Nachweis von Aspergillus-fumigatus-Infektionen aus dem Respirationstrakt mittels TaqMan-PCRCarola Scheer11.111.2234561.37891.4101122.12.1.111623#4102.1.2122.1.313623#33314627#32915623#3032.22.2.12.2.2161718623#4982.2.3192021222.2.42.2.5232.2.62.2.6.12425362#732.2.6.2262.2.6.3272.2.6.4282930520#5262.2.6.52.2.6.631620#31032332.334531#5343533.135363.23.2.137336#863839347#1163.2.240388#713.2.341423.2.43.2.4.1433.2.4.2443.2.4.3453.2.4.4617#43446625#3053.2.53.2.6473.33.3.1483.3.2493.3.2.1505152533.3.2.2543.3.2.3553.3.2.456555#378575#34757583.3.33.3.43.3.4.1593.3.4.260602#879609#8693.4613.4.13.4.23.4.3623.4.4621#28044.1634.24.2.14.2.2644.2.34.2.4654.2.5664.367684.4695697071671DanksagungKonferenzbeiträgeErklärung an Eides StattLiteraturverzeichnisdeInhaltsverzeichnisHilfe Ergebnisse
Patienteneinteilung

In die Untersuchung werden 269 Proben von 204 Patienten eingeschlossen. Davon werden 67 Patienten (71 Proben) aus der Lungenfachklinik Heckeshorn einem sogenannten Vergleichskollektiv zugeordnet. Diese Patienten unterliegen keiner hämatologischen Grunderkrankung. Nach den in Kapitel 2.3 festgelegten Kriterien werden 66 Patienten (98,5 %) als negativ hinsichtlich der Erkrankung an einer invasiven Aspergillose bewertet (siehe Kapitel 3.3.1). Ein Patient wird laut Kriterien der Erkrankung an einer möglichen invasiven Aspergillose zugeordnet.

Im Patientenkollektiv werden 198 Proben von 137 Patienten von verschiedenen hämatologischen/onkologischen Abteilungen (siehe Kapitel 2.1.2) untersucht. Bei insgesamt acht Patienten liegt eine histologisch gesicherte und damit bewiesene Aspergillose vor. Bei allen Patienten kann histologisch ein Aspergillus fumigatus nachgewiesen werden. Dabei handelt es sich im Einzelnen um sechs pulmonale invasive Aspergillosen, eine zerebrale Aspergillose sowie um einen Sonderfall einer lokalen Aspergillus-Infektion des Auges (Tabelle 10). Sechs von acht Patienten sind verstorben. Bei den beiden nicht an der Aspergillose-Infektion verstorbenen Patienten, handelt es sich um den Patienten mit der lokalen okulären Infektion sowie um einen Patienten mit einer invasiven pulmonalen Aspergillose. Ein detaillierter Verlauf dieser beiden Patienten folgt in Kapitel 3.3.4.

Weitere acht Patienten werden der Gruppe der wahrscheinlichen (Tabelle 11) und weitere 42 der Gruppe der möglichen invasiven Aspergillose zugeordnet (Tabelle 12). Bei 79 Patienten werden laut vorgegebenen Kriterien keine Zeichen einer invasiven Aspergillose gesehen (Tabelle 13).

Molekularbiologische Verfahren

Entwicklung der DNS-Extraktion

Es erfolgt zunächst die Etablierung eines geeigneten Extraktionsverfahrens, mit dem sich reproduzierbar DNS aus verschiedensten Untersuchungsmaterialien extrahieren lässt. Dafür wird ein enzymatisch-chemisches Verfahren mit einem enzymatisch-mechanischem Verfahren verglichen. Als initiales Ausgangsmaterial dient eine Pilzsuspension, bestehend aus einer in physiologischer Kochsalzlösung gelösten Aspergillus–fumigatus-Reinkultur (siehe Kap. 2.2.5).

Extraktion 1 (enzymatisch-chemisch):

Als Vergleich zur enzymatisch-mechanischen Extraktion wird eine etablierte enzymatisch-chemische Methode durchgeführt. Nach Durchführung dieses Verfahrens mittels Einsatz magnetischer beads (Dynabeads) lässt sich reproduzierbar DNS von verschiedenen Aspergilllus-Species (Aspergillus fumigatus DSM 790, DSM 819, DSM 63359, Aspergillus flavus ATCC 9643, Aspergillus niger ATCC 10535, Aspergillus terreus ATCC 10690, Aspergillus solani DSM 1164) extrahieren. In den anschließend getesteten Verdünnungsreihen zur Sensitivtätstestung lässt sich eine untere Nachweisgrenze von 104KBE/ml Aspergillus-fumigatus-DNS beobachten (siehe Abbildung 10).

Abbildung 10:
DSM 790: M: Marker VI, 1: McFarland 1, 2: McFarland 0,5 (entsprechend 106 KBE/ml), 3: 105 KBE/ml, 4: 104 KBE/ml, 5: 103 KBE/ml, bp = Basenpaare

Extraktion 2 (enzymatisch-mechanisches Verfahren):

Anschließend wird die Extraktion mit dem Schwerpunkt der mechanischen Aufspaltung der Zellwände unter Verwendung des FastPrep cell disrupters (BIO 101) durchgeführt. Die im dazugehörigen Kit enthaltene Lysing-Matrix enthält drei verschiedene Komponenten (Sphere, Cylinder und Garnet Matrix), aus denen verschiedene Kombinationen erstellt werden können. Es lässt sich durch den Einsatz von „Sphere und Garnet“ reproduzierbar DNS extrahieren. Mit allen anderen Kombinationen gelingt in der anschließenden PCR wiederholt keine DNS-Amplifikation.

Es wird versucht, eine Extraktion ohne den Zusatz des RCLB-Puffers durchzuführen, um die Gesamtdauer des Extraktionsvorgangs zu minimieren. Das Auslassen erweist sich jedoch als ineffektiv, da damit das vollständige Auswaschen des Hämoglobins nicht erreicht werden kann. In der anschließend durchgeführten konventionellen PCR lässt sich bei 25% der Proben weniger, bei allen anderen keine DNS amplifizieren. Ebenfalls der Versuch, die Lyse der Erythrozyten parallel zur Lyse der Leukozyten durchzuführen, bleibt erfolglos. In den Proben, die zeitgleich mit RCLB- und WCLB-Puffer inkubiert werden, kann in der folgenden PCR keine DNS amplifiziert werden.

Es werden verschiedene Geschwindigkeiten, mit denen die Proben im FastPrep cell disrupter bewegt werden, getestet. Bei 4,5 und 5m/s kann keine DNS nachgewiesen werden. Erst bei einer maximalen Geschwindigkeit von 5,5m/s kann Aspergillus-fumigatus-DNS isoliert werden. Wie die Abbildung 11 zeigt, kann die Effizienz der DNS-Ausbeute verbessert werden, wenn die Dauer des „Schüttelns“ auf das Dreifache, von initial 30 auf insgesamt 90s verlängert wird. Nach jeweils 30s wird wegen der entstehenden Reibungswärme eine Pause gemacht und das Probengut auf Eis gelagert.

Abbildung 11:
Extraktion mit verschiedenen Geschwindigkeiten bzw. Zeiten im FastPrep cell disrupter: 1 und 2: 3 x 30s, 5,5m/s, 3 und 4: 2 x 30s, 5m/s, 5 und 6: 2 x 30s 5,5m/s, M: Marker VI, 1: Aspergillus fumigatus (DSM 63359), 2: Aspergillus flavus (ATCC 9643),3: Aspergillus fumigatus (DSM 63359),4: Aspergillus flavus (ATCC 9643), 5: Aspergillus fumigatus (DSM 63359), 6: Aspergillus flavus (ATCC 9643), bp = Basenpaare

Sensitivität

Nach Herstellung der Verdünnungsreihen gelingt nach Durchführung der konventionellen PCR der Nachweis von Aspergillus-fumigatus-DNA bis zu einer Konzentration von umgerechnet 101KBE/ml (Abbildung 12).

Abbildung 12:
Verdünnungsreihe Aspergillus fumigatus, 1: 106KBE/ml, 2: 105KBE/ml, 3: 104KBE/ml 4: 103KBE/ml 5: 102KBE/ml 6: 101KBE/ml, 7: 100KBE/ml, 8: Negativkontrolle, 9: Positivkontrolle, M: Gewichtsmarker VI

Die für die Kalibrierung benötigte Standardkurve wird bis zu einer unteren Konzentration von 10 Kopien/2µl erstellt. In insgesamt fünf unabhängigen Testläufen kann eine untere Nachweisgrenze von 20 Kopien, entsprechend 0,1fg Plasmid-DNS erreicht werden (Tabelle 9). Zweimal (zu 40%) gelingt der Nachweis von 10 Kopien.

In Bezug auf die durch die Extraktion erreichte Sensitivität der Verdünnungsreihe, kann in der real-time-PCR eine untere Kopienzahl von 32 Kopien erreicht werden. Proben, die diesen Wert erreichen, werden als positiv bewertet.

 Spezifität der verwendeten Primer/Sonde

Die zur Etablierung der Methode eingesetzten Panfungus-Primer erfassen alle in der Tabelle 8 angegebenen Pilzspezies. Die Amplifikatlängen variieren zwischen 480 und 500 bp. Einzelne Bakterien, sowie humane DNS werden ebenfalls getestet. Hier kann entweder keine DNS oder nur ein unspezifisches Bandenmuster erzeugt werden.

Es erfolgt anschließend die Durchführung der PCR mit den Aspergillus-fumigatus-spezifischen Primern, sowie der Sonde. Die zur Erfassung der Aspergillus-fumigatus-DNS eingesetzten Primer und Sonde amplifizieren selektiv die im Labor vorhandenen registrierten Stämme der Aspergillus-fumigatus-Spezies: Aspergillus fumigatus DSM 790, DSM 819, DSM 63359.

Andere Stämme bleiben ohne positives Signal, dazu gehören Aspergillus flavus ATCC 9643, Aspergillus niger ATCC 10535, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamarii ATCC 10690, Aspergillus tamarii ATCC 10836, Aspergillus terreus ATCC 10690, Candida albicans ATCC 90028, Candida glabrata DSM 20614, Candida krusei DSM70065, Cryptococcus neoformans ATCC 34544, Fusarium solani DSM1164, Mucor sp. DSM 1222, Rhizopus oryzae DSM 853, Rhizopus oryzae DSM 905und Trichosporem cutaneum DSM 70675. Diese können nicht amplifiziert werden.

+ = DNS-Amplifikation, - = Keine DNS-Amplifikation.

Untersuchte Pilz-/bzw. Bakterienkultur

Panfungus Primer

Aspergillus- fumigatus -spezifische Primer/Sonde

Aspergillus flavus

+

-

Aspergillus fumigatus DSM 790

+

+

Aspergillus fumigatus DSM 819

+

+

Aspergillus fumigatus DSM 63359

+

+

Aspergillus niger

+

-

Aspergillus oryzae

+

-

Aspergillus tamarii

+

-

Aspergillus terreus

+

-

Candida albicans

+

-

Candida glabrata

+

-

Candida kefyr

+

-

Candida krusei

+

-

Candida parapsilosis

+

-

Cryptococcus neoformans

+

-

Fusarium solani

+

-

Mucor

+

-

Rhizopus oryzae I

+

-

Rhizopus oryzae II

+

-

Trichosporem cutaneum

+

-

Staphylococcus aureus

-

-

Pseudomonas aeruginsosa

unspezifisch

-

Tabelle 8: Spezifitäten der Panfungus-Primer versus Aspergillus fumigatus-spezifischer Primer

Entwicklung der TaqMan-PCR Auswahl der TaqMan-Sonde

Die für die TaqMan-PCR eingesetzte Sonde weist in Anlehnung an das 7700 SDS Workshop Manual, Version 2.1 (Dr. Thomas A Schild, Applied Biosystems GmbH Weiterstadt) bestimmte Eigenschaften vor:

  • Der GC-Gehalt der Sonde liegt bei 38,2%. Er sollte zwischen 20 und 80% (optimal bei 50%) liegen.

  • Die Länge der Sonde sollte, um eine ausreichende Spezifität zu erzielen, zwischen 20 und maximal 35 Nukleotiden liegen. Längere Sonden könnten durch die Ausbildung von Sekundärstrukturen während der Hybridisierung zu Problemen führen. Die hier eingesetzte Sonde besitzt eine Länge von 34 Nukleotiden.

  • Markierung mit einem Reporter-Farbstoff am 5´-Ende sowie mit einem Quencher-Farbstoff am 3´-Ende. Zur Markierung der eingesetzten Sonde wird als Reporter FAM, als Quencher DABCYL verwendet. DABCYL weist keine Eigenfluoreszenz auf und kann keine Interaktion mit FAM eingehen.

  • Eine Phosphorylierung der Sonde liegt vor, um eine Extension des 3´-Endes während der PCR zu vermeiden.

Zusätzlich wird bei der Auswahl der Sonde die Platzierung des Quenchers berücksichtigt und der Quencher an das 3’-Ende der Sonde platziert. Zur optimalen Energieübertragung zwischen Reporter und Quencher ist eine räumliche Nähe der beiden zueinander wichtig [57[. Untersuchungen durch Livak [58[ konnten nachweisen, dass die Positionierung des Quenchers am 3´-Ende der Sonde ideal ist, da hier die Bildung des PCR-Produktes vollständig nachgewiesen werden kann. Entsprechend der oben genannten Voraussetzungen wurde die Sonde über die Gendatenbank ermittelt (Genbank accession number: AF 22238) und weist folgende Sequenz auf:

FAM 5´- TGC GAG AAC AGG CAA AAT GTC ATT ATC AAA ATC C –3´ DABCYL

Die Sondenmoleküle nehmen, isoliert betrachtet, durch das Vorhandensein negativ geladener Phosphatreste durch Abstoßungskräfte eine gestreckte Form an. Aufgrund der somit größeren Entfernung zwischen Reporter und Quencher kommt es zu einer Reduzierung des so genannten Quenching-Effekts. Um den abgeschwächten Quenching-Effekt zu verbessern, ist eine ausreichende Magnesium-Ionen-Konzentration wichtig. Die positiv geladenen Magnesium-Ionen sorgen für die Neutralisation der elektrostatischen Abstoßung innerhalb der Sondenmoleküle. Diese werden flexibler und bewirken durch räumliche Faltung eine Annäherung der Fluorophore und damit eine Verbesserung des Quenching-Effekts. In der vorliegenden Arbeit wird eine Konzentration von 4,5mM MgCl2 (50mM)angewendet. Die empfohlenen Magnesium-Konzentrationen liegen zwischen 3,5 und 6mM.

 Thermocycler-Einstellungen

Im Gegensatz zur klassischen PCR, die sich pro Zyklus aus den drei Schritten Denaturierung, Annealing und Extension zusammensetzt, wird bei der hier durchgeführten TaqMan-PCR die Annealing- und die Extensionsphase zu einem Schritt zusammengefasst [59. Der erste Schritt – die Denaturierung – wird sowohl bei der herkömmlichen PCR als auch bei der TaqMan-PCR angewendet. Hier werden die DNS-Stränge bei Temperaturen von 90 bis 95°C voneinander getrennt. In der nun folgenden Annealing-Phase lagern sich die Primer und Sonde bei Temperaturen um 55°C an den zu vervielfältigenden DNS-Abschnitt. Die Polymerisation beginnt klassischerweise bei 72°C in der sich anschließenden Extensionsphase. Nach Zusammenfassung der letzten beiden Schritte setzt sich jeder Zyklus nur noch aus zwei Temperatur-Stufen zusammen, aus 95°C sowie einer zweiten Temperatur zwischen 50 und 70°C. Bei niedriger letzterer Temperatur ist auf der einen Seite die Anlagerung der Primer verbessert, auf der anderen Seite kann es zu falsch-positiven Ergebnissen kommen. In Abhängigkeit vom Schmelzpunkt der Primer werden Untersuchungen mit verschiedenen Thermocycler-Einstellungen vorgenommen. Es zeigt sich, dass bei einer Temperatur von 67°C keine ausreichende Amplifikation mehr erreicht wird. Bei einer Temperatur von 63°C werden falsch-positive Signale erfasst. Als Optimum erweist sich eine Temperatur von 65°C, die über eine Minute gehalten wird.

 Die quantitative Standardreihe für die TaqMan-PCR

Zur Erstellung einer Aspergillus-fumigatus-spezifischen Standardreihe wird ein mittels FastDNA-Kit extrahierter Aspergillus-fumigatus-Stamm (DSM 819) gewählt. Nach Klonierung mit Hilfe des TOPO TA Cloning Kits wird die Konzentration des entstandenen Produktes photometrisch bestimmt. Bei einer optischen Dichte von 0,06g/l wird über der Molmasse mit Hilfe der Avogadro-Konstanten die Molekülzahl ermittelt. Die genaue Berechnung zur Erstellung der Standardreihe wird in der Tabelle 9 dargestellt.

Ausgehend von 1010 Kopien wird durch Verdünnung eine Standardreihe bis zu einer Konzentration von 10 Kopien/2µl pipettiert. Davon werden die letzten acht Stufen (107, 106, 105, 104, 103, 102, 20, 10 Kopien) in der TaqMan-PCR eingesetzt. Weniger Standardstufen bergen die Gefahr eines schlechten Korrelationskoeffizienten.

PCR-Produkt:

212 bp

Vektor-Länge:

+ 3906 bp

Produktgröße:

4118 bp

Molekülmasse

=Produktgröße*

durchschnittliche Molmasse eines Basenpaares

=4118*

660g/mol

=2 717 880 g/mol

Konzentration laut OD:

0,06 g/l

0.06g/l / 2 717 880 g/mol

=20 420*10-8 mol/l

Konzentration

=20 420*10-8mol/l*

6.02213670* 1023/mol Avogadro-Konstante

=12 297*1016

Moleküle/l

= 12 297 400 432

Moleküle/µl in der Ausgangs-probe

Verdünnung :

10µl Ausgangsprobe + 14,6µl TE-Puffer

=1010 Kopien/2µl.

Konzentration in g:

12 297 400 432 Kopien/µl

1 Kopie/µl

10 000 000 000 Kopien/µl

107 Kopien/µl

104 Kopien/µl

10 Kopien/µl

= 0.06 g/l = µg/µl

= 0.06 µg/µl / 12 297 400 432 Kopien/µl

= 0.049 * 10-10 µg = 49 * 10-10 ng

= 0.049 µg

= 49 ng

= 49 pg

= 49 fg

= 0,049 fg Plasmid-DNS

Tabelle 9: Kopienzahlberechnung zur Erstellung einer Verdünnungsreihe bekannter Kopienzahl:

Detektion der Standardreihe

Nach erfolgter PCR wird zunächst die Standardreihe bewertet. Mit Hilfe des Amplifikation-Plots können die analysierten Daten dargestellt werden. Für jede Probe wird grafisch die relative Fluoreszenzintensität (ΔRn) über der Zyklusanzahl aufgetragen. Die Darstellung kann linear oder logarithmisch erfolgen (Abbildung 13, Abbildung 14).

Abbildung 13:
Lineare Darstellung der Standardreihe, ΔRn: Fluoreszenzintensität, Cycle: Zyklusanzahl

Anhand der bekannten Ct-Werte und der festgelegten Ausgangskonzentrationen ist die Ermittlung einer Kalibratorkurve möglich (Abbildung 14), mit der unbekannte Proben analysiert werden können. Als Standardkurve erscheinen alle Werte, die zu Reaktionsbeginn als Standardproben (STND) gekennzeichnet werden. Dabei wird der Ct-Wert über den logN der Startkopienzahl aufgetragen und eine Eichgerade ermittelt. Diese sollte im Idealfall eine negative Steigung zwischen 3,5 und 4,0 vorweisen. Das bedeutet, dass eine 100%ige Effektivität dann vorliegt, wenn sich die Anzahl der Kopien alle 3,5 bis 4,0 Zyklen um einen Exponenten erhöht. Die gemessenen Steigungswerte befinden sich zwischen -3,837 und -3,480. Der arithmetische Mittelwert beträgt -3,584. Aus der Abweichung der Einzelpunkte von der Eichgeraden wird ein Korrelationskoeffizient gebildet. Die Korrelation sollte bei einem möglichen maximalen Wert von 1,0 um die 0,98 betragen. Der mittlere Korrelationskoeffizient in den durchgeführten Untersuchungen beträgt 0,988, wobei die höchste Korrelation mit 0,999 und die geringste mit 0,969 gemessen werden kann.

Abbildung 14:
Standardkurve, schwarze Punkte markieren die vorgegebenen Kopienzahl der Standardreihe, rote Punkte die zu untersuchenden Proben. Ct: Zyklusanzahl, Starting Quantity: Ausgangsquantität in Kopienzahl/2µl

Testung verschiedener Materialien

Es werden verschiedene Materialien mit dem oben angegebenen Extraktionsverfahren getestet, dazu gehören Bronchiallavagen (inklusive Trachealsekreten und Bronchialsekreten), Pleurapunktate, Liquorproben und Blutproben. Zusätzlich werden Biopsate von Patienten mit bewiesener invasiver Aspergillose untersucht. Die Blutproben werden mindestens zweimal mit dem RCLB-Puffer vorbehandelt. Zuvor werden die Blutproben von nicht erkrankten Personen mit Aspergillus-fumigatus-Mycel versetzt und anschließend extrahiert. Es lässt sich wiederholt Aspergillus-DNS extrahieren. Eine Sensitivitätstestung wird nicht vorgenommen. Aufgrund der fehlenden Möglichkeit andere Untersuchungsmaterialien wie Bronchiallavagen, Pleurapunktionen, Liquorproben und Biopsate von gesunden Probanden mit Aspergillus-Mycel zu versetzen und zu untersuchen, können diese Materialien nur an Hand der vorhandenen Patientenproben getestet werden. Aus diesen Materialien lässt sich bei Patienten mit bewiesener invasiver Aspergillose, ausser bei zwei Pleurapunktaten, Aspergillus-fumigatus-DNS extrahieren. Diese Pleurapunktate sind post mortem abgenommen worden. Unter den Patienten mit möglicher invasiver Aspergillose kann einmal Aspergillus-DNS in einem Pleurapunktat nachgewiesen werden.

 Kontaminationsprophylaxe

Zur Kontaminationskontrolle werden bei jeder Extraktion und zusätzlich bei jedem PCR-Lauf Negativ- und Positivkontrollen mitgeführt. Der für die Extraktion verwendete RCLB-Puffer wird nach dem Ansetzen vor der Weiterverarbeitung steril filtriert und autoclaviert. Anschließend erfolgt bis zur Weiterverarbeitung eine Lagerung bei 4°C in. Der WCLB-Puffer wird steril filtriert und bis zur Weiterverarbeitung bei -20°C gelagert. Beide Puffer werden in Einzelvolumina von 50ml gesplittet. Bei Durchführung der PCR werden die Arbeitsschritte vor und nach der PCR in verschiedenen Räumen durchgeführt, um Carry-Over-Kontaminationen zu vermeiden. Die konventionelle und die real-time-PCR werden zusätzlich in getrennten Räumen durchgeführt. Die PCR-Vorbereitung erfolgt unter der Lamin Air Abzugsbank, in der ein stetiger laminarer Luftstrom herrscht. Die für den Mastermix verwendeten Reagenzien werden vor ihrer Weiterverarbeitung einzeln aliquotiert. Das Pipettieren erfolgt mit sterilen Einmalpipetten mit Filtereinsatz. Der fertige Mastermix wird zur Inaktivierung eventuell vorhandener Kontaminationen vor dem Aufteilen auf die einzelnen Proben mit ultraviolettem Licht bestrahlt. Da die Taq-Polymerase lichtempfindlich ist, wird sie erst nach der Bestrahlung dazu gegeben. Die Pipettierung der Standardreihe erfolgt aufgrund der hohen Konzentration der Plasmid-DNS als letztes. Vorher werden alle anderen Proben verschlossen.

Trotz der prophylaktischen Maßnahmen können Kontaminationen beobachtet werden. Dabei können während der Durchführung der konventionellen PCR, zweimal von insgesamt 36 Läufen Kontaminationen des gesamten Laufes und einmal eine Kontamination der Negativkontrolle beobachtet werden. Eine anschließende Testung sämtlicher Reagenzien bleibt negativ. Bei Durchführung der real-time-PCR kann eine Verunreinigung des gesamten Laufes nicht beobachtet werden. Jedoch treten einzelne positive Proben auf, bei denen eine Kontamination in Betracht gezogen werden kann. In zwei von insgesamt 34 Läufen handelt es sich um eine Kontamination der PCR-Negativkontrolle.

Untersuchungen von Patientenmaterial

Sämtliche Angaben der Kopienzahl in den folgenden Untersuchungen sind in jeweils 2µl Volumen gemessen worden. Alle Proben werden doppelt gemessen. Bei den verwendeten Werten handelt es sich um den Mittelwert.

Untersuchungen im Vergleichskollektiv

Als Vergleichsgruppe werden 71 bronchoalveoläre Lavagen von 67 Patienten herangezogen. Im Allgemeinen liegt je Patient eine Probe vor. Von vier dieser Patienten werden jeweils zwei Bronchiallavagen untersucht. Sämtliche Patienten weisen keine hämatologische Grunderkrankung auf.

Insgesamt vier der Bronchiallavagen weisen in der TaqMan-PCR Werte mit einem Mittelwert von 4 Kopien auf [1, 2, 4, 9]. Diese Werte werden, da sie unter dem Schwellenwert liegen als negativ bewertet. Ein einziger Wert liegt mit 1353 Kopien deutlich im positiven Bereich. Bei dem dazu gehörigen Patienten liegt als Grunderkrankung ein Bronchial-Karzinom vor. Aufgrund von anhaltendem antibiotikarefraktärem Fieber und klinischen sowie radiologisch auffälligen Lungenbefunden, ist eine Bronchoskopie durchgeführt worden. In der parallel angelegten Kultur lässt sich kein Aspergillus fumigatus isolieren. Laut den in Kapitel 2.3 angegebenen Kriterien wird er als Patient mit einer möglichen invasiven Aspergillose-Erkrankung angesehen. Neben der Möglichkeit der Erkrankung an einer invasiven Mykose durch Aspergillus-fumigatus könnte auch eine Kolonisation vorliegen. Auch eine Kontamination lässt sich nicht mit Sicherheit ausschließen.

Alle anderen Patienten (98,5%) werden hinsichtlich der Erkrankung an einer invasiven Aspergillose als negativ bewertet. Korrelierend dazu lässt sich in keiner der dazu gehörigen Proben ein relevanter TaqMan-Wert messen.

Untersuchungen im Patientenkollektiv

Es werden insgesamt 198 Proben von 137 Patienten untersucht. 51 Proben (25,8%) geben ein positives Signal, davon zeigen 76,9% (n=40) einen Wert, der über dem Cut-off-Wert liegt. Elf Proben bleiben mit einem arithmetischen Mittelwert von 6 Kopien unter dem festgelegten Schwellenwert. Bei den übrigen 147 Proben (74,2%) kann kein positives Signal gemessen werden.

Unter Betrachtung der verschiedenen Ausgangsmaterialien können folgende Ergebnisse ermittelt werden:

25 Bronchiallavagen, sieben Trachealsekrete und ein Bronchialsekret geben ein relevantes positives Signal. Drei Lungenbiopsate sowie ein Leberbiopsat zeigen ein positives Ergebnis. Des Weiteren lässt sich in einer Liquorprobe, in einem Pleurapunktat, sowie in einem Hornhautabradat relevante Aspergillus-fumigatus-DNS nachweisen. Sämtliche Patienten dieses Kollektivs sind mit Nummern (Nr.) versehen und in Tabelle 10 bis Tabelle 13 dargestellt.

Bewiesene invasive Aspergillose

Acht Patienten (5,8%) von insgesamt 137 werden laut in Kapitel 2.3 angegebener Vorgabe zur Gruppe der bewiesenen invasiven Aspergillose zugeordnet. Dabei handelt es sich um drei disseminierte und drei pulmonale invasive Aspergillosen, eine zerebrale invasive Aspergillose sowie um eine lokale Aspergillus-fumigatus-Infektion des Auges.

Disseminierte invasive Aspergillose:

Alle drei Patienten sind an einer post mortem diagnostizierten disseminierten Aspergillose verstorben. Bei allen Patienten wird mindestens einmal ein positver Wert in der TaqMan-PCR erreicht. Von zwei Patienten mit disseminierter Aspergillose liegen zusätzlich zur Bronchiallavage ein Lungenbiopsat sowie ein Lungen- und Leberbiopsat vor. In allen Proben lässt sich in der real-time-PCR Aspergillus-fumigatus-DNS nachweisen.

Patient Nr. 1 verstarb an disseminierter Aspergillose. Der Nachweis von 7.200 Kopien Aspergillus-fumigatus-DNS gelingt in der Bronchiallavage vier Tage vor dem Tod. In der Sektion lässt sich eine disseminierte Aspergillose mit Lungen- und Leberbeteiligung nachweisen. In der TaqMan-PCR lässt sich in den Sektionsbiopsaten in der Lunge ein massiv erhöhter Wert von 563.000 Kopien, in der Leber ein weitaus geringerer Wert von 50 Kopien nachweisen. Von Patient Nr. 7 liegt neun Tage vor dem Tod eine Bronchiallavage vor, die einen Wert von 1.135 Kopien misst. Das post mortem untersuchte Lungenbiopsat misst 112 Kopien. Weitere Proben liegen nicht vor. Bei Patientin Nr. 5 liegt prae mortem ein Trachealsekret vor, in dem 3.750 Kopien nachgewiesen werden. Post mortem liegt ein Peurapunktat vor, aus dem keine Aspergillus fumigatus-DNS isoliert werden kann.

Pulmonale invasive Aspergillose:

Zwei der drei Patienten sind verstorben. Von Patient Nr. 6 liegen insgesamt sechs Proben (fünf Bronchiallavagen und ein Trachealsekret) vor. Vor Beginn einer antimykotischen Therapie werden in der Bronchialavage der rechten Lunge 2650, in der linken Lunge 2615 Kopien nachgewiesen. Nach antimykotischer Therapie werden 15 Tage später im Trachealsekret noch 56 Kopien, 17 Tage später in einer weiteren Bronchiallavage 132 Kopien und 18 Tage später in der Lavage der rechten Lunge 45, in der der linken Lunge 20 Kopien festgestellt. Der Patient wird lange intensivmedizinisch behandelt und kann nach insgesamt sechs Monaten das Krankenhaus verlassen. Ein detaillierter Verlauf ist in Abbildung 17 dargestellt. Von Patient Nr. 3 mit pulmonaler Aspergillose liegt ein Trachealsekret vor. In diesem lässt sich eine Kopienzahl von 92.500 nachweisen. Von Patientin Nr. 4 werden prae mortem in der Bronchialavage 3.750 Kopien nachgewiesen. Im Pleurapunktat kann wie bei Patientin Nr. 5 post mortem keine Aspergillus-fumigatus-DNS nachgeweisen werden.

Zerebrale Aspergillose:

Bei Patient Nr. 2 kann im Liquor bei prae mortem bewiesener zerebraler Aspergillose eine Kopienzahl von 520.000 Kopien nachgewiesen werden. Der Patient ist verstorben.

Lokale okuläre Aspergillose:

Von Patient Nr. 8 liegen insgesamt fünf Proben vor. Bei im Vorfeld bewiesener Aspergillose des rechten Auges, kann bei beiden Proben des rechten Auges Aspergillus-DNS nachgewiesen werden. Die erste Probe (Hornhautabradat) misst 35 Kopien, die andere (Kammerwasser) nach einer antimykotischen Behandlung noch 11 Kopien und liegt damit unter dem Schwellenwert. Aufgrund des verschiedenen Probenmaterials kann jedoch nicht beurteilt werden, wieviel Aspergillus-DNS sich vor der antimykotischen Behandlung im Kammerwasser befand. 16 Tage später wird ein Biopsat des rechten Auges untersucht. Bei der Biopsat–Probe des rechten Bulbus oculi handelt es sich um den Zeitpunkt der Enukleation nach erfolgter antimykotischer Therapie, diese Probe bleibt negativ. Ebenfalls negativ bleiben die beiden Proben des linken Auges. In diesem kann weder klinisch noch in anderen Untersuchungen eine Aspergillus-Infektion nachgewiesen werden. Der Patient hat überlebt.

Insgesamt liegen 22 Proben in dieser Gruppe vor, d. h. im Mittel 2,75 Proben pro Patient. 68,2% (n=15) weisen ein positives Ergebnis in der TaqMan-PCR vor. In fünf der Proben lässt sich keine Aspergillus-fumigatus-DNS nachweisen (Abbildung 15). Bei zwei der negativen Proben handelt es sich um Sektionsmaterial (Pleuraerguss).

Die Werte der als positiv gewerteten Proben innerhalb der Gruppe der bewiesenen Aspergillose liegen im Bereich von 45 bis 563.000 Kopien (Tabelle 10). Der arithmetische Mittelwert liegt bei 79.808,7 Kopien (Abbildung 16).

 Wahrscheinliche invasive Aspergillose

Es können acht (5,8%) Patienten mit wahrscheinlicher invasiver pulmonaler Aspergillose evaluiert werden. Insgesamt liegen vier Trachealsekrete und fünf Bronchiallavagen vor. Bei Patient Nr. 9, 10, 13 und 16 liegt jeweils ein Trachealsekret vor. In drei der Proben können 3950/350 bzw. 43 Kopien nachgewiesen werden. Drei von fünf Bronchialavagen bleiben negativ, davon gehören zwei zu Patientin Nr. 14. In den beiden positiven Lavagen werden 203 und 63 Kopien nachgewiesen.

Insgesamt kann in fünf von neun Proben (55,6%) Aspergillus-fumigatus-DNS nachgewiesen werden. Bezogen auf die Patienten kann bei fünf von acht Patienten (62,5%) Aspergillus-fumigatus-DNSnachgewiesen werden (Abbildung 15). Der Bereich der fünf positiven Proben in der Gruppe der wahrscheinlichen invasiven Aspergillose reicht von 43 bis 3950 Kopien (Tabelle 11). Der arithmetische Mittelwert liegt bei 921,8 Kopien (Abbildung 16).

Mögliche invasive Aspergillose

Es liegen 54 Bronchiallavagen vor. Davon kann in 11 Proben Aspergillus-fumigatus-DNS nachgewiesen werden. Zwei werden mit je 2 Kopien wie die anderen 41 Proben als negativ bewertet. Von zwei Trachealsekreten misst eins 86 Kopien, das andere ist negativ. In einem Bronchialsekret können 650 Kopien nachgewiesen werden. Von zwei Lungenbiopsaten kann in einem der Nachweis von 107 Kopien erbracht werden. In einem von zwei Pleurapunktaten kann der Nachweis von 200 Kopien erbracht werden. In weiteren drei Proben, darunter zwei Liquorproben und ein Pankreasekret, lässt sich keine Aspergillus-fumigatus-DNS nachweisen.

42 Patienten (30,6%) werden der Gruppe der möglichen invasiven Aspergillose zugeordnet. Innerhalb dieser Gruppe wird bei 14 Patienten (33,3%) ein positives Ergebnis erzielt. Insgesamt kann in 15 von insgesamt 64 getesteten Proben (23,4%) Aspergillus-fumigtaus-DNS nachgewiesen werden (Abbildung 15). Der Bereich der relevanten Werte innerhalb der Gruppe der möglichen invasiven Aspergillose reicht von 82 bis 900 Kopien (Tabelle 12). Der arithmetische Mittelwert beträgt in dieser Gruppe 331,6 Kopien (Abbildung 16).

 Keine invasive Aspergillose

71 Bronchiallavagen werden untersucht. Davon kann in fünf Aspergillus-fumigatus-DNS nachgewiesen werden (340/120/6/56/32 Kopien). Die übrigen, darunter zwei mit jeweils 2 Kopien sind negativ. In allen zehn Pleurapunktaten kann keine relevante Aspergillus-fumigatus-DNS nachgewiesen werden. Das gleiche gilt für alle zehn Liquorproben. In einem von drei Lungenbiopsaten können 10 Kopien nachgewiesen werden. Der Wert wird, da er unter dem Schwellenwert liegt als negativ betrachtet. Das gleiche gilt für eins von zwei Trachealsekreten mit nachgewiesenen 3 Kopien. Die übrigen Proben, darunter ein Bronchialsekret, eine-Aszites-Probe, ein Perikarderguss sowie ein Magenbiopsat bleiben negativ. Mit 57,7% (n=79) ist die Anzahl der Patienten, die hinsichtlich der zu Grunde gelegten Diagnosekriterien nicht von einer invasiven Aspergillose betroffen sind, die größte getestete Gruppe. Hier lässt sich bei fünf von 79 Patienten (6,3%) Aspergillus-fumigatus-DNS nachweisen.

Insgesamt weisen fünf von 103 Proben (4,9%) relevante Aspergillus-fumigatus-DNS vor. Weitere sechs Werte (5,8%) bleiben mit einem Mittelwert von 5,4 Kopien deutlich unter dem Schwellenwert. Zusammenfassend kann bei 93,7 % der Patienten, bei denen laut Kriterien keine invasive Aspergillose vorliegt, keine relevante Aspergillus-fumigatus-DNS nachgewiesen werden.

Die Werte in dieser Gruppe liegen in einem Bereich von 32 bis 340 Kopien. Der arithmetische Mittelwert wird mit 121,6 Kopien bestimmt (Abbildung 16).

Abbildung 15:
Darstellung der TaqMan-Ergebnisse in Bezug auf die Gruppeneinteilung: bewiesene, wahrscheinliche, mögliche und keine invasive Aspergillose, Angaben in Bezug auf die Probenanzahl n

Abbildung 16:
Quantitative Ergebnisse innerhalb der einzelnen Patientengruppen: bewiesene, wahrscheinliche, mögliche und keine invasive Aspergillose in Bezug auf die positiven Proben

A. = Aspergillus
ALL = akute lymphatische Leukämie
A/V/I-Gabe =Amphotericin-B-/Voriconazol-/Itraconazol-Gabe
BAL=Bronchiallavage
C.=Candida
k.W:=kein Wachstum
li=links
LTX =Lebertransplantation
NHL = Non-Hodgkin-Lymphom
n.a. = nicht angelegt
n.d. = nicht durchgeführt
re = rechts

Nr.

Patienten-kürzel: Initialien, Alter, Geschlecht

Diagnose

Probe

Probe-entnahme, Tag n nach (+) / vor (-) Antimykotika-Gabe (A/V/I-Gabe)

Kopienzahl /2µl (TaqMan-PCR)

Ergebnisse Panfungus-PCR

Kultur (parallel angelegt)

1

GH-80m

NHL

BAL

-3

7.200

++

A.fumigatus C.kefyr C.tropicalis

Lungenbiopsat

+2

563.000

++

n.a.

Leberbiopsat

+2

50

-

n.a.

2

HJ-11m

ALL

Liquor

?

520.000

++

n.a.

3

TL-38m

LTX

Trachealsekret

+/-0

92.500

Schmier

A.fumigatus

4

CP-42w

NHL

BAL

+/-0

3.850

+

C.albicans

Pleurapunktat (aus Sektion)

+/-0

0

-

k.W.

5

RA-54w

Malaria tropica

Trachealsekret

+/-0

3.750

+

A.fumigatus C.glabrata C.tropicalis

Pleurapunktat (aus Sektion)

+2

0

-

k.W.

6

KJ-40m

M.Wegener

BAL li

+/-0

2.615

+

A.fumigatus

BAL re

+/-0

2.650

++

A.fumigatus

Trachealsekret

+15

56

+

A.fumigatus

BAL

+17

132

-

k.W.

BAL li

+18

20

-

k.W.

BAL re

+18

45

-

k.W.

7

MH-47m

ALL

BAL

+/-0

1.135

+

A.fumigatus

Lungenbiopsat

+9

112

-

A.fumigatus

8

JH-65m

okuläre Infektion

Hornhaut-abradat re

+/-0

35

n.d.

k.W.

Hornhaut-abradat li

+/-0

0

n.d.

k.W.

Kammer-wasser re

+1

11

n.d.

n.a.

Kammer-wasser li

+1

0

n.d.

n.a.

Bulbus-oculi-Biopsat

+16

0

n.d.

n.a.
Tabelle 10: Ergebnisse TaqMan-PCR der Patienten mit bewiesener invasiver Aspergillose in absteigender Reihenfolge

A. = Aspergillus
AML = akute myeloische Leukämie
A/V/I-Gabe =Amphotericin-B-/Voriconazol-/Itraconazol-Gabe
BAL=Bronchiallavage
C.=Candida
k.W:=kein Wachstum
li=links
LTX =Lebertransplantation
M.=Morbus
NHL=Non-Hodgkin-Lymphom
n.a. = nicht angelegt
n.d. = nicht durchgeführt
re = rechts

Nr.

Patienten-kürzel: Initialien,Alter, Ge-

Sch schlecht

Diagnose

Probe

Probe-entnahme, Tag n nach (+) / vor (-) Antimykotika-Gabe (A/V/I-Gabe)

Kopienzahl /2µl (TaqMan-PCR)

Ergebnisse Panfungus-PCR

Kultur (parallel angelegt)

9

SC-64w

AML

Trachealsekret

+/-0

3.950

+

A.fumigatus

10

HB-49w

NHL

Trachealsekret

+/-0

350

+

C.albicans

11

KD-41w

NHL

BAL

+/-0

203

-

A.fumigatusC.albicans C.dublinien-sis

12

BJ-69m

Aplasie

BAL

+1

63

+

A.fumigatus C.glabrata

13

SM-48m

NHL

Trachealsekret

+/-0

43

n.d.

k.W.

14

AA-42w

Chronische Granulo-matose

BAL

-8

0

+

A.fumigatus C.albicans

BAL

-8

0

+

k.W.

15

SE-51m

M. Hodgkin

BAL

-1

4

-

A.fumigatus

16

GS-53m

LTX

Trachealsekret

+2

0

+

A.fumigatus

Tabelle 11: Ergebnisse TaqMan-PCR der Patienten mit wahrscheinlicher invasiver Aspergillose in absteigender Reihenfolge

A.= AspergillusALL = akute lymphatische Leukämie
AML = akute myeloische Leukämie
A/V/I-Gabe =Amphotericin-B-/Voriconazol-/Itraconazol-Gabe
BAL=Bronchiallavage
C.=CandidaCa=Karzinom
CLL=chronische Lymphatische Leukämie
CML=chronische Myeloische Leukämie
d = Tag
ITP = idiopathisch thrombozytopenische Purpura
k.W: = kein Wachstum
li = links
LTX = Lebertransplantation
M. = Morbus
NHL = Non-Hodgkin-Lymphom
n.a. = nicht angelegt
n.d. = nicht durchgeführt
re = rechts

Nr.

Patienten-kürzel (Initialien, Alter, Ge-schlecht)

Diagnose

Probe

Probeentnahme, Tag n nach (+) / vor (-) Antimykotika-Gabe (A/V/I-Gabe)

Kopien-zahl/2µl (TaqMan-PCR)

Ergebnis Panfungus-PCR

Kultur (parallel angelegt)

17

PM-41m

AML

BAL

-2

900

+

k.W.

18

SA-33m

AML

BAL

+/-0

900

+

k.W.

19

JH-76m

NHL

BAL

-1

865

+

k.W.

20

ÜK-21m

NHL

Bronchial-sekret

+/-0

650

+

k.W.

Liquor

-1

0

-

k.W.

21

SA-52m

CLL

BAL

+/-0

310

+

C.albicans

22

WS-56w

AML

BAL, d1

kein A/V/I

214

-

k.W.

BAL, d22

kein A/V/I

0

-

k.W.

BAL li, d142

kein A/V/I

125

+

C.albicans

BAL re, d142

kein A/V/I

0

+

C.albicans

23

CV- 49m

AML

BAL

+9

200

+

C.kefyr

24

TR-58w

MDS

Pleurapunktat

+/-0

200

+

k.W.

Pleurapunktat

+/-0

0

-

k.W.

25

WR-44w

AML

BAL

+16

122

-

C.albicans

26

SL-66m

Bronchial-Ca

BAL

kein A/V/I

115

+

C.glabrata C.krusei

27

BF-57m

NHL

BAL

+1

0

-

k.W.

Lungenbiopsat

+1

107

-

n.a.

28

RR-48w

NHL

BAL

+1

98

+

C.albicans

29

FG-70w

AML

Tracheal-sekret

+1

86

+

C.albicans

30

KB- 36m

AML

BAL

+5

82

(+)

k.W.

31

LR-60m

AML

BAL li

-1

2

n.d.

k.W.

BAL re

-1

0

n.d.

k.W.

32

UU-56m

Haarzell-Leukämie

BAL re, I

+2

2

-

k.W.

BAL re, II

+2

0

-

k.W.

33

AA-64m

ALL

BAL

+3

0

-

k.W.

34

BW-63m

Plasmo-zytom

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

35

BF-29w

ALL

BAL li

kein A/V/I

0

+

k.W.

BAL re

kein A/V/I

0

-

k.W.

Tracheal-sekret

kein A/V/I

0

+

k.W.

36

BJ-40m

CLL

BAL

+/-0

0

-

C.albicans

37

DK-58m

AML

Lungenbiopsat

+15

0

-

k.W.

38

EA-61w

CML

BAL

kein A/V/I

0

+

k.W.

39

FD-42m

Sepsis

BAL

+2

0

+

C.albicans

40

FG-81m

Rektum-Ca

Pankreas-sekret

+1

0

-

C.albicans

41

GL-51m

CLL

BAL

+8

0

-

n.a.

BAL

+8

0

-

k.W.

42

HE-57m

AML

BAL

+/-0

0

+

C.albicans

43

HH-62m

AML

BAL

+2

0

+

k.W.

44

HH-60m

AML

BAL

+2

0

-

k.W.

45

IB-60w

AML

BAL li

-1

0

+

C.albicans

BAL re

-1

0

-

C.albicans

46

KR-58w

Plasmazell-leukämie

BAL

+1

0

n.d.

k.W.

47

LK-64m

AML

BAL I

+/-0

0

+

C.tropi-calis

BAL II

+/-0

0

+

C.tropi-calis C.glabrata

48

LO-31m

ALL

Liquor

+1

0

-

n.a.

49

NA-69w

AML

BAL li

+/-0

0

-

C.krusei

BAL re

+/-0

0

-

C.krusei

50

OG-37w

AML

BAL

+5

0

-

C.albicans C.tropi-calis

BAL

+5

0

-

C.albicans C.tropi-calis

51

PB-57w

CLL

BAL

+3

0

-

C.glabrata

52

PS-44m

AML

BAL

+13

0

-

k.W.

BAL

+13

0

-

C.krusei

BAL

+13

0

-

k.W.

53

PF-35m

NHL

BAL, d1

kein A/VI

0

-

k.W.

BAL, d8

kein A/VI

0

-

Moraxella

BAL, d15

kein A/VI

0

+

C.albicans

BAL, d21

kein A/VI

0

-

Moraxella

BAL, d24

kein A/VI

0

-

Moraxella

54

PC-32m

ITP

BAL

+3

0

-

k.W.

55

SC-61w

M.Hodgkin

BAL

kein A/VI

0

++

C.albicans

56

SJ-45m

CML

BAL

-2

0

-

k.W.

57

SJ-51m

NHL

BAL

+2

0

-

k.W.

58

WM-37w

AML

BAL

+5

0

-

C.albicans

BAL

+35

0

-

k.W.
Tabelle 12: Ergebnisse TaqMan-PCR der Patienten mit möglicher invasiver Aspergillose in absteigender Reihenfolge

A. = Aspergillus
ALL = akute lymphatische Leukämie
AML = akute myeloische Leukämie
A/V/I-Gabe =Amphotericin-B-/Voriconazol-/Itraconazol-Gabe
BAL=Bronchiallavage
C.=Candida
Ca=Karzinom
CLL=chronische lymphatische Leukämie
CML=chronische myeloische Leukämie
d = Tag
HIV = human immunodeficiency virus
ITP = idiopathisch thrombozytopenische Purpura
k.W: = kein Wachstum
li = links
LTX = Lebertransplantation
M. = Morbus
n.d. = nicht durchgeführt
NHL = Non-Hodgkin-Lymphom
n.a. = nicht angelegt
re = rechts
TBC = Tuberkulose

Nr.

Patienten-kürzel (Initialien, Alter, Ge-schlecht)

Diagnose

Probe

Probeent-nahme, Tag n nach (+) / vor (-) Antimyko-tika-Gabe (A/V/I-Gabe)

Kopien-zahl/2µl (TaqMan-PCR)

Ergebnis Panfungus-PCR

Kultur (parallel angelegt)

59

DI-47w

NHL

BAL, d1

kein A/V/I

0

-

k.W.

BAL, d23

kein A/V/I

340

-

k.W.

Lungen-biopsat, d23

kein A/V/I

0

-

n.a.

60

SN-54m

Larynx-Ca

BAL

kein A/V/I

120

+

C.albicans C.glabrata

61

MD-65w

Bronchial-Ca

BAL

kein A/V/I

60

-

C.albicans

62

WE-48m

Sepsis

BAL li

kein A/V/I

0

-

k.W.

BAL re

kein A/V/I

56

+

A.fumigatus

63

BM-31w

CML

BAL, d1

kein A/V/I

32

+

k.W.

BAL, d26

kein A/V/I

0

-

k.W.

64

KH-42m

HIV

Lungen-biopsat I, d1

kein A/V/I

10

+

C.albicans C.glabrata

Lungen-biopsat II, d1

kein A/V/I

0

+

C.albicans C.glabrata

BAL, d36

kein A/V/I

0

+

C.albicans

65

SH-49m

Plasmo-zytom

Liquor, d1

kein A/V/I

8

-

n.a.

Liquor, d120

kein A/V/I

0

-

n.a.

66

LL-41m

AML

Tracheal-sekret

kein A/V/I

3

n.d.

C.albicans

67

KM-50w

Sarkoidose

BAL

kein A/V/I

2

-

k.W.

68

KR-33m

NHL

BAL

kein A/V/I

2

-

k.W.

69

GB-49m

AML

Pleurapunktat, d1

kein A/V/I

2

-

k.W.

Pleurapunktat, d50

+15

0

-

k.W.

70

AS-57w

Sarkoido-se

BAL

kein A/V/I

0

-

C.albicans C.glabrata

71

AS-32w

HIV

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

72

BA-22m

AML

Liquor

+3

0

-

k.W.

73

BU-44w

Pneumo-nie

BAL

kein A/V/I

0

+

C.albicans

74

BR-38w

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

75

BR-36m

Hoden-Ca

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

76

BJ-53m

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

77

BJ-41w

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

78

BE-49m

CML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

79

DR-52m

AML

BAL

kein A/V/I

0

+

C.norwegien-sis

80

DJ-71m

NHL

BAL

+9

0

(+)

k.W.

81

EH-51m

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

82

EM-12w

ALL

BAL I, d1

kein A/V/I

0

-

k.W.

BAL II, d1

kein A/V/I

0

-

n.a.

BAL, d15

kein A/V/I

0

-

k.W.

Bronchial-sekret, d21

kein A/V/I

0

-

k.W.

Perikard-erguss, d28

kein A/V/I

0

-

k.W.

Liquor, d36

kein A/V/I

0

-

n.a.

BAL, d37

kein A/V/I

0

-

n.a.

83

FM-22m

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

C.albicans

84

FR-47m

NHL

Liquor

kein A/V/I

0

-

k.W.

85

GZ-79m

TBC

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

86

GJ-66m

NHL

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

87

GW-60m

Plasmo-zytom

BAL

kein A/V/I

0

+

C.albicans

88

HW-41m

NHL

Liquor

kein A/V/I

0

-

n.a.

89

HR-59w

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

n.a.

90

HT-35m

Sarkoidose

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

91

HM-33w

Cervix-Ca

BAL

kein A/V/I

0

+

C.albicans

92

HH-51w

AML

BAL

kein A/V/I

0

n.d.

k.W.

93

HU-19w

M.Hodgkin

BAL

kein A/V/I

0

+

C.albicans

94

HR-67m

AML

BAL

kein A/V/I

0

+

C.albicans

95

HA-44w

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

96

HD-63m

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

97

ID-56w

AML

Pleurapunktat

kein A/V/I

0

-

k.W.

98

JG-69m

CLL

BAL

kein A/V/I

0

+

C.albicans

99

JH-72m

TBC

BAL

kein A/V/I

0

-

C.albicans

100

KR-59w

AML

Pleurapunktat, d1

kein A/V/I

0

n.d

k.W.

Pleurapunktat, d10

kein A/V/I

0

n.d

k.W.

BAL, d16

kein A/V/I

0

n.d

k.W.

Pleurapunktat, 16

kein A/V/I

0

n.d

k.W.

BAL, d60

kein A/V/I

0

n.d

k.W.

101

KC-36m

NHL

Liquor

kein A/V/I

0

-

n.a.

102

KW-42m

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

n.a.

103

KW-44m

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

104

KA-60m

Plasmo-zytom

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

105

KH-66m

AML

BAL

kein A/V/I

0

+

k.W.

106

KR-35m

Sepsis

Aszites

kein A/V/I

0

-

C.albicans

107

LS-48m

AML

BAL

kein A/V/I

0

(+)

k.W.

108

LK-48m

NHL

Magen-biopsat

kein A/V/I

0

n.d.

n.a.

109

LT-45m

AML

BAL

kein A/V/I

0

(+)

k.W.

110

LF-56m

AML

BAL

kein A/V/I

0

(+)

k.W.

111

MH-66m

AML

Pleurapunktat, d1

kein A/V/I

0

+

k.W.

BAL, d9

kein A/V/I

0

+

k.W.

Pleurapunktat, d 106

kein A/V/I

0

-

k.W.

112

MK-56m

Plasmo-zytom

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

113

MK-39w

Sarkoidose

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

114

MG-43m

NHL

Liquor, d1

kein A/V/I

0

-

n.a.

Liquor, d5

kein A/V/I

0

-

n.a.

115

MK-43w

AML

Pleurapunktat

kein A/V/I

0

-

n.a.

116

MV-44m

AML

BAL

kein A/V/I

0

+

C.krusei

117

NM-55w

Bronchial-Ca

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

118

OH-63w

AML

BAL

kein A/V/I

0

n.d.

k.W.

119

PH-47m

Sarkoidose

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

120

PA-73m

AML

BAL, d1

kein A/V/I

0

-

k.W.

BAL, d25

kein A/V/I

0

-

k.W.

121

RH-45w

Pneumonie

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

122

RG-44m

Plasmo-zytom

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

123

RE-52m

AML

BAL I

kein A/V/I

0

n.d.

k.W.

BAL II

kein A/V/I

0

n.d.

k.W.

BAL III

kein A/V/I

0

n.d.

k.W.

124

SR-41m

CML

BAL

kein A/V/I

0

+

C.albicans

125

SI-46m

NHL

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

126

SK-34w

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

n.a.

127

SG-63m

Magen-Ca

BAL

kein A/V/I

0

-

n.a.

128

SB-65w

AML

Pleurapunktat

kein A/V/I

0

-

k.W.

129

SG-41w

AML

Tracheal-sekret

kein A/V/I

0

+

C.glabrata

130

SS-37w

NHL

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

131

SL-44m

CML

BAL

kein A/V/I

0

-

C.albicans

132

TJ-51m

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

133

TC-38w

Sepsis

Liquor

kein A/V/I

0

-

n.a.

134

WH-59m

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

135

WP-79m

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

k.W.

136

ZG-59m

AML

BAL

kein A/V/I

0

+

C.albicans

137

ZA-50w

AML

BAL

kein A/V/I

0

-

n.a.
Tabelle 13: Ergebnisse TaqMan-PCR der Patienten mit keiner invasiven Aspergillose in absteigender Reihenfolge

Panfungus-PCR

Die zum Vergleich bei 90,2% (n=184) Proben parallel durchgeführte Panfungus-PCR zeigt bei 36 von 140 Proben die negativ in der TaqMan-PCR sind, ein positives Ergebnis. In drei Proben lässt sich parallel kulturell ein Aspergillus fumigatus nachweisen. In 18 Proben kann ein isolierter Candida-Wachstum nachgewiesen werden, davon sind 14 der Spezies der Candida albicans zugehörig. Bei den übrigen vier handelt es sich um andere Candida-Spezies (Tabelle 10 bis Tabelle 13). Einmal wird ein Candida-albicans-Wachstum zusätzlich zum Aspergillus-fumigatus-Wachstum beschrieben. Bei drei Proben wachsen zwei verschiedene Candida-Spezies.

 Darstellung einzelner Patienten im Verlauf Patient Nr. 6 (KJ-40m)

Als Beispiel für einen quantitativen Verlauf wird ein Patient (siehe Patient 6, Tabelle 10 und Abbildung 17) herangezogen, von dem insgesamt sechs Proben zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht werden können. Patient, männlich, 40 Jahre:

  • Dezember 1999: Erstdiagnose einer Wegener-Granulomatose, Mitte Januar 2000: Beginn Cyclophosphamid-Therapie (entspricht Zeitpunkt Woche 0 in der graphischen Darstellung).

  • Ende Januar anhaltende Neutropenie, erste klinische Auffälligkeiten (pulmonale Beschwerden), Bildgebung: Im Röntgen Thorax Infiltrate, HR-CT: Rundherde, histologischer Nachweis von Aspergillus fumigatus nach Bronchoskopie, zu diesem Zeitpunkt liegt keine Probe für eine TaqMan-PCR vor.

  • Zunächst Besserung unter Breitband-Antibiose, Mitte Februar erneute Verschlechterung (klinisch und radiologisch), erneute Bronchoskopie, Beginn Antimykotikum-Gabe, Beatmung für vier Wochen.

  • Nach mehreren Wochen langsame klinische und radiologische Besserung (Entlassung aus dem Krankenhaus im Juni 2000).

 Patient Nr. 1 (GH-80m)

Bei Patient 1 (Tabelle 10, Abbildung 16) handelt es sich um einen Patienten, der innerhalb von 14 Tagen an einer fulminanten invasiven Aspergillose verstorben ist:

Patient, männlich, 80 Jahre:

  • August 1999: Erstdiagnose eines großzelligen B-Non-Hodgkin-Lymphoms (B-NHL) im Stadium IV. Am 1. Dezember 1999 erfolgt die stationäre Aufnahme mit neutropenem Fieber nach dem vierten Zyklus Chemotherapie (entspricht Tag 0 in der graphischen Darstellung), klinisch bestehen Thoraxschmerzen und Dyspnoe und Fieber, im Röntgen-Thorax zeigt sich ein Infiltrat rechts.

  • Innerhalb der nächsten Tage weitere Verschlechterung, im HR-CT (High-Resolution-Computertomographie) am 9.12.1999: Rundherde.

  • Trotz antimykotischer Therapie verstirbt der Patient am 14.12.1999. Histologisch kann post mortem eine invasive Aspergillose aus den Lungen-Rundherden und den Leberherden gesichert werden.

Abbildung 17:
Verlauf Patient Nr. 6, m, 40 Jahre, Hauptdiagnose: Morbus Wegener, bewiesene invasive Aspergillose

Abbildung 18:
Patient Nr. 1: männlich, 80 Jahre, Hauptdiagnose: Non-Hodgkin-Lymphom, verstorben am 14.Dezember 1999 an einer fulminanten invasiven Aspergillose.

Testvalidität/Resultatvalidität

Für die Beurteilung der Validität der in dieser Arbeit vorgestellten Methode, werden die Patientengruppen der bewiesenen, der wahrscheinlichen und möglichen invasiven Aspergillose sowie die Gruppe nicht an invasiver Aspergillose erkankt einbezogen. Auf Grund der nur unsicheren Aussage hinsichtlich einer Aspergillose-Erkrankung in der Gruppe der möglichen Aspergillose, werden die Berechnungen unter Einschluss und unter Ausschluss dieser Patientengruppe vorgenommen und die Ergebnisse tabellarisch gegenübergestellt (Tabelle 14).

Diagnostische Sensitivität

Eine hohe diagnostische Sensitivität liegt vor, wenn mit der Methode viele Kranke als krank erkannt werden. Unter Betrachtung der drei oben angegebenen Patientengruppen liegt eine Sensitivität von 81,3% vor. Erfolgt die Betrachtung nur unter Einbeziehung der Patienten mit bewiesener Aspergillose, so liegt die Sensitivität bei 100%. Eine Sensitivität von 46,6% liegt vor, wenn alle Patientengruppen einbezogen werden (Tabelle 14).

 Diagnostische Spezifität

Eine Methode zeichnet sich durch eine hohe Spezifität aus, wenn mit ihr möglichst viele Nichtkranke als solche erkannt werden. Unter Einbeziehung der in Kapitel 3.4 angegebenen Patientengruppen kann eine Spezifität von 93,7% erreicht werden. Bei Ausschluss der Patienten mit wahrscheinlicher invasiver Aspergillose, bzw. mit möglicher invasiver Aspergillose ändert sich das Ergebnis nicht.

 Positiver prädiktiver Wert

Der positive prädiktive Wert gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der ein Patient tatsächlich an einer invasiven Aspergillose erkrankt ist, wenn er ein positives Testergebnis vorweist. Werden alle Patientengruppen betrachtet, liegt ein positiver prädiktiver Wert von 84,4% vor. Unter Ausschluss der Patientengruppe mögliche invasive Aspergillose lässt sich ein positiver prädiktiver Wert von 72,2% ermitteln. Wird die Gruppe der wahrscheinlichen invasiven Aspergillose ebenfalls ausgeschlossen, so sinkt er auf 61,5%.

 Negativer prädiktiver Wert

Der negative prädiktive Wert gibt die bedingte Wahrscheinlichkeit an, mit der ein Patient bei einem negativen Testergebnis tatsächlich nicht erkrankt ist. Er liegt bei 70,5% unter Einbeziehung aller Patientengruppen, bei 96,1% unter Ausschluss der Patientengruppe der möglichen Aspergillose. Bei zusätzlichem Ausschluss der wahrscheinlich invasiven Aspergillose kann der negative prädiktive Wert mit 100% angegeben werden.