5 Zusammenfassung

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Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, eine Methode zum schnellen und quantitativen Nachweis von Aspergillus-fumigatus-DNS zu etablieren. Sie basiert einerseits auf dem Extraktionsverfahren mit dem FastDNA-Kit und andererseits aus der anschließenden real-time-PCR im ABI Prism 7700 Sequence Detection System. Die Extraktionsmethode zeichnet sich durch die Kombination eines enzymatisch-mechanischen Verfahrens mittels Einsatz einer kommerziellen Lysing Matrix und Bearbeitung im FastPrep cell disrupter aus und erwies sich im Vergleich mit dem enzymatisch-chemischen Verfahren hinsichtlich der Sensitivität als überlegen (104 versus 101 KBE/ml). In der anschließenden TaqMan-PCR erfolgte die Amplifikation und Detektion der extrahierten DNS in einem Arbeitsschritt, so dass Carry-over-Kontaminationen durch häufiges Öffnen der Reaktionsgefäße minimiert wurden. Die gleichzeitige Quantifizierung der Proben erfolgte an Hand Einsatz einer Standardreihe, die zuvor aus Aspergillus-fumigatus-DNS mittels Klonierung, Transformation und Plasmid-Isolierung erstellt wurde. Für die Spezifizierung wurden ein Primerpaar und eine fluoreszierende Sonde über die Gendatenbank ermittelt. Die Primer wurden als spezifisch für Aspergillus fumigatus getestet. Durch Untersuchung von Verdünnungsreihen konnte eine Sensitivität von 101KBE/ml erreicht werden. Die Durchführung des gesamten Vefahrens dauert etwa sechs Stunden, so dass ein Ergebnis innerhalb eines Arbeitstages vorliegen kann.

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Die Methode wurde an Hand von 204 Patienten klinisch evaluiert. In einem Zeitraum von drei Jahren werden insgesamt 269 Proben untersucht. Dabei handelte es sich zu 83,5% um Proben aus dem Respirationstrakt, darunter befanden sich 212 bronchoalveoläre Lavagen. 167 Proben wurden von hämatologischen/onkologischen Abteilungen der Charité Berlin bezogen, 31 entstammten dem Universitäts-Klinikum Eppendorf, Hamburg. 71 Proben wurden aus der Lungenfachklinik Heckehorn bezogen und als Vergleichskollektiv betrachtet. Der Nachweis von Aspergillus-fumigatus-DNS gelang aus verschiedenen Materialien, darunter Bronchiallavagen, Trachealsekreten, Bronchialsekreten, Lungenbiopsaten, einem Leberbiopsat, einer Liquorprobe sowie einem Hornhautabradat. Bei zwei Patienten mit bewiesener invasiver pulmonaler und disseminierter Aspergillose gelang der Nachweis aus Pleurapunktaten nicht.

Jeder Patient wurde an Hand klinischer Daten in eine bestimmte Gruppe, entweder in die Gruppe der bewiesenen, wahrscheinlichen, möglichen oder nicht vorhandenen invasiven Aspergillose, eingeteilt. Die höchsten Werte konnten innerhalb der Gruppe der bewiesenen Aspergillose gemessen werden. Die weitere Differenzierung zwischen den anderen Gruppen gestaltete sich bei nur noch geringfügigen Unterschieden zwischen den gemessenen Werten sowie höheren Werten in Gruppen mit geringerem Risiko als schwierig. 6,3% falsch-positive Patienten in der Gruppe der nicht invasiven Aspergillose ließen an eine Kolonisation denken. Diese lässt sich nicht an Hand der Höhe des Wertes erkennen. Eine Kontamination konnte nicht ausgeschlossen werden. Die diagnostische Sensitivität beträgt unter Ausschluss der Patienten mit möglicher invasiver Aspergillose 81,3%, die Spezifität 93,7%. Der positive prädiktive Wert liegt bei 72,2%, der negative prädiktive Wert bei 96,1%.

Bei etwa 90% der Patienten wurde parallel eine Panfungus-PCR durchgeführt. Etwa jeder vierte (25,7%) in der TaqMan-PCR negative Wert, wies hier ein positives Signal auf, so dass eine Erweiterung des Keimspektrums erwogen werden sollte.

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Mit der hier angewendeten Methode lässt sich schnell und zuverlässig Aspergillus-fumigatus-DNS aus Bronchiallavagen und Gewebeproben isolieren. Die Bewertung der Ergebnisse reicht allein jedoch nicht aus, um eine zuverlässige Diagnose zu stellen, bzw. um zwischen Kontamination und Kolonisation zu unterscheiden. Als zusätzlicher Baustein in einer umfangreicheren Gesamtdiagnostik, die für das Erkennen einer invasiven Aspergillose unerlässlich ist, kann sie einen Beitrag zur Verbesserung molekularer Nachweisverfahren leisten.


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06.09.2007