2  Material und Methoden

In die retrospektive Analyse wurden Patienten mit sporadischem kolorektalem Adenokarzinom im UICC Stadium III und IV nach operativer Therapie am Universitätsklinikum Benjamin-Franklin (Freie Universität zu Berlin) zwischen 1989 und 1991 aufgenommen (Grabowski et al., 2000). Alle Patienten im Stadium III wurden einer radikalen Resektion des Primärtumors und regionaler Lymphadenektomie in kurativer Intention unterzogen. Drei Tumore konnten jedoch nur als R₁-Resektion exstirpiert werden. Alle Tumore wurden nach Diagnosestellung durch die UICC/TNM-Klassifikation bewertet, so dass das N-Stadium mit N₀ bis N₃ beziffert ist. Unvollständiges Follow-up (n=7) oder Staging (n=8), das Auftreten eines Zweitkarzinoms postoperativ innerhalb von 3 Jahren nach Diagnosestellung (n=8) oder Tod von Patienten postoperativ innerhalb von 30 Tagen (n=7), führten zum Ausschluss aus dem anfänglich aus 146 Patienten bestehenden Patientenkollektiv (Grabowski et al., 2001). Das hier untersuchte Kollektiv besteht aus 116 Patienten. 59 Patienten befanden sich im Stadium III und 57 im Stadium IV nach den Kriterien der UICC. Für diese Patienten war eine Nachbeobachtung für einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren oder bis zum Sterbedatum vorhanden, welche mit Hilfe eines Fragebogens an Hausärzte und das Einwohnermeldeamt vervollständigt und aus Klinik eigenen Daten der Nachsorgesprechstunde für Tumorpatienten der chirurgischen Poliklinik ergänzt wurde. Die mittlere Beobachtungszeit für das Gesamtkollektiv betrug 42,1 Monate ± 3,9 SEM (SEM: Standardfehler), das mediane Überleben betrug 17 Monate. Die detaillierten klinisch-pathologischen Daten sind in Tabelle 8 zusammengefasst.

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Tabelle 8: Klinisch-pathologische Daten des Patientenkollektivs

Anmerkung: T Infiltrationstiefe. N Lypmphknotenstatus. M Fernmetastasen.

In dieser Studie wurde der Expressions- und Mutationsstatus von p53, Bax und p16^INK4a in einer großen Patientengruppe mit CRC bestimmt und in Kenntnis der klinisch-pathologischen Daten ausgewertet. Für das Mutationsscreening wurde genomische DNA aus dem Tumorgewebe der Patienten isoliert, welche als Matritze für die durch Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizierende Bindungsdomäne des p53-Gens diente. Die amplifizierten Exone 5 - 8 wurden mittels Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)–PCR auf Mutationen untersucht. Für die Expressionsanalyse des [Seite 37↓]Bax- und p16^INK4a-Proteins wurde das Tumorgewebe immunhistochemisch gefärbt und anschließend lichtmikroskopsich von zwei Untersuchern ausgewertet. Die gewonnenen Daten wurden mit klinisch-pathologischen Daten korreliert und statistisch analysiert.

Die genomische DNA wurde aus 30 μm dicken Gewebeschnitten von in Formalin fixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe extrahiert und bei –20 ºC gelagert. Das folgende Protokoll wurde verwendet:

Deparaffinierung des Probenmaterials:

1. Gewebeschnitt in 1 ml n-Octan lösen, bei 14000 upm zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Zur vollständigen Entparaffinierung Wiederholung des Reaktionsschritts.
2. Rehydrierung des Gewebepellets in 0,5 ml Ethanol (96 %) und kurze Zentrifugation bei 14000 upm.
3. Entfernen des Alkohols durch Abpipettieren und Inkubation bei 52 °C im offenen Reaktionsgefäß.

DNA-Extraktion wurde mit dem Invisorb®Spin Tissue Kit durchgeführt:

1. Lyse des Gewebepellets in 400 μl Lysepuffer und 40 μl Proteinase K für 12 h bei 52 °C unter kontinuierlichem Schütteln.
2. Zentrifugation für 2 min bei 14000 upm. Zur Einstellung von optimalen Bindungsbedingungen Überführung der im Überstand gelösten DNA in neues Reaktionsgefäß mit 200 μl Bindungspuffer.
3. Inkubation der DNA-Lösung auf einer Säule für 2 min bei Raumtemperatur. Zentrifugation bei 12000 upm für 2 min. Verwerfen des Filtrats und Waschen der Säule mit 550 μl Waschpuffer. Erneute Zentrifugation bei 12000 upm für 1 min.
4. Elution der DNA von der Säule durch Inkubation für 2 min bei 52 ºC mit 50 μl Elutionspuffer (10 mM Tris HCl/ 0,1 mM EDTA Puffer, pH 8,7). Zentrifugation bei 10000 upm. Aliquotierung und Lagerung der DNA bei –20 °C.

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine der schnellsten in vitro-Techniken zur gezielten Vervielfältigung von DNA-Abschnitten für weiterführende molekulare Analysen. Mit Hilfe von Oligonukleotidprimern, kurzen einzelsträngigen DNA-Molekülen, die komplementär zu den Enden einer definierten Sequenz der DNA-Matrize (Template) sind, synthetisiert die DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTP) einen komplementären DNA-Strang entlang der Matrize. Mit Hilfe von DNA-Thermocyclern ist der schnelle Wechsel und die Einstellung unterschiedlicher Temperaturen möglich, die für die DNA-Denaturierung, Primeranlagerung und Extension der komplementären DNA-Stränge notwendig sind.

Die PCR-Primer für die Mutationsanalyse der p53-Bindungsdomäne wurden aus dem Protokoll von Weyrer et. al. für die Exone 5 - 8, die für die DNA-Bindungsdomäne des Proteins kodieren, übernommen (Weyrer et al., 1996). Exon 5, welches aufgrund seiner Größe mit 2 Primerpaaren in 2 PCR-Produkte unterteilt wurde, Exon 6, Exon 7 und Exon 8 wurden amplifiziert. Die Primer sind in Tabelle 9 aufgelistet und haben eine Länge von 18 bis 21 Basenpaaren (bp). Die amplifizierten PCR-Produkte waren 139 bis 199 bp lang und hatten somit eine optimale Länge für die SSCP-Analyse.

Tabelle 9: PCR-Primer für die p53-Mutationsanalyse

Anmerkung: A Adenin, C Cytosin, G Guanin, T Thymin.

Alle Arbeitsschritte der PCR der Bindungsdomäne des p53-Gens sind nach dem bereits etablierten Protokoll von Sturm et al. (Sturm et al., 1999) für die Tumorproben-DNA optimiert worden. Für die Durchführung der PCR-Reaktion wurden 2 μl Aliquots der genomischen DNA eingesetzt und mit 48 μl Reaktionsgemisch in einem Gesamtvolumen von 50 μl zur Reaktion gebracht. Die Konzentrationen der Reagenzien wurde für die [Seite 39↓]Amplifikation der Proben optimiert und sind in Tabelle 10 aufgelistet. Die PCR-Reaktion wurde in einem Thermocycler nach dem Protokoll in Tabelle 11 durchgeführt.

Tabelle 10: PCR-Reagenzien für p53-Mutationsanalyse

Anmerkung: dNTP Desoxynukleosidtriphosphate.

Tabelle 11: PCR-Protokoll für 35 Zyklen

Anmerkung: AT annealing temperature.

Als Screeningverfahren zur Detektion von p53-Mutationen wurde in dieser Studie die Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)-PCR ausgewählt. Die Methode hat sich in verschiedenen Studien als zuverlässiges und informatives Verfahren zur Identifizierung von Mutationen in durch PCR amplifizierten Regionen des Genoms erwiesen. Obwohl die Sensitivität dieser Methode nur bei 80 - 90 % liegt und somit einige Mutationen unerkannt bleiben, ist sie trotzdem aufgrund der Einfachheit und schnellen Durchführbarkeit ein anerkanntes Verfahren zum Screening großer Patientenkollektive (Condie et al., 1993; Orita et al., 1989). Ziel dieser Studie war es, p53-Mutationen in den Tumorproben aufzudecken, um deren prognostische Relevanz zu untersuchen. Durch Optimierung der Elektrophoresebedingungen vor Screeningbeginn und Herstellung von [Seite 40↓]PCR-Fragmenten, die eine Größe von 200 bp nicht überschritten, konnte die Sensitivität der Methode noch gesteigert werden (Hayashi et al., 1993, Condie et al., 1993). Durch diese Vorgehensweise konnte das Patientenkollektiv schnell und effizient auf p53-Mutationen untersucht werden.

Die Methode der SSCP-PCR basiert auf der elektrophoretischen Beweglichkeit von Molekülen innerhalb einer Gelmatrix, die von der Größe, Ladung und Form, welche durch die intramolekulare Basenpaarung, also der Sequenz, bestimmt wird. Der einzelne DNA-Strang ist unter nicht denaturierenden Bedingungen gefaltet. Bei der nicht denaturierenden Polyacrylamidgel-Elektrophorese, können schon geringste Sequenzänderungen Einfluss auf die Konformation des Stranges und somit auch auf die Laufeigenschaften nehmen (Orita et al., 1989). Der Unterschied einer einzigen Base genügt, damit sich zwei Stränge unterschiedlich falten (Newton und Graham, 1994).

Bei der SSCP-PCR werden die zu amplifizierenden DNA-Fragmente durch Hitze denaturiert und in ihre Einzelstränge aufgetrennt. Durch schnelles Abkühlen falten sich die einzelnen DNA-Stränge zurück und nehmen eine sequenzspezifische Konformation ein. Im Vergleich mit Wildtyp-DNA faltet sich der mutierte DNA-Strang aufgrund der veränderten Basensequenz anders und hat dadurch andere Laufeigenschaften in der Elektrophorese. Auf dem mit Silbernitrat (AgNO₃) gefärbten Gel erkennt man die veränderten Laufeigenschaften als aberrierende Bande. Nukleinsäuren reagieren dabei mit AgNO₃ zu elementarem Silber, das als schwarze Bande sichtbar wird. Durch die Färbung können Nukleinsäuren im Picogrammbereich mit einer Sensitivität von 20-50 μg DNA pro Bande nachgewiesen werden. Die Proben mit aberrierenden Bandenmustern entsprechen Alterationen des p53-Gens.

Alle Arbeitsschritte der SSCP-Analyse wurden unter für die Tumorproben optimierten Bedingungen nach dem Protokoll von Sturm et al. (Sturm et al., 1999) auf einem zehnprozentigen nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel durchgeführt. Dafür wurde die Gellösung (Tab. 12) in eine vorbereitete Gelkammer aus zwei 26 x 20 cm Glasplatten gegossen. Nach 90 minütiger Polymerisation wurde das auf einer Folie fixierte Gel in eine Multiphor II™-Elektrophoresekammer platziert und in TBE-Puffer getränkte Filterpapierstreifen aufgebracht. Um optimale Elektrophoresebedingungen zu schaffen, wurde der Vorlauf bei 100 V und 50 mA gestartet.

Präparation der Proben für die Elektrophorese:

1. Mischen von Proben und Ladungspuffer (1:1) und Denaturierung für 5 min bei 95 °C
2. Sofortiges Abkühlen auf Eis für 1 min zur Fixierung der einzelsträngigen DNA.
3. Auftragen von je 8 μl der denaturierten Probe, der Kontrolle für denaturierte DNA (4 μl denaturiertes PCR-Produkt LoVo-DNA, 4 μl SSCP-Ladungspuffer) sowie der Kontrolle für nicht denaturierte DNA (4 μl nicht-denaturiertes PCR-Produkt LoVo-DNA mit 4 μl SSCP-Ladungspuffer) in die Taschen des Gels.
4. Eletrophorese bei 50 mA, 300 V und 22 °C für 30 min und weitere 30 min bei 900 V.

Tabelle 12: nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel (10 %)

Anmerkung: APS Ammoniumpersulfat, TEMED N,N,N-Tetramethylethylendiamin

Zur Visualisierung der DNA-Fragmente wurde eine Silberfärbung mit dem
PlusOne™-DNA Silver Staining Kit durchgeführt:

1. Fixierung der Nukleinsäuren mit 25 ml Fixierlösung (Benzolsulfonsäure 3 %; Ethanol 24 %) im Gel für 30 min.
2. Anfärbung der Nukleinsäuren mit Färbelösung (Silbernitrat 1 %; Benzolsulfonsäure 0,35 %) für 30 min.
3. Spülen mit Aqua dest. für 1 min zur Entfernung der überschüssigen Reagenzien.
4. Entwicklung in Entwicklerlösung (Natriumcarbonat 12,5 %, Formaldehyd 37 % und Natriumthiosulfat 2 %) für 4 min.
5. Beendigung der Reaktion in Stopplösung (Essigsäure 5 %; Natriumacetat 25 %; Glycerin 50 %) für 30 min.

Bei der Untersuchung von Apoptose- und Zellzyklusregulatoren in verschiedenen Ge[Seite 42↓]weben hat sich das Verfahren der immunhistochemischen Färbung bewährt. Mit dem Verfahren steht eine geeignete Screeningmethode zur Verfügung, die sich in der Durchführung als Kosten- und Zeit-günstig sowie in der Aussagekraft als zuverlässig erwiesen hat. Zur Qualifizierung des Bax- und p16^INK4a-Status wurde deshalb in dieser Studie die Analyse der Proteinexpression mittels Immunhistochemie gewählt. Die immunhistochemische Färbetechnik mittels Peroxidase konjugiertem Streptavidin und dem Chromophor DAB ist ein etabliertes Verfahren. Dabei wird die Bindung des Primärantikörpers an das Antigen als intensive Braunfärbung erkannt, welche einen guten Kontrast zur HE (Hämatoxylin-Eosin)-Gegenfärbung darstellt. Obwohl die Aussagekraft der immunhistochemischen Analyse von verschiedenen Parametern abhängig ist - von Art und Dauer der Gewebefixation, von der Schichtdicke der Gewebeschnitte, der Spezifität und Sensitivität der Antikörper, der posttranslationalen Modifikation der Proteine sowie der subjektiven Beurteilung der Untersucher – stellt sie eine zuverlässige und effiziente Methode zur Genexpressionsanalyse dar.

Zur Detektion der Bax- und p16^INK4a-Proteinexpression wurde die immunhistochemische Färbung mit den monoklonalen Primärantikörpern YTH-2D2 für Bax und G175-405 für p16^INK4a durchgeführt. Der primäre, gegen das Zielantigen gerichtete Antikörper wird dabei von einem sekundären mit Biotin konjugierten Antikörper gebunden. Das Vitamin Biotin weist eine hohe Affinität zum Streptavidin-Protein auf, welches in diesem Fall an Peroxidase gekoppelt ist. Durch Zugabe eines chromogenen Substrats (DAB) wird dieses durch die Peroxidase umgesetzt und es entsteht eine Farbreaktion. Die Arbeitsschritte der immunhistochemischen Färbung wurden für die Primärantikörper optimiert und nach dem bereits etablierten Protokoll von Sturm et al. (Sturm et al., 1999) durchgeführt:

1. Entparaffinierung in Xylol für 20 min der auf Objektträgern fixierten Gewebeschnitte (Schichtdicke 4 μm) sowie der internen Positiv- bzw. Negativkontrolle. Rehydrierung für je 2 min in absteigender Alkoholreihe (Ethanol 96 %, 80 %, 70 %, 50 % und Aqua bidest) und Überführung in TBS-Puffer.
2. Zur Antigendemaskierung Kochen der Gewebeschnitte in Zitratpuffer (pH 6,0) für 10 min. Waschen mit Aqua bidest für 5 min und Lagerung in TBS-Puffer. Abklopfen der Flüssigkeit und Abgrenzung des Gewebes mit hydrophobem PAP-Stift.
3. Blockierung der endogenen Peroxidase mit H₂O₂. (3 %).[Seite 43↓]
4. Blockierung der unspezifischen Protein-Protein-Bindungen mit 200 μl Sea-Block^® (100 %), einer kommerziell erhältlichen Fischserum-Lösung, je Schnitt und Inkubation für 10 min.
5. Dekantieren der Lösung und Überschichtung der Schnitte mit 200 μl des Primärantikörpers. Der monoklonale Maus-Antikörper gegen humanes Bax-Protein, Klon YTH-2D2 (Trevigen, USA), in der Konzentration von 25 μg/μl, wurde zum Gebrauch auf 1:750 bzw. 0,003 μg/μl in TBS-Puffer verdünnt. Der monoklonale Maus-Antikörper gegen humanes p16^INK4a-Protein, Klon G175-405 (Pharmingen, USA), in der Konzentration von 0,5 mg/ml, wurde zum Gebrauch auf 1:150 bzw. 0,003 mg/ml in TBS-Puffer verdünnt.
6. Inkubation in feuchter Kammer für 1h bei Raumtemperatur.
7. Nach Waschen (3x) mit TBS-Puffer Auftragen von 200 μl des polyklonalen biotinylierten Sekundärantikörpers (Biotin-SP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG und IgM (H+L), 1,6 mg/ml, Jackson ImmunoResearch, USA), auf 1:250 bzw. 0,006 mg/ml in TBS-Puffer verdünnt.
8. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
9. Waschen (3x) in TBS-Puffer Auftragen von Streptavidin-konjugierter Peroxidase (Peroxidase-conjugated-Streptavidin, 1,0 mg/ml, Jackson ImmunoResearch, USA), zum Gebrauch auf 1:500 bzw. 0,02 mg/ml in TBS-Puffer verdünnt.
10. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur.
11. Waschen (3x) in TBS-Puffer und Färben der Schnitte mit 3,3-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (1% in Stable Peroxide Solution Buffer). Inkubation für 5 - 10 min. Entfernen des überschüssigen Farbstoffs mit Aqua bidest und Gegenfärben mit Hämatoxylin nach Mayer für ca. 15 min. Bläuen in Leitungswasser. Dehydrierung in aufsteigender Alkoholreihe zum Eindecken in Paraclear^®, einem Eindeckmedium und Deckgläsern.

Durch immunhistochemische Färbung ist es möglich, die Expression der Proteine Bax und p16^INK4a nachzuweisen. Bei positiver Proteinexpression wird eine Färbung des Zytoplasmas (Bax) oder eine Färbung der Zellkerne (p16^INK4a) sichtbar. Als interne Kontrolle wurde für beide Antikörper Tumor- und Normalgewebe verwendet, die zur Über[Seite 44↓]prüfung der Antikörperfunktion dienten. Als probeninterne Positivkontrolle der Färbung diente die Anfärbung von infiltrierenden lymphatischen Zellen. Die mikroskopische Auswertung der Immunfärbung wurde quantitativ durchgeführt. Zwei Untersucher beurteilten die gefärbten Schnitte hinsichtlich der Färbequalität und Intensität ohne Kenntnis der klinisch-pathologischen Daten. Für die Auswertung wurden jeweils 4 Gesichtsfelder in 400-facher Vergrößerung untersucht und der Prozentsatz der positiv gefärbten Zellen (0 - 100 %) in jeweils 5%-Schritten und die Färbeintensität (0 - +++ bzw. 0 - 3) beurteilt. Eine Färbeintensität von 0 entspricht einer negativen Proteinexpression von Bax oder p16^INK4a, Grad 1 bedeutet niedrige Expression und Grad 2 und 3 entsprechen mäßiger bzw. hoher Expression. Für alle weiteren statistischen Analysen wurde der Färbeindex angewendet, welcher sich aus dem Produkt der positiv gefärbten Zellen und der Färbeintensität errechnet und so eine Spannbreite (Range) von 0 - 300 aufweist. Die Tumorproben zeigen in der immunhistochemischen Analyse des Bax-Proteins eine überwiegend zytoplasmatische und in einigen Fällen auch nukleäre Proteinexpression. In Übereinstimmung mit anderen Autoren und vorangegangenen Analysen (Sturm et al., 1999) wurde nur die zytoplasmatische Färbung ausgewertet. Die Expression von p16^INK4a war größtenteils nukleär und zytoplasmatisch. In Anlehnung an Ergebnisse aus vorangegangen Arbeiten (Ruas und Peters, 1998) wurde nur die nukleäre Proteinexpression ausgewertet. Zur Qualitätssicherung wurden zufällig ausgewählte Proben von einem Pathologen beurteilt.

Das kumulative Überleben wurde nach der Kaplan-Meier Methode ab dem Tag der Operation bestimmt. Die Überlebenswahrscheinlichkeiten wurden mit dem Mantel-Cox Log-Rang-Test analysiert. Für Zusammenhänge zwischen kontinuierlichen und kategorialen Variablen wurde der Mann-Whitney U–Test angewendet. Univariate und multivariate Regressionsanalysen wurden mit dem Cox-Regressionsmodell durchgeführt. Die biologischen und pathologischen Variablen wurden als dichotomisierte (kategoriale) Variablen verwendet: T₃ und T₄ versus T₂ und T₁, N₂ und N₃ versus N₀ und N₁, Grading (G₃ versus G₁ und G₂), Alter (Median als Schwellenwert: > 67 versus ≤ 67), Geschlecht (männlich versus weiblich), Chemotherapie (ja versus nein), Tumorlokalisation (Rektum versus andere), p53 Mutation (ja oder nein), Bax-Expression (hoch versus niedrig), [Seite 45↓]p16^INK4a-Expression (hoch versus niedrig) und die p53/Bax-Interaktionsvariable. Für die immunhistochemische Analyse wurde der mediane Färbeindex der Bax-Expression bzw. der p16^INK4a-Expression als Schwellenwert, d.h. Werte ≥ medianer Färbeindex wurden als „hohe Expression“ und Werte < medianer Färbeindex als „niedrige Expression“, definiert (Altman et al., 1994). Für die multivariate Regressionsanalyse des Überlebens wurde das Cox-Regressionsmodell angewendet. Die kategorialen Variablen wurden dabei schrittweise vorwärts und rückwärts ausgewählt, abhängig von Änderungen des Likelihood-Quotienten zwischen den verschiedenen Parametern. Als Signifikanzniveau für den β-Fehler wurde p < 0,05 definiert.

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Antikörper gegen humanes p16 ^INK4a -Protein (monoklonales Maus-IgG1), Klon G175-405, (Pharmingen, USA). 0,5 mg/ml auf 1:150 bzw. 0,003 mg/ml in TBS-Puffer verdünnt.

Antikörper gegen humanes Bax-Protein (monoklonales Maus-IgG1), Klon YTH-2D2 (Trevigen, USA). 25 μg/μlauf 1:750 bzw. 0,003 μg/μl in TBS-Puffer verdünnt.

Biotin-SP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG und IgM (H+L),polyklonaler Antikörper (Jackson ImmunoResearch, USA). 1,6 mg/ml auf 1:250 bzw. 0,006 mg/ml in TBS-Puffer verdünnt.

Peroxidase-conjugated-Streptavidin (Jackson ImmunoResearch, USA). 1,0 mg/ml, auf 1:500 bzw. 0,02 mg/ml in TBS-Puffer verdünnt.

LoVo, humane Kolonkarzinomzelllinie.