Schema 1: Synthetischer Zugang zu Trisamino-[1,3,5]-triazinen.

Schema 2: Temperaturabhängige Chlorsubstitution am Cyanurchlorid 5 durch Amine nach Thurston et al. ^[7]

Abb. 1: Beispiele für pharmakologisch relevante [1,3,5]-Triazine.

Abb. 2: In Lösung synthetisierte kombinatorische [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken. ^{[22, 23]}

Abb. 3: Am Polystyrolharz nach der „split-and-mix“-Methode synthetisierte [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken 13 . ^{[29, 30]}

Abb. 4: Verschiedene Techniken zur parallelen Synthese an fester Phase; a) Synthesereaktoren, b) PIN-Methode, c) Arrays auf planaren Oberflächen.

Schema 3: Definition der SPOTs und Anfärben der Aminogruppen (i). Nach schrittweiser ortsadressierter Synthese der Peptide (ii) können direkt Bindungsstudien mit markierten Proteinen (iii) oder Abspaltung der SPOTs für Analytik bzw. Tests in Lösung (iv) folgen.

Schema 4: Darstellung von Peptiden 15 PNAs, 16 und Peptoiden 17 mittels SPOT-Synthese.

Schema 5: Geplante Vorgehensweise zur Erzeugung von diversen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken an planaren Oberflächen; ein Linker wird auf einer planaren Oberfläche verankert ( A ), Reaktion der Aminofunktion des Linkers mit geeigneten Reagenzien zur Diversitätssteigerung ( B ) mit anschliessender Immobilisierung von Cyanurchlorid ( C ) und schrittweisem Austausch der verbleibenden Chloratome ( D ) sowie Abspaltung vom polymeren Träger ( E ).

Schema 6: Aminoderivatisierung der Zellulosemembran 18 durch Veresterung mit 19 nach Frank. ^[34]

Schema 7: Abspaltung von Peptiden von der Zellulose durch Diketopiperazin-Bildung.

Schema 8: Optimierte esterfreie Aminoderivatisierung von Zellulosemembranen. ^[52]

Schema 9: Aufbringen eines funktionalisierten Pfropfpolymers an den Fasern der PP-Membran durch photoinitiierte Copolymerisation.

Abb. 5: Mögliche Realisierungen einer gravimetrisch bestimmten Beladung von sechs Acrylsäuremolekülen pro Flächeneinheit. Im Fall a) würde eine geringere Homogenität pro Flächeneinheit erreicht als bei der gleichmässigeren Reaktion im Fall b).

Schema 10: Umsetzung der carbonsäure- zu einer aminoderivatisierten PP-Membran 31 .

Schema 11: Umsetzung einer methylester- zu einer aminoderivatisierten PP-Membran 32 .

Schema 12: Spaltung der Esterbindung durch verschiedene Amine. ^[104]

Schema 13: Acylierung von aminoderivatisierten planaren Oberflächen mit aktiviertem Rink-Linker. Nach Acetylierung der nicht umgesetzten Aminofunktionen mit Acetanhydrid und Entschützen der N-Termini können die SPOTs mit Bromphenolblau angefärbt werden ( 38 ). Nach beendeter Synthese werden die Produkte mittels TFA-Dampf von dem Träger gespalten, wobei die roten Rink-Radikale die Position der adhäsiv gebundenen Verbindungen anzeigen ( 39 ).

Abb. 6: HPLC-Spur nach TFA-Dampf-Abspaltung und Ablösen mit Wasser:Acetonitril von 40 an der Zellulosemembran (a) und anschliessender Nachspaltung der selben Membran mit flüssiger TFA (b) zur Überprüfung der Vollständigkeit.

Schema 14: Darstellung des Carbamatlinkers 41-1 an PP-Membranen.

Schema 15: Immobilisierung des photolabilen Linkers 50 und Spaltungsmechanismus unter Bestrahlung bei 365 nm in Anlehnung an Pillai et al. ^[115]

Abb. 7: Abspaltungskinetik des Photolinkers an einer Zellulosemembran 27 (Beladung von 380 nmol/cm ² ). Die abgespaltene Menge an 2,4,6-Triamino-[1,3,5]-triazin in Abhängigkeit von der Photolysezeit bei 365 nm wurde HPLC-chromatographisch bei 220 nm durch Vergleich mit Werten einer Eichkurve (vgl. Kapitel 2.3) bestimmt.

Schema 16: Immobilisierung von Cyanurchlorid an einer aminoderivatisierten Oberfläche.

Abb. 8: Integral der UV-Absorption bei 220 nm in Abhängigkeit von der Injektionsmenge an 53 .

Schema 17: Umsetzung membrangebundener Dichlor-[1,3,5]-triazine 54 mit unterschiedlichen Aminen und anschliessende Abspaltung für eine Analytik.

Schema 18: Bestimmung der Umsetzung von Aminen mit Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 am Beispiel des n-Butylamins 58 .

Schema 19: Umsetzung von membrangebundenem Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 mit Mischungen (1:5 bis 5:1) aus n-Propanol 61 und n-Butylamin 58 .

Abb. 9: HPLC-MS-Spuren des abgespaltenen Rohprodukts 60- 1 : 63 bei einem Mischungs-verhältnis von 1 : 5 (n-Butylamin : n-Propanol). Abgebildet ist die UV-Spur (a), der Massenfilter für 60-1 (M+H ⁺ ) (b) und 63 (M+H ⁺ ) (c).

Schema 20: Bestimmung der Umsetzung von Arylaminen mit Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 am Beispiel des 2-Chlorbenzylamins 64 nach Abspaltung von der planaren Oberfläche.

Abb. 10: Umsatzverteilung der getesteten Amine an der Zellulose- und PP-Membran.

Schema 21: Untersuchungen zur SPOT-Synthese von diamino-oxy-substituiertem Triazin 69 an einer PP-Membran am Beispiel von Alkoholen mit Arylrest.

Abb. 11: Umsatz verschiedener O-Nucleophile mit Dichlor-[1,3,5]-triazin 54 an der PP-Membran.

Abb. 12: Modellsysteme zur Untersuchung der Substituierbarkeit des Chloratomes von Monochlor-[1,3,5]-triazinen an Zellulose- und PP-Membran in der SPOT-Synthese.

Schema 22: Untersuchungen der Cäsiumphenolate zur Chlorsubstitution am Monochlor-[1,3,5]-triazin unter Mikrowellenbestrahlung.

Schema 23: Halbautomatische SPOT-Synthese der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek mit einer C-terminalen Peptomereinheit.

Abb. 13: Die eingesetzten Amine in der Peptoidsynthese (R ¹ ) und zur Monochlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin bei Raumtemperatur (R ² / R ³ ).

Schema 24: Hydrolyse des C-Terminus der Peptomereinheit von 91-( 1-18-1 ) vor der HPLC-MS Analytik.

Schema 25: Hydrolyse von 93 zu 94 vor der HPLC-MS Analytik.

Abb. 14: Hydrolyse von 93 zu 94 in wässrigem Acetonitril mit 0,1 % TFA nach 30 (a), 120 (b) und 360 (c) min.

Schema 26: Einsatz verschiedener Amine zur Darstellung von fünf Trisamino-[1,3,5]-triazinen am Glycin-Esterlinker.

Schema 27: Darstellung von Trisamino-[1,3,5]-triazinen unter Einsatz des Carbamatlinkers 41 -1 an der PP-Membran.

Schema 28: Cyclisierung von linearen Oligomeren durch schrittweise nucleophile Substitution an Cyanurchlorid 5 .

Schema 29: Variation der Cyclengrösse in 106 unter Verwendung eines Lysin-Scans durch die Peptidsequenz 104 und Umsetzung mit Cyanurchlorid 5 .

Schema 30: Variation der Cyclengrösse durch schrittweise Verkürzung der Peptidsequenz und Umsetzung mit Cyanurchlorid 5 .

Schema 31: Minimierung der Ringgrösse durch Einbau von Aminosäuren mit verkürzter Aminoseitenkette in die Peptidsequenz 110 .

Schema 32: Synthese der 19 Tripeptide Ala-Xxx-Lys und Cyclisierung an der Zellulosemembran zur Untersuchung des Einflusses der Seitenketten auf die Cyclisierungseffizienz.

Abb. 15: Reinheiten der cyclisierten Tripeptide Ala-Xxx-Lys 119 in Abhängigkeit von den Aminosäureseitenketten bzw. Schutzgruppen.

Abb. 16: Reinheiten der cyclisierten Tripeptide Xxx-Phe-Lys in Abhängigkeit von den Aminosäureseitenketten bzw. Schutzgruppen.

Schema 33: „Seitenkette-zu-Seitenkette“-Cyclisierung durch intramolekulare Chlorsubstitution am Dichlor-[1,3,5]-triazin.

Schema 34: Einsatz von Mikrowellenbestrahlung zur Chlorsubstitution an cyclischen Peptid-Triazinderivaten.

Schema 35: Darstellung von Peptomer-Triazin-Cyclen mit verschiedenen Ringgrössen durch Variation der Aminoseitenkettenlängen.

Schema 36: Cyclisierung von Peptoiden durch intramolekulare Reaktion einer Amino-seitenkettengruppe mit einem am N-Terminus befindlichem Dichlor-[1,3,5]-triazinrest.

Schema 37: Regioisomere Dichlorpyrimidin-Peptide nach Reaktion von 2,4,6-Trichlorpyrimidin 136 mit Ala-Phe-Lys an der Zellulosemembran.

Abb. 17: HPLC-Spur der regioisomeren Dichlorpyrimidin-Peptide; im Verlauf der Analytik kam es zu partiellen Boc-Entschützung durch TFA im Lösungsmittel.

Schema 38: Intramolekulare Substitution am Dichlorpyrimidinrest von 137 durch die ε -Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit an der Zellulosemembran.

Abb. 18: HPLC-Spur der drei möglichen regioisomeren cyclischen Monochlorpyrimidin-Peptide 140 direkt nach der Abspaltung von der Zellulose.

Schema 39: Immobilisierung von 4,6-Dichlor-5-nitropyrimidin 141 an zellulosegebundenen Ala-Phe-Lys.

Schema 40: Intramolekulare Substitution am 6-Chlor-5-nitropyrimidinrest durch die ε -Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit an der Zellulosemembran.

Schema 41: Immobilisierung von 2,6,8-Trichloro-7-methyl-7H-purin 145 an den N-Terminus des zellulosegebundenen Tripeptides Ala-Phe-Lys unter Ausbildung dreier möglicher Regioisomere.

Abb. 19: HPLC-Chromatogramm der regioisomeren Dichlorpurin-Peptide; im Verlauf der Analytik kam es zu partiellen Boc-Entschützung durch TFA im Lösungsmittel. Die gekennzeichneten Peaks zeigten die erwartete Masse für das Dichlorpurin-Peptidderivat.

Schema 42: Intramolekulare Substitution am Dichlorpurinrest von 146 durch die ε -Aminogruppe des Lysins der Tripeptid-Einheit an der Zellulosemembran.

Abb. 20: HPLC-Spur der möglichen regioisomeren cyclischen Monochlorpurin-Peptide direkt nach der Abspaltung von der Zellulose.

Abb. 21: Nachweis von Peptid-mAk-TAB-2-Wechselwirkung an einer Zellulosemembran durch einen zweiten POD-markierten Antikörper (POD = Peroxidase, Substrat: Chemolumineszenz-Substrat auf Luminol-Basis).

Abb. 22: Substitutionsanalyse des Hepta-Peptids VVSHFND: 140 (7 x 20) Peptide zzgl. 7 Kopien des Wildtyps (wt) wurden an einer Zellulosemembran (6 x 13 cm) synthetisiert und mit mAk TAB-2 inkubiert. Dunkle SPOTs zeigen Bindung des Antikörpers, und unter-scheiden sich in einer Aminosäure (hervorgehoben in den angegeben Sequenzen). ^{[35, 102]}

Abb. 23: Entwurf der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzelverbindungen.

Abb. 24: Verteilung der Häufigkeit der a) H-Akzeptor-, b) H-Donor Gruppen, c) des Molgewichtes und d) einzelner logP-Wert in der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzelverbindungen ermittelt mit dem Programm ChemX.

Schema 43: Syntheseschritte für die [1,3,5]-Triazin-Bibliothek aus 8000 Einzel-verbindungen.

Abb. 25: Verteilung der Amine in der [1,3,5]-Triazin-Bibliothek. Jeder Block der Amine repräsentiert 400 Verbindungen bestehend aus einer Dipeptid- und einer Triazin-Hälfte (vgl. Schema 23 ).

Abb. 26: Bindung des mAk TAB-2 an einzelnen SPOTs der Bibliothek aus 8000 [1,3,5]-Triazinderivaten 149 . Die Visualisierung erfolgte durch einen POD-markierten Nachweisantikörper, Umsatz mit einem Chemolumineszenz-Substrat und digitale Detektion der Lumineszenz (LumiImager™).

Abb. 27: Inhibition der Bindung des mAk TAB-2 an das festphasengebundene Peptidepitop VVSHFNDCPDSHTQFAF durch die Verbindungen 18-6-19 , 6-3-1 und das Peptid VVSHFND in ELISA-Experimenten. Die Negativkontrolle 7-14-6 zeigt keine Inhibition.

Schema 44: Gestaltung der Folgebibliothek. 6 Dipeptidsequenzen (A-F) wurden in Zeilen synthetisiert, nach Immobilisierung von Cyanurchlorid wurden 10 Nucleophile (1-10) zur Monochlorsubstitution eingesetzt. Das verbleibende Chloratom jeder Verbindung wurde mit Piperidin umgesetzt.

Abb. 28: Bindungsstudien an [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken 153 synthetisiert an Zellulose- (a und b) und PP-Membran (c und d). Die Kontrollinkubation (a und c) zeigt an der Zellulose geringe, an der PP-Membran keine Bindung des POD-markierten Antikörpers. Die Zahlen in der Abbildung codieren die jeweiligen Reste von 153 .

Abb. 29: Primärstruktur von S14 und dem Derivat Sandostatin ® . Im Gegensatz zu S14 enthält Sandostatin ® D-Aminosäuren und trägt C-terminal einen Alkohol. Die Schlüsselpositionen für die Aktivität von S14 sind rot hervorgehoben.

Abb. 30: Prinzip des Assays; a) Zugabe von S14 zur modifizierten Hefe löst eine Signalkaskade aus und LacZ wird gebildet, das im Nähragar mit X-Gal durch eine Blaufärbung nachgewiesen wird. Die Menge an zugegebenen S14 ist proportional zum Radius der Blaufärbung (b).

Abb. 31: Durchführung des Agardiffusions-Assays mit ausgestanzten SPOTs und Auswertung nach drei Tagen.

Abb. 32: Austausch der Disulfidbrücke im S14 gegen eine 2,4-Diamino-[1,3,5]- triazineinheit.

Abb. 33: Ansatz zur Transformation von S14 und zusätzliche lineare Kontrollen A und B der cyclischen Verbindungen C für das Assay.

Abb. 34: Ergebnis des ersten Screenings mit cyclischen Peptid-Triazinderivaten; eine Blaufärbung zeigt aktive Verbindungen auf den SPOTs an.

Abb. 35: Screening der Substanzen nach der letzten Verkürzung der Peptidsequenz. Nur die cyclische „Ausgangssequenz“ zeigte, neben den Kontrollen, eine agonistische Aktivität.

Abb. 36: HPLC-MS Analytik von 4-1C (a) und 4-4C (b); gezeigt sind die UV-Spur bei 220 nm (oben) und der entsprechende Massenbereich der Zielverbindung (unten).

Abb. 37: Kleinster aktiver SSTR2-Agonist 4-1C aus der Transformation von S14. Die im S14 bekannten Schlüsselpositionen sind gelb hervorgehoben.

Schema 45: Aminoderivatisierung der PP-Membranen.

Abb. 38: Modulares System bei der Synthese von diversen [1,3,5]-Triazin-Bibliotheken.

Schema 46: Variabilität in der neuen Cyclisierungsmethode; es können unterschiedliche Oligomere mit verschiedenen halogenierten Stickstoff-Aromaten umgesetzt werden.

Abb. 39: Kleinster im Verlauf dieser Arbeit gefundener SSTR2-Agonist 4-1C.