1 Einleitung

1.1  Vorkommen und Morphologie von Aspergillus-Spezies

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Aspergillen sind in unserer Umwelt ubiquitär vorkommende Mikroorganismen, die zu den Schimmelpilzen gezählt werden. Schimmelpilze sind ein Sammelbegriff für Fadenpilze, die in Form von verzweigten Pilzfäden, sogenannten Hyphen, wachsen. Nach Verzweigung entsteht ein Geflecht, welches als Mycel bezeichnet wird. Pilzgeflechte sind oft mit dem bloßen Auge nicht erkennbar.

Bei den Aspergillen handelt es sich um Vertreter der thermotoleranten Schimmelpilze, das heißt (d. h.), sie gedeihen am besten bei erhöhten Temperaturen (bis über 40°C), weshalb sie besondere gesundheitliche Relevanz besitzen. Die wichtigsten humanpathogenen Arten sind Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus terreus und Aspergillus niger, wobei Aspergillus fumigatus der am häufigsten nachgewiesene Erreger ist [1]. Erwurde das erste Mal im Jahr 1863 von Johann Baptist Georg Wolfgang Fresenius beschrieben [2]. Häufig in der Erde, z. B. Blumenerde oder Kompost vorkommend, wächst er bevorzugt auf organischem Abfall und sendet Tausende von Sporen in die Umgebung. Die Sporen messen einen Durchmesser von 2 bis 3µm, so dass sie problemlos in die Lungenalveolen gelangen können [ 3]. Untersuchungen haben ergeben, dass ein Mensch täglich neben mindestens 5.000 verschiedenen Sporenarten einige hundert Aspergillus-fumigatus-Sporen inhaliert [ 4]. Die Zusammenhänge zwischen Vorkommen der Aspergillus-Sporen und Auftreten von nosokomialen Aspergillus-Infektionen sind wiederholt mit unterschiedlichen Ergebnissen untersucht worden. Walsh [5] und Weems [6] et al. beschrieben in den 80er Jahren ein vermehrtes Auftreten von invasiven Aspergillosen in hämatologischen Abteilungen. Als Ursache wurde eine erhöhte Aspergillus-Sporen-Anzahl während Bauarbeiten innerhalb des Krankenhauses vermutet. Leenders et al. verglich 1999 [7] das Vorkommen von Pilzsporen innerhalb und außerhalb eines Krankenhauses. In den Untersuchungen konnte eine erhöhte Inzidenz der invasiven Aspergillose nicht mit dem erhöhten Vorkommen von Aspergillus-Sporen in der Umgebung erklärt werden. Dabei wurden die Aspergillus-fumigatus-Stämme der Patienten mit denen der Umgebung verglichen. Sie zeigten Unterschiede in der Genotypisierung, so dass Leenders et al. vermutete, dass der Patient bei Betreten des Krankenhauses den Pilz „mitbringt“. Curtis et al. [8] überprüfte die Konzentration an Aspergillen in einem Krankenhaus. Erhöhte Konzentrationen ließen sich während Renovierungsarbeiten, nach fehlerhaften Dacharbeiten, in einem Raum mit leckender Rohrleitung und in einem Raum mit vermehrter Kondenswasserbildung messen.

Für eine Person mit einem intakten Immunsystem stellen die humanpathogenen Aspergillus-Sporen in der Regel keine Gefahr dar, da sie durch das Immunsystem abgewehrt werden. Immungeschwächte Personen können jedoch an verschiedenen Manifestationsformen erkranken [1], (Kapitel 1.2).

1.2  Aspergillus-assoziierte Erkrankungen

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Durch Aspergillus-Spezies verursachte Erkrankungen variieren von lokaler Besiedlung an Haut und Schleimhäuten, allergischen Reaktionen bis hin zu lebensbedrohlichen systemischen Infektionen. Aspergillus-Infektionen werden überwiegend durch Aspergillus fumigatus [1], seltener durch Aspergillus flavus, Aspergillus niger oder durch Aspergillus terreus hervorgerufen. Die häufigste Eintrittspforte stellen die Atemwege dar. Nach Aufnahme kommt es zur Ansiedlung der Sporen im Respirationstrakt. In einem gesunden Organismus werden sie durch das Vorhandensein von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen eliminiert. Im Falle eines geschwächten Immunsystems mit unzureichender Keimabwehr kommt es zur Mycelbildung, im weiteren Verlauf zur Ausbildung von Fruchtkörpern mit Ausbildung von Sporen und damit zur weiteren Vermehrung und Verbreitung. Der Verlauf wird maßgeblich durch die Kompetenz des Immunsystems bestimmt [9,10,11]. Verschiedene invasive Manifestationsformen der Aspergillose können unterschieden werden [1,12]:

1. Akute invasive pulmonale Aspergillose:

Die akute Form kann unter dem Bild einer Pneumonie einen fulminanten Verlauf nehmen und vor allem bei immunsupprimierten Patienten innerhalb kürzester Zeit zum Tod führen. Bei 25 bis 33% der Patienten können initiale Symptome wie Husten und Fieber fehlen [1] und erst bei fortgeschrittener Erkrankung auftreten. Als schwerste Erkrankungsform tritt sie in Form der disseminierten invasiven Aspergillose auf.

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2. Chronische invasive Aspergillose:

Sie ist seltener als die akute Form und tritt unter anderem bei Patienten mit AIDS (acquired immunodeficiency syndrome), chronischer Granulomatose [13,14] sowie nach länger andauernder Therapie mit Kortikosteroiden wie bei Sarkoidose [15] auf. Symptome wie Husten, Hämoptysen, aber auch Fieber, können Wochen bis Monate bestehen.

3. Aspergillus Tracheobronchitis:

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Sie tritt vorrangig bei AIDS- und lungentransplantierten Patienten [16,17] auf. Die milde Form äußert sich mit vermehrter Schleimproduktion und lokaler Entzündung. Vor allem nach Lungentransplantation werden schwerere Verläufe mit Ulzerationen und Ausbildung von Pseudomembranen beschrieben [18].

4. Zerebrale Aspergillose:

In 10 bis 20% aller Fälle einer invasiven Aspergillose liegt eine zerebrale Manifestation vor [1]. Eine klinische Symptomatik tritt erst spät auf. Dabei äußern weniger immunsupprimierte Patienten lokale Beschwerden z. B. Kopfschmerzen. Die Symptome stärker immunsupprimierter Patienten sind unspezifisch und können sich z. B. in mentalen Defiziten äußern.

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5. Invasive Aspergillus Sinusitis:

Die akute Rhinosinusitis kann sich in Patienten nach Knochenmarktransplantation und in neutropenischen Patienten manifestieren [19]. Sie äußert sich zunächst unspezifisch mit Fieber, Husten und Nasenbluten. Sie kann parallel zu einer pulmonalen Aspergillose auftreten. Die chronische Form betrifft eher Patienten mit einem nicht geschwächten Immunsystem [20]. Die Symptomatik variiert je nach Progress der Erkrankung und kann sich in visuellen Problemen und Kopfschmerzen äußern.

6. Disseminierte Aspergillose:

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Sie ist die schwerste Erkrankungsform der invasiven Aspergillose mit hoher Mortalität, bei der es zur systemischen Ausbreitung des Erregers mit Absiedlung in weitere Organe kommt [21]. Davon sind vor allem die Leber, Milz, Haut sowie das zentrale Nervensystem betroffen.

In den letzten 20 Jahren ist die Prävalenz invasiver Mykosen von 2,2% auf 5,1% gestiegen [22]. Wald et al. [23] berichtet 1997 über ein Ansteigen der Inzidenz der invasiven Aspergillose bei knochenmarktransplantierten Patienten von 5,7% auf 11,2%. Zu über 90% ist der Aspergillus fumigatus der verursachende Keim einer invasiven Aspergillose [3,1]. Die erhöhte Inzidenz ist vermutlich auf eine steigende Zahl von Patienten mit geschwächter Immunkompetenz zurückzuführen. Zu erwähnen sind die zunehmenden Eingriffe mit begleitender immunsuppressiver Therapie wie z. B. Knochenmark- und Stammzelltransplantationen [24], die Transplantation solider Organe [25] sowie der steigende Gebrauch von Breitbandantibiotika und Zytostatika im Rahmen maligner Erkrankungen [26].

Trotz antimykotischer Therapie wird weiterhin eine hohe Mortalität im Zusammenhang mit der invasiven Aspergillose beschrieben. Sie beträgt für die invasive pulmonale Aspergillose fast 75%, bei zerebralem Befall liegt sie bei mehr als 95% [1]. Die invasive Aspergillose ist eine der Haupttodesursachen unter Patienten nach durchgeführter Hochdosis-Chemotherapie sowie nach Knochenmark-, Stammzell-, oder Organtransplantation [3]. Einsele et al. [27] untersuchte 1998 mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) bronchoalveoläre Lavagen und konnte eine signifikante Korrelation zwischen dem Nachweis von Aspergillus-DNS vor einer Knochenmarktransplantation und der Erkrankung an einer invasiven Aspergillose nach der Transplantation beobachten. Eine vorbestehende Kolonisation mit Aspergillus-Spezies könnte somit als ein zusätzlicher Risikofaktor für die Entwicklung einer invasiven Aspergillose betrachtet werden.

1.3 Problematik der Diagnostik

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Aufgrund des vielfältigen Erscheinungsbildes und der wechselnden unspezifischen klinischen Symptome, gestaltet sich die Diagnose der invasiven Aspergillose sehr schwierig. Gerade bei immunsupprimierten Patienten kann eine starke Diskrepanz zwischen einer eher milden Symptomatik bei bereits fortgeschrittener Infektion beobachtet werden [1]. Bei der körperlichen Untersuchung können die Zeichen einer Pneumonie auch ganz fehlen [28]. Durch die vielseitige Symptomatik ist die invasive Aspergillose nicht von bakteriellen oder viralen Infektionen zu unterscheiden. Bei Auftreten von Fieber in der Neutropenie und pulmonalen Infiltraten, sollte an die Möglichkeit einer invasiven Mykose gedacht und eine schnelle Diagnostik eingeleitet werden. Schon Ende der 70er Jahre wird die Wichtigkeit einer frühzeitigen Diagnose und die schnelle Einleitung einer antimykotischen Therapie postuliert [29]. Kontoyiannis [30] und Caillot [ 31] et al. beobachteten 2002 und 1997 eine höhere Überlebensrate bei Einleitung einer frühzeitigen Therapie. Maschmeyer et al. [32] beobachtete 1994 fast 300 Patienten in der Neutropenie mit malignen hämatologischen Erkrankungen. Bei Auftreten von Fieber oder pulmonalen Infiltraten wurde eine antimikrobielle Therapie eingeleitet. Dabei wurde eine Ansprechrate von 27,1% auf eine isolierte antibiotische Therapie beobachtet, die nach Erweiterung um ein Antimykotikum auf 61,3% anstieg.

Wie das klinische Bild, so sind auch die pathologischen Veränderungen im konventionellen Röntgenbild unspezifisch und vielseitig. Manchmal können noduläre unscharfe Herde zu erkennen sein [33]. In der Frühphase ist das Röntgenbild jedoch meistens unauffällig [ 34]. In der Computertomographie können sich bei Patienten in der Neutropenie sehr früh meist pleuranah gelegene Noduli abzeichnen, die den Veränderungen des konventionellen Röntgenbildes vorausgehen [12,31]. Diese computertomographischen Veränderungen können sich im Verlauf wie folgt darstellen [34, 35,36]:

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Trotz der besseren Sensitivität der Computertomographien gegenüber den Röntgenaufnahmen, zeigen sich ihre Grenzen in der Schwierigkeit der diagnostischen Interpretation. Eine nähere Identifizierung des Erregers ist durch die Bildgebung nicht möglich.

Die spezifische Charakterisierung des Erregers kann mikroskopisch durch Begutachtung von gefärbten Ausstrichen sowie kulturell durch die Anzüchtung des Erregers auf speziellen Nährmedien aus Sputum, Trachealsekret, Bronchiallavage, Pleurapunktat, Liquor und anderen Präparaten erfolgen. Problematisch ist die Bewertung von angelegten Kulturen. Kontaminationen durch ubiquitär vorkommende Aspergillus-Sporen, aber auch ausbleibendes Wachstum werden beschrieben [37,38]. Bei positiven Befunden kann oft zwischen Kontamination des Materials, Kolonisation oder Infektion des Patienten, insbesondere bei fehlenden anderen diagnostischen Hinweisen, nicht eindeutig entschieden werden. Die genaue Differenzierung innerhalb der Aspergillus-Spezies ist nicht immer möglich. Erste Ergebnisse sind erst nach ungefähr zwei bis drei Tagen zu erwarten. Blutkulturen hingegen bleiben fast immer negativ [39,40]. Eine invasive Aspergillose gilt als bewiesen, wenn der histopathologische oder zytopathologische Nachweis von Hyphen aus einer Biopsie oder Feinnadelaspiration oder wenn der kulturelle Nachweis von Aspergillus aus steril gewonnenem Material gelingt.

Verschiedene serologische Verfahren existieren für die Diagnostik einer invasiven Aspergillose, darunter der Nachweis von zirkulierendem Galaktomannan, einem Polysaccharid-Antigen der Aspergillus-Zellwand, welches während der Ausbreitung des Erregers im Gewebe in den Blutkreislauf gelangt. Die am häufigsten angewendeten Methoden sind der Latex-Agglutinationstest und der „enzyme linked immunosorbent assay“ (ELISA), wobei der ELISA mit 1ng/ml eine bessere Sensitivtät als der Latex-Test mit 25ng/ml aufweist [1]. Der Nachweis positiver Werte vor dem Auftreten klinischer Symptome aus dem Serum [41] ist möglich. Die Spezifität des Erregernachweises wird durch das Auftreten von Kreuzreaktionen unter anderem mit Penicillium-Spezies, geschmälert [42,43]. Die Angaben über die diagnostische Sensitivität des ELISA variieren stark. Während Herbrecht et al. [44] über eine Sensitivität von teilweise unter 30% berichtet, liegt sie nach Musher et al. bei 61% [45] und nach Becker et al. bei 100% [ 46].

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Eine weitere – die modernste – Methode zum Nachweis von Krankheitserregern kommt aus dem Bereich der Molekularbiologie. Das Verfahren zur Vervielfältigung kleinster Desoxyribonukleinsäure-Fragmente (DNS-Fragmente), die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde 1983 von Kary Mullis erfunden. 1993 erhielt er dafür den Nobelpreis. Durch die Auswahl definierter Primer können Genabschnitte durch enzymatische Replikation amplifiziert werden, die in verschiedenen Pilzspezies vorkommen [47, 48, 49, 50] oder die für Aspergillen spezifisch sind [51, 52, 53]. Eine weitere Differenzierung innerhalb der Aspergillus-Spezies kann zum Beispiel durch anschließende Hybridisierung mit spezifischen Sonden (PCR-ELISA, Blotting-Tests) oder durch die Methode der Restriktionsanalyse („restriction fragment polymorphysm“, RFLP) erfolgen. Dafür sind zusätzliche Arbeitsschritte wie beispielsweise Inkubation, Waschvorgänge oder eine gelelektrophoretische Auftrennung erforderlich. Neben dem hohen Arbeits- und Zeitaufwand bergen diese Verfahren ein hohe Gefahr der Carry-over-Kontamination.

1993 wurde von Lee [54] mit Hilfe des Einsatzes einer fluorogenen Oligonukleotid-Sonde die real-time-PCR entwickelt. Diese Sonde bindet zunächst mit den Primern innerhalb der amplifizierten Gensequenz. Im Verlauf der PCR kann bei Sondenhydrolyse eine Fluoreszenz gemessen werden, die sich proportional zur Menge des eingesetzten Ausgangsproduktes verhält. Durch Anwendung dieses sogenannten real-time-PCR-Assays kann somit eine quantitative Aussage über das amplifizierte PCR-Produkt gemacht werden. Zusätzlich werden die Arbeitschritte der Amplifikation und der folgenden Detektion in einem Schritt zusammengefasst. Zur Durchführung der real-time-PCR steht entweder der LightCycler (Roche Diagnostics) oder das in der vorliegenden Arbeit angewendete ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Perkin Elmer, Applied Biosystems) zur Verfügung.

Problematisch gestaltet sich die Vorbereitung des PCR-Produktes, die Extraktion der Aspergillus-DNS. Pilze, darunter die Aspergillus-Spezies besitzen im Gegensatz zu Bakterien eine Zellwand aus Polysacchariden wie Chitin, Glukan und Mannan, die sich als sehr resistent gegenüber der enzymatischen Lyse erwiesen hat [ 55]. Zusätzliche chemische Versuche, die Wand zu durchbrechen [50] sowie die Zerstörung durch physikalische Kräfte [48, 56] werden beschrieben. Kommerzielle Tests (Qiagen, Fast Prep) werden vermehrt mit unterschiedlichen Ergebnissen eingesetzt [55].

1.4 Ziel und Fragestellung

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Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung einer sensitiven und spezifischen Methode, mit der der Nachweis von Aspergillus fumigatus innerhalb weniger Stunden möglich ist. Um das zu erreichen, wird der Frage nachgegangen, ob durch die Anwendung einer kommerziellen Extraktionsmethode auf mechanischer Basis, Aspergillus-fumigatus-DNS aus Bronchiallavagen (BAL) und anderen Materialien schnell und zuverlässig nachgewiesen werden kann.

Die anschließende Amplifikation und Detektion der extrahierten DNS soll durch die Etablierung einer quantitativen real-time-PCR (TaqMan-PCR) erfolgen. Die Frage ist, ob sich Primer mit einer passenden fluoreszenzmarkierten Sonde entwickeln lassen, die spezifisch Aspergillus-fumigatus-DNS nachweisen können.

Zur Überprüfung der Methode wird die Spezifität durch den Einsatz verschiedener Pilzstämme und die Sensitivität an Hand von Verdünnungsreihen ermittelt.

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Die Methode wird an Hand einer prospektiven Untersuchung von Patientenmaterial von 204 Patienten klinisch evaluiert und validiert.


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06.09.2007