[1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intramolekulare S_NAr; Eine neue Cyclisierungsmethode für Peptide und Peptidmimetika

Im vorangegangenen Kapitel wurden die Synthesen unterschiedlicher [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken durch intermolekulare Substitution am Cyanurchlorid an planaren Oberflächen beschrieben. Die dort gezeigte schrittweise Substitution der Chloratome durch verschiedene Nucleophile liess den Schluss zu, dass diese Nucleophile nicht nur von unterschiedlichen, sondern auch von ein und der selben Spezies stammen können. Bei der Verwendung von Biopolymeren wie z.B. Peptiden als Träger der nucleophilen Gruppen würde sich ein interessanter Zugang zu vollkommen neuartigen makrocyclischen Verbindungen eröffnen (Schema 28).

Schema 28: Cyclisierung von linearen Oligomeren durch schrittweise nucleophile Substitution an Cyanurchlorid 5 .

Ziel der folgenden Untersuchungen war es, mittels einer geeigneten Schutzgruppenstrategie möglichst verschiedene Grössen an Peptid-Triazincyclen zu synthetisieren. Als nucleophile Gruppe kamen vor allem Aminogruppen in Frage. Für die notwendige orthogonale Schützung bot sich die Boc- bzw. die Mtt-Gruppe (Entschützung durch Säuren) und die Fmoc-Gruppe (Entschützung durch Nucleophile) bei der Peptidsynthese an, wobei der Photolinker eine sichere Verankerung zur planaren Oberfläche bietet. Es sollten zugängliche Ringgrössen, Einflüsse verbleibender funktioneller Gruppen in den Cyclen auf den Ringschluss, unterschiedliche oligomerer Strukturen als lineare Vorläufer und verschiedene Cyclisierungsarten wie z.B. „N-Terminus zur Seitenkette“ und „Seitenkette zur Seitenkette“ untersucht werden.

Ein potentieller Einsatzbereich für diese Methode stellt die Entwicklung von Peptid-mimetika dar. Hierbei ist häufig das Ziel eine Peptidsequenz in Verbindungen mit grösserer proteolytischer Stabilität, Selektivität oder Aktivität zu transformieren.^{[65, 131]} Es wurden Strategien entwickelt, solche Peptidmimetika durch den Einbau von nicht-natürlichen Aminosäuren, Einsatz von Amidbindungsisosteren oder Cyclisierung zugänglich zu machen.^[56]Speziell durch die Cyclisierung von biologisch aktiven Peptiden kann man nicht nur deren Stabilität im Serum erhöhen, sondern vermag auch die entscheidende Konformation einzufrieren.^[132]Ein zentrales Problem bei diesem Vorgehen ist jedoch, dass nur sehr selten die „richtige“ Konformation und optimale Grösse des cyclischen Peptides oder Peptidmimetikums bekannt sind. Es ist deshalb wichtig eine Methodik zu entwickeln, die sich auf eine Vielzahl von linearen Oligomeren und für viele Ringgrössen anwenden lässt.

Einfluss der Ringgrösse auf die Effizienz der Cyclisierung

Am Anfang der Untersuchungen stand neben der Frage der prinzipiellen Durchführbarkeit der intramolekularen Substitution an Dichlor-[1,3,5]-triazinderivaten auch die Zugäng-lichkeit unterschiedlicher Ringgrössen. Die durch diese Methode erreichbaren Ringgrössen werden durch den Abstand der Aminogruppen in der linearen Sequenz bestimmt, die zur Substitution der Chloratome am Cyanurchlorid 5 eingesetzt werden sollen. Es wurden zwei Zugänge zur Darstellung unterschiedlicher Ringgrössen untersucht, wobei der jeweilige N-Terminus und die ε-Aminogruppe einer Lysin-Seitenkette als nucleophile Gruppen eingesetzt wurden:

A)

Variation des Abstandes zwischen dem N-Terminus und der ε-Aminogruppe des Lysins bei konstanter Sequenzlänge durch Verschieben des Lysins.

B)

Variation des Abstandes zwischen dem N-Terminus und der ε-Aminogruppe des Lysins bei variabler Sequenzlänge durch schrittweises „Entfernen“ von Aminosäuren.

Zur Bestimmung der minimal erreichbaren Ringgrösse wurde im Anschluss das Lysin gegen Analoga mit verkürzter Seittenkette ersetzt.

Variation der Cyclengrösse bei konstanter Sequenzlänge

Die ersten Untersuchungen zur Darstellung von cyclischen Peptidmimetika mit unterschiedlicher Ringgrösse bestanden in der Variation der Abstände der Verknüpfungs-punkte zur Cyclisierung bei konstanter Länger der Peptidsequenz. Bei der Cyclisierung durch sequentielle S_NAr von Aminogruppen eines linearen Oligomers am Cyanurchlorid 5 wurde die Ringgrösse durch den Abstand der beiden verwendeten Aminogruppen festgelegt. Eine Position wurde durch den N-Terminus festgelegt, die zweite Aminogruppe wurde aus der ε-Funktion der Lysinseitenkette erhalten. Die Position des Lysins wurde beginnend vom C-Terminus in Richtung N-Terminus in der linearen Sequenz eines Modellpeptides schrittweise verschoben. Für die Untersuchungen zur Zugänglichkeit der verschiedenen Ringgrössen wurde eine einfache Modellsequenz gewählt. Das Modellpeptid sollte neben der zum Ringschluss einzusetzenden ε-Aminogruppe des Lysins keine weiteren Seitenkettenfunktionalitäten, die zu Nebenreaktionen führen konnten, enthalten. Der grösste Makrocyclus nach der intramolekularen nucleophilen Substitution am N-terminalen Dichlor-[1,3,5]-triazinrest sollte zehn Aminosäuren einschliessen. Somit wurde als erstes das Dekapeptid „GAFGAFGAFK“ gewählt. Zur Untersuchung verschiedener Ringgrössen wurden neun weitere Peptidsequenzen mittels SPOT-Synthese an der Zellulose- und PP-Membran dargestellt, bei denen systematisch Lysin vom C-Terminus in Richtung N-Terminus „verschoben“ wurde (Schema 29).

Schema 29: Variation der Cyclengrösse in 106 unter Verwendung eines Lysin-Scans durch die Peptidsequenz 104 und Umsetzung mit Cyanurchlorid 5 .

Als Linkersystem wurde der Photolinker 51 (vgl. Kapitel 2.2.3) gewählt. Die ε-Aminogruppe des C-terminalen Lysins wurde Boc-geschützt eingesetzt. Cyanurchlorid 5 wurde an den freien N-Terminus der Peptide immobilisiert und die Boc-Schutzgruppe der ε-Funktion des Lysins mit TFA entfernt. Der erste Versuch einer Cyclisierung erfolgte durch Inkubation der Membranen in einer 20 %-igen Lösung von DIEA in NMP. In Analogie zur intermolekularen Reaktion wurde eine Reaktionszeit von 30 Minuten gewählt. Nach Abspaltung der Verbindungen von der planaren Oberfläche wurde die Reinheit und Identität mittels HPLC-MS-Analytik bestimmt (Tabelle 23).

^a nach HPLC bei 220 nm
^b nicht nachweisbar

Tabelle 23: Reinheiten der unterschiedlichen Makrocyclen nach einen Lysin-Scan in der Peptidsequenz und Umsetzung mit Cyanurchlorid an der Zellulose- und PP-Membran.

Nach Abspaltung der Produkte durch Photolyse der Membranen und Analytik mittels HPLC-MS zeigte sich, dass in fast allen Fällen das gewünschte Produkt in sehr guten Reinheiten erhalten werden konnte (106- 1 bis 106- 8 ). Die angegebenen Werte in der Tabelle 23 sind die Reinheiten der cyclisierten Endprodukte. Die Cyclisierung der Peptide GAFGAFGAFK bis GAKFGAFGAF (106- 1 bis 106- 8 ) verlief vollständig. In keinem der Fälle konnten lineare Peptid-Triazinverbindungen gefunden werden. In den Fällen 106- 9 und 106- 10 konnte nur eine geringe Reinheit bzw. kein Zielprodukt detektiert werden. Die Synthese der linearen Sequenz des Peptides GKAFGAFGAF (104- 9 ) verlief sowohl an der Zellulose- als auch an der PP-Membran in geringeren Reinheiten (ca. 30 %) als bei den anderen Sequenzen (durchschnittlich über 85 %). Da dieses Problem an beiden polymeren Trägern auftrat, scheint dies nicht an einer einzelnen missglückten Synthese zu liegen. Eine Resynthese der linearen Sequenz mit zusätzlichen Kopplungen der entsprechenden Amino-säuren lieferte ebenfalls kein signifikant besseres Ergebnis. Im Fall der Cyclisierung des Peptides durch die ε-Aminogruppe mit einem N-terminalen Lysin (106- 10 ) war weder an der Zellulose- noch an der PP-Membran das gewünschte Produkt nachweisbar. Eine Erklärung hierfür könnte der zu grosse Abstand zwischen der ε-Aminogruppe und der Chlortriazineinheit sein, so dass es zu keiner Reaktion kommen kann. Es wurde kein signifikanter Unterschied der Produktqualität in Abhängigkeit von der verwendeten planaren Oberfläche beobachtet. Im Folgenden sollte ein alternativer Zugang zu vergleichbaren Ringgrössen untersucht werden.
Variation der Cyclengrösse bei variabler Sequenzlänge
Eine alternative Darstellung möglichst unterschiedlicher Ringgrössen mittels S_NAr-Reaktion am Cyanurchlorid ist die Verkürzung der Peptidsequenz durch schrittweises Entfernen der Aminosäuren zwischen den nucleophilen Gruppen. Als Modellpeptid wurde wiederum die Sequenz GAFGAFGAFK gewählt, welches systematisch verkürzt wurde. Die resultierenden zehn Verbindungen wurden unter Verwendung des Photolinkers sowohl an der Zellulose- als auch an der PP-Membran mittels SPOT-Synthese dargestellt. Die ε-Aminogruppe des C-terminalen Lysins wurde Boc-geschützt eingesetzt. Die Immobilisierung von Cyanurchlorid 5 erfolgte nach beendeter Peptidsynthese über die freie Aminogruppe des N-Terminus. Die ε-Aminogruppe des Lysins wurde mit 80 %-iger TFA in DCM im Verlauf einer Stunde quantitativ entschützt. Die Cyclisierung durch nucleophilen Angriff der Aminogruppe an der Dichlor-[1,3,5]-triazineinheit wurde durch Inkubation der Membranen in 20 %-iger DIEA-Lösung in NMP für 30 Minuten erreicht (Schema 30).

Schema 30: Variation der Cyclengrösse durch schrittweise Verkürzung der Peptidsequenz und Umsetzung mit Cyanurchlorid 5 .

Anschliessend wurden die Cyclen von den Membranen durch UV-Bestrahlung abgespalten und mit HPLC-MS-Technik analysiert. Die Ergebnisse der Cyclisierung bzgl. der Reinheit der erhaltenden Produkte sind in Tabelle 24 zusammengefasst.

^a nach HPLC bei 220 nm
^b nicht nachweisbar
Nr.

Peptidsequenz

Reinheit^a nach Cyclisierung an der

Zellulose [%]

PP-Membran [%]

109- 1

GAFGAFGAFK

89

86

109- 2

AFGAFGAFK

71

78

109- 3

FGAFGAFK

75

75

109- 4

GAFGAFK

73

70

109- 5

AFGAFK

76

70

109- 6

FGAFK

65

65

109- 7

GAFK

84

85

109- 8

AFK

86

87

109- 9

FK

76

73

109- 10

K

n.n.^b

n.n.^b

Tabelle 24: Reinheiten der unterschiedlichen Makrocyclen durch Verkürzung der Peptidsequenz 107 und Umsetzung mit 5 an der Zellulose- und PP-Membran.

Die Analytik zeigte, dass die Cyclisierung zu den 37- bis 13-gliedrigen Ringen (109- 1 bis 109- 9 ) quantitativ erfolgte. Bei den in guten bis sehr guten Reinheiten erhaltenden Zielverbindungen konnten keine linearen Triazin-Peptid-Derivate 108- 1 bis 108- 9 bzw. entsprechende Hydrolyseprodukte beobachtet werden. Lediglich Lysin selbst (109- 10 ) konnte nicht „cyclisiert“ werden, was vermutlich an einer zu grossen Ringspannung bzw. eine zu grossen Entfernung zwischen dem Chloratom am [1,3,5]-Triazinring und der Aminogruppe liegt. Es wurde nicht das lineare Edukt erhalten, sondern es konnten nur Zersetzungsprodukte mit unterschiedlichen Massen detektiert werden. Die Art der Zersetzung konnte nicht aufgeklärt werden. Eine einfache oder doppelte Hydrolyse der Dichlor-[1,3,5]-triazineinheit konnten allerdings ausgeschlossen werden.

Im Anschluss wurde der Einfluss der Base, ihrer Konzentration und der Reaktionszeit auf die Effizienz der Cyclisierung untersucht, um möglichst milde Reaktionsbedingungen zu erhalten. Als Modell wurde das Tripeptid Ala-Phe-Lys 107- 8 verwendet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 25 zusammengefasst.

^a Prozentangaben in w/w
^b nach HPLC bei 220 nm
^c zusätzlich Zersetzung
Nr.

Base^a

Zeit [min]

Cyclisierung [%]^b

1

30 % DIEA

30

95^c

2

20 % DIEA

30

> 95

3

10 % DIEA

30

> 95

4

5 % DIEA

30

85

5

5 % DIEA

45

90

6

5 % DIEA

60

91^c

7

10 % DMAP

30

75^c

8

1 % DMAP

30

60^c

9

10 % DABCO

30

64

10

1 % DABCO

30

52

Tabelle 25: Einfluss der Base und Zeit auf die Cyclisierungseffizienz von 107- 8 an Zellulosemembran.

Die Ergebnisse in Tabelle 25 zeigen, dass der Anteil an DIEA zur Cyclisierung auf 10 % reduziert werden kann (Nr. 3). Die Verwendung anderer Basen als DIEA wie z.B. DMAP (Nr. 7 und 8) oder DABCO (Nr. 9 und 10) ist hingegen ungünstig, da nicht nur die Cyclisierungen unvollständig ablaufen, sondern zusätzlich Hydrolyse des Dichlor-[1,3,5]-triazines auftritt. Im Verlauf weiterer Untersuchungen wurden, wenn nicht anders beschrieben, 10 % DIEA als Base eingesetzt.

Minimierung der erreichbaren Ringgrösse durch Verwendung von Aminosäuren mit verkürzter Aminoseitenkette
Im Verlauf der vorangegangenen Untersuchungen konnte als kleinstes Peptid das Dipeptid FK cyclisiert werden (13 Ringatome), jedoch nicht Lysin selbst (10 Ringatome). Es stellte sich nun die Frage, ob Makrocyclen zwischen 13 und 10 Ringatomen durch intramolekulare nucleophile Substitution am [1,3,5]-Triazinring dargestellt werden können. Dies wurde durch den Austausch des Lysins im Dipeptid durch spezielle nicht-natürliche Analoga mit verkürzter Aminoseitenkette untersucht. Durch den Einsatz von Ornitin (Orn), Diaminobutter (Dbu)- und Diaminopropionsäure (Dpr) mit jeweils Boc-geschützter Aminogruppe in der Seitenkette sollten so nach Cyclisierung durch schrittweise Substitution am Cyanurchlorid 10- bis 13-gliedrige Ringe erhalten werden (Schema 31).

Schema 31: Minimierung der Ringgrösse durch Einbau von Aminosäuren mit verkürzter Aminoseitenkette in die Peptidsequenz 110 .

Parallel zu diesen Untersuchungen wurden mittels analogem Austausch des Lysins bei dem Tripeptid Ala-Phe-Lys der Einfluss der Seitenkettenverkürzung ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 26 zusammengefasst.

^a nicht nachweisbar

Tabelle 26: Reinheiten der Cyclen bei Minimierung der Ringgrösse durch Einsatz von Lysinanaloga mit verkürzten Seitenketten.

Die verglichen mit den Ausgangscyclus Monochlor-(F-K)-[1,3,5]-triazin um jeweils ein bzw. zwei Atom(e) kleineren Ringe mit den Aminosäuren Orn und Dbu (112- 2 und 112- 3 ) sind in guten Reinheiten erhältlich. In keinem der Fälle konnten lineare Derivate detektiert werden. Bei dem Versuch das Dipeptid Phe-Dpr (112- 4 ) durch Reaktion mit Cyanurchlorid zu cyclisieren konnte hingegen kein Zielprodukt erhalten werden. Die Untersuchungen bestätigten die Ergebnisse aus der Verkürzung der Peptide dahingehend, dass 10-gliedrige Ringe (112- 4 ) nicht mit dieser Methode der Cyclisierung zugänglich sind. Eine Verkürzung der Seitenkette an sich scheint keinen Einfluss auf den Ringschluss zu haben, solange die minimale Ringgrösse von 11 Atomen nicht unterschritten wird, was die Ergebnisse bei den Verbindungen 113- 1 bis 113- 4 zeigen.

Kompatibilität der Cyclisierungsmethode mit proteinogenen Aminosäuren
Die Kompatibilität der neuen Cyclisierungsmethode mit den proteinogenen Aminosäuren bzw. den verwendeten Schutzgruppen ist essentiell für die allgemeine Anwendung z.B. für eine Transformation von biologisch aktiven Peptiden hin zu pharmazeutisch relevanten Peptidmimetika. Hierfür wurden in dem Tripeptid Ala-Phe-Lys die Aminosäuren Alanin und Phenylalanin getrennt gegen alle proteinogenen Aminosäuren ausgetauscht, wobei auf die Verwendung von Cystein verzichtet wurde. Die zwei resultierenden Sets aus je 19 Verbindungen mit den Sequenzen Ala-Xxx-Lys und Xxx-Phe-Lys wurden an der Zellulosemembran unter Verwendung des Photolinkers synthetisiert. Die ε-Aminogruppe des C-terminalen Lysins wurde Mtt-geschützt eingesetzt, um eine selektive Entschützung mit 1 % TFA in DCM mit 5 % TIPS innerhalb einer Stunde zu ermöglichen. Die Synthese und Cyclisierung ist für die Tripeptide Ala-Xxx-Lys in Schema 32 gezeigt.

Schema 32: Synthese der 19 Tripeptide Ala-Xxx-Lys und Cyclisierung an der Zellulosemembran zur Untersuchung des Einflusses der Seitenketten auf die Cyclisierungseffizienz.

Eine selektive Entschützung der zur Cyclisierung verwendeten Gruppe ist besonders für den Fall von Bedeutung, dass sich weitere geschützte nucleophile Gruppen in den Seitenketten der Peptide befinden. Die Mtt-Gruppe kann gezielt in Gegenwart von Boc-Schutzgruppen entfernt werden, um so z.B. zwischen verschiedenen (Mtt- und Boc-geschützen) Lysinen einer Sequenz zu unterscheiden. Die Reinheiten der Tripetide in der Reihe Ala-Xxx-Lys sind in Abb. 15 dargestellt.

Abb. 15: Reinheiten der cyclisierten Tripeptide Ala-Xxx-Lys 119 in Abhängigkeit von den Aminosäureseitenketten bzw. Schutzgruppen.

Die 19 Aminosäuren zeigten gute bis sehr gute Ergebnisse in Bezug auf Reinheit und Cyclisierungsausbeute der 16-gliedrigen Ringe. Bei dem Einbau der Aminosäuren Histidin und Prolin wurde eine Reinheit des Zielmoleküls von weniger als 50 % beobachtet. Der Grund lag jedoch nicht in einer schlechten Cyclisierungsausbeute, sondern an einer unvollständigen Kopplung des N-terminalen Alanins an die Aminosäuren, und damit an der Abbruchsequenz Ac-His-Lys bzw. Ac-Pro-Lys. Unterschiede bei der Cyclisierung in Abhängigkeit von einzelnen Seitenketten oder entsprechenden Schutzgruppen konnten somit nicht beobachtet werden.

Mit den Tripeptiden des Typs Xxx-Phe-Lys sollte der Einfluss der N-terminalen Aminosäure auf die intramolekulare nucleophile Substitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin untersucht werden. Das Vorgehen hierbei erfolgte in Analogie zu dem bei der vorangegangenen Untersuchung am Modell Ala-Xxx-Lys. Nach Darstellung der entsprechenden Sequenzen am Photolinker einer Zellulosemembran wurde Cyanurchlorid an den jeweiligen N-Termini immobilisiert. Nach Entfernen der Mtt-Gruppe des C-terminalen Lys wurde die Cyclisierung durchgeführt. Anschliessend wurden weiter Seitenkettenfunktionen entschützt und die Produkte von der Zellulosemembran abgespalten. Die Reinheiten der cyclisierten Tripeptide sind in Abb. 16 gezeigt.

Abb. 16: Reinheiten der cyclisierten Tripeptide Xxx-Phe-Lys in Abhängigkeit von den Aminosäureseitenketten bzw. Schutzgruppen.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungsreihe bzgl. der Reinheit der Cyclisierungsausbeute der Zielverbindungen sind noch besser als für die Sequenzen des Typs Ala-Xxx-Lys. Es scheint, dass der Einfluss der N-terminalen Aminosäure auf die Cyclisierungseffizienz sehr gering ist. Im Fall des N-terminalen Glycins verlief die Synthese des Ausgangspeptides mit geringeren Reinheiten, es konnten nach der Cyclisierung keine linearen Peptid-Triazinderivate nachgewiesen werden. Erneut verlief die Synthese des Histidin-haltigen Peptides mit geringer Reinheit. Die Cyclisierung „vorbei“ an den weiteren Trityl-geschützten Aminosäuren gelang in sehr guten Reinheiten.

Die Untersuchungen zur Kompatibilität der verschiedenen Seitenketten der proteinogenen Aminosäuren bzw. mit den entsprechenden Schutzgruppen mit der neuen Cyclisierungsmethode ergaben, dass fast alle Aminosäuren ohne Probleme eingesetzt werden können. Eine Ausnahme bildet hierbei eventuell Histidin, da es in beiden Untersuchungen die Produkte mit der geringsten Reinheit lieferte. Die restlichen 18 untersuchten Aminosäuren führen in beiden Modellsystemen zu keinerlei Nebenreaktionen. Diese proteinogenen Aminosäuren konnten erfolgreich N-terminal (im Modell Xxx-Phe-Lys) und direkt vor dem Cyclisierungsanker Lysin (Ala-Xxx-Lys) eingesetzten werden. Die Verwendung vom Mtt als Schutzgruppe für die ε-Aminofunktion des Lysins ermöglicht durch ihre selektive Abspaltbarkeit den Einsatz weiterer Lysine in der zu cyclisierenden Sequenz, ohne dass Regioisomere bzgl. des Ringschlusses auftreten.

Variation der Cyclisierungsrichtung
Neben der bislang verwendeten Cyclisierung von Peptiden vom N-Terminus auf die ε-Aminogruppe der Lysin-Seitenkette sollten weitere Richtungen der Cyclisierung untersucht werden. Eine zusätzliche Möglichkeit eine konformelle Restriktion in Peptide einzuführen liegt in der Cyclisierung ausgehend von der Seitenkette hin zu dem N-Terminus. Aufgrund der Symmetrie des [1,3,5]-Triazinringes entstehen hierbei allerdings die selben Cyclen wie bei dem Ringschluss durch nucleophilen Angriff der Seitenketten-Aminogruppe an das N-terminal gebundene Dichlor-[1,3,5]-triazin.

Bei der Verknüpfung zweier Seitenkette-Aminogruppen eines Peptides hingegen werden zusätzliche Cyclen erhalten. Im Folgenden wurde diese „Seitenkette-zu-Seittenkette“-Cyclisierung untersucht. Das einfachste Modellpeptid für diese Untersuchungen ist das N-terminal acetylierte Dipeptid Lys-Lys. Der [1,3,5]-Triazinring wurde hierbei nicht wie zuvor am N-Terminus, sondern an einer Lysin-Seitenkette immobilisiert. Die intra-molekulare nucleophile Substitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin sollte dann durch eine ε-Aminogruppe eines weiteren Lysins erfolgen. Entscheidend für die Synthese ist, wie schon bei der Untersuchung zur Kompatibilität der proteinogenen Aminosäuren (Kapitel 3.2), die selektive Entfernung der Mtt-Gruppe von der Seitenketten eines entsprechend geschützten Lysins in Gegenwart eines zweiten, an der ε-Aminoseitenkette Boc-geschützten Lysins (Schema 33).

Schema 33: „Seitenkette-zu-Seitenkette“-Cyclisierung durch intramolekulare Chlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin.

Die Synthese des Dipeptides 120 erfolgte am Photolinker einer aminoderivatisierten Zellulosemembran. Nach Acetylierung des N-Terminus wurde selektiv die Mtt-Schutzgruppe an der Seitenkette des N-terminalen Lysins entfernt und der [1,3,5]-Triazinring immobilisiert. Nach Entschützung der ε-Aminogruppe des C-terminalen Lysins gelang eine intramolekulare Substitution eines Chloratoms am Dichlor-[1,3,5]-triazin durch Einsatz einer 10 %-igen DIEA-Lösung in NMP (v/v) innerhalb von 30 min. Diese „Seitenkette-zu-Seitenkette“-Cyclisierung wurde an zwei weiteren Modellpeptiden erfolgreich untersucht (Tabelle 27).

Nr.

Sequenz

Cyclisierung [%]

Reinheit [%]

122

Ac-Lys-Lys

97

76

123

Ac-Lys-Phe-Lys

98

78

124

Ac-Lys-Ala-Phe-Lys

97

78

Tabelle 27: „Seitenkette-zu-Seittenkette“ Cyclisierung durch intramolekulare Substitution eines Chloratoms am Dichlor-[1,3,5]-triazinrest mit der ε-Aminogruppe eines C-terminalen Lysins.

Die geringeren Reinheiten nach Abspaltung der cyclischen Peptidmimetika von der Zellulosemembran sind auf eine unvollständige Kopplung des N-terminalen Lysins zurückzuführen. In allen drei Fällen konnte eine geringe Menge an hydrolysiertem linearen Peptid-Triazinderivat (ca. 2 %) nachgewiesen werden. Dennoch gelang der Ringschluss bei allen untersuchten Modellpeptiden nahezu vollständig. Neben der Cyclisierung durch nucleophilen Angriff einer Aminoseitenkette am N-terminalen Dichlor-[1,3,5]-triazin ist die neue Methode somit auch auf den Ringschluss „Seitenkette-zu-Seittenkette“ übertragbar.

Nucleophile Substitution an cyclischen 6-Monochlor-[1,3,5]-triazinderivaten
Nach erfolgter Monochlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin durch eine Aminosäure- seitenkette verbleibt noch ein weiteres Chloratom am [1,3,5]-Triazinring. Dies bietet die Möglichkeit die molekularen Eigenschaften der cyclischen Peptidmimetika zu variieren. Im Kapitel 2.5 wurden Bedingungen zur Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an „linearen“ Triazine beschrieben, welche auf die hier erhaltenden cyclischen Verbindungen angewendet werden sollten.

Schema 34: Einsatz von Mikrowellenbestrahlung zur Chlorsubstitution an cyclischen Peptid-Triazinderivaten.

Tabelle 28: Untersuchungen zur Chlorsubstitution unter Mikrowellenbestrahlung an cyclischen Peptid-Triazinderivaten.

Wie bereits bei den Untersuchungen an den „linearen“ Triazinderivaten erwies sich die Mikrowellenbestrahlung als geeignete Methode für den Energietransfer bei der Chlorsubstitution. In allen Fällen erfolgte die Reaktion der Nucleophile mit dem Monochlor-[1,3,5]-triazinrest in sehr guten Umsätzen. Die Schwankungen in den Reinheiten der Zielprodukte resultieren vornehmlich aus der Peptidsynthese. So wurde gefunden, dass speziell im Fall von n-Butyl- und Benzylamin (125- 1 und 125- 6 ) die Kopplung des Alanins unvollständig war. Insgesamt konnte anhand dieser zehn Beispiele gezeigt werden, dass das verbliebene Chloratom der cyclischen Peptid-Triazinderivate mit einer Reihe von Aminen und Phenolaten umgesetzt werden kann, um so die Diversität der Verbindungen zu erhöhen, und ggf. die molekularen Eigenschaften hinsichtlich pharmakologischer Fragestellungen zu variieren.

Weitere lineare Oligomere mit orthogonal geschützten Aminogruppen
Bei der Untersuchung der intermolekularen Monochlorsubstitution membrangebundener Dichlor-[1,3,5]-triazine (Kapitel 2.6) konnte gezeigt werden, dass die Reaktion des [1,3,5]-Triazingerüst mit den eingesetzten Aminen unabhängig von der Art des Ankers (Peptid, Aminosäure, Peptomer usw.) ist. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob auch bei der intramolekularen Chlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin verschiedene lineare Oligomere eingesetzt werden können.
Peptomere als lineare Sequenzen für die Cyclisierung
Es wurde eine Reihe verschiedener Peptomere untersucht, die nach der Cyclisierung verschiedene Ringgrössen ergeben. Unter Berücksichtigung der bisherigen Ergebnisse der Synthese grosser Ringe beschränkten sich die Untersuchungen zur Cyclisierung von Peptomeren auf die Darstellung kleiner 10 bis 17-gliedriger Ringe. Wie zuvor bei der Untersuchung zur minimal erreichbaren Ringgrösse bei der Cyclisierung von Peptiden (Kapitel 3.1.3) wurden in der Synthese der Peptoideinheit nach der Sub-Monomer-Methode Mono-Boc-geschützte Diamine mit unterschiedlicher Länge der Alkylkette eingesetzt (Schema 35).

Schema 35: Darstellung von Peptomer-Triazin-Cyclen mit verschiedenen Ringgrössen durch Variation der Aminoseitenkettenlängen.

Die Synthese der linearen Peptomere mit anschliessender Immobilisierung von Cyanur-chlorid, Entschützung der Aminogruppe der Seitenketten und Cyclisierung durch intramolekulare Reaktion der Aminogruppe mit dem Dichlor-[1,3,5]-triazinrest wurde sowohl an der Zellulose- als auch an der PP-Membran durchgeführt.

Zusätzlich zu den Peptomeren die in Schema 35 dargestellt sind, wurden die trimeren Peptomere mit zusätzlichem Alanin am N-Terminus in die Untersuchungen mit einbezogen. Die Reinheiten nach erfolgter Cyclisierung und Abspaltung sind in Tabelle 29 zusammengefasst.

^a n.n. nicht nachweisbar
^b Anteil an gefundenem Dimer

Tabelle 29: Variation der Ringgrösse durch Einsatz verschiedener Diamine im Peptoid-Baustein und Sequenzlänge.

An diesem Modell konnten die bisherigen Ergebnisse, die erreichbaren Ringgrössen betreffend, bestätigt werden. An beiden Membranen konnten 12-gliedrige Ringe (129- 3 ) mit guter Cyclisierungsausbeute und Reinheit dargestellt werden. Die Reinheit der 11-gliedrigen Ringe (129- 4 ) lag unter der bei der Cyclisierung von Peptiden (Tabelle 26, 112- 3 ) beobachteten. In den Fällen unvollständiger oder nicht erfolgter intramolekularer nucleophiler Substitution konnte zusätzlich ein Anteil an Dimer aus zwei Peptomer-Triazineinheiten (129- 4 und 129- 5 ) mittels HPLC-MS nachgewiesen werden, welches durch die intermolekulare Reaktion des Dichlor-[1,3,5]-triazinreste mit den Aminogruppen des Peptoidbausteins generiert wurde. Aufgrund der weiteren Ergebnisse dieser Versuchsreihe, ist es wahrscheinlich, dass das Dimer in Lösung erst nach der Abspaltung gebildet wurde, da bei längeren und somit flexibleren Alkylketten (129- 1 bis 129- 3 und 130- 1 bis 130- 3 ) kein Dimer nachgewiesen werden konnte.

Eine Untersuchung des Einflusses eines N-terminalem Peptoid-Baustein erfolgte im Rahmen der Cyclisierung von „reinen“ Peptoiden, wie im folgenden Kapitel beschrieben.

Peptoide als lineare Sequenzen für die Cyclisierung
Die dritte Gruppe an untersuchten linearen Oligomeren zur Cyclisierung durch Cyanur-chlorid stellten die Peptoide dar. Die Synthese erfolgte nach der Sub-Monomer-Methode sowohl an einer aminoderivatisierten Zellulose- als auch an einer PP-Membran. Wie in den vorangegangenen Untersuchungen wurde der Photolinker eingesetzt (Schema 36).

Schema 36: Cyclisierung von Peptoiden durch intramolekulare Reaktion einer Amino-seitenkettengruppe mit einem am N-Terminus befindlichem Dichlor-[1,3,5]-triazinrest.

Es wurden N-terminal fünf verschiedene Amine (n-Butylamin, Benzylamin, Mono-Boc-1,5-Diaminopentan, 4-Amino-1-butanol und p-Anisidin) zur Bromsubstitution für die Synthese der Tripeptoide eingesetzt. Nach Darstellung der Peptoide wurde der Triazinring durch Inkubation der Zellulose- und der PP-Membran mit einer 2 M Lösung von Cyanurchlorid in DCM immobilisiert. Anschliessend wurde die Boc-Schutzgruppe der Seitenkette entfernt und die Cyclisierung durch Inkubation der Membranen in einer 10 %-igen DIEA Lösung in NMP durchgeführt. Aus Ergebnissen vorangegangener Untersuchungen (Kapitel 3.5.1) war eine Nebenreaktion der ε-Aminogruppe des eingesetzten 1,5-Diaminopentans nicht zu erwarten. Die Reinheiten nach erfolgter Cyclisierung und Abspaltung vom planaren Träger sind in Tabelle 30 zusammengefasst.

Tabelle 30: Reinheiten der cyclischen Peptoid-Triaziderivate 135 der Abspaltung.

In allen untersuchten Fällen verlief sowohl die Immobilisierung als auch die Cyclisierung mit guten bis sehr guten Reinheiten an beiden planaren Oberflächen. Selbst bei einem sterisch sehr anspruchsvollen Rest (135- 5 ) konnte nach der Cyclisierung keine linearen (hydrolisierten) Peptoid-Triazinderivate nachgewiesen werden. Der N-terminale Rest des Peptoids scheint keinen signifikanten Einfluss auf die Effizienz der intramolekularen Chlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin zu haben. Somit stellt die sequentielle Chlorsubstitution durch Aminogruppen ausgehend vom Cyanurchlorid 5 auch für Peptoide eine neue Möglichkeit der Cyclisierung dar.

Intramolekulare S_NAr–Reaktionen an weiteren halogenierten Heteroaromaten
Bislang konnte gezeigt werden, dass verschiedene lineare Oligomere mit geeignet geschützten Aminogruppen zur sequentiellen nucleophilen Substitution am Cyanurchlorid eingesetzt werden können. Es stellte sich die Frage, ob sich das entwickelte Verfahren auf weitere halogenierten Heteroaromaten übertragen lässt. Zur Evaluierung wurden drei Heteroaromaten ausgewählt; 2,4,6-Trichlorpyrimidin, 4,6-Dichlor-2-nitropyrimidin und 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin. Die Untersuchungen wurden an dem Tripeptid Ala-Phe-Lys durchgeführt, da es sich bei den Reaktionen mit Cyanurchlorid als gut geeignet erwiesen hatte. In allen Fällen wurde der Photolinker zur Verankerung an der aminoderivatisierten Zellulosemembran verwendet.
2,4,6-Trichlorpyrimidin

Die Untersuchungen zum Einsatz weiterer halogenierter Heteroaromaten wurden mit 2,4,6-Trichlorpyrimidin begonnen. Zunächst wurden die Bedingungen zur Immobilisierung des Aromaten an dem membrangebundenen Tripeptid erarbeitet. Bei der Immobilisierung können zwei Regioisomere bzgl. der Substitution der Chloratome am Pyrimidinring auftreten (Schema 37).

Schema 37: Regioisomere Dichlorpyrimidin-Peptide nach Reaktion von 2,4,6-Trichlorpyrimidin 136 mit Ala-Phe-Lys an der Zellulosemembran.

Untersuchungen der Reaktivität der Chloratome in 2- und 4-Position am Pyrimidinring gegenüber Aminen von Delia et. al. zeigten eine statistische Verteilung der Produkte von eins zu zwei zugunsten der 4-Aminoderivate.^[133]

Zur Bestimmung der Immobilisierungsausbeute von 2,4,6-Trichlorpyrimidin am N-Terminus des zellulosegebundenem Tripeptides wurde keine Referenzverbindung am Harz synthetisiert, sondern das Verhältnis in der HPLC-Spur nach Abspaltung vom Träger von Dichlorpyrimidin-Peptid 138 und „freiem“ Ala-Phe-Lys ohne Dichlorpyrimidinrest bestimmt. Hierbei wurde nur die Summe beider Regioisomere am Dichlorpyrimidin-Peptid 138a und b berücksichtigt. Eine Änderung des Verhältnisses der Regioisomere zueinander bei den einzelnen Immobilisierungsversuchen wurde nicht beobachtet. Die Versuche zur Immobilisierung von 2,4,6-Trichlorpyrimidin 136 erfolgten durch Inkubation der gesamten Membran mit einer 50 %-igen Lösung von 136 in NMP. Die Ergebnisse der einzelnen Versuche sind in Tabelle 31 dargestellt.

^a aus der Summe beider regioisomeren Dichlorpyrimidin-Peptide 137a und b
Nr.

Zeit

[min]

Temperatur

[°C]

Base

Verhältnis^a

138 / Tripeptid

1

30

RT

-

8 / 92

2

30

RT

10 % DIEA

32 / 68

3

30

50

-

19 / 81

4

30

80

10 % DIEA

72 / 28

5

60

RT

10 % DIEA

40 / 60

6

60

50

-

31 / 69

7

60

50

10 % DIEA

74 / 26

8

60

80

10 % DIEA

81 / 19

9

120

50

10 % DIEA

90 / 10

10

120

80

10 % DIEA

98 / 2

Tabelle 31: Bedingungen zur Immobilisierung von 136 an zellulosegebundenem 107- 8 und Verhältnis von Zielverbindung/Tripeptid nach der Abspaltung.

Für die Versuche bei erhöhter Temperatur (Nr. 3,4 und 6-10) wurde die Membran in einer Metallschale auf einer beheizbaren Matte plaziert, wobei die angegebene Temperatur auf der Oberfläche der Matte gemessen wurde. Die besten Ergebnisse zur Immobilisierung wurden mit einer zweistündigen Inkubation der Membran in Gegenwart von 10 % DIEA bei 80°C erzielt (Nr. 10). Nach Abspaltung von der Zellulose wurden zwei regioisomere Dichlorpyrimidin-Peptid-Addukte erhalten. Die Bestimmung des Verhältnisses der beiden Verbindungen und deren massenspektroskopische Analyse erfolgte durch HPLC-MS (Abb. 17). Die Zuordnung der Regioisomere erfolgte unter der Annahme gleicher Absorbtionskoeffizienten, in Anlehnung an die Ergebnisse bzgl. der Regiochemie von Dolle et. al.^[70]

Abb. 17: HPLC-Spur der regioisomeren Dichlorpyrimidin-Peptide; im Verlauf der Analytik kam es zu partiellen Boc-Entschützung durch TFA im Lösungsmittel.

Zur genauen Identifizierung der Regioisomere wurde die Synthese am Rink-Linker eines Syntheseharzes wiederholt, um so ausreichend Substanz für eine NMR-Analytik zu erhalten. Nach Immobilisierung von 2,4,6-Trichlorpyrimidin am N-Terminus des Tripeptides Ala-Phe-Lys wurden die Verbindungen mit TFA abgespalten. Die beiden erhaltenden Regioisomere wurden HPLC-chromatographisch getrennt und mittels NMR untersucht. Zur Bestimmung der Regiochemie wurde die unterschiedliche Verschiebung des C-5 Atoms im Dichlorpyrimidinring in Abhängigkeit der Substitution in Nachbarstellung ausgenutzt. Befindet sich das C-5-Atom zwischen zwei chlorsubstituierten Kohlenstoffatomen, so ist das entsprechende Signal im ¹³C-NMR-Spektrum zu tieferem Feld verschoben, als wenn sich in Nachbarschaft ein NH-Substituent befindet. Die Zuordnung der Regioisomere aus Abb. 17 konnte anhand der Retentionszeiten und der NMR-Spektren der jeweiligen Verbindung bestätigt werden.

Im Anschluss an die Immobilisierung von 2,4,6-Trichlorpyrimidin am zellulose-gebundenem Tripeptid Ala-Phe-Lys erfolgten die Untersuchungen zur intramolekularen Substitution am Dichlorpyrimidinrest. Hierzu wurde die Boc-Schutzgruppe der ε-Aminogruppe des C-terminalen Lysins durch Inkubation der Membran in einer 80 %-igen TFA-Lösung in DCM entfernt. Die Membran wurde mit 1 M HCl behandelt, um eventuell entstandene Trifluoracetylierungsprodukte zu zersetzen. Die Darstellung der regioisomeren cyclischen Produkte nach Entfernen der HCl und Zusatz von Base sollte die Cyclisierung an der Zellulose erreicht werden (Schema 38).

Schema 38: Intramolekulare Substitution am Dichlorpyrimidinrest von 137 durch die ε -Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit an der Zellulosemembran.

Es sollten Bedingungen gefunden werden, unter denen eine Cyclisierung möglichst quantitativ erfolgt. Dabei musste die Möglichkeit einer Hydrolyse des Dichlor-pyrimidinrestes durch die Gegenwart der Base und Spuren von Wasser bei der Reaktion berücksichtigt werden. Die untersuchten Bedingungen sind in Tabelle 32 zusammengefasst.

^a teilweise Hydrolyse
^b unter Mikrowellenbestrahlung
Nr.

Zeit

[h]

Temperatur

[°C]

Cyclisierung

[%]

Reinheit

[%]

1

4

RT

10

10

2

8

RT

15

15

3

4

50

25

23

4

8

50

35

30^a

5

2

80

68

61^a

6

8

80

79

60^a

7

3 min

> 100°C ^b

85

79

8

2 x 3 min

> 100°C ^b

99

92

Tabelle 32: Bedingungen für die intramolekulare Substitution am Dichlorpyrimidinrest durch die ε-Aminogruppe der Tripeptid-Einheit.

Bei langen Reaktionszeiten und erhöhter Temperatur (Nr. 4-6) kam es zum Teil zu einer Hydrolyse des Dichlorpyrimidinrestes, was durch HPLC-MS Analytik nachgewiesen werden konnte. Die besten Ergebnisse konnten durch den Einsatz von Mikrowellenbestrahlung erhalten werden (Nr. 7-8). Nach zweimaliger Bestrahlung à drei Minuten konnte das lineare Edukt nur noch in der Massenspur des HPLC-MS-Laufes nachgewiesen werden (zur Empfindlichkeit der Massendetektion vgl. Kapitel 2.3).

Es gelang nicht, die HPLC-Peaks der regioisomeren cyclischen Produkte zu trennen, um zu überprüfen, ob alle drei theoretisch möglichen Produkte entstanden waren (Abb. 18).

Abb. 18: HPLC-Spur der drei möglichen regioisomeren cyclischen Monochlorpyrimidin-Peptide 140 direkt nach der Abspaltung von der Zellulose.

Anhand der guten Ausbeuten der Cyclisierung scheinen die Chlorsubstitutionen an den einzelnen Positionen des Pyrimidinringes durch die ε-Aminogruppe des Lysins vollständig zu verlaufen. Wie bereits bei der Analytik der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek mit Peptomerteil (vgl. Kapitel 2.6) kam es zur partiellen Hydrolyse am C-Terminus. So handelte es sich bei der Verbindung mit einer Retentionszeit von 9,40 min in Abb. 18 nicht um ein Regioisomer, sondern es wurde eine um eins grössere Molmasse als bei 140 beobachtet, was auf eine (die) C-terminale Säure(n) hindeutet.

Es gelang nicht nur 2,4,6-Trichlorpyrimidin an dem N-Terminus eines zellulose-gebundenem Peptides zu immobilisieren, sondern es konnten auch Bedingungen gefunden werden, unter denen ein verbliebenes Chloratom am Pyrimidinring durch eine weitere Aminogruppe des Peptides substituiert werden kann. Dies ist somit der erste Hinweis auf die Übertragbarkeit des Konzeptes der Cyclisierung von linearen Oligomeren durch schrittweise nucleophile Substitution am Cyanurchlorid 5 auf weitere halogenierte Heteroaromaten. Im Folgenden wurden zwei weitere Stickstoff-Heteroaromaten untersucht.
4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin

Der nächste untersuchte halogenierte Heteroaromat war das 4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin 141. Aufgrund der Symmetrie der beiden Positionen der Chloratome am Pyrimidinring können bei der Immobilisierung dieses Pyrimidinderivates keine Regioisomere auftreten (Schema 39).

Schema 39: Immobilisierung von 4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin 141 an zellulosegebundenen Ala-Phe-Lys.

Die Vorgehensweise bei den Versuchen zur Immobilisierung am N-Terminus des zellulosegebundenem Tripeptides Ala-Phe-Lys war analog zu der bei 2,4,6-Trichlor-pyrimidin. Die Tripeptid-modifizierte Zellulose wurde mit einer 1 M Lösung von 4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin in NMP unter verschiedenen Bedingungen inkubiert. Das Verhältnis aus 6-Chlor-5-nitropyrimidin-Peptid 143 zu „freiem“ Peptid wurde nach der Abspaltung durch HPLC-MS-Analytik bestimmt, um so die jeweiligen Umsetzungen zu ermitteln. Die Ergebnisse der verschiedenen Bedingungen sind in Tabelle 33 zusammengefasst.

^a inklusive Hydrolyseprodukt
Nr.

Zeit

[min]

Temperatur

[°C]

Base

Verhältnis

6-Chlor-5-nitropyrimidin-Peptid / Peptid

1

30

RT

-

40 / 60

2

30

RT

10 % DIEA

66^a / 34

3

30

50

-

44 / 56

4

60

RT

10 % DIEA

94^a / 6

5

60

RT

5 % DIEA

94^a / 6

6

60

RT

1 % DIEA

98 / 2

Tabelle 33: Bedingungen zur Immobilisierung von 4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin an den N-Terminus von zellulosegebundenem Ala-Phe-Lys.

Hierbei stellte sich heraus, dass das verbliebene Chloratom des 6-Chlor-5-nitropyrimidin-peptids scheinbar in Gegenwart von Base besonders leicht hydrolysiert (Nr. 2, 4 und 5). Die HPLC-MS Analytik zur Hydrolyse eines Chloratomes in Lösung ergab, dass eine 1 M Lösung von 4,6-Dichlor-5-Nitro-pyrimidin in NMP in Gegenwart von 10 % DIEA mindest. zwei Stunden stabil ist. Die Hydrolyse an der Zelluloseoberfläche kann jedoch durch Einsatz nur einer sehr geringen Mengen an Base (Nr. 6) vermieden werden. In diesem Fall lässt sich das gewünschte Produkt in sehr guter Reinheit ( > 95 % ) erhalten.

Der nächste Schritt im Rahmen dieser Untersuchungen war, nach Entschützung der ε-Aminogruppe des Lysins, das Auffinden geeigneter Bedingungen zur nucleophilen Substitution des verliebenden Chloratomes am Pyrimidinring (Schema 40).

Schema 40: Intramolekulare Substitution am 6-Chlor-5-nitropyrimidinrest durch die ε -Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit an der Zellulosemembran.

Hierbei musste besonders auf die leichte Hydrolysierbarkeit des Chloridrestes, als Nebenreaktion der Cyclisierung, geachtet werden. Für die Cyclisierungsversuche wurden eine Reihe verschiedener Basen eingesetzt, um bei maximaler Cyclisierungseffizienz möglichst keine Hydrolyse zu erhalten. Nach Abspaltung von der Membran wurde das erhaltende Gemisch mittels HPLC-MS analysiert und das Verhältnis von Cyclus 144, freiem Peptid und Hydrolyseprodukt bestimmt (Tabelle 34).

Nr.

Zeit

[min]

Temperatur

[°C]

Base

Cyclisierung

[%]

Lineares Edukt / Hydrolyse

[%]

1

30

RT

1 % DIEA

60

30 / 10

2

30

RT

1 % DABCO

15

70 / 15

3

30

RT

5 % DABCO

25

62 / 23

4

30

RT

1 % DBU

24

56 / 30

5

30

50

1 % DIEA

68

22 / 10

6

60

RT

1 % DIEA

97

2 / 1

Tabelle 34: Bedingungen für die intramolekulare Substitution am 6-Chlor-5-nitropyrimidinrest durch die ε-Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit.

Der Einsatz von DABCO oder DBU als Basen bei der Cyclisierung (Nr. 2 bis 4) führte zu einem grossen Anteil an hydrolisiertem Produkt. Eine Erhöhung der Temperatur erwies sich als ungeeignet verglichen mit einer Verlängerung der Reaktionszeit (Nr. 5 und 6). Eine einstündige Behandlung des zellulosegebundenem 6-Chlor-5-nitropyrimidin-Peptidderivates mit einer 1 %-igen DIEA in NMP Lösung (v/v) lieferte die besten Ergebnisse.

Es konnten Bedingungen zur Immobilisierung an einem N-Terminus eines zellulosegebundenem Tripeptides für 2,6-Dichlor-5-nitropyrimidin gefunden werden. Desweiteren gelang eine Cyclisierung von Peptiden an Zellulose mittels nucleophiler Substitution des verbleibenden Chloratoms durch eine zuvor geschützte Aminogruppe. Es handelt sich damit um einen weiteren, für diesen Zweck erfolgreich eingesetzten halogenierten Stickstoff-Heteroaromat und liefert einen Hinweis auf die allgemeine Anwendbarkeit der neuen Cyclisierungsmethode.
2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin

Nach einem halogenierten Triazin und zwei Pyrimidinderivaten wurde als Vertreter einer dritten Gruppe an Heteroaromaten das 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin untersucht. Das Vorgehen hierbei erfolgte in Analogie zu den in Kapitel 3.6.1 und 3.6.2 beschriebenen Cyclisierungsversuchen. Wie bereits beim 2,4,6-Trichlorpyrimidin kann es bei der Immobilisierung von 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin zu Regioisomeren kommen. In diesem Fall sind drei Regioisomere möglich (Schema 41).

Schema 41: Immobilisierung von 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin 145 an den N-Terminus des zellulosegebundenen Tripeptides Ala-Phe-Lys unter Ausbildung dreier möglicher Regioisomere.

Die unterschiedliche Reaktivität der einzelnen Chloratome des 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin gegenüber Nucleophilen wurde von Sutcliffe et. al. untersucht.^[134]Er fand heraus, dass die Reaktivität der Positionen am 145 in der Reihenfolge 8 > 6 > 2 abnahm. Im Fall der Immobilisierung wäre somit eine Produktverteilung von a > b > c zu erwarten. In Tabelle 35 sind die Bedingungen zur Immobilisierung und die jeweiligen Ergebnisse gegenüber gestellt.

^a aus der Summe aller regioisomeren Dichlorpurin-Peptide 147a-c
Nr.

Zeit

[min]

Temperatur

[°C]

Base

Verhältnis^a

Dichlorpurin-Peptid/Peptid

1

30

RT

-

12 / 88

2

30

RT

10 % DIEA

28 / 72

3

30

50

10 % DIEA

38 / 62

4

30

80

10 % DIEA

74 / 26

5

60

50

10 % DIEA

78 / 22

6

60

80

10 % DIEA

87 / 13

7

120

50

10 % DIEA

91 / 9

8

120

80

10 % DIEA

93 / 7

Tabelle 35: Bedingungen zur Immobilisierung von 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin an den N-Terminus von zellulosegebundenem Ala-Phe-Lys.

Nach Abspaltung von der Zellulosemembran wurden die Gemische mittels HPLC-MS analysiert. Hierbei zeigte sich, dass bei allen acht untersuchten Bedingungen mehr als ein Peak erhalten wurde, der die erwartete Masse für die abgespaltenen Dichlorpurin-Peptid-derivate 147a-c aufwies. Exemplarisch ist das HPLC-Chromatogramm des Rohprodukts von Nr. 8 aus der Tabelle 35 gezeigt, wobei die Peaks gekennzeichnet sind, deren korrespondierende Verbindung die entsprechende Masse zeigte (Abb. 19).

Abb. 19: HPLC-Chromatogramm der regioisomeren Dichlorpurin-Peptide; im Verlauf der Analytik kam es zu partiellen Boc-Entschützung durch TFA im Lösungsmittel. Die gekennzeichneten Peaks zeigten die erwartete Masse für das Dichlorpurin-Peptidderivat.

Von den drei erwarteten Regioisomeren wurden scheinbar nur zwei erhalten. Es besteht die Möglichkeit, dass in dem Hauptpeak nicht nur ein, sondern zwei Regioisomere enthalten sind. Es gelang keine weitere Auftrennung durch verschiedene HPLC-Gradienten. MS-Fragmentierungsexperimente brachten diesbezüglich auch keinen Aufschluss, etwa durch unterschiedliche Fragmentierungsmuster, so dass es sich bei dem Hauptpeak vermutlich um ein Regioisomer handelt. Eine Zuordnung der Peaks des HPLC-Chromatogrammes zu den einzelnen Regioisomeren war nicht möglich. Da im Rahmen dieser Arbeit aufgrund der geringen isolierten Substanzmengen keine Strukturaufklärung erfolgen konnte, bleibt es zu vermuten, dass es sich nach^[134]bei dem Hauptpeak in Abb. 19 um 147a handelt.

Im Folgenden sollten geeignete Bedingungen zur nucleophilen Substitution eines der ver-bliebenen Chloratome am Purinring durch die ε-Aminogruppe des Lysins gefunden werden. Hier können sich aufgrund der Struktur des Purinringes eine Reihe von Regioisomeren bezogen auf die Orientierung des Heteroaromaten und des Peptides ergeben (Schema 42).

Schema 42: Intramolekulare Substitution am Dichlorpurinrest von 146 durch die ε -Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit an der Zellulosemembran.

Für die intramolekulare Substitution am Dichlorpurinrest durch die ε-Aminogruppe des Lysins sollten geeignete Reaktionsbedingungen gefunden werden. In allen Fällen wurde eine 10 %-ige Lösung von DIEA in NMP verwendet. Die Variation der Reaktions-temperatur und –zeit sind zusammen mit den entsprechenden Cyclisierungsausbeuten und Reinheiten nach Abspaltung von der Zellulose in Tabelle 36 aufgeführt.

^a Summe der Regioisomere
^bteilweise Hydrolyse
^c Mikrowellenbestrahlung
Nr.

Zeit

[h]

Temperatur

[°C]

Cyclisierung ^a

[%]

Reinheit

[%]

1

4

RT

10

5

2

8

RT

15

10

3

4

50

25

23

4

8

50

41

34 ^b

5

2

80

64

59 ^b

6

8

80

73

62 ^b

7

3 min

> 100°C ^c

85

79

8

2 x 3 min

> 100°C ^c

90

79

9

3 x 3 min

> 100°C^c

99

86

Tabelle 36: Bedingungen für die intramolekulare Substitution am Dichlorpurinrest durch die ε-Aminogruppe der Tripeptid-Einheit.

Die Untersuchungen ergaben schlechte bis mittlere Umsetzungen für die Cyclisierung bei langen Reaktionszeiten (Nr. 1-6). Bei einer langen Reaktionszeit und erhöhten Temperaturen (Nr. 4-6) kam es zu einer Hydrolyse einzelner Chloratome am Purinring. Wie auch bei der nucleophilen Substitution am 2,4,6-Trichlorpyrimidin (Kapitel 3.6.1) lieferte die Reaktion unter Mikrowellenbestrahlung die besten Ergebnisse bzgl. Cyclisierungs-ausbeute und Reinheit (Nr.7-9). Von den möglichen Regioisomeren nach Ringschluss konnten durch HPLC-MS Analytik nur zwei Isomere getrennt werden (Abb. 20).

Abb. 20: HPLC-Spur der möglichen regioisomeren cyclischen Monochlorpurin-Peptide direkt nach der Abspaltung von der Zellulose.

Die nahezu vollständige intramolekulare Reaktion der ε-Aminogruppe des Lysins mit den Chloratomen des Purinderivates deutet auf keine spezielle regiochemische Hinderung einzelner Isomere hin. Hier zeichnet sich jedoch ein Nachteil der SPOT-Synthese ab. Es konnte nicht genug Material für exakte Untersuchung der Regiochemie der erhaltenden Produkte erreicht werden. Dennoch konnte gezeigt werden, dass an einem N-Terminus eines Peptides an der Zellulosemembran ein weiterer halogenierter Heteroaromat immobilisiert werden kann. Ferner gelang es Bedingungen zu finden, unter denen verbliebene Chloratome durch die ε-Aminogruppe des Lysins substituiert werden können.

Zusammenfassung: Möglichkeiten und Grenzen der intramolekularen S_NAr an halogenierten Heteroaromaten unter SPOT-Bedingungen
Die Cyclisierung einer Peptidsequenz durch die schrittweise nucleophile Substitution der Chloratome des Cyanurchlorids mittels Aminogruppe des Peptides stellt eine neue Methode zur Einschränkung der verfügbaren Konformationen dar.

Die Untersuchungen der Möglichkeiten dieser Methode haben folgende Ergebnisse geliefert:

-

es sind Ringgrössen von 11 bis mindest. 37 Atomen zugänglich

-

der Ring kann die gesamte Sequenz oder nur einen Teil umspannen

-

soll nur ein Teil der Sequenz cyclisiert werden, so kann der Ringschluss von der Seitenkette zum N-Terminus oder zu einer weiteren Seitenkette erfolgen

-

der Einsatz der selektiv spaltbaren Mtt-Schutzgruppe an der zur Cyclisierung zu verwendenden Lysinseitenkette können alle proteinogen Aminosäuren (ausser Cystein) in der Peptidsequenz eingesetzt werden

-

als lineare Sequenzen sind entweder Peptide, Peptomere oder Peptoide einsetzbar

-

als halogenierte Heteroaromaten können Cyanurchlorid und 4,6-Dichlor-2-nitro-pyrimidin eingesetzt werden

-

falls Regioisomere bzgl. der Orientierung des Heteroaromaten toleriert werden, können zusätzlich 2,4,6-Trichlorpyrimidin und 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin eingesetzt werden

Eine zusätzliche Derivatisierung der cyclischen Peptidmimetika ist bei der Verwendung von Cyanurchlorid zur Cyclisierung möglich. Die nicht im Zuge des Ringschlusses substituierten Chloratome können durch Amine oder Phenolate ersetzt werden, um so die physiko-chemischen Eigenschaften der Makrocyclen zu variieren.

Erneut hat sich die Mikrowellenbestrahlung als geeignete Methode des Energietransfers bei nucleophilen Substitutionen erwiesen. So gelang es durch ihren Einsatz Produkte mit höherer Reinheit darzustellen, als durch Verwendung herkömmlicher Methoden zur Erwärmung. Bei der Untersuchung intramolekularer S_NAr-Reaktionen von weiteren mehrfach halogenierten Heteroaromaten mit (Modell-)Peptiden sollte ggf. Mikrowellenbestrahlung eingesetzt werden.