4 Diskussion

4.1  Patienteneinteilung

↓63

Sämtliche untersuchten Patienten wurden zur Evaluierung nach den von Ascioglu et al. [35] aufgestellten Kriterien in die Kategorie der bewiesenen, wahrscheinlichen, möglichen oder keinen invasiven Aspergillose eingeordnet. Dazu wurden die Kriterien hinsichtlich der Spezifizierung für den Aspergillus-fumigatus-Nachweis abgeändert. Diese Kriterien wurden 2002 als Gemeinschaftsarbeit von der EORTC/IFICG und von der National Institute of Allergy and Infectious Mycoses Study Group aufgstellt. Ziel dieser Einteilung von Patienten in definierte Gruppen, ist die Verbesserung der klinischen Forschung auf dem Gebiet der invasiven Mykosen durch einheitliche vergleichbare Maßstäbe. Bei der Einteilung der Patienten in der vorliegenden Arbeit fiel auf, dass zwischen den beiden Gruppen der bewiesenen und der wahrscheinlichen invasiven Aspergillose und den beiden Gruppen der möglichen und der nicht an invasiver Aspergillose Erkrankter, ein deutliches Ungleichgewicht zugunsten der letzten beiden Gruppen festgestellt werden konnte. Viele Patienten wurden aufgrund fehlender, oft schwer zu erhaltener, mikrobiologischer und histologischer Aspergillus-Nachweise in die Stufe der möglichen Aspergillose eingeteilt. Bei nur wenigen kann die invasive Aspergillose nachgewiesen werden. Ungleiche Gruppengrößen bergen den Nachteil, dass geringfügige Veränderungen innerhalb der anzahlmäßig kleinen Gruppen, große Auswirkungen auf die diagnostische Auswertung einer Methode haben können (Kapitel 4.3). Das hat zur Folge, dass ein klinischer Vergleich verschiedener Methoden schwer zu bewerten ist, auch wenn die vorherige Einteilung der Patienten nach einem einheitlichen Schema vorgenommen wurde. Subirà et al. [60] überprüft die von Ascioglu et al. [35] aufgestellten Kriterien an Hand von 22 Patienten, bei denen in der Autopsie eine invasive Aspergillose nachgewiesen werden konnte. Von diesen Patienten wurden im Vorfeld zwei der bewiesenen, sechs der wahrscheinlichen und 13 der möglichen invasiven Aspergillose zugeordnet. Diese Publikation verdeutlicht die in der Einleitung beschriebenen Schwierigkeiten, eine invasive Aspergillose prae mortem zu erkennen.

4.2 Molekularbiologische Diagnostik

4.2.1  DNS-Extraktionsverfahren

In der Literatur werden viele Extraktionsmethoden beschrieben wie sich die stabile Zellwand der Aspergillen durchbrechen lässt. Die verschiedenen Methoden beruhen auf der mechanischen, chemischen, enzymatischen oder thermischen Lyse der Zellwand. Dabei werden im Allgemeinen mehrere Verfahren kombiniert. So setzt Haynes et al. [ 61] ein chemisch-toxisches Verfahren unter der Verwendung von Phenol und Chloroform ein. Einsele [ 62], Sandhu [50] and Williamson et al. [ 63] beschreiben die Methode der Kombination aus chemischer und enzymatischer Lyse. Dabei wird unter Einwirkung von Proteinase K und Zymolase sowie weiteren chemischen Reagenzien eine Zerstörung der Pilzwände erreicht. Einsele et al. [62] ergänzte das Verfahren um eine alkalische Behandlung mit Natriumhydroxid. Der zeitliche und materielle Aufwand dieser Methoden ist durch eine Vielzahl an Wasch- und Lyseschritten hoch. Zudem findet häufig der Einsatz toxischer Reagenzien statt. Zusätzlich bergen häufige Wechsel und häufiges Öffnen der Reaktionsgefäße die Gefahr der Kontamination [64]. Vergleichsversuche mit einem erweiterten enzymatisch-chemischen Extraktionsverfahren (Dynabeads, Kapitel 3.2.1) wurden durchgeführt. Die Dynabeads bringen zwar einen Zeitvorteil gegenüber der reinen enzymatisch-chemischen Methode, jedoch kann mit einer Nachweisgrenze mit umgerechnet 104KBE/ml in der vorliegenden Arbeit keine zufriedenstellende Sensitivität erreicht werden [55].

Beschriebene mechanische Verfahren beinhalten die Zerstörung der Zellwände entweder durch sterile Glaskügelchen oder durch eine kommerziell hergestellte aus festen Bestandteilen bestehende Matrix [56]. Das Ziel ist, die stabile Zellwand der Aspergillen durch die Einwirkung physikalischer Kräfte in Kombination mit einem Lysepuffer zu Durchbrechen. Trotz zusätzlicher Wasch- und Lyseschritte besteht dieses Kombinationsverfahren aus weniger Arbeitsschritten, so dass der zeitliche und materielle Aufwand geringfügiger ist. Die Kontaminationsgefahr wird durch weniger Arbeitsschritte herabgesetzt. Die Glaspartikel-Methode („glassbeads“) wird von Hopfer [48], Hayette [ 65], Rantakokko-Jalava [76], Tang [ 66] und Yamakami [ 67] et al. angewendet. Dabei kann Rantakokko-Jalava et al. durch die einminütige Vorbehandlung der Proben mit „glassbeads“ die Sensitivität der anschließenden Phenol-Chloroform-Extraktion verbessern (Kapitel 4.2.2). Die Anwendung einer kommerziell hergestellten Matrix zur Zerstörung der Zellwände wird 1998 von Müller et al. [56] publiziert. Er kann mit seiner Methode im Vergleich mit der Phenol-Chloroform-Extraktion eine mehr als doppelt so hohe DNS-Ausbeute für den Aspergillus fumigatus nachweisen (29,9µl/ml versus 10,2µl/ml aus 107KBE/ml). Dabei werden mittels Einsatz einer Lysing Matrix und Bearbeitung der Proben im FastPrep cell disrupter durch die Einwirkung von Scherkräften, die Zellwände aufgespalten. Eine Sensitivitätsbestimmung wird nicht durchgeführt. Die zusätzliche Schnelligkeit dieser Methode, mit der zwölf Proben innerhalb einer Stunde extrahiert werden können und der damit verbundene geringere Arbeitsaufwand im Gegensatz zu anderen Extraktionsmethoden (Phenol-Chloroform mindestens 4h, Dynabeads 2,5h, Qiagen 3h) führte, neben der hohen Effizienz der DNS-Ausbeute, zu der Entscheidung, das hier eingesetzte Extraktionsverfahren nach dieser Methode durchzuführen. Verschiedene Kombinationen der Lysing Matrix wurden getestet. Dabei erwies sich nur eine Kombination („Sphere und Garnet“) als geeignet, Aspergillus-fumigatus-DNS nachzuweisen. Zusätzlich erfolgte eine Verlängerung der mechanischen Behandlung im FastPrep cell disrupter durch zweimalige Wiederholung des Vorganges sowie eine Verstärkung der einwirkenden Scherkräfte durch Erhöhung der Geschwindigkeit bis auf ein Maximum von 5,5m/s. Beides führt zu einer Erhöhung der DNS-Ausbeute (Abbildung 11). Zum Nachweis der unteren Detektionsgrenze wurden Verdünnungsreihen getestet.

4.2.2 Sensitivität

↓64

Die Angabe von kolonie-bildenden Einheiten (KBE) bei den Aspergillen aufgrund ihres flächenhaften Wachstums ist schwierig [4]. Zur Bestimmung der Konzentration wird eine vorher homogenisierte Suspension mit enthaltenem Aspergillus-Mycel photometrisch auf einen McFarland-Faktor abgeglichen und dann in KBE umgerechnet [ 68]. Aus der Angabe „kolonie-bildende Einheiten“ kann die Menge an genomischer DNS abgeschätzt werden [68]. Problematisch gestaltet sich die Homogenisierung des Mycels in der physiologischen Kochsalzlösung, um einen genauen Wert der optischen Dichte zu erhalten. Durch das Vorhandensein noch kleinster Partikel kann je nach Messungszeitpunkt eine andere optische Dichte bestimmt werden, so dass es zu Schwankungen der Werte zwischen den folgenden Verdünnungsreihen kommen kann. Dieser Problematik wird versucht, durch ausgiebiges Zermörsern, entgegen zu gehen. Letztendlich müssen diese Schwierigkeiten und damit verbundenen Schwankungen beim Auswerten einer Verdünnungsreihe berücksichtigt werden. Da weder für die Erstellung von Aspergillus-spezifischen Verdünnungsreihen, noch für die Extraktion standardisierte Vorgaben existieren und die Extraktion schwierig ist, existieren wenig vergleichbare Angaben in der Literatur. Ein Vergleich mit anderen Autoren ist kritisch zu betrachten. Aufgrund der einfacheren Homogenisierung werden Verdünnungsreihen häufig mit Candida albicans durchgeführt. Loeffler et al. [55] verglich 1997 Sensitivitäten von fünf verschiedenen Extraktionsverfahren mit der hausinternen enzymatisch-chemischen Methode. Die dafür verwendeten Verdünnungsreihen wurden aus Candida-albicans-Suspensionen gewonnen. Es konnten Sensitivitäten von 1 bis 103KBE/ml nachgewiesen werden. Die hauseigene Methode und der QIAmp Tissue Kit (Qiagen) wurden mit 1 bis 101KBE/ml, die Dynabeads mit 102KBE/ml publiziert. Rantakokko-Jalava et al. verglich 2003 verschiedene Extraktionsmethoden, darunter die Phenol-Chloroform-Extraktion. Als Ausgangsmaterial diente eine Aspergillus-fumigatus-Suspension. Die erreichte Sensitivität wird von 102 bis 105KBE/ml angegeben. Hier lag die Sensitivität des Qiagen-Kits bei 104KBE/ml. Die klassische Phenol-Chloroform-Extraktion wurde ohne Vorbehandlung mit Glaskügelchen mit 103KBE/ml, nach einminütiger Vorbehandlung mit 102KBE/ml publiziert. Costa et al. [74] und Loeffler et al. [ 69] publizierten 2002 ein automatisiertes Extraktionsverfahren mit dem MagNA Pure LC System mit anschließender real-time-PCR im LightCycler. Für dieses Verfahren kann Loeffler et al. [69] eine Detektionsgrenze von 1KBE/ml für Aspergillus-fumigatus nachweisen.

Die Sensitivität der hier vorgestellten Extraktionsmethode liegt für die Extraktion von Aspergillus fumigatus bei einer unteren Nachweisgrenze von 101KBE/ml. Verglichen mit den hier angegebenen Daten ist die Grenze sehr niedrig. Angaben in der Literatur mit dem FastPrep cell disrupter zur Sensitivitätsbestimmung aus Verdünnungsreihen von Aspergillus-fumigatus liegen nicht vor und können daher nicht angegeben werden. Die Frage ist, ob sich das Erreichen einer sehr niedrigen Sensitivitätsstufe hinsichtlich der Untersuchung von Bronchiallavagen nachteilig auswirken kann. Durch den Nachweis kleinster DNS-Mengen besteht die Gefahr, viele Patienten mit nur geringfügiger Aspergillus-fumigatus-Besiedlung nachzuweisen. Da der Aspergillus in Form von Sporen ubiquitär in unserer Umgebung vorkommt und er von Gesunden und Kranken gleichermaßen inhaliert wird, könnten diese Keimmengen ausreichen, um einen Aspergillus-fumigatus-DNS-Nachweis zu erbringen, obwohl keine Erkrankung vorliegt. Es könnte somit eine hohe Anzahl an falsch-positiven Befunden provoziert werden. In der vorliegenden Arbeit liegt die Rate an falsch-positiven Befunden bei 4,3% (5/105 Proben) und ist damit verhältnismäßig niedrig (Kapitel 4.3), so dass sich der hier vermutete Nachteil in der Detektion kleinster DNS-Mengen innerhalb der untersuchten Patienten nicht bestätigt. Sollte eine Erweiterung des Verfahrens auf die Untersuchung von Blutproben erfolgen, so erweist sich eine sehr niedrige Detektionsgrenze als äußerst sinnvoll, da die Pilzlast im Blut bei Patienten mit histologisch gesicherter Aspergillose von Loeffler et al. [68] mit 1 bis 10KBE/ml Blut beschrieben wird. Die Sensitivitätsgrenze in der hier vorliegenden Arbeit erscheint für die klinische Arbeit in einem anwendbaren Bereich zu liegen. Weitere Sensitivitätsbestimmungen mit anderen Pilzstämmen und aus anderen Probenmaterialien sollten zu Erweiterung erfolgen.

4.2.3 TaqMan-PCR

Die Durchführung einer real-time-PCR mit der Möglichkeit der Quantifizierung des Ergebnisses für den Nachweis von Aspergillus-DNS wird in den letzten Jahren vermehrt angewendet [68,70,71,72,73, 74, 75, 76,78, 77]. Einer der Hauptvorteile dieser Methode ist die Verminderung falsch-positiver Ergebnisse, die auf eine Kontamination mit vorangehenden amplifizierten PCR-Produkten zurückzuführen ist. Durch das nicht mehr notwendige Öffnen der Reaktionsgefäße nach Amplifikation, wird die Gefahr der Carry-over-Kontamination an dieser Stelle deutlich reduziert. In der vorliegenden Arbeit konnte von insgesamt 34 Läufen, zweimal eine isolierte Kontamination einer Negativkontolle beobachtet werden. Ob es sich bei den insgesamt fünf falsch-positiven von insgesamt 105 Proben um Kontaminationen oder Kolonisationen handelt, kann letztendlich nicht entschieden werden. Der andere Vorteil gegenüber der konventionellen PCR ist die Quantifizierbarkeit der Ergebnisse. Einer der wichtigsten Punkte nach Erhalt des quantitativen Wertes ist die Aussagekraft dieses Wertes. Damit verbunden sind die Fragen, ob die Höhe des Wertes mit der Schwere der Erkrankung korreliert, ob sich an Hand der Veränderung der Werte das Anprechen einer antimykotischen Therapie kontrollieren lässt und ob zwischen vermuteter Kolonisation und Infektion unterschieden werden kann. In den hier durchgeführten Untersuchungen lässt sich ein Trend unter den Gruppen abzeichnen. Danach ist die größte Menge an Aspergillus-fumigatus-DNS in der Gruppe der bewiesenen invasiven Aspergillose gemessen worden. Schwieriger wird die Differenzierung innerhalb der anderen drei Gruppen, da die Unterschiede zwischen den Werten weitaus geringer sind. Die Werte innerhalb der Erkrankung an einer möglichen Aspergillose liegen mehrfach über denen der Gruppe der wahrscheinlichen invasiven Aspergillose. Klare Grenzen lassen sich nicht ziehen. Eine eventuelle Kolonisation in der Gruppe der nicht an invasiver Aspergillose erkrankten Patienten lässt sich allein an Hand der Höhe eines positiven Wertes nicht bestimmen. Über die gleiche Schwierigkeit, an Hand der Höhe der Werte zwischen Kolonisation und Infektion zu unterscheiden, berichtet Rantakokko-Jalava et al. [76]. Bowman et al. [70] weist 2003 im Mausmodell Aspergillus-fumigatus-DNS mittels TaqMan-PCR nach. Dabei werden Mäuse mit disseminierter Aspergillose antimykotisch behandelt. Nach antimykotischer Behandlung kann eine Rückläufigkeit der zuvor gemessenen Aspergillus-fumigatus-DNS in Gewebeproben der Niere nachgewiesen werden. In der hier vorliegenden Arbeit konnte ein Rückgang der Werte nach antimykotischer Therapie bei einem Patienten beobachtet werden. Dabei handelte es sich um die Untersuchung von Bronchiallavagen. Bei der äußerst geringen Anzahl an fortlaufenden Proben eines Patienten, kann über die Zuverlässigkeit, mit der eine antimykotische Therapie auf diesem Weg kontrolliert werden könnte, jedoch keine sichere Aussage gemacht werden. Die fehlende Anzahl fortlaufender Proben sind dadurch bedingt, dass die notwendigen Untersuchungen wie Bronchoskopie oder z. B. die Punktion seröser Höhlen risikoreich und wenn überhaupt, nur einmal, aber sehr selten mehrmals durchführbar sind. Um weitere Aussagen treffen zu können, sind Untersuchungen einer größeren Patientengruppe und die Untersuchung fortlaufender Proben (wie z. B. Blutproben) erforderlich.

4.2.4 Primer- und Sondenauswahl, Spezifität

↓65

Der Aspergillus-fumigatus ist der am weitesten verbreiteteste Erreger der invasiven Aspergillose [1]. Da das Anlegen von Kulturen kein verlässlicher und ein langwieriger Vorgang ist, wird in dieser Arbeit die Spezifizierung des Aspergillus-fumigatus mittels TaqMan-PCR durch Einführung eines speziellen Primerpaars, in dessen Amplfikat eine gewählte Sonde ansetzt, vorgenommen. Brandt et al. [ 78] ermittelt 1998 mittels Durchführung einer RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA) Aspergillus fumigatus spezifische Gensequenzen und konstruiert ein Primerpaar, das in einer dieser Sequenzen ansetzt und das ein Aspergillus-fumigatus-spezifisches Fragment von 864 Basenpaaren amplifiziert. Das in der vorliegenden Arbeit angewandte Primerpaar setzt an einer dieser spezifischen Gensequenzen an und amplifiziert ein aus 212 Basenpaaren bestehendes Fragment. Dabei werden die Primer als spezifisch für verschiedene Aspergillus-fumigatus-Stämme getestet. Aufgrund der Vielfalt an Aspergillus-Spezies, auch innerhalb der Gruppe der Aspergillus-fumigatus-Gruppe, kann wegen der nur begrenzten Auswahl an im Labor zur Verfügung stehender Stämme, die Aussage über die Spezifität lediglich für diese Auswahl getroffen werden.

Die Frage ist, ob hinsichtlich der Anwendung in der klinischen Diagnostik, die hier gewählte Spezifität ein zu enges Erregerspektrum erfasst. Hayette und Tang et al. [65, 66] erfassten zusätzlich zum Aspergillus fumigatus den Aspergillus flavus. Von insgesamt über 200 Patienten ließ sich bei zwei Patienten (Bronchiallavagen) kulturell ein Aspergillus flavus nachweisen. In der PCR ließ sich einmal jedoch nur ein Aspergillus flavus nachweisen. Spiess et al. [ 79] untersuchte zwölf Bronchiallavagen von elf Patienten mit bewiesener oder wahrscheinlicher invasiver Aspergillose mittels LightCycler-PCR. Dazu werden ein Primerpaar und eine Aspergillus-fumigatus-spezifische Sonde eingesetzt. Bei allen untersuchten Proben ließ sich Aspergillus-fumigatus-DNS nachweisen. Spreadbury et al. [80] konnte bei insgesamt drei bestätigten invasiven Aspergillosen, dreimal Aspergillus-fumigatus-DNS mittels PCR unter Einsatz eines Aspergillus-fumigatus-spezifischen Primerpaars, in Bronchiallavagen nachweisen.

In der klinischen Diagnostik einer invasiven Aspergillose erscheint der spezifische Nachweis von Aspergillus-fumigatus-DNS als sinnvoll, da in der Literatur wiederholt der Aspergillus fumigatus als Hauptverursacher dieser Erkrankung nachgewiesen kann. Eine Erweiterung der Diagnostik hinsichtlich des Nachweises von anderen Aspergillus-Spezies sollte jedoch erwogen werden. Problematisch gestaltete sich die Bewertung bei ausbleibendem Nachweis der Aspergillus-fumigatus-DNS, verbunden mit nicht eindeutigen Begleitbefunden eines Patienten, wie es in der Gruppe der möglichen invasiven Aspergillose vorkommt. Hier könnte der Nachweis eines noch breiteren Erregerspektrums zur weiteren Diagnosefindung beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde zu 91% parallel eine Panfungus-PCR durchgeführt. Hierbei zeigt sich, dass jede vierte Probe (25,7%), die in der TaqMan-PCR negativ ist, einen positiven Wert in der Panfungus-PCR aufweist. In der parallel angelegten Kultur ließ sich in über 50% der Fälle Candida-Spezies nachweisen, davon mit fast 80% führend der Candida albicans. Aber auch bei Proben, die in der TaqMan-PCR positiv sind, ließen sich in parallel dazu angelegten Kulturen Candida-Spezies nachweisen. Um zwischen zusätzlicher Erkrankung und Kolonisation unterscheiden zu können, wäre eine weitere Spezifzierung der Panfungus-PCR erforderlich. Eine Spezifitätstestung der Aspergllis-fumigatus-spezifischen Primer mit verschiedenen Candida-Speziesist erfolgt. Da keine Amplifikation von Candida-DNS nachgewiesen werden konnte, ist eine Kreuzreaktion mit den getesteten Candida-Spezies nicht wahrscheinlich. Da die Unterscheidung zwischen Aspergillus- und Candida-Spezies in der klinischen Anwendung therapeutische Konsequenzen nach sich ziehen würde, sollte eine Erweiterung des Erregerspektrums der TaqMan-PCR zum Nachweis von Candida albicans oder verschiedenen Candida-Spezies, in Betracht gezogen werden.

4.2.5 Probenmaterial

↓66

Über 83,5% der Proben entstammten dem Respirationstrakt. Darunter befanden sich 78,3% bronchoalveoläre Lavagen. Bei allen acht Patienten mit einer bewiesenen invasiven Aspergillose ließ sich Aspergillus-fumigatus-DNS nachweisen. Darunter in sieben Bronchiallavagen, zwei Trachealsekreten und zwei Lungenbiopsaten. Der Nachweis in einem Leberbiopsat bei bewiesener disseminierter Aspergillose gelang, allerdings mit einem deutlichen Quantitätsverlust (Lungenbiopsat 563.000 Kopien versus Leberbiopsat 50 Kopien), ob dieser auf eine geringere Aspergillus-fumigatus-Konzentration in diesem Gewebe oder auf eine schlechtere Extrahierbarkeit des Gewebes zurückzuführen ist, lässt sich nicht klären. Weitere Leberbiopsate wurden nicht untersucht. Problematisch erscheint der Nachweis von Aspergillus-fumigatus-DNS im Pleurapunktat. Hier konnte in beiden Punktaten bei bewiesener disseminierter bzw. pulmonaler invasiver Aspergillose keine Aspergillus-fumigatus-DNS nachgewiesen werden. Das könnte einerseits mit dem Zeitpunkt der Probenentnahme zusammenhängen, da diese post mortem stattfand. Die andere Möglichkeit ist die fehlende Verbreitung des Aspergillus-fumigatus in der Pleuraflüssigkeit. Der Nachweis einer zerebralen Aspergillose im Liquor konnte durch das hier angewendete Verfahren in der Liquoruntersuchung mit einem Wert von 520.000 Kopien bestätigt werden. Über die Zuverlässigkeit kann bei nur einer Liquorprobe eines Patienten mit bewiesener Aspergillose nicht geurteilt werden. Der Nachweis von Aspergillus-fumigatus-DNS aus anderen Materialien wie Hornhautabradat war möglich, kann jedoch bei ebenfalls nur einer Probe eingeschränkt bewertet werden.

4.3 Testvalidität/Resultatvalidität

Die Beurteilung der Validität der in dieser Arbeit angewendeten Methode gestaltet sich schwierig, da es sich bei der relativ großen Gruppe der Patienten mit möglicher invasiver Aspergillose um Patienten handelt, bei der man letztendlich nicht entscheiden kann, ob bei ihnen eine invasive Aspergillose vorliegt. Unter Ausschluss dieser fraglichen Gruppe kann eine diagnostische Sensitivität zu 81,3% erreicht werden. Unter zusätzlichem Ausschluss der Patientengruppe der wahrscheinlichen invasiven Aspergillose liegt eine Sensitivität von 100% vor, d. h., jede bewiesene Aspergillose wird auch als solche erkannt.

Die diagnostische Spezifität hingegen liegt bei 93,7% und ändert sich bei Einbeziehung oder Ausschluss der Gruppen der möglichen und wahrscheinlichen Aspergillosen aufgrund der stets gleichbleibenden Zahl der als gesund betrachteten Patienten nicht.

↓67

In der Literatur werden unterschiedliche Ergebnisse beschrieben [ 81]. Diese lassen sich aufgrund verschiedener Faktoren schwer miteinander vegleichen. Ein Punkt ist die unterschiedliche Patientenanzahl, die untersucht wurde. Ein weiterer Punkt, die Kriterien, nach denen die untersuchten Patienten ausgewählt wurden und ein weiterer entscheidender Punkt beinhaltet die Bewertung der Patienten hinsichtlich der Erkrankung an einer invasiven Aspergillose. Da die von Ascioglu et al. [35] aufgestellten Kriterien erst seit ca. drei Jahren vorliegen, gab es vorher keine „sogenannte“ Standardeinteilung, nach der Patienten im Rahmen der klinischen Forschung eingeteilt werden konnten. Unter Berücksichtigung der genannten Faktoren werden folgende unterschiedliche Ergebisse beschrieben: So untersuchte Tang et al. 1993 [66] mittels PCR bronchoalveoläre Lavagen von 51 Patienten auf Aspergillus fumigatus und flavus. Vier Patienten wurden nach hausinternen Kriterien in die Gruppe der bewiesenen und wahrscheinlichen, ein Patient in die Gurppe der möglichen und die übrigen in die Gruppe der nicht invasiven Aspergillose eingeteilt. Es lässt sich (unter Einbeziehung der bewiesenen und der wahrscheinlichen Aspergillose) eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 94,4% ermitteln. Jones et al. [ 82] untersucht 1998 die Bronchiallavagen von 69 Patienten mittels PCR-ELISA auf Aspergillus fumigatus, flavus, terreus und niger. Zwölf Patienten werden nach hausinternen Kriterien in die Gruppe der bewiesenen und wahrscheinlichen und 57 Patienten in die Gruppe der nicht invasiven Aspergillose eingeordnet. Die Sensitivität und die Spezifität werden mit jeweils 100% angegeben. Hayette et al. [65] untersuchte 2001 mittels „nested PCR“ die bronchoalveolären Lavagen von 177 Patienten auf Aspergillus fumigatus und flavus. Die Einteilung der Patienten erfolgt in bewiesene und wahrscheinliche Aspergillose (eine Gruppe) sowie in Kolonisation (diese Patienten wurden nicht in die Berechnung einbezogen) und in keine Aspergillose. Es wurde über eine Sensitivität von 100% sowie eine Spezifität von 96% beobachtet. Buchheidt et al. [ 83] untersuchte 2001 mittels „nested PCR“ die Bronchiallavagen von 67 immunsupprimierten Patienten auf Aspergillus Spezies und kann eine Sensitivität von 100% sowie eine Spezifität von 92,6% feststellen. Dabei werden 13 Patienten in die Gruppe der bewiesenen und wahrscheinlichen Aspergillose zusammengefasst. Die übrigen Patienten gehören der Gruppe der nicht invasiven Aspergillose zu.

Zusätzlich zu beachten ist, dass wegen der geringfügigen Patientenzahlen in den Gruppen der bewiesenen und der wahrscheinlichen invasiven Aspergillose im Verhältnis zur oft weitaus größeren Gruppe der nicht an einer invasiven Aspergillose erkrankten Patienten, kleine Differenzen innerhalb der einzelnen Patientenergebnisse große Auswirkungen auf das Gesamtergebnis der diagnostischen Gütekriterien haben können. Bei Betrachtung der Literatur liegt der Wert der in der vorliegenden Arbeit festgestellten diagnostischen Sensitivität (für die bewiesene und wahrscheinliche invasive Aspergillose) von 81,3% häufig unter den angegebenen Werten.

Insgesamt wurden in der Gruppe der wahrscheinlichen Aspergillose vier falsch-negative Proben (von drei Patienten) beobachtet. Patient Nr. 16 (Tabelle 11) der Gruppe der wahrscheinlichen Aspergillose war zum Zeitpunkt der Probenentnahme bereits zwei Tage antimykotisch behandelt. Der Wert in der TaqMan-PCR ist negativ. In der Kultur ließ sich ein Wachstum von Aspergillus fumigatus feststellen. Da bei zwei anderen Patienten (Nr. 6 und Nr. 8, Tabelle 10) mit bewiesener Aspergillose rückläufige Werte bis unter den Schwellenwert nach antimykotischer Therapie beobachtet werden konnten, könnte die antimykotische Therapie den fehlenden Nachweis bei Patient Nr. 16 erklären. Bei zusätzlich klinischen Auffälligkeiten mit röntgenologischen und computertomographischen Aspergillus-verdächtigen Rundherden ist weder eine Kontamination der Kultur, noch eine Kolonisation wahrscheinlich. Weiter zu erwägen ist bei positver Panfungus-PCR die (zusätzliche) Infektion mit einer anderen Pilzspezies, die mit der angelegten Kultur nicht erfasst wurde. Bei einer weiteren Patientin (Nr. 14, Tabelle 11) mit einer wahrscheinlichen invasiven Aspergillose liegt als Grunderkrankung eine chronische Granulomatose vor. In der Kultur ließ sich in einer von zwei Bronchiallavagen Aspergillus-fumigatus-Wachstum nachweisen. Die untersuchten Proben zeigten einen negativen TaqMan-Wert bei positiver Panfungus-PCR. Da in der Kultur zusätzlich ein Wachstum von Candida albicans beschrieben werden konnte, liegt der Verdacht einer zusätzlichen Infektion mit diesem Pilz nahe. Eine andere Möglichkeit ist die Kontamination der angelegten Kulturen durch aerogene Aspergillus-Sporen, jedoch ist diese Möglichkeit bei zusätzlich röntgenologisch Aspergillus-verdächtigen Auffälligkeiten fraglich. Eine weitere Erklärung könnte eine Aspergillose durch eine andere Aspergillus-Spezies als Aspergillus fumigatus sein. Der Nachweis von Aspergillus nidulans bei Patienten mit chronischer Granulomatose wird wiederholt beschrieben [84]. Ein durchgeführter Antigen-Test aus der Bronchiallavage und aus dem Serum für Aspergillus fumigatus bleibt wiederholt negativ. Verweij et al. [ 85] beschrieb den Fall eines Patienten mit ebenfalls chronischer Granulomatose, bei dem trotz bewiesener invasiver Aspergillose wiederholt weder Aspergillus-DNS noch zirkulierendes Antigen im Serum nachgewiesen werden konnte. Hier gelingt jedoch zweimal der Antigen-Nachweis im Aspirat eines Aspergillus-Rundherdes. Letztendlich kann der fehlende Nachweis nicht sicher erklärt werden. Ebenfalls unklar bleibt Patient Nr. 15 (Tabelle 11), bei dem trotz Aspergillus-fumigatus-Wachstum in der Kultur und klinischer Erfüllung eines Wirtskriteriums und zwei Majorkriterien kein relevanter Wert in der TaqMan-PCR gemessen werden konnte. Bei positiver Pan-Fungus-PCR könnte in diesem Fall eine Kontamination der Kultur mit Aspergillus-Sporen, bei Erkrankung durch einen anderen fungalen Erreger vorliegen, der kulturell nicht erfasst wurde.

↓68

In der Gruppe der nicht invasiven Aspergillose beträgt die Anzahl an falsch-positiven Patienten 6,3%. In der Literatur werden wiederholt falsch-positive Befunde beschrieben. Der Anteil der falsch-positiven Befunde bei der Untersuchung von Bronchiallavagen liegt je nach Publikation bei 6,2% über 15,4% bis zu 18% [53, 83, 66]. Als Ursache werden Kolonisationen (z. B. bei zusätzlich positivem Sputum) [66], aber auch Kontaminationen vermutet [53]. Da sich die Anzahl der falsch-positiven Befunde bei den hier untersuchten Patienten auf die Risikopatienten mit einer hämatologischen Grunderkrankung beziehen, kann eine Kolonisation als Ursache für diese positiven Befunde angenommen werden.

4.4 Ausblick

Die Diagnose der invasiven Aspergillose ist, wie aus der Einleitung hervorgeht, heutzutage immer noch ein Problem. Ein Standbein in der Diagnostik werden die molekularbiologischen Methoden darstellen. Weiterhin fehlt es jedoch an standardisierten Verfahren. Zudem werden in der Bewertung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität noch deutliche Schwankungen beschrieben [65, 66, 81, 82, 83, siehe Kapitel 4.3), so dass die klinische Einsetzbarkeit beschränkt ist.

Unter den Extraktionsverfahren existieren eine Vielzahl kommerzieller und nicht kommerzieller [48, 50, 56, 61, 62, 63, 65, 66, 67] Methoden bezüglich der Aspergillus-Spezies, aber auch anderer Pilze. Costa [74] und Loeffler et al. [69] publizierten 2002 erfolgreich ein automatisches Extraktionsverfahren (MagNA Pure LC), mit dem 23 verschiedene Pilz-Spezies nachgewiesen werden können. Dieses könnte ein weiterer Schritt Richtung Vereinheitlichung auf kommerzieller Basis bedeuten.

↓69

Die Weiterentwicklung der PCR in Richtung der quantitativen real-time-PCR bietet hinsichtlich einer Minimierung des Kontaminationsrisikos deutliche Vorteile. Zusätzlich bietet die Quantifizierung unter anderem die Möglichkeit den Erfolg einer Therapie zu bewerten. Weitere Studien zur Anwendbarkeit in der klinischen Diagnostik sind erforderlich.

Ein anderes wichtiges diagnostisches Verfahren ist der Nachweis des Galactomannan Antigens mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Ein Vorteil dieses Verfahrens ist die kommerzielle Verfügbarkeit (Aspergillus Platelia) sowie die Möglichkeit standardisierter serologischer Berechnungen, die einen Vergleich mit verschiedenen Arbeitsgruppen ermöglichen. Ein Vergleich zwischen diesem Verfahren der Antigen-Bestimmung und der PCR wurde wiederholt mit unterschiedlichen Ergebnissen durchgeführt [46, 63, 74, 75, 86, 87, 88, 89, 90]. Die uneinheitlichen Egebnisse sind unter anderem auf verschiedene Testbedingungen, aber auch auf das nicht standardisierte Verfahren der PCR zurückzuführen. So berichten Becker [46] und Verweij et al. [90] über eine Überlegenheit des Galactomannan-ELISA. Bretagne et al. [86] beschreibt keinen bedeutenden Unterschied beider Verfahren. Hashimoto [88], Kawamura [89] und Williamson et al. [63] hingegen berichten über eine Überlegenheit der PCR gegenüber des Nachweises von Galactomannan. Kawazu et al. [75] vergleicht 2004 den ELISA mit der real-time-PCR und stellt eine Überlegenheit des Galaktomannan-Antigen-Nachweises fest. Dieser Vielfalt an Daten ist zu entnehmen, dass bis heute kein Verfahren isoliert als Optimum betrachtet werden kann. Vielmehr erscheint die Kombination beider Verfahren die Zuverlässigkeit der Diagnose einer invasiven Aspergillose zu erhöhen [65].


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06.09.2007