2 Material und Methoden

2.1  Patientengut

2.1.1  Probenverteilung

↓11

Über einen Zeitraum von drei Jahren (06/1998 bis 06/2001) werden prospektiv insgesamt 269 Proben von 204 Patienten bearbeitet. Es handelt sich zu 83,6% um Proben aus dem Respirationstrakt, darunter befinden sich 212 Bronchiallavagen (BAL) elf Trachealsekrete und zwei Bronchialsekrete. Zusätzlich werden 14 Pleuraerguss-Punktate, 13 Liquorproben, sowie zehn Biopsate untersucht (sieben Lungenbiopsate, ein Leberbiopsat, ein Magenbiopsat und ein Bulbus-oculi-Biopsat). Unter die Rubrik „Sonstige“ fallen weitere sieben Proben, die sich wie folgt aufschlüsseln: Ein Aszitespunktat, zwei Hornhaut-Abradate, zwei Kammerwasser-Punktate, ein Pankreassekret und ein Perikarderguss-Punktat (Abbildung 1).

Abbildung1:
Probenverteilung innerhalb des untersuchten Patienten- und Vergleichkollektivs (Probenanzahl n=269), Sonstige Biopsate: Bulbus oculi (n=1), Leber (n=1), Magen (n=1); Sonstige: Aszites (n=1), Hornhaut-Abradat (n=2), Kammerwasser-Punktat (n=2), Perikarderguss-Punktat (n=1), Pankreassekret (n=1).

2.1.2 Probenherkunft

↓12

Die überwiegende Anzahl der Proben (62,1%, n=167) werden über die hämatologischen/onkologischen Abteilungen der Charité Berlin (Standort Charité Virchow-Klinikum n=120, Benjamin Franklin n=16, Berlin-Buch n=31) bezogen. Ein kleinerer Anteil der Proben, 11,5% entstammen dem Universitäts-Klinikum Eppendorf, Hamburg (n=31). Insgesamt 71 BAL-Proben (26,4%) lassen sich aus der Lungenfachklinik Heckeshorn (Zentralklinik Emil-von-Behring, Berlin) von primär pulmologischen Patienten heranziehen. Sie werden als sogenanntes Vergleichskollektiv betrachtet.

2.1.3 Patientendaten

Die hier betrachteten Patienten weisen einen Alterdurchschnitt (arithmetischen Mittelwert) von 53,3 Jahren auf. Der Median liegt bei 54 Jahren. Das Alter des jüngsten Patienten beträgt elf Jahre, das des ältesten 86 Jahre. Die Geschlechterverteilung differiert mit 130 Männern zu 74 Frauen.

Vergleichskollektiv:

↓13

Von den 204 Patienten werden die 67 Patienten (71 Proben) der Lungenfachklinik einem so genannten Vergleichskollektiv zugeordnet. Es handelt sich hierbei um Patienten mit verschiedenen Lungenerkrankungen, die keine hämatologische Grunderkrankung aufweisen. Mit abnehmender Häufigkeit leiden 21 von ihnen hauptdiagnostisch unter einer meist bakteriellen Pneumonie. Neben zwölf Sarkoidose-Erkrankten, sind zehn am Bronchial-Karzinom (Bronchial-Ca) erkrankt. Sechs Patienten leiden an chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COLD), darunter befindet sich ein Asthmatiker. Weitere fünf sind an Tuberkulose (TBC) erkrankt. Die übrigen 13 Patienten werden mit verschiedenen Hauptdiagnosen unter „Sonstige“ zusammengefasst. Eine Übersicht bietet die Abbildung 2. Ein Patient weist zum Zeitpunkt der Probenabnahme eine Neutropenie nach Chemotherapie auf.

Abbildung 2:
Diagnosenverteilung innerhalb der Vergleichsgruppe, Angaben in Prozent, in absteigender Reihenfolge: Pneumonie (n=21), Sarkoidose (n=12), Bronchial-Ca (n=10), COPD/Asthma (n=6), TBC (n=5), Sonstige (n=13), darunter: Lungenfibrose (n=4), Alveolitis (n=3), HIV (n=2), Bronchiolitis obliterans (n=1), Histiozytom (n=1), Lungenarterienembolie (n=1), Pleuraempyem (n=1), n=Anzahl

HIV = Human Immunodeficiency Virus

↓14

Patientenkollektiv:

Die Grunderkrankungen der 137 Patienten der Hauptgruppe setzen sich zu 85% aus hämatologischen Erkrankungen zusammen, darunter führend die akute myeloische Leukämie (AML n=59), gefolgt von den Lymphomen (n=25), die sich in 22 Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) und drei Hodgkin-Lymphome (Morbus Hodgkin = M. Hodgkin) aufteilen. Weitere acht Patienten weisen einen soliden malignen Tumor (vorrangig das Bronchial-Ca) vor. Sechs Patienten leiden unter einem Plasmozytom. 21 Patienten können nicht den hämatologischen/onkologischen Gruppierungen zugeordnet werden. Sie leiden entweder unter einer schweren systemischen Infektion oder weisen bei verschiedenen Grunderkrankungen eine anhaltende Neutropenie vor. Die genaue Zusammensetzung sind den Abbildung 3 undAbbildung 4 zu entnehmen.

Abbildung 3 :
Kreisdiagramm zur Verteilung der Grunderkrankungen innerhalb des Patientenkollektivs (n=137), Angaben in Prozent. MDS = Myelodysplastisches Syndrom

↓15

Abbildung 4:
Flussdiagramm zur detaillierten Ansicht der Hauptdiagnosen im Patientenkollektiv. Die Zahlen geben die Anzahl (n) der Patienten an, die an den jeweiligen Erkrankungen leiden:

AML = akute myeloische Leukämie
ALL = akute lymphatische Leukämie
CML = chronische myeloische Leukämie
CLL = chronische lymphatische Leukämie
NHL = Non-Hodgkin-Lymphom
IgG = Immunglobulin G
ITP = Idiopathisch thrombozytopenische Purpura
MDS = Myelodysplastisches Syndrom
HIV = Human Immunodeficiency Virus
TBC = Tuberkulose
LTX = Lebertransplantation

2.2 Labortechnischer Teil

Eine detaillierte Reagenzienliste befindet sich im Anhang dieser Arbeit (Kapitel 6).

2.2.1  Probenvorbereitung

Sämtliche Proben werden direkt nach Entnahme ins Labor gesandt und bei –80°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Zuvor werden 100µl von hausinternen Bronchiallavagen auf einer Sabouraud-Agar-Platte (SAB-Agar) ausplattiert, 24 Stunden bei 35°C und danach bei Raumtemperatur inkubiert.

2.2.2 DNS-Extraktion

↓16

Die Proben werden zu Beginn langsam auf Raumtemperatur erwärmt. Das eingesetzte Probenvolumen beträgt je 1ml. Erythrozytenreiche Proben erfahren zunächst eine zweimalige Vorbehandlung mit einem hypotonen Red Cell Lysis Buffer (RCLB). Nach Zugabe von 1ml RCLB zu 1ml Probenmaterial wird das Gemisch 10min im Überkopfschüttler geschwenkt (GFL 3025). Biopsate werden bis auf 2ml mit oben genannten RCLB versetzt und weiter behandelt wie die übrigen Proben. Nach der anschließend folgenden zehnminütigen Zentrifugation bei 3.000rpm (Heraeus Sepatech Varifuge RF) entsteht ein Pellet, welches nach Entfernung des Überstandes erneut in 2ml RCLB resuspensiert und unter den oben angegebenen Bedingungen geschwenkt sowie zentrifugiert wird.

Nach erneutem Entfernen des Überstandes können die vorbehandelten anfänglich erythrozytenreichen Proben gemeinsam mit dem erythrozytenarmen Material extrahiert werden. Für die nun folgende enzymatische Lyse der Leukozyten wird 1ml des noch nicht vorbehandelten Materials mit 1ml eines White Cell Lysis Buffers (WCLB) versetzt. Die übrigen Proben, Biopsate, sowie mit RCLB vorbehandelte Proben werden mit WCLB bis auf ein Volumen von 2ml aufgefüllt. Als Negativkontrolle dient 1ml einer physiologischen Kochsalzlösung, anstelle des Probenmaterials. Die Positivkontrolle stellt eine mit Aspergillus fumigatus (DSM 790, DSM 819 oder DSM 63359) gespickte physiologische NaCl-Lösung dar. Der Stamm wird zuvor in einer Sabouraud-Agar-Flüssigkultur als Reinkultur angelegt. Die Proben werden nun für 1h bei 65°C inkubiert (Thermomixer 5463, Eppendorf) und anschließend 5min bei 13.000rpm zentrifugiert.

An dieser Stelle werden die Proben nach zwei verschiedenen Verfahren weiter bearbeitet. Als Vergleich zum enzymatisch-mechanischem Verfahren wird zunächst ein enzymatisch-chemisches Extraktionsverfahren durchgeführt.

↓17

Extraktions-Methode 1 (enzymatisch-chemisch):

Der gesamte Überstand wird nach der fünfminütigen Zentrifugation dekantiert. Anschließend erfolgt die chemische Lyse der Pilzellen durch Zugabe von 100µl NaOH-Lösung, verbunden mit einer zehnminütigen Inkubation bei 95°C in einem Heizblock. Zum Kondensationsschutz werden die Proben mit vier Tropfen Mineralöl überschichtet. Nach Entfernen der Ölschicht erfolgt eine fünfminütige Zentrifugation bei 3.000rpm. Nach Dekantieren des Überstandes wird 100µl Zymolase-Reagenz zugegeben. Es erfolgt eine 30minütige Inkubation im Wasserbad bei 37°C. Anschließend werden 10µl SDS-Lösung (10%) und 150µl Magnetbeads (Dynabeads) zugefügt. Das Gemisch wird für 15min bei 65°C und anschließend für 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Jetzt erfolgt die biomagnetische Isolation der Nukleinsäuren durch Einsatz einer flexiblen Magnetschiene. Die Schiene gehört zu einem Ständer, in den das Reaktionsgefäß gesetzt wird. Nach 2min wird die Flüssigkeit vorsichtig abpipettiert. Das Pellet wird durch die Magnetkraft an der Innenwand des Gefäßes gehalten. Nach Entfernung der Magnetschiene wird das Pellet mit 200µl Waschpuffer resuspensiert. Nach erneutem Einsetzen der Magnetschiene wird der Vorgang wiederholt. Das entstehende Pellet wird mit 30µl TBE-Puffer versetzt und 30min bei Raumtemperatur belassen. Die Produkte werden bei 4°C gelagert.

Extraktionsmethode 2 (enzymatisch-mechanisch):

↓18

Nach Zentrifugation werden 800µl des Überstandes verworfen. Nach der enzymatischen Lyse erfolgt die zusätzliche mechanische Behandlung im FastPrep cell disrupter. Dafür wird der Fast DNA-Kit (Qbiogene, Illkirch, France, No. 6540-400) eingesetzt. Die verbleibenden 1,2ml werden in die im Kit enthaltenen Reaktionsgefäße überführt. Die Reaktionsgefäße enthalten eine Lysing Matrix bestehend aus „Ceramic Spheres (1/4“) und Garnet“ (Kugel und Körner), welche die mechanische Zerstörung der Zellen im Fast Prep cell disrupter unterstützen (Abbildung 5).

Abbildung 5 :
Mechanismus des Fast Prep FP120 cell disrupter, Qbiogene, Movers &Shakers: Mechanismus des Fast Prep FP120 cell disrupter, Qbiogene, Movers & Shakers

Die Reaktionsgefäße inklusive Überstand und der Lysing-Matrix werden dreimal im FastPrep FP 120 cell disrupter (Qbiogene, Illkirch, France) bei einer Geschwindigkeit von 5,5m/s jeweils 30s mechanisch behandelt. Der „cell disrupter“ erzeugt schnelle Bewegungen in allen drei Dimensionen und überträgt diese auf die darin befestigten Reaktionsgefäße. Die durch die Bewegung der Lysing Matrix entstehenden Scherkräfte sollen eine Aufspaltung der Aspergillus-Zellwände bewirken. Um der entstehenden Reibungswärme entgegen zu wirken, werden die Proben zwischen den einzelnen Durchgängen für circa (ca.) 30s auf Eis gelagert. Nach dem dritten Durchgang werden die Proben 15min lang bei 13.000rpm zentrifugiert. 600µl des Überstandes werden in neue Reaktionsgefäße (1,5ml, Eppendorf 0030 120.086) überführt und ebenfalls mit 600µl einer dem FastPrep-Kit zugehörigen Glasmilch (Binding Matrix) versetzt. Das Gemisch wird durch vorsichtiges Umdrehen der Reaktionsgefäße vermengt und 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Einer anschließenden Zentrifugation für 2min bei 13.000rpm, folgt die Entfernung des Überstandes. Die zurückbleibenden Pellets werden in 500µl 70% Ethanol resuspendiert und zweimal für 1min bei 13.000rpm zentrifugiert. Nach jedem Durchgang wird der Überstand entfernt. Anschließend werden die Pellets in 100µl TBE-Puffer resuspendiert und 10min bei Raumtemperatur inkubiert. Bei der nun folgenden zweimaligen Zentrifugation für 2min bei 13.000rpm wird der die DNS enthaltene Überstand, nach jedem der beiden Durchgänge in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die Proben werden bis zur Durchführung der PCR bei 4°C gelagert.

2.2.3 Amplifikation der extrahierten DNS mittels konventioneller PCR

↓19

Das Grundprinzip der PCR beruht auf einer exponentiellen Vermehrung einer bestimmten Sequenz im Genom. Das zuvor extrahierte DNS-Stück, das die gesuchte Sequenz enthält, dient als Matrize. Die zunächst durchgeführte PCR erfolgt mit einem Primerpaar, welches Genabschnitte amplifiziert, die bei verschiedenen Pilzspezies vorliegen. Diese Vorversuche sollen gewährleisten, dass die in der vorliegenden Arbeit angewendete Extraktionsmethode viele verschiedene Pilzspezies erfasst. Die Sequenzen der sogenannten Panfungus-Primer lauten wie folgt:

Primer 1:

5’- ATT GGA GGG CAA CTG TGG TG - 3’

20mer

Primer 2:

5’- CCG ATC CCT AGT CGG CAT AG - 3’

20mer

Nach Durchführung einer PCR nach unten angegebenem Schema, erfolgt die Durchführung einer weiteren PCR mit Aspergillus-fumigatus-spezifischen Primern. Aufgrund der bekannten Sequenz wird über die Gendatenbank ein aus Oligonukleotiden bestehendes Primerpaar ermittelt (Genbank accession number: AF 22238):

↓20

Primer 1:

5´- CCA GCT CAG CCG GAT TTA TAC C- 3´

22-mer

Primer 2:

5´- CAT GGT TGA GCT TAG CCA GGA AC- 3´

23-mer

Mit diesem Primerpaar wird eine 212 Basenpaare (bp) lange Sequenz aus dem Aspergillus-fumigatus-Genom herausgefiltert. In diesem Fragment liegt eine Zielsequenz, an der später im Rahmen der TaqMan-PCR eine Sonde (Genbank accession number: AF 22238) ansetzen soll.

Zur Durchführung der PCR wird zunächst ein sogenannter Mastermix hergestellt, der sich aus den in Tabelle 1 aufgelisteten Reagenzien zusammensetzt. Davon werden 48µl je Probe eingesetzt. Je PCR-Durchlauf werden eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle mit eingeplant.

↓21

Tabelle 1: Zusammensetzung des Mastermix für beide Primerpaare je Probe, Gesamtvolumen48µl/Probe, UV-Licht: ultraviolettes Licht

Volumen in µl

Reagenz

Hersteller

34,75

Aqua ad injectabilis

Braun

5,00

PCR-Puffer (10mM Tris-HCl, 500mM KCl, pH 8,3, Konzentration 10x)

Perkin Elmer

2,00

MgCl2 (25mM)

Sigma

4,00

dNTP (ATP, CTP, GTP,TTP á 2,5mM)

BRL

1,00

Primer 1 (20µM)

TIB MOLBIOL

1,00

Primer 2 (20µM)

TIB MOLBIOL

Vor Hinzufügen der Taq-Polymerase wird der Mix für 13min mit UV-Licht der Wellenlänge 254 nm bestrahlt (UV Stratalinker 2400, Stratagene).

0,25

Taq-Polymerase (5U/µl)

Perkin Elmer

Nach Hinzufügen der Taq-Polymerase wird der angesetzte Mix auf Microtubes (500µl, Sarstedt, Nümbrecht) verteilt. Abschließend erfolgt die Zugabe des Extraktionsprodukts bis zum Erreichen des Gesamtvolumens von 50µl (2µl von jeder Probe). Als Positivkontrolle dient ein bekanntes, reproduzierbares Aspergillus-fumigatus-Extraktionsprodukt, die Negativkontrolle erhält keinen weiteren Zusatz. Vor Verschließen der Microtubes werden die für die PCR fertigen Ausgangsprodukte mit einem Tropfen Mineralöl versetzt. Sämtliche Arbeitsschritte werden unter der Lamin Air Abzugsbank (HBB 2448, Haereus) durchgeführt.

Die PCR-Produkte durchlaufen, je nach eingesetztem Primerpaar, im Thermocycler (Trio-Thermoblock, Biometra) die in den Tabelle 2 und Tabelle 3 angegebenen Programme und werden anschließend bei 4°C gelagert.

↓22

Tabelle 2: PCR-Programm für die Aspergillus-fumigatus-spezifischen Primer

50°C

10

min

94°C

10

min

94°C

30

s

###

62°C

1

min

### 35 Zyklen

65°C

1

min

###

72°C

10

min

4°C

Tabelle 3: PCR-Programm für die Panfungus-Primer

95°C

5

min

95°C

30

s

###

62°C

1

min

### 35 Zyklen

72°

2

min

###

72°C

5

min

4°C

2.2.4 Detektion der Amplifikate mittels Gelelektrophorese

Der Nachweis der amplifizierten DNS erfolgt mittels Agarose-Gelelektrophorese. Hier erfolgt die Auftrennung der negativ geladenen Nukleinsäuren aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe und Konformation in einem elektrischen Feld. Als Matrix dafür wird 1,2%ige Agarose in TBE-Puffer erhitzt und mit 5µl Ethidiumbromid pro 100ml versetzt. Ethidiumbromid ist ein mit DNS interkalierender Fluoreszenzfarbstoff, der bei Anregung durch ultraviolettes Licht (UV-Licht) zum Fluoreszieren gebracht werden kann. In den Gelträger, der die Form des Gels bestimmt, wird bis zum Erkalten ein zwölfzinkiger Probenkamm eingesetzt. Nach Erkalten wird der Probenkamm entfernt und das Gel in eine mit TBE-Puffer gefüllte Gelkammer (Minnie the gel Cicle TM HE 33, Hoefer Scientific Instruments) gelegt. In die nach Abbinden des Gels entstandenen Probentaschen werden pro Öffnung 7µl des PCR-Produktes und 3µl Gelladepuffer einpipettiert. Um die Größe der zu analysierenden Fragmente nach der Elektrophorese bestimmen zu können, wird ein DNS-Größen-Standard eingesetzt (DNA-Gewichtsmarker VI). Dieser enthält 15 definierte Fragmente verschiedener Größen und erzeugt ein spezifisches Bandenmuster von 154 bis 2176 Basenpaaren. Durch den Vergleich der einzelnen Laufstrecken der Proben mit den einzelnen Banden des Markers lässt sich die Größe des Produktes ermitteln. Insgesamt werden 1µl des Gewichtsmarkers, 6µl TBE-Puffer und 3µl Gellade-Puffer pro Probe verwendet. Um eine möglichst weite Wanderungsstrecke zu durchlaufen, wird das Gel in den verwendeten horizontalen Elektrophorese-Kammern so orientiert, dass die Probentaschen nahe der Kathode liegen. Nach Anlegen einer Spannung von 80 Volt über eine Stunde, werden die Amplifikate unter einem UV-Schirm (Biometra TI 3) visuell dargestellt und mittels Kamera fotografisch gesichert (Biometra Bio Doc CCD-Camera).

2.2.5 Sensitivität

↓23

Die in dieser Arbeit verwendeten Aspergillus-Stämmewerden von der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen (Braunschweig) bezogen. Für die Kulturen werden verschiedene Aspergillus-Stämme (unter anderem Aspergillus fumigatus DSM 790, DSM 819, DSM 63359) auf Sabouraud-Glucose-Agar ausplatiert, 24h bei 35°C bebrütet (Brutschrank: Heraeus Function Line B20) und weitere 24h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird auf die Kultur 10ml physiologische Kochsalzlösung gegeben. Mit einer Einwegpipette wird 1ml Suspension aspiriert, mit einem Mörser homogenisiert und photometrisch (Eppendorf Photometer 1101 M) mittels Verdünnung durch 0,9%ige Kochsalzlösung auf einen McFarland-Faktor von 0,5 (entspricht ca. 106 Kolonie bildende Einheiten=KBE/ml) abgeglichen. Weitere Verdünnungen erfolgen durch erneute Zugabe von Kochsalzlösung im Verhältnis 1:10.

2.2.6 Etablierung der real-time-PCR

Nach Extraktion, Durchführung der konventionellen PCR und Darstellung der Amplifikate mittels Gelelektrophorese erfolgt die Etablierung der real-time-PCR. Für die spätere quantitative Messung wird zunächst eine Standardreihe einer definierten Kopienzahl an Plasmid-DNS erstellt. Zur Herstellung der Plasmid-DNS wird extrahierte und amplifizierte Aspergillus-fumigatus-DNS dem folgenden Verfahren unterzogen:

2.2.6.1  Klonierung und Transformation

Zunächst erfolgt die Klonierung der Aspergillus-fumigatus-DNS. Die Klonierung wird mittels TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen) durchgeführt. Ein zuvor hergestelltes PCR-Produkt wird unter erneuter Zugabe von 0,25µl Taq-Polymerase bei 72°C im Thermocycler (Trio-Thermoblock, Biometra) erhitzt. Während dieser Extensionsreaktion wird durch die Taq-Polymerase an das jeweilige 3´-Ende der doppelsträngigen DNS ein Adenosin-Überhang ansynthetisiert. Diese 3´-terminale Base ist nicht komplementär gepaart, so dass sie keine stabile Form darstellt. Nach Durchführung erfolgt die Kontrolle mittels Gel-Elektrophorese (Kapitel 0). Anschließend wird mit der Klonierung begonnen.

↓24

Das vorliegende PCR-Produkt wird in der nun folgenden TOPO-Cloning-Reaktion durch Zugabe eines pCR-TOPO Vektors mit diesem ligiert. Dieser zeichnet sich durch 3´-Thymidin-Überhänge sowie durch die sich an den Enden befindliche Topoisomerase I aus. Diese Konstellation ermöglicht den Einbau des frischen, mit Adenosin-Überhängen versehenen PCR-Produktes in den Vektor (TA-Cloning). Dafür werden 0,5 bis 2µl PCR-Produkt mit 1,0µl pCR 2.1-TOPO vector (10ng/µl plasmid DNA, Invitrogen) pipettiert und anschließend mit sterilem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 5µl ergänzt. Dem vorsichtigen Umrühren mit der Pipettenspitze folgt eine fünfminütige Inkubationszeit bei Raumtemperatur (ca. 25°C). Nach Inkubation erfolgt die Zugabe von 1,0µl sechsfach konzenztrierter TOPO Cloning Stop Solution. Nach Mixen bei Raumtemperatur für 10s wird der Ansatz 30min auf Eis gelagert. Während der Kühlung entkoppelt sich die Topoisomerase I vom Vektor. In der Zwischenzeit werden die im Kit enthaltenen bei -80°C gelagerten immunkompetenten Escherichia coli Bakterien (E. coli Zellen, TOP 10 One Shot Zellen, Invitrogen) auf Eis aufgetaut. Bei anhaltender Kühlung auf Eis werden 2µl des zuvor hergestellten Ansatzes in das vom Hersteller bereit gestellte Gefäß mit immunkompetenten E. coli Bakterien (TOP 10 One Shot Zellen, Invitrogen) hineinpipettiert, vorsichtig vermischt und für 30min auf Eis inkubiert.

Während der Inkubation erfolgt die Transformation der ligierten Plasmide in die E. coli Zellen. Die entkoppelte Topoisomerase I soll zu einer, um das zwei- bis zehnfach verbesserten Transformationsrate führen. Die Transformationsreaktion wird durch eine exakt 30s dauernde Hitzeschockbehandlung bei 42°C beendet. Anschließend wird der Ansatz erneut 2min auf Eis gelagert.

Das SOC-Medium wird auf Raumtemperatur erwärmt. Anschließend werden 250µl dieses Mediums hinzugefügt. Das Gemisch wird bei 37°C für eine halbe Stunde bei horizontaler Lage und Bewegung inkubiert (Ampicillin-Selektion). Während der Inkubation im SOC-Medium exprimieren die plasmidtragenden Zellen ihre erworbene Antibiotika-Resistenz (Ampicillin-Resistenz ist plasmidkodiert). Nach Inkubation wird der Ansatz zu 50 und zu 100µl auf Ampicillin-haltigen Selektivplatten (LB-Platten) ausgestrichen. Die unterschiedlichen Volumina sollen sicherstellen, dass die Platten nicht überwachsen sind, beziehungsweise (bzw.), dass nicht zu wenige Kolonien heranwachsen. Es erfolgt eine Inkubation über Nacht bei 37°C. Durch die Ampicillin-Zugabe ist es nur den plasmidhaltigen (Ampicillin-resistenten) Zellen möglich Kolonien zu bilden. Nach der Kultivierung entstehen weiße bis blaue heterogene Kolonien von 1 bis 3mm Größe. Die Farbgebung weiß, hell-, bis tiefblau beruht auf einer Farbreaktion mit dem Kunstprodukt x-Galaktosidase (x-Gal), die den Selektivplatten neben dem Ampicillin zusätzlich beigefügt ist. Der verwendete pCR-TOPO Vektor enthält eine Promoterregion (LacZα-Gen), die bei Unterbrechung durch eingesetzte DNS des PCR-Produktes (Insert) keine Farbreaktion mit x-Gal mehr eingehen kann, d. h. die entstehende Kolonie weist eine weiße Färbung auf. Plasmidtragende Zellen, welche kein Insert enthalten rufen durch Spaltung von x-Gal eine Farbreaktion hervor, bei der Brom-Chlor-Indigo entsteht, das sich durch eine tiefblaue Farbe auszeichnet.

↓25

Jetzt erfolgt das „Picken“ der weißen Kolonien (mit Insert). Mit einer Impföse wird nacheinander Material von mehreren weißen Kolonien asserviert. Zur Kontrolle werden zusätzlich zwei gefärbte Kolonien „gepickt“. Das erhaltene Material wird in 10µl TBE-Puffer je Kolonie resuspendiert. Jeweils 2µl der sich daraus ergebenen Ansätze durchlaufen eine Kontrolle mittels PCR und Gelelektrophorese (Kapitel 2.2.3 und 0). Zusätzlich läuft eine Negativkontrolle und eine Positivkontrolle mit (Abbildung 6).

Abbildung 6:
Gelelektrophorese der asservierten Kolonien, M: Marker VI, 1-4: Klon 1-4 mit Insert (aus weißer Kolonie), 5+6: Klon 5+6 ohne Insert (aus blauer Kolonie) 7: Positivkontrolle, 8: Negativkontrolle, bp = Basenpaare

Es erscheinen Banden in der richtigen Größe (212 Basenpaare). Klon 2 bis 4 werden für die Weiterverarbeitung ausgewählt. Die restlichen 8µl der in TE resuspensierten Kolonie (Klon 2 bis 4) werden jeweils in ein Röhrchen (Falcon) überführt, welches zuvor mit 3ml Flüssigmedium (LB-Medium) und 50µg/ml Ampicillin befüllt wurde. Diese Flüssigkulturen werden über Nacht (12h) bei 37°C unter Schütteln (220rpm) inkubiert. Um eine ausreichende Luftversorgung zu erreichen, werden die Gefäße während der Kultivierung nicht vollständig verschlossen. Anschließend werden 1,5ml von der Flüssigkultur, die das beste Wachstum (Trübung) vorweist, in ein Reaktionsröhrchen (Eppendorf) überführt und bei 10.000rpm für 10min zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert. Das entstehende Pellet wird zur Plasmid-Isolierung verwendet.

2.2.6.2 Plasmid-Isolierung

↓26

Die weitere Plasmid-Isolierung erfolgt nach dem NUCLEOBOND kit for nucleic acid purification (MACHEREY-NAGEL). Das Pellet wird zunächst vorsichtig in 400µl Puffer S1 resuspensiert. Die darin enthaltene RNase zerstört vorhandene RNS (Ribonukleinsäure). Anschließend werden 400µl S2-Puffer zugegeben und die Suspension sechs- bis achtmal über Kopf geschwenkt. Dieser SDS-haltige Puffer bewirkt die Lyse der Zellen durch Denaturierung der zellulären Proteine sowie der Plasmid- und der chromosomalen DNS. Das Gemisch wird 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Präzipitation erfolgt jetzt die Zugabe von 400µl des kaliumacetathaltigen S3-Puffers mit darauf folgendem erneuten Schwenken der Suspension über Kopf (sechs- bis achtmal). Das Gemisch wird für 5min auf Eis inkubiert. Durch Zentrifugation bei 13.000rpm für 15min werden die denaturierten Proteine, Zelltrümmer und chromosomale DNS abgetrennt. Umgehend nach dem Zentrifugieren wird der klare Überstand in die dem Kit beigefügte Säule (cartridge AX 20, NUCLEOBOND) überführt. Die Plasmid-DNS wird an die Matrix der Säulen gebunden. Diese wird vorher mit 1ml N3-Puffer versetzt. Anschließend erfolgt dreimaliges Waschen mit jeweils 1ml Puffer N4. Schließlich erfolgt die Elution der DNS von der Membran durch die Zugabe von 800µl des Puffers N5 und Auffangen des Eluats in einem neuen Reaktionsgefäß.

Die gereinigte Plasmid-DNS wird jetzt mit 700µl Isopropanol versetzt und 30min mit 10.000rpm zentrifugiert. Anschließend erfolgt das Herauswaschen der DNS mit 600µl 70%igem Ethanol und Zentrifugation bei 10.000rpm für 10min. Das entstandene Pellet wird nach fünfminütigem Trocknen in 36µl sterilem Wasser resuspensiert und kann jetzt als Ausgangsprodukt für die Herstellung der quantitativen Standardreihe verwendet werden.

2.2.6.3 Erstellung der quantitativen Standardreihe

Zunächst wird die Konzentration des zuvor gewonnenen Eluats photometrisch bestimmt (Photometer: GeneQuant II RNS/DNS Calculator, Pharmacia Biotech, Cambridge, England). Zur Messung wird die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260nm (Absorptionsmaximun) ermittelt. Die Messung erfolgt in der 10mm Ultramikroküvette (Pharmacia Biotech, Cambridge, England). Der Nullabgleich wird mit sterilem Wasser durchgeführt. Es wird eine zehnmalige Messung durchgeführt. Die ermittelten Werte werden mit einem Faktor multipliziert (50µg DNS/ml = 1OD). Das Produkt entspricht der DNS-Konzentration der Lösung. Die entsprechenden Kopienzahlen pro Eluat können danach errechnet werden.

↓27

Anhand der errechneten Daten werden Verdünnungsreihen von 0,5 x 107 bis 0,5 x 101 Kopien/µl hergestellt. Ausgehend von einer 0,5 x 1010 Kopien/µl enthaltenden Stammlösung werden Verdünnungen im Verhältnis eins zu zehn mit TE-Puffer durchgeführt. Dazu werden pro Schritt 10µl der nächst höheren Verdünnungsstufe mit 90µl TE-Puffer versetzt, d. h. pro Ansatz erhält man 100µl, von denen 10µl für die nächste Verdünnungsstufe eingesetzt werden. Die entstehende Verdünnungsreihe beinhaltet folgende Verdünnungsstufen:

107, 106, 105, 104, 103, 102, 20, 10 Kopien/2µl

Die Lagerung der Verdünnungsreihe erfolgt nach Zugabe des TE-Puffers bei 4°C. Nach Erstellung der Standardreihe erfolgt die Etablierung der TaqMan-PCR.

2.2.6.4 Funktionsprinzip der TaqMan-PCR

↓28

Das Grundprinzip der TaqMan-PCR ist mit dem einer klassischen PCR gleich zu setzen. Ausgangsprodukt ist ein doppelsträngiges DNS-Stück, welches die gesuchte Sequenz enthält und als Matrize dient. Durch Hitzebehandlung wird die doppelsträngige DNS in Einzelstränge (Denaturierung) aufgespalten. Es folgt die Annealing-Phase, in der definierte Primer (Oligonukleotide) die gesuchte Sequenz einrahmen, hybridisieren und durch eine DNS-Polymerase verlängern. Durch Wiederholung dieses Vorgangs (im Allgemeinen 25 bis 40 Zyklen) wird eine exponentielle Vermehrung der Sequenz erreicht.

Danach erfolgt im Rahmen der konventionellen PCR die Analyse des Reaktionsprodukts über die größenabhängige gelelektrophoretische Auftrennung der Fragmente oder über die Hybridisierung mittels spezifischer Sonden.

Bei der TaqMan-PCR (auch real-time-PCR) erfolgen die Amplifikation und der Nachweis des PCR-Produktes simultan in einem Reaktionsgefäß. Zusätzlich wird die 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der Taq-DNS-Polymerase zur Generierung eines messbaren Signals während der PCR ausgenutzt. Dafür wird der PCR eine für die Zielsequenz spezifische Sonde zugesetzt. Diese wird mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert, einem sogenannten Reporter-Farbstoff (Fluoreszein-Derivat) am 5´-Ende sowie einem Quencher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat) am 3´-Ende. Zusätzlich ist die Sonde mit einem Phosphatrest blockiert. Durch die Nähe des Quencher-Farbstoffes kommt es bei Anregung der Sonde durch eine spezifische Wellenlänge (488nm) zu einem Förster-Energietransfer, der die emittierte Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes unterdrückt. Während der PCR bindet die spezifische Sonde an die denaturierte Zielsequenz. Die Taq-Polymerase trifft während der Extensionsphase auf die Sonde und beginnt diese zu verdrängen. Durch 5´-3´-Exonuklease-Aktivität der Polymerase, die jetzt aktiviert wird, kommt es zur Spaltung der Sonde und damit zur Trennung des Energietransfers zwischen Reporter- und Quencher-Farbstoff. Es entsteht ein fluoreszierendes Signal im Frequenzbereich des Reporters. Dieses ist sequenzspezifisch, da nicht vollständig bindende Sondenmoleküle verdrängt werden, bevor die Polymerase aktiviert wird. Anschließend wird die Synthese des Gegenstranges zu Ende geführt (Abbildung 7).

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Mit ansteigender Zahl der Zyklen werden proportional zu den synthetisierten PCR-Produkten immer neue Reporter-Moleküle freigesetzt, die zu einem ebenfalls proportionalen Anstieg der Fluoreszenzsignale führen. Die Fluoreszenz wird Zyklus für Zyklus während jedes Amplifikationsschrittes erfasst und kann grafisch dargestellt werden.

In den ersten 20 bis 35 Zyklen (abhängig von der PCR) reicht in der Regel die Menge der Fluoreszenz gebenden Spaltprodukte nicht aus, um ein signifikantes Signal zu erfassen. Der Wert, bei dem der erste deutliche Anstieg des spezifischen Sondensignals erfasst wird, wird als Grenzwert (threshold) bezeichnet, die Berechnung erfolgt aus der zehnfachen Standardabweichung der ersten 15 detektierten Signale. Je mehr Startkopien in die PCR anfangs eingebracht werden, desto früher wird ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenz gemessen. Der dazu gehörige Zyklus wird als Schwellenzyklus (threshold cycle = Ct) bezeichnet. Er ist ein zuverlässiger Parameter für die Quantifizierung der zu Beginn einer PCR vorhandenen Matrizenzahl. Es erfolgt anschließend die Phase des exponentiellen Anstieges mit Überschreitung des Grenzwertes. Nach einer Gesamtlänge von 35 bis 40 Zyklen stellt sich eine Plateauphase ein, d. h. es findet durch verbrauchte PCR-Reagenzien keine signifikante Neusynthese mehr statt. Des Weiteren wird die Annealing-Phase durch das Vorhandensein großer Amplifikat-Mengen gestört. Die Höhe des Plateauwertes gibt Auskunft über die Effizienz der PCR (Reaktionsbedingungen, Ausgangsmaterialien).

Die Quantifizierung der Startkopienzahl einer unbekannten Probe erfolgt mittels Einsetzen eines quantitativen Standards in Form einer definierten Verdünnungsreihe. Die Ct-Werte werden gegen den Logarithmus der Startkopienzahl dieser Reihe, automatisch durch die Software des Systems, grafisch als Gerade dargestellt. Die Quantifizierung der unbekannten Probe erfolgt durch Extrapolation dieser sogenannten Standardkurve.

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Abbildung 7:
Einfluss der Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq-DN-Polymerase auf eine fluorogene Sonde während der Extensionsphase einer TaqMan-PCR.

2.2.6.5 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (7700 SDS)

Als Gerät diente der ABI PRISM 7700 SDS (Perkin Elmer, Applied Biosystems). Dieser besitzt einen eingebauten Thermocycler, basierend auf der Technologie des GeneAmp PCR Systems 9600. Zusätzlich wurde ein optischer Heizdeckel entwickelt, der die optische Detektion des Fluoreszenzsignals gewährleistet. Über jeder Thermocyclerposition befindet sich eine Linse, die den Laserstrahl in das jeweilige Reaktionsgefäß weiterleitet. Die Fluoreszenz-Anregung erfolgt durch einen Argonlaser mit einer Wellenlänge von 488nm. Der Laserstrahl wird mittels eines Multiplexers (MUX) auf jede einzelne Position verteilt, ein kompletter Plattenscan (96 Positionen) erfolgt innerhalb von 7s. Eine charge-coupled-device-camera (CCD-Kamera) misst ebenfalls alle 7s die Fluoreszenzemission jeder einzelnen Probe in einem Bereich von 500 bis 660nm und wandelt das Signal digital um.

Die Analyse sowie die Steuerung der des Systems wird über einen Power Macintosh 4400 durchgeführt.

2.2.6.6 Ansatz und Durchführung der TaqMan-PCR

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Ein PCR-Ansatz (Mastermix) mit einem Volumen von 50µl besteht aus den in Tabelle 4 beschriebenen Teilkomponenten. Dieser wird unter Kühlung mit Eis hergestellt. Die eingesetzte Sonde ist mit den Farbstoffen FAM (6 –Carboxy-Fluoreszein) und DABCYL markiert. Die einzelnen Farbstoffe einschließlich des Referenzfarbstoffes ROX (6 –Carboxy-X-Rhodamin) entwickeln ihre fluoreszierende Wirkung bei verschiedenen Wellenlängen: FAM bei 518nm und ROX bei 602nm.

Das verwendete Aspergillus-fumigatus-spezifische Primerpaar ist das gleiche, das in der konventioniellen PCR (Kapitel 2.2.3) eingesetzt wurde. Mit diesem Primerpaar wird eine 212 Basenpaare lange Sequenz aus dem Aspergillus-fumigatus-Genom herausgefiltert. In diesem Fragment liegt eine Zielsequenz, an der die über die Gendatenbank ermittelte Sonde ansetzt (Abbildung 8).

Abbildung 8:
Lokalisation der Primer (forward and reverse) und der Aspergillus-fumigatus-spezifischen Sonde (Genbank accession number: AF 22238), Primer: grau hinterlegt, Sonde: gelb hinterlegt.

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Primer 1:

5´- CCA GCT CAG CCG GAT TTA TAC C-3´

22-mer (reverse)

Primer 2:

5´- CAT GGT TGA GCT TAG CCA GGA AC-3´

23-mer (forward)

Sonde:

5´- TGC GAG AAC AGG CAA AAT GTC ATT GTC ATT ATC AAA ATC C – 3´

Tabelle 4: Zusammensetzung des Mastermix für die TaqMan-PCR, ca. 48µl (48,33µl) Gesamtvolumen/Probe

Volumen in µl

Teilkomponenten des Mastermix:

Hersteller:

27,95

Aqua ad injectabila

Braun

5,00

10 x PCR-Puffer

Invitrogen, Gibco

4,50

MgCl2 (50mM)

Invitrogen, Gibco

4,00

dNTP (2,5mM)

BRL

0,80

TE-Puffer (pH 8, 10mM TRIS, 1mM EDTA)

0,33

ROX (6-Carboxy-X-Rhodamin, 150 µM)

TIB Molbiol

2,50

Primer 1 (10µM)

TIB Molbiol

2,50

Primer 2 (10µM)

TIB Molbiol

0,50

Sonde (10µM)

TIB Molbiol

0,25

Taq Platinum Polymerase (5 U/µl)

Invitrogen, Gibco

Der Mastermix wird jeweils zu 48µl in ein Reaktionsgefäß einer Mikrotiterplatte (MicroAmp Optical 96-Well Plate) pipettiert. Anschließend erfolgt die Zugabe von 2µl Probe je Gefäß. Jede Probe wird zweifach gemessen. Zwei Gefäße ohne Probe werden bei jedem Lauf als Negativkontrolle mitgeführt. Die Mikrotiterplatte wird mit optischen Deckeln verschlossen. Um zu gewährleisten, dass die Reaktionsansätze keine Luftblasen beinhalten, wird die Platte bei 10.000rpm eine Minute zentrifugiert.

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Anschließend erfolgt die Durchführung der TaqMan-PCR mit dem ABI PRISM 7700 SDS. Der Thermocycler durchläuft die in Tabelle 5 angegeben Zeitintervalle:

Tabelle 5: Thermocycler-Einstellungen für die Durchführung der TaqMan-PCR

95°C

5

min

95°C

30

s

###

### 45 Zyklen

65°C

1

min

###

4°C

2.3 Definition der invasiven Aspergillose

Die Patienten werden hinsichtlich des Verdachts, an einer invasiven Aspergillose erkrankt zu sein, in verschiedene Gruppen unterteilt. Da das klinische Bild stark variiert, ist ein standardisiertes Schema, aufbauend auf festgelegte klinische und diagnostische Kriterien, für eine Einteilung unerlässlich. Als Grundlage dienen die im Jahr 2002 entwickelten Richtlinien derEuropean Organisation for Research and Treatment of Cancer (EORTC) und des National Institute of Allergy and Infectious diseases (IFICG) ( 35 ).

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Die Aufsplittung erfolgt in drei verschiedene Gruppen, die den Verdacht einer invasiven Aspergillose in möglich, wahrscheinlich und bewiesen unterteilen. Hiernach gilt: Eine invasive Aspergillose ist als bewiesen anzusehen, wenn der histopathologische oder zytopathologische Nachweis von Aspergillus-Hyphen in Biopsaten oder Sektionsmaterial gelingt. Ebenfalls als bewiesen gilt der Nachweis von Aspergillus-Wachstum in der Kultur aus primär sterilem Gewebe in Kombination mit klinischen oder radiologisch auffälligen Befunden (Abbildung 9).

Abbildung 9:
Flussdiagramm zur Bewertung einer bewiesenen invasiven Aspergillose

Sollten keine Nachweise in der oben angegebenen Form erbracht werden können, so erfolgt die weitere Abschätzung der Situation an Hand bestimmter laborchemischer, mikrobiologischer sowie klinischer Parameter. Letztere werden in Major- und Minorkriterien unterteilt. Anhand der Tabelle 7 lässt sich eine mögliche oder wahrscheinliche invasive Aspergillose-Infektion unter Beachtung der Gesichtspunkte in Tabelle 6 definieren.

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Tabelle 6: Parameter, die für die Einteilung in eine wahrscheinliche oder mögliche invasive Aspergillos beachtet werden müssen.

Für eine mögliche oder wahrscheinliche Aspergillose-Infektion muss jeweils ein Wirtskriterium nachweisbar sein.

Eine wahrscheinliche invasive Aspergillose-Infektion liegt vor, wenn zusätzlich zwei Parameter nachgewiesen werden können:

  • mindestens ein mikrobiologisches Kriterium
  • mindestens ein klinisches Major Kriterium oder zwei klinische Minor-Kriterien.

Eine mögliche invasive Aspergillose-Infektion liegt vor, wenn zusätzlich ein Parameter nachgewiesen werden kann:

  • mindestens ein mikrobiologisches Kriterium oder mindestens ein klinisches Major-Kriterium oder zwei klinische Minor Kriterien.

Tabelle 7: Kriterien zur Einteilung in die Gruppen der wahrscheinlichen oder möglichen invasiven Aspergillus-Infektionen (modifiziert nach Ascioglu et al. 2002).

1)

Wirtskriterien:

Neutropenie < 500 Neutrophile/mm3 für > 10 Tage

Refraktäres Fieber > 4 Tage unter Therapie mit Breitspektrum-Antibiotika

Körpertemperatur > 38°C oder < 36°C und einer der folgenden Risikofaktoren:

  • Anhaltende Neutropenie (> 10 Tage) innerhalb der letzten 60 Tage
  • Starke Immunsuppressiva innerhalb der letzten 30 Tagen
  • Zurückliegende bewiesene oder wahrscheinliche Pilzinfektion
  • AIDS-Infektion

Zeichen und Symptome einer Graft-versus-Host-Disease

Kortikostroid-Therapie > 3 Wochen in den letzten 60 Tagen

2)

Mikrobiologische Kriterien:

Positive Kultur/Zytologie von Aspergillus aus Bronchiallavage oder Sputum

Nachweis von Aspergillus-Antigen in der Bronchiallavage oder in einer Blutprobe

3)

Klinische Kriterien:

3a)

Infektion des unteren Respirationstrakts:

Major:

Minor:

  • „halo-sign“, „air-crescent-sign“ oder Hohlraum innerhalb einer Konsolidierung in der Computertomographie
  • Symptome einer Infektion der unteren Atemwege: Husten, Dyspnoe, Brustschmerz, Hämoptysen, Pleurareiben
  • Radiologische Infiltrate, die nicht den Majorkriterien zugeordnet werden können

3b)

Sinonasale Infektion:

Major:

Minor:

  • Radiologischer Nachweis einer Infektion im Sinonasal-Trakt
  • Symptome einer Infektion der oberen Atemwege bei fehlendem radiologischem Nachweis
  • Ulcerationen/Nekrosen der Nasen-/Mundschleimhaut
  • Epistaxis
  • Periorbitale Schwellung

3c)

Infektion des ZNS’:

Major:

Minor:

  • Radiologischer Nachweis einer ZNS-Infektion
  • Symptome einer ZNS-Infektion bei fehlendem radiologischem Nachweis:
  • Hemiparese, Hirnnervenausfälle und andere fokale Symptome
  • Mentale Veränderungen
  • Meningitische Zeichen
  • Liquorauffälligkeiten

3d)

Disseminierte Pilz-Infektion:

Major:

Nachweis papulöser/nodulärer Hauteffloreszenzen, intraokulare Veränderungen, Leber-, Milz-Streuherde

ZNS = zentrales Nervesystem


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06.09.2007