausreichende Produktmenge für Analytikzwecke sicher zu stellen. Säurelabile Linkersysteme wie der Rink- oder der Carbamatlinker haben sich als geeignet für die Darstellung von [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken erwiesen. Zur Steigerung der Diversität der Bibliotheken können sowohl Aminosäuren, als auch Peptoide eingesetzt werden, an deren N-Terminus Cyanurchlorid immobilisiert werden kann.

Für die schrittweise Substitution verbliebener Chloratome am [1,3,5]-Triazinring können verschiedene Amine eingesetzt werden. Aus den durchgeführten Untersuchungen ergaben sich folgende Kriterien die diese Amine erfüllen müssen, wenn sie in der SPOT-Synthese eingesetzt werden sollen:

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der Siedepunkt sollte über 50°C liegen

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das Amin kann sich an einem prim. oder sek. C-Atom befinden

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prim. und sek. Amine (unabhängig deren sterischer Hinderung) mit einer Löslichkeit von mindestens 1 M in NMP oder Wasser sind geeignet

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funktionelle Gruppen wie Hydroxylgruppen, Ether, Ester, Amide tert. Amine oder Nitrogruppen sind kompatibel

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weitere Amino- oder Aldehydgruppen sollten geeignet geschützt sein (nicht nötig bei symmetrischen Diaminen)

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Arylamine sollten mindestens so elektronenreich sein wie Anilin

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der Zusatz von TMSCl bei elektronenarmen Aminen ist erforderlich

Als ungeeignet haben sich Hydrazinderivate und sterisch gehinderte Amine z.B. mit α,α‘-Verzweigung herausgestellt. Für die Substitution an membrangebundenen Monochlor-[1,3,5]-triazinen hat sich die Mikrowellenbestrahlung als effiziente Methode des Energie-transfers gezeigt. Bei der Substitution des letzten Chloratoms unter Mikrowellenbestrahlung durch leicht flüchtige Aminen wie z.B. Allylamin empfiehlt sich eine Wiederholung des Spottens und Erhitzens. Bei wenig reaktiven Anilinderivaten kann es hingegen zu einer Verfärbung der SPOTs kommen, weswegen bei diesen Verbindungen von mehrfacher Mikrowellenbestrahlung abgeraten wird.

Alkohole haben sich als ungeeignete Bausteine für die SPOT-Synthese von O-substituierten [1,3,5]-Triazinen herausgestellt. Phenole sollten in Form von Cäsiumphenolate als gesättigte Lösung in DMSO verwendet werden. Bei der Synthese von Monooxy-[1,3,5]-triazinderivaten, sollten die Phenolate zur Substitution des letzten Chloratoms unter Mikrowellenbestrahlung eingesetzt werden.

Trotz der abgeleiteten Auswahlkriterien sollten Amine und Phenole, die bislang nicht in der SPOT-Synthese eingesetzt wurden, einem chemischen Test unterzogen werden.