Aus der Klinik für Hämatologie und Onkologie
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Nachweis von Aspergillus-fumigatus-Infektionen aus dem Respirationstrakt mittels TaqMan-PCR

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Carola Scheer

aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. M. Ruhnke
2. Prof. Dr. med. H. Hof
3. Prof. Dr. med. H. Einsele

Datum der Promotion: 16.01.2006

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Vorkommen und Morphologie von Aspergillus-Spezies
  • 1.2  Aspergillus-assoziierte Erkrankungen
  • 1.3 Problematik der Diagnostik
  • 1.4 Ziel und Fragestellung
• 2 Material und Methoden
  • 2.1  Patientengut
    • 2.1.1  Probenverteilung
    • 2.1.2 Probenherkunft
    • 2.1.3 Patientendaten
  • 2.2 Labortechnischer Teil
    • 2.2.1  Probenvorbereitung
    • 2.2.2 DNS-Extraktion
    • 2.2.3 Amplifikation der extrahierten DNS mittels konventioneller PCR
    • 2.2.4 Detektion der Amplifikate mittels Gelelektrophorese
    • 2.2.5 Sensitivität
    • 2.2.6 Etablierung der real-time-PCR
      • 2.2.6.1  Klonierung und Transformation
      • 2.2.6.2 Plasmid-Isolierung
      • 2.2.6.3 Erstellung der quantitativen Standardreihe
      • 2.2.6.4 Funktionsprinzip der TaqMan-PCR
      • 2.2.6.5 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (7700 SDS)
      • 2.2.6.6 Ansatz und Durchführung der TaqMan-PCR
  • 2.3 Definition der invasiven Aspergillose
• 3  Ergebnisse
  • 3.1  Patienteneinteilung
  • 3.2 Molekularbiologische Verfahren
    • 3.2.1  Entwicklung der DNS-Extraktion
    • 3.2.2 Sensitivität
    • 3.2.3 Spezifität der verwendeten Primer/Sonde
    • 3.2.4 Entwicklung der TaqMan-PCR
      • 3.2.4.1  Auswahl der TaqMan-Sonde
      • 3.2.4.2 Thermocycler-Einstellungen
      • 3.2.4.3 Die quantitative Standardreihe für die TaqMan-PCR
      • 3.2.4.4 Detektion der Standardreihe
    • 3.2.5 Testung verschiedener Materialien
    • 3.2.6 Kontaminationsprophylaxe
  • 3.3 Untersuchungen von Patientenmaterial
    • 3.3.1  Untersuchungen im Vergleichskollektiv
    • 3.3.2 Untersuchungen im Patientenkollektiv
      • 3.3.2.1  Bewiesene invasive Aspergillose
      • 3.3.2.2 Wahrscheinliche invasive Aspergillose
      • 3.3.2.3 Mögliche invasive Aspergillose
      • 3.3.2.4 Keine invasive Aspergillose
    • 3.3.3 Panfungus-PCR
    • 3.3.4 Darstellung einzelner Patienten im Verlauf
      • 3.3.4.1  Patient Nr. 6 (KJ-40m)
      • 3.3.4.2 Patient Nr. 1 (GH-80m)
  • 3.4 Testvalidität/Resultatvalidität
    • 3.4.1  Diagnostische Sensitivität
    • 3.4.2 Diagnostische Spezifität
    • 3.4.3 Positiver prädiktiver Wert
    • 3.4.4 Negativer prädiktiver Wert
• 4 Diskussion
  • 4.1  Patienteneinteilung
  • 4.2 Molekularbiologische Diagnostik
    • 4.2.1  DNS-Extraktionsverfahren
    • 4.2.2 Sensitivität
    • 4.2.3 TaqMan-PCR
    • 4.2.4 Primer- und Sondenauswahl, Spezifität
    • 4.2.5 Probenmaterial
  • 4.3 Testvalidität/Resultatvalidität
  • 4.4 Ausblick
• 5 Zusammenfassung
• 6 Reagenzienliste
• Danksagung
• Konferenzbeiträge
• Erklärung an Eides Statt
• Literaturverzeichnis

Tabellen

• Tabelle 1: Zusammensetzung des Mastermix für beide Primerpaare je Probe, Gesamtvolumen48µl/Probe, UV-Licht: ultraviolettes Licht
• Tabelle 2: PCR-Programm für die Aspergillus-fumigatus-spezifischen Primer
• Tabelle 3: PCR-Programm für die Panfungus-Primer
• Tabelle 4: Zusammensetzung des Mastermix für die TaqMan-PCR, ca. 48µl (48,33µl) Gesamtvolumen/Probe
• Tabelle 5: Thermocycler-Einstellungen für die Durchführung der TaqMan-PCR
• Tabelle 6: Parameter, die für die Einteilung in eine wahrscheinliche oder mögliche invasive Aspergillos beachtet werden müssen.
• Tabelle 7: Kriterien zur Einteilung in die Gruppen der wahrscheinlichen oder möglichen invasiven Aspergillus-Infektionen (modifiziert nach Ascioglu et al. 2002).
• Tabelle 8: Spezifitäten der Panfungus-Primer versus Aspergillus fumigatus-spezifischer Primer
• Tabelle 9: Kopienzahlberechnung zur Erstellung einer Verdünnungsreihe bekannter Kopienzahl:
• Tabelle 10: Ergebnisse TaqMan-PCR der Patienten mit bewiesener invasiver Aspergillose in absteigender Reihenfolge
• Tabelle 11: Ergebnisse TaqMan-PCR der Patienten mit wahrscheinlicher invasiver Aspergillose in absteigender Reihenfolge
• Tabelle 12: Ergebnisse TaqMan-PCR der Patienten mit möglicher invasiver Aspergillose in absteigender Reihenfolge
• Tabelle 13: Ergebnisse TaqMan-PCR der Patienten mit keiner invasiven Aspergillose in absteigender Reihenfolge

Bilder

• Abbildung1: Probenverteilung innerhalb des untersuchten Patienten- und Vergleichkollektivs (Probenanzahl n=269), Sonstige Biopsate: Bulbus oculi (n=1), Leber (n=1), Magen (n=1); Sonstige: Aszites (n=1), Hornhaut-Abradat (n=2), Kammerwasser-Punktat (n=2), Perikarderguss-Punktat (n=1), Pankreassekret (n=1).
• Abbildung 2:  Diagnosenverteilung innerhalb der Vergleichsgruppe, Angaben in Prozent, in absteigender Reihenfolge: Pneumonie (n=21), Sarkoidose (n=12), Bronchial-Ca (n=10), COPD/Asthma (n=6), TBC (n=5), Sonstige (n=13), darunter: Lungenfibrose (n=4), Alveolitis (n=3), HIV (n=2), Bronchiolitis obliterans (n=1), Histiozytom (n=1), Lungenarterienembolie (n=1), Pleuraempyem (n=1), n=Anzahl
• Abbildung 3 :  Kreisdiagramm zur Verteilung der Grunderkrankungen innerhalb des Patientenkollektivs (n=137), Angaben in Prozent. MDS = Myelodysplastisches Syndrom
• Abbildung 4:  Flussdiagramm zur detaillierten Ansicht der Hauptdiagnosen im Patientenkollektiv. Die Zahlen geben die Anzahl (n) der Patienten an, die an den jeweiligen Erkrankungen leiden:
• Abbildung 5 : Mechanismus des Fast Prep FP120 cell disrupter, Qbiogene, Movers &Shakers: Mechanismus des Fast Prep FP120 cell disrupter, Qbiogene, Movers & Shakers
• Abbildung 6:  Gelelektrophorese der asservierten Kolonien, M: Marker VI, 1-4: Klon 1-4 mit Insert (aus weißer Kolonie), 5+6: Klon 5+6 ohne Insert (aus blauer Kolonie) 7: Positivkontrolle, 8: Negativkontrolle, bp = Basenpaare
• Abbildung 7:  Einfluss der Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq-DN-Polymerase auf eine fluorogene Sonde während der Extensionsphase einer TaqMan-PCR.
• Abbildung 8:  Lokalisation der Primer (forward and reverse) und der Aspergillus-fumigatus-spezifischen Sonde (Genbank accession number: AF 22238), Primer: grau hinterlegt, Sonde: gelb hinterlegt.
• Abbildung 9:  Flussdiagramm zur Bewertung einer bewiesenen invasiven Aspergillose
• Abbildung 10:  DSM 790: M: Marker VI, 1: McFarland 1, 2: McFarland 0,5 (entsprechend 10⁶ KBE/ml), 3: 10⁵ KBE/ml, 4: 10⁴ KBE/ml, 5: 10³ KBE/ml, bp = Basenpaare
• Abbildung 11:  Extraktion mit verschiedenen Geschwindigkeiten bzw. Zeiten im FastPrep cell disrupter: 1 und 2: 3 x 30s, 5,5m/s, 3 und 4: 2 x 30s, 5m/s, 5 und 6: 2 x 30s 5,5m/s, M: Marker VI, 1: Aspergillus fumigatus (DSM 63359), 2: Aspergillus flavus (ATCC 9643),3: Aspergillus fumigatus (DSM 63359),4: Aspergillus flavus (ATCC 9643), 5: Aspergillus fumigatus (DSM 63359), 6: Aspergillus flavus (ATCC 9643), bp = Basenpaare
• Abbildung 12:  Verdünnungsreihe Aspergillus fumigatus, 1: 10⁶KBE/ml, 2: 10⁵KBE/ml, 3: 10⁴KBE/ml 4: 10³KBE/ml 5: 10²KBE/ml 6: 10¹KBE/ml, 7: 10⁰KBE/ml, 8: Negativkontrolle, 9: Positivkontrolle, M: Gewichtsmarker VI
• Abbildung 13: Lineare Darstellung der Standardreihe, ΔRn: Fluoreszenzintensität, Cycle: Zyklusanzahl
• Abbildung 14:  Standardkurve, schwarze Punkte markieren die vorgegebenen Kopienzahl der Standardreihe, rote Punkte die zu untersuchenden Proben. Ct: Zyklusanzahl, Starting Quantity: Ausgangsquantität in Kopienzahl/2µl
• Abbildung 15:  Darstellung der TaqMan-Ergebnisse in Bezug auf die Gruppeneinteilung: bewiesene, wahrscheinliche, mögliche und keine invasive Aspergillose, Angaben in Bezug auf die Probenanzahl n
• Abbildung 16:  Quantitative Ergebnisse innerhalb der einzelnen Patientengruppen: bewiesene, wahrscheinliche, mögliche und keine invasive Aspergillose in Bezug auf die positiven Proben
• Abbildung 17:  Verlauf Patient Nr. 6, m, 40 Jahre, Hauptdiagnose: Morbus Wegener, bewiesene invasive Aspergillose
• Abbildung 18:  Patient Nr. 1: männlich, 80 Jahre, Hauptdiagnose: Non-Hodgkin-Lymphom, verstorben am 14.Dezember 1999 an einer fulminanten invasiven Aspergillose.