3  Ergebnisse

In dieser Analyse wurden 116 Patienten mit CRC im UICC Stadium III und IV nach Tumorresektion untersucht. Für das Follow-up wurden die Patienten für 17 Monate (Range 1-112; Mittelwert 42,1; Standardfehler ± 3,9) im Median nachbeobachtet. 24 Patienten waren zum Nachbeobachtungszeitpunkt noch am Leben und weitere 10 Patienten waren an tumorassoziierten Todesursachen verstorben (Grabowski et al., 2001). Diese 34 Patienten wurden als zensiert bezeichnet und in alle Analysen eingeschlossen. Patienten im Stadium III überlebten für die Zeitspanne von Diagnose bis zum Zensierungszeitpunkt im Median 69 Monate (Range 4-112), im Stadium IV hingegen nur 8 Monate (Range 1-84). Das mediane Überleben der 34 zensierten Patienten beträgt 83,5 Monate (Range 9-112). Im Stadium III überlebten 90 % das erste postoperative Jahr (geschätzte 1-Jahresüberlebensrate nach Kaplan-Meier), im Stadium IV nur 35 % der Patienten (Abb. 5).

	Abbildung 5: Kumulatives Überleben im Stadium III und IV.

Die 5-Jahresüberlebensraten betrugen im Stadium III 64,5 % und im Stadium IV 2 %. Das kumulative Überleben der Patienten im Stadium III und IV unterschied sich, wie zu [Seite 50↓]erwarten, signifikant (Mantel-Cox Log-Rang-Test: p<0,0001). Deshalb wurden die folgenden Analysen stadienspezifisch durchgeführt.

P53 ist ein transkriptioneller Aktivator des Bax-Gens (Miyashita und Reed, 1995). Um die Abhängigkeit der Expression von Bax vom p53-Status zu untersuchen, wurde nach Mutationen in der DNA-Bindungsdomäne des p53-Gens unter Anwendung der SSCP-PCR gesucht. Mehr als 90 % der p53-Missense-Mutationen maligner Tumore befinden sich in der Core-Domäne, welche sequenzspezifische DNA-Bindung von p53 ermöglicht. Durch die SSCP-Analyse wurden in 46 von 116 (39,7 %) Tumorproben aberrierende Bandenmuster gefunden (Abb. 6). Zwei Tumore enthielten Mutationen in 2 Exonen. Im Stadium III sind 28 von 59 Tumoren (47,5 %) mutiert, im Stadium IV waren es 18 von 57 Tumoren (31,6 %).

	Abbildung 6: SSCP-PCR.
	Anmerkung: Exon 6 Wildtyp, Mutation und Exon 7 Wildtyp und Mutation. WT Wildtyp, DS-DNA Doppelstrang-DNA, * aberrierende Bande.

Das Bax-Protein wird in vielen Geweben exprimiert, und zwar besonders in denen, die einen hohen Zellumsatz aufweisen. In normalen Kolonzellen ist die Bax-Färbung in den superfizialen epithelialen Zellen stärker und hauptsächlich intrazellulär (Krajewski et al.,1994) mit diffus zytoplasmatischem Färbemuster. In dieser Studie war das normale Färbemuster für den Bax-Antikörper deutlich diffus zytoplasmatisch und in einigen Fällen schwach nukleär, wobei die Zellen an der luminalen Oberfläche eine stärkere teilweise auch leicht granuläre Expression aufweisen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Autoren und vorangegangenen Analysen (Sturm et al.,1999) wurde nur die zytoplasmatische Färbung ausgewertet (Abb. 7 a,b, Tab. 13). Die Tumorzellen, die keine zytoplasmatische Färbung zeigten, wurden als negativ gewertet. Nur einer der 116 Tumore zeigt weder zytoplasmatische noch nukleäre Bax-Expression.

	Abbildung 7: Immunhistochemische Färbung des Bax-Proteins in kolorektalen Adenokarzinomen 200x, 400x

Tabelle 13: Immunhistochemische Bax-Färbung von UICC III- und IV-Tumoren

Anmerkung: Werte als Absolutwerte. FI Färbeindex, UICC Union Internationale Contre le Cancer.

Die Assoziation der Bax-Expression (Färbeindex 0 - 300; kontinuierliche Variable) mit den univariaten Parametern Infiltrationstiefe (pT_1-4), Lymphknotenbefall (pN_0-3) und Differenzierungsgradsgrad (G_1-3) wurde mit dem Mann-Whitney U-Test untersucht (Abb. 8).

	Abbildung 8: Boxplotanalyse des Bax-Färbeindex (FI) in Relation zum pT-, bzw. pN-Stadium und dem Differenzierungsgrad

Im Stadium III ist eine signifikante Abnahme der Bax-Expression bei Zunahme der Infiltrationstiefe von pT₂ zu pT₄ (p=0,0192), eine tendenzielle Abnahme bei fortschreitendem Lymphknotenstatus von pN₁ zu pN₂ sowie die Entdifferenzierung von G₂ zu G₃ zu erkennen. Im Stadium III existiert jeweils kein pN₀ sowie kein G₁-Tumor. Die Zusammenhänge zwischen Bax-Expression Lymphknoteninfiltration und Differenzierungsgradsgrad der Stadium III-Tumore sind jedoch bei Anwendung des Mann-Whitney U-Tests nicht signifikant. Im Stadium IV sind die Tendenzen ähnlich, eine Verminderung der Proteinexpression bei Anstieg von pN₀ zu pN₃ sowie von G₂ zu G₃ sind zu erkennen. Sturm et al. konnten ebenso bei der Untersuchung der Bax-Expression in Lebermetastasen CRC die Tendenz zu schwächerer Bax-Expression in G₃ Tumoren und Tumoren mit höherem Lymphknotenstatus zum Zeitpunkt der Erstdiagnose beobachten (Sturm et al.,1999). Für die weitere Auswertung wurden die Patienten an Hand des Färbeindex der Bax-Expression mit dem Median als Grenzwert in 2 Gruppen kategorisiert. Werte [Seite 53↓]größer als der mediane Färbeindex (UICC III: 112,5; UICC IV: 152) wurden nach Altman et al. (Altman et al., 1994) als „hohe Expression“ und Werte kleiner als der mediane Färbeindex als „niedrige Expression“ festgelegt. Die Bax^hoch-Gruppe bestand im Stadium III aus 30 Patienten, im Stadium IV aus 29 Patienten. Die Bax^niedrig–Gruppe bestand im Stadium III aus 29 Patienten und im Stadium IV aus 28 Patienten. 40 Patienten wurden neben der Tumorresektion zusätzlich mit einer Strahlentherapie, adjuvanter oder palliativer Chemotherapie behandelt, wobei ein Patient sowohl eine neoadjuvante Strahlentherapie als auch eine palliative Chemotherapie erhielt. Im Stadium III erhielten 21 der 59 Patienten eine zusätzliche Therapie und verteilten sich gleichmäßig auf die Bax^hoch- (n=11) und die Bax^niedrig–Gruppen (n=10). Im Stadium IV erhielten 20 der 57 Patienten eine zusätzliche Therapie und verteilten sich ebenfalls gleichmäßig auf die Bax^hoch- (n=11) und die Bax^niedrig–Gruppe (n=9).

Das p16^INK4a-Protein ist in Tumorproben durch immunhistochemische Färbung sowohl nukleär als auch in einigen Proben zytoplasmatisch lokalisierbar (Abb. 9 a,b, Tab. 14).

	Abbildung 9: Immunhistochemische Färbung des p16INK4a-Proteins in kolorektalen Adenokarzinomen 200x, 400x

Hier wurde nur die nukleäre Proteinexpression untersucht (Ruas und Peters, 1998). Die p16^INK4a-Expression war deutlich niedriger als die Bax-Expression. Jeweils ein Stadium III- und ein Stadium IV-Tumor der 116 Tumoren zeigte weder zytoplasmatische noch nukleäre Proteinexpression.

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Tabelle 14: Immunhistochemische p16^INK4a-Färbung von UICC III- und IV-Tumoren

Anmerkung: Werte als Absolutwerte. FI Färbeindex, UICC Union Internationale Contre le Cancer.

	Abbildung 10: Boxplotanalyse des p16INK4a-FI (Färbeindex) in Relation zu pT-, pN-Stadium und Differenzierungsgrad

Der Zusammenhang zwischen p16^INK4a-Expression (Färbeindex, 0 - 300 bzw. %-gefärbte Zellen, 0 – 100 %; kontinuierliche Variablen) und den kategorialen Variablen Infiltrationstiefe (pT_1-4), Lymphknotenstatus (pN_0-3) und der Differenzierungsgrad (G_1-3) wurde mit dem nicht-parametrischen Mann-Whitney U-Test bestimmt (Abb. 10, 11).

Bei Tumoren im Stadium III wurde, wie auch bei der Bax Expression (Abb. 10), eine Tendenz zu verminderter p16^INK4a-Expression bei der Progression von pT₁ zu pT₄ sowie [Seite 55↓]G₂ zu G₃ deutlich. Bei Anstieg des Lymphknotenstatus von pN₁ zu pN₂ steigt die p16^INK4a-Expression minimal an. Der Zusammenhang der p16^INK4a-Expression mit den Variablen ist im Mann-Whitney U-Test nicht signifikant. Im Stadium IV ist p16^INK4a-Expression anders verteilt. Bei Zunahme der Lymphknoteninfiltration von pN₀ zu pN₃ steigt die p16^INK4a-Expression deutlich an. Auch bei Zunahme der Entdifferenzierung war ebenso eine stärkere p16^INK4a-Expression zu erkennen (G₃ versus G₂). Auch diese Ergebnisse sind nur Trends und hatten keine statistische Signifikanz.

Für die weitere Auswertung wurde der Färbeindex der p16^INK4a-Expression durch den Median in 2 Gruppen geteilt. Werte größer als der mediane Färbeindex (UICC III: 6,5; UICC IV: 13,9) wurden nach Altman et al. (Altman et al., 1994) als „hohe Expression“ und Werte kleiner als der mediane Färbeindex als „niedrige Expression“ festgelegt. Die p16^hoch-Gruppe bestand aus 30 Patienten im Stadium III und 29 Patienten im Stadium IV. Die p16^niedrig–Gruppe bestand aus 29 Patienten im Stadium III und 28 Patienten im Stadium IV. 40 Patienten erhielten eine zusätzliche präoperative Strahlentherapie, adjuvante oder palliative Chemotherapie, wobei ein Patient im Stadium IV sowohl eine präoperative Strahlentherapie als auch eine palliative Chemotherapie erhielt. Diese 21 zusätzlich therapierten Patienten im Stadium III (n=59) verteilten sich gleichmäßig auf beide Tumorstadien. Zehn der Stadium III-Tumore zeigten eine starke p16^INK4a-Expression und 11 Stadium III-Tumoren eine schwache p16^INK4a-Expression. Bei den 19 zusätzlich therapierten Patienten im Stadium IV zeigten 13 Tumore eine starke p16^INK4a-Expression und sechs eine schwache.

Die prozentuale Analyse der p16^INK4a-Expression bei Tumoren im Stadium III zeigte (Abb. 11), wie auch beim p16^INK4a-Färbeindex, lediglich eine Tendenz zu verminderter p16^INK4a-Expression bei Progression von pT₁ zu pT₄ sowie G₂ zu G₃. Bei Anstieg des Lymphknotenstatus von pN₁ zu pN₂ steigt die p16^INK4a-Expression minimal an. Der Zusammenhang der prozentualen p16^INK4a-Expression mit den Variablen ist im Mann-Whitney U-Test nicht signifikant. Für die weiteren Analysen wurde daher der p16^INK4a-Färbeindex verwendet.

	Abbildung 11: Boxplotanalyse der prozentualen p16INK4a-Expression in Relation zu pT-, pN-Stadium und Differenzierungsgrad

Da p53 ein transkriptioneller Aktivator des Bax-Gens ist, wurde der Zusammenhang von p53-Mutationen und der Bax-Proteinexpression untersucht (Abb.12 a,b,c, Tab. 15).

Tabelle 15: Bax-Färbung in Abhängigkeit vom p53-Status

Anmerkung: Werte als Absolutwerte. FI Färbeindex, WT Wildtyp.

Wie schon in anderen Arbeiten zum Kolon- und Mammakarzinom sowie zur Bax-Promotorregulation (Thornborrow und Manfredi, 1999) gezeigt werden konnte, hat der p53-Mutationsstatus keinen Einfluss auf die Bax-Expression (p>0,05).

	Abbildung 12a,b,c: Boxplotanalyse des Bax-FI in Relation zum p53-Mutationsstatus von UICC III und IV-, UICC III- und UICC IV-Tumoren.

Für Patienten im Stadium III unterscheidet sich das kumulative Gesamtüberleben mit p53-Mutation (n=31) nicht signifikant vom Überleben der Patienten mit p53-Wildtyp (n=28) (Mantel-Cox Log-Rang-Test: p=0,11).

	Abbildung 13a,b: p53-Mutationsstatus und kumulatives Gesamtüberleben

Allerdings besteht eine Tendenz zu längerem Überleben der Patienten mit p53-Wildtyp [Seite 58↓]Tumoren (Abb. 13a). Im Stadium IV gibt es einen tendenziellen, jedoch nicht signifikanten Unterschied (Mantel-Cox Log-Rang-Test: p=0,31) des Überlebens von Patienten mit p53-mutierten (n=18) und p53-Wildtyp Tumoren (Abb. 13b).

Um den prognostischen Wert der Bax-Expression zu bestimmen, wurde die Proteinexpression als dichotomisierte Variable in hohe und niedrige Bax-Expression unterteilt (Kap. 2.2.7). Bei Patienten im Stadium III (n=59) und niedriger Bax-Expression (n=29) kann eine signifikant geringere Überlebenswahrscheinlichkeit (medianes Überleben 23,6 Monate) als bei Patienten mit hoher Bax-Expression (n=30) (medianes Überleben 77,5, Monate) beobachtet werden. Der Mantel-Cox Log-Rang-Test ist für diesen Zusammenhang signifikant, p=0,009 (Abb. 14a).

	Abbildung 14a,b: Überleben im Stadium III und IV nach Kaplan-Meier

Der Mantel-Cox Log-Rang-Test ist für diesen Zusammenhang signifikant, p=0,009 (Abb. 14a). Bei Patienten im Stadium IV hat die Bax-Expression jedoch keinen Einfluss auf das Gesamtüberleben, p > 0,05 (Abb. 14b).

In einer Studie zum Gesamtüberleben nach Lebermetastasenresektion von CRC in kurativer Intention zeigte die Überlebensanalyse, dass für Tumore mit einem intakten p53-[Seite 59↓]Gen der Verlust der Bax-Expression prognostisch ungünstiger war. Deshalb wurde hier ermittelt, ob die Kombination des p53-Mutationsstatus und der Bax-Expression von prognostischer Relevanz für das Überleben von Patienten mit fortgeschrittenem CRC ist. Die Kaplan-Meier Analysen für Stadium III und IV wurden mit den dichotomisierten Variablen p53-Mutation/Bax^hoch versus p53-Mutation/Bax^niedrig sowie p53-Wildtyp/Bax^hoch versus p53-Wildtyp/Bax^niedrig durchgeführt.

	Abbildung 15a,b: p53-Status/Bax-Expression und kumulatives Überleben

Im Stadium III ist das Überleben mit einer 5-Jahresüberlebensrate von 81,5 % in der p53-Wildtyp/Bax^hoch-Gruppe (n=16) am längsten. Im Gegensatz dazu beträgt die 5-Jahresüberlebensrate in der p53-Mutation/Bax^niedrig-Gruppe (n=14) nur 39,5 % (Abb. 15a, Tab. 16). Die 4 Kurven wurden mittels Mantel-Cox Log-Rang-Test mit 3 Freiheitsgraden verglichen. Die Gruppen unterscheiden sich signifikant voneinander, p=0,0043. Die p53-Mutation/Bax^niedrig-Gruppe zeigt einen deutlich schlechteren Verlauf als die anderen 3 Gruppen. Das mediane Überleben in der p53-Mutation/Bax^niedrig-Gruppe beträgt 18 Monate versus 77,5 Monate medianes Überleben in der p53-Wildtyp/Bax^hoch-Gruppe. Im Stadium IV zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Überleben der Gruppen (Mantel-Cox Log-Rang-Test: p=0,32). Das Überleben der p53-Wildtyp/Bax ^hoch-Gruppe, die aus 25 Patienten besteht, differiert nur geringfügig von den anderen 3 Gruppen (Abb. 15b). Trotzdem zeigt die Patientengruppe mit p53-Mutation/Bax^niedrig-exprimierenden Tumoren die geringste Überlebenswahrscheinlichkeit.

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Tabelle 16: 1-, 2- und 5-Jahresüberlebensrate und p53- und Bax-Status

Anmerkung: Werte: % Überleben. WT Wildtyp, Mut Mutation, FI Färbeindex, JÜR Jahresüberlebensrate.

Um die prognostische Relevanz der p16^INK4a-Expression zu bestimmen, wurde der Expressionsgrad als dichotomisierte Variable in hohe und niedrige Proteinexpression kategorisiert. Die Kriterien für die Dichotomisierung sind in Kapitel 2.2.7 dargestellt. Für die 59 Patienten im Stadium III hat der Färbeindex der p16^INK4a-Expression keine prognostische Relevanz.

	Abbildung 16a,b: p16INK4a-Expression und kumulatives Überleben

Das mediane Überleben der Patienten mit Tumoren niedriger (n=29) und hoher p16^INK4a-Expression (n=30) unterscheidet sich nur gering (p=0,41). Es ist eine Tendenz zu kürzerem Überleben der p16^niedrig-Gruppe zu erkennen (Abb. 16a). Das mediane [Seite 61↓]Überleben beträgt 63 versus 70 Monate (p16^niedrig versus p16^hoch).

Im Stadium IV hat die p16^INK4a-Expression ebenfalls keine prognostische Relevanz (Abb. 16b). 28 Tumore zeigen niedrige und 29 Tumoren hohe p16^INK4a-Expression, p=0,56. Dennoch ist ein Trend zu längerem Überleben der Patienten mit hoher p16^INK4a-Expression zu erkennen.

Da p53 und p16^INK4a bei der Induktion von Apoptose und Zellzyklus kooperieren können, wurde hier die Kombination der 4 Parameter, p53-WT/p16^hoch , p53-WT/p16^niedrig, p53-Mutation/p16^hoch und p53-Mutation/p16^niedrig, für die Stadium III-Tumore analysiert.

	Abbildung 17a,b: p53/p16INK4a-Status und Überleben im Stadium III und IV

In Abbildung 17a lässt sich eine bessere Prognose für die p53-WT/p16^hoch-Gruppe erkennen. Das kumulative Überleben der p53-WT/p16^hoch-Gruppe differiert von den anderen 3 Gruppen (Breslow-Gehan-Wilcoxon-Test p=0,04; Mantel-Cox Log-Rang-Test jedoch nicht signifikant, p=0,09 ). Das mediane Überleben beträgt 24 versus 72 Monate (p53-Mutation/p16^niedrig versus p53-WT/p16^hoch).

Da im Stadium IV (Abb. 17b) die p53- und p16^INK4a-Expression in der univariaten Analyse keine Signifikanz erreichen konnte, erschien eine Kombination der Parameter nicht sinnvoll.

Um einen möglichen additiven Effekt der Bax- und p16^INK4a-Expression auf die klinische Prognose zu untersuchen, wurde die Gruppe der 59 Stadium III-Patienten entsprechend der Proteinexpression für Bax und p16^INK4a in 4 Gruppen kategorisiert. Der Mantel-Cox Log-Rang-Test konnte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen aufzeigen. In Abbildung 18a wird deutlich, dass nur die Bax-Expression von prognostischer Bedeutung ist, der Zusatz von p16^INK4a ergab keine weitere Auftrennung.

	Abbildung 18a,b: Bax/p16INK4a-Status und Überleben im Stadium III und IV

Auch im Stadium IV (Abb. 18b) konnte die Bax- und p16^INK4a-Expression in der univariaten Analyse das Signifikanzniveau nicht erreichen.

Mit der univariaten Regressionsanalyse der Patienten im Stadium III wurden die klinisch-pathologischen Variablen (Lokalisation [Rektum versus Kolosigmoid]; pN-Status [pN₂,pN₃ versus pN₀,pN₁]; T-Stadium [T₃,T₄ versus T₁,T₂]; Differenzierungsgrad [G₃ versus G₁,G₂]; Alter [> 67 Jahre versus ≤ 67 Jahre]; Geschlecht [männlich versus weiblich]; weitere Therapie [Therapie versus keine weitere Therapie]; p53 Mutation versus p53 Wildtyp; dichotomisierte Variablen für Bax^hoch und p16^hoch), die wahrscheinlich relevant für die Prognose von Patienten mit Stadium III-Tumoren sind, untersucht. Außer[Seite 63↓]dem wurde die p53 WT*Bax^hoch-Interaktionsvariable in die Analyse aufgenommen. In der univariaten Analyse erreichten die Variablen „Lokalisation“, „pN-Status“ und „Bax FI^niedrig“ sowie der „Interaktionsvariable: Baxhoch*p53 WT“ das Signifikanzniveau von p < 0,05. Diese Variablen gehen mit einem erhöhten relativen Risiko für früheren Tod einher. Alle untersuchten Variablen sind in Tabelle 17 zusammengefasst:

Tabelle 17: Univariate Regressionsanalyse für UICC III (n=59)

Anmerkung: FI Färbeindex, WT Wildtyp, RR relatives Risiko, KI Konfidenzintervall.

Die multivariate Regressionsanalyse zur Identifizierung negativer prognostischer Marker für Patienten im Stadium III wurde mit dem Cox-Modell durchgeführt. Dafür wurden die dichotomisierten Variablen schrittweise vorwärts und rückwärts ausgewählt. Unter Anwendung des Cox-Modells wurden hier drei unabhängige prognostische Faktoren für das CRC im Stadium III identifiziert: „pN-Status“, „Lokalisation: Rektum“, „Bax FI ^niedrig“. Für Stadium III-Tumore ist eine schwache Bax-Expression von signifikant negativer prognostischer Relevanz mit einem 5,27-fach höheren Risiko für Tod (p=0,0003; Tab. 18). Das Signifikanzniveau erreichten außerdem die etablierten prognostischen Parameter „Tumorlokalisation im Rektum“ und „fortgeschrittenes N-Stadium“ (Cohen et al.,1997) mit einem relativen Risiko von 5,40 bzw. 2,60.

Tabelle 18: Multivariate Regressionsanalyse für UICC III (n=59)

Anmerkung: FI Färbeindex, KI Konfidenzintervall, RR relatives Risiko. UICC Union Internationale Contre le Cancer. Schrittweise Vorwärts- und Rückwärtsauswahl der Variablen.

Ebenso wurde eine univariate Regressionsanalyse für Patienten im Stadium IV durchgeführt. In der univariaten Analyse erreichte ein Parameter, Differenzierung „G3“ das Signifikanzniveau von p < 0,05 (Tab. 19). Da nur ein Parameter das Signifikanzniveau erreichte, konnte hier keine multivariate Analyse durchgeführt werden. Das Differenzierungsstadium „G3“ ist somit ein prognostischer Faktor für kolorektale Karzinome im Stadium IV. Das relative Risiko für Tod ist für diese Patienten um den Faktor 2,02 (p=0,02) erhöht.

Tabelle 19: Univariate Regressionsanalyse für UICC IV (n=57)

Anmerkung: FI Färbeindex, WT Wildtyp, RR relatives Risiko, KI Konfidenzintervall.