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4  Diskussion

4.1 Prognostische Relevanz von Apoptose- und Zellzyklus-
regulatoren für CRC

Die Entstehung von Tumoren ist ein multifaktorieller Prozess als Folge von Veränderungen zellulärer Mechanismen, die zu Dysregulation von Zellproliferation und Apoptose führen. Das p53-Gen ist ein transkriptioneller Regulator einer Vielzahl von Zellzyklu regulierenden und Apoptose induzierenden Genen (Daniel et al., 2000; Kannan et al., 2001). Das p53-Gen und das proapoptotische Bax-Gen, ein Mitglied der Bcl-2 Familie, sind Regulatoren der Apoptosekaskade und sind somit möglicherweise für die Entstehung und Progression von malignen Erkrankungen entscheidend. Auch für die Therapie von Malignomen sind Apoptosesignalwege von zentraler Bedeutung. Zytotoxische Chemotherapien und Bestrahlung induzieren Apoptosesignalwege, wobei der mitochondriale DISC im Gegensatz zur Todesrezeptor vermittelten Apoptose bedeutender ist (Wieder et al., 2001). Bei der onkogenen Transformation spielt auch die Dysregulation des Zellzyklus eine wichtige Rolle. Innerhalb dieses Signalwegs hat das p16INK4a-Gen eine regulatorische Funktion. Darüber hinaus scheinen p16INK4a und p53 bei der Induktion von Zellzyklusarrest zu kooperieren (Sandig et al.,1997).

Die verschiedenen Modelle der Apoptose- und Zellzyklusregulation basieren auf experimentellen Daten von artifiziellen Mausmodellen und Zellinien. Ob diese Modelle auch auf humanes Tumorgewebe übertragen werden können und die gewonnenen Erkenntnisse von prognostischer Bedeutung für den Verlauf von Malignomen sind, bleibt Gegenstand der Forschung. Deshalb wurde hier die prognostische Relevanz von Apoptose- und Zellzyklusregulatoren für CRC im Stadium III und IV untersucht.

4.1.1 p53-Mutationen sind für die Prognose nicht entscheidend

Bei der Suche nach Mutationen in der DNA-Bindungsdomäne des p53-Gens wurden in der hier präsentierten Studie in 46 von 116 (39,7 %) Tumorproben genetische Alterationen nachgewiesen. Dieses Ergebnis liegt im Rahmen der zu erwartenden Häufigkeit von p53-Mutationen in CRC von 35 – 60 % (Hasegawa et al., 1995; Wang et al., 1997). Dennoch hatten diese Mutationen keine prognostische Relevanz für den Krankheitsver[Seite 66↓]lauf von Patienten im Stadium III oder IV. Der p53-Mutationsstatus ist somit kein unabhängiger Prognosefaktor für das kolorektale Adenokarzinom.

Die prognostische Relevanz von p53-Mutationen wird schon seit einiger Zeit für verschiedene Tumorentitäten untersucht. Als geeignete Methode zur Suche nach Mutationen wurden anfänglich immunhistochemische Färbemethoden gewählt. Es wurde angenommen, dass die p53-Proteinexpression eine Abgrenzung von p53-Wildtyp und mutiertem Protein ermöglichen kann. p53-mutiertes Protein wird stabilisiert - es hat eine längere Halbwertszeit - und kann deshalb im Gegensatz zum Wildtyp-Protein mittels immunhistochemischer Färbemethoden detektiert werden. In verschiedenen Analysen wurde gezeigt, dass die nukleäre Akkumulation von p53-Protein mit dem Mutationsstatus korreliert (Marks et al., 1991). Außerdem wurde nachgewiesen, dass die nukleäre Überexpression des Proteins mit einer schlechteren Prognose für Patienten mit CRC korreliert (Zeng et al., 1994). Auch Bosari et al. (Bosari et al., 1994) konnten eine schlechtere Prognose für CRC mit zytoplasmatischer Akkumulation von p53-Protein nachweisen. Andererseits wurde vermutet, dass sich nicht alle p53-Mutationen mittels immunhistochemischer Färbung nachweisen lassen (Rodrigues et al., 1990). Beim Vergleich von immunhistochemischen Methoden und SSCP-PCR konnte nur eine Korrelation von 68 % erreicht werden (Soong et al., 1996). Insbesondere zeigten sich hier auch p53-mutierte Tumore mit fehlender p53-Überexpression. Der p53-Überexpressions-status lässt sonst keine Aussage über genetische Veränderungen des p53-Gens zu. Möglicherweise sind posttranslationale Prozessierungsvorgänge sowie die Expression von Nonsense-Proteinen bei p53-Mutation eine Ursache für die Unzuverlässigkeit der Analyse. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurden Methoden zur direkten Detektion von Mutationen der DNA-Bindungsdomäne bevorzugt durchgeführt. In einigen Arbeiten, die mit direkter Sequenzierung oder SSCP-PCR durchgeführt wurden, hatten Patienten mit Mutationen in den Exonen 5 bis 8 eine ungünstigere Prognose (Borresen-Dale et al., 1998; Goh et al., 1995; Hamelin et al.,1994; Pricolo et al., 1997). Neuere Analysen konnten diese Korrelation nicht bestätigen. Der p53-Mutationsstatus ist demnach kein unabhängiger Prognosefaktor für verschiedene Tumoren (Elsaleh et al., 2000; Goh et al., 2000; Paradiso et al.,1996; Poller et al.,1997; Soong et al., 2000; Sturm et al., 1999).

Obwohl p53 eine zentrale regulatorische Rolle bei Apoptose- und Zellzyklusregulation einnimmt, ist möglicherweise gerade diese Vielzahl von Funktionen die Ursache dafür, dass sich das Protein nicht als Prognosefaktor eignet. Der basale p53 Wildtyp Spiegel [Seite 67↓]ist gewebeabhängig und aufgrund eines hohen Proteinumsatzes sowie der Repression durch Mdm-2 gering. Das Protein kann durch eine Vielzahl von Ereignissen stabilisiert und aktiviert werden: durch genotoxische Schäden wie DNA-Strangbrüche, zyto-toxischen Stress wie Hypoxie, Hitze, virale Infektion oder Onkogenaktivierung. Über die transkriptionelle Aktivierung von Zielgenen vermittelt p53 seine verschiedenen Funktionen: die Regulation von Wachstum, DNA-Reparatur, Zellzyklusarrest und Apoptose. Zielgene sind u.a. die Zellzyklusregulatoren p21Waf1/Cip1, Mdm-2, 14-3-3 σ, die Zelltod-aktivatoren Bax, Puma, Noxa, Nbk, IGF-BP3 und p53-AiP1, sowie die DNA-Reparaturfaktoren MSH-2 und GADD45. Zellzyklusarrest wird über Induktion von p21Waf1/Cip1 als Antwort auf DNA-Schäden vermittelt. Zusätzliche Aktivierung von DNA-Reparaturmechanismen nach Bestrahlung oder Chemotherapie ermöglichen der Zelle, sich von der Schädigung zu erholen und zu überleben (Funk, 1999). p53-vermittelte Apoptose kann als Folge von DNA-Schäden, Expression von E1A oder c-Myc oder nach Entzug von Wachstumsfaktoren aktiviert sowie durch antiapoptotisches Bcl-2 gehemmt werden. Über Aktivierung von BH 3-only Proteinen wie Puma, Noxa, Nbk, den Multidomänen Bcl-2-Homologen Bax und Bok, dem mitochondrialen DISC und der Caspasenkaskade wird Apoptose ausgelöst.

Da die monogene Analyse des p53-Gens keine Relevanz für die Prognose CRC hat, ist die Analyse der nachgeschalteten Effektoren in Abhängigkeit vom p53-Mutationstatus der DNA-Bindungsdomäne von besonderem Interesse.

4.1.2 Verminderte Bax-Expression korreliert mit schlechter Prognose

In dieser Arbeit konnte eine prognostische Relevanz der Bax-Proteinexpression für CRC im Stadium III nachgewiesen werden. Geringe Bax-Proteinexpression geht mit ungünstiger Prognose einher und ist ein prognostisch unabhängiger Faktor für das fortgeschrittene CRC. Zwischen der Bax-Expression und den klinisch-pathologischen Daten besteht jedoch keine signifikante Korrelation. Ebenso hängt die Infiltrationstiefe des Primärtumors nicht vom Niveau der Bax-Expression ab. Tendenziell ist die Proteinexpression in Tumoren mit höherem Lymphknotenstatus und höherem Grading vermindert.

Das proapoptotische Bax-Gen wird durch p53 transkriptionell reguliert (Miyashita und Reed, 1995). Bax induziert über den mitochondrialen Signaltransduktionsweg die Frei[Seite 68↓]setzung von Cytochrom c mit konsekutiver Veränderung der mitochondrialen Permeabilität (Gross et al., 1999; Pastorino et al., 1998). Über die Aktivierung von APAF-1 und Pro-Caspase 9 wird die Endstrecke der Caspasenkaskade induziert, welche letztendlich den Zelltod auslöst. Verlust des Bax-Proteins kann bei einer Vielzahl von Tumoren beobachtet werden. Die Mechanismen für den Proteinverlust sind aber in den meisten Tumoren noch unklar. Bei Hypermethylierung des Bax-Promotors (Carton et al., 2002), Frameshiftmutationen mit Ausbildung eines Stopkodons oder Punktmutationen der BH1- und BH3-Domäne, kann ein Verlust der Bax-Expression beobachtet werden.

Apoptoseregulatoren der Bcl-2-Familie, insbesondere Bax, werden auf Grund ihrer Bedeutung für die therapieinduzierte Apoptose intensiv untersucht. Bax ist nicht nur ein zentraler Effektor der p53-abhängigen onkogenen Transformation (McCurrach et al., 1997), sondern auch der chemotherapeutisch induzierten Apoptose (Wagener et al., 1996). Dabei ist die prognostische Bedeutung der Bax-Expression auch in Abhängigkeit von adjuvanten oder palliativen Therapien für verschiedene Tumorentitäten von zentralem Interesse. Schwache Bax-Expression geht auch bei Non-Hodgkin-Lymphomen mit einer schlechten Prognose einher (Gascoyne et al., 1997). Beim metastasierten Mammakarzinom korreliert schwache Bax-Expression mit kürzerem Überleben (Krajewski et al., 1995). Des Weiteren kann bei diesen Patienten ein schlechteres Ansprechen auf zytotoxische Chemotherapien beobachtet werden. Ähnliches konnte bei der Analyse von Ovarialkarzinomen beobachtet werden. Die Mehrzahl der Bax-exprimierenden Tumore zeigten nach Chemotherapie mit Paclitaxel und einem Platinanalogon eine komplette Remission sowie ein längeres krankheitsfreies Überleben (Tai et al., 1998). Auch beim Adenokarzinom des Pankreas geht starke Bax-Expression mit einer besseren Prognose einher (Friess et al., 1998).

Für das CRC konnte an einer kleinen, nicht stadienspezifischen Untersuchung längeres Überleben bei Bax-positiven Tumoren beobachtet werden (Ogura et al., 1999). Es konnte keine Korrelation mit klinisch-pathologischen Parametern aufgezeigt werden. Andererseits war starke Bax-Expression signifikant mit geringer Lymphgefäßinvasion und geringer Invasionstiefe assoziiert. Hingegen zeigte eine Arbeit von Sturm et al. bei hepatisch metastasierten CRC, dass Verlust von Bax mit höherem Differenzierungsgrad und schlechterer Prognose assoziiert ist (Sturm et al., 1999). Die Diskrepanz dieser Daten zu den hier präsentierten, spiegelt das Problem der Vergleichbarkeit von Daten wieder. Unterschiedliche Methoden der Herstellung und Auswertung von immunhistochemischen Färbungen, des Stichprobenumfangs und der Art des Tumormaterials wirken [Seite 69↓]dabei erschwerend. Des Weiteren ist die transkriptionelle Regulation der Bax-Expression noch nicht vollständig bekannt. Bax wird p53-abhängig induziert, es kann aber auch über Bak, die BH3-only-Proteine Nbk/Bik, Puma und Noxa Apoptose vermitteln. Welche Bedeutung diese Signalwege für die Bax-Proteinexpression haben, ist noch unklar. Dennoch kann, nicht zuletzt aufgrund der vorliegenden Studie davon ausgegangen werden, dass der Verlust von Bax-Protein ein unabhängiger prognostischer Faktor für das kolorektale Adenokarzinom ist.

4.1.3 Der p53/Bax-Signalweg ist von prognostischer Relevanz

Die Deregulation des p53/Bax-Signalwegs infolge von p53-Mutation und Expressionsverlust von Bax, ist prognostisch besonders ungünstig für den Krankheitsverlauf von CRC im Stadium III. Interessanterweise besteht aber keine Korrelation zwischen dem p53-Status und der Bax-Expression. p53-Wildtyp und p53-mutierte Tumore unterschieden sich in der Bax-Expression nicht signifikant. Eine Erklärung dieser Diskrepanz ist möglicherweise die Tatsache, dass Bax von 2 Promotoren, einem in der 5´-untranslatierten Region und einem zweiten in Exon 1 und 2, transaktiviert wird (Miyashita et al., 1994). Des Weiteren wird Bax nicht nur durch p53 reguliert. BH3-only Proteine wie Nbk/Bik, tBid, Bim, Bad, Noxa, Puma oder Hrk können Bax transaktivieren. Andererseits kann p53 in einigen Fällen trotz Mutation des Gens durch differenzielle Effekte induziert werden. p53 wird durch verschiedene Signale induziert und stabilisiert. Über die Transaktivierung von Zielgenen wie p21Waf1/Cip1, 14-3-3 σ, Puma, Noxa, Gadd45, MSH2, Apaf-1, u.a. vermittelt es seine verschiedenen Funktionen: die Regulation von Wachstum, Zellzyklus und Apoptose. Wird p53 in Folge von DNA-Schäden, Expression von E1A oder c-Myc oder nach Entzug von Wachstumsfaktoren induziert, vermittelt es Apoptose u.a. über die Transaktivierung von Bax, den mitochondrialen DISC und die Caspasenkaskade.

Die Inaktivierung des p53-Signalwegs sowie verschiedener nachgeschalteter Regulatoren konnte in anderen Tumoren prognostische Signifikanz aufweisen. Eine Vorarbeit zur p53-Signalweganalyse von Lebermetastasen kolorektaler Adenokarzinome konnte ebenfalls ein besseres Überleben der Patienten mit intaktem Signalweg, p53-Wildtyp-Tumoren und starker Bax-Expression, aufzeigen (Sturm et al., 1999). Durch die multigene Analyse des p53/Bax/p16-Signalwegs von Plattenepithelkarzinomen des Ösopha[Seite 70↓]gus (Sturm et al., 2001) können Patienten mit günstiger Prognose identifiziert werden.

In experimentellen Arbeiten zur Bax-Regulation konnte gezeigt werden, dass p53 das Bax-Gen transaktiviert und so die Bax-Expression verstärkt. Für CRC im Stadium III kann in vivo jedoch keine Abhängigkeit der Bax-Proteinexpression vom p53-Mutationsstatus festgestellt werden. Der p53-Mutationsstatus scheint nicht der determinierende Faktor für die Expression von Bax zu sein (DeAngelis et al., 1998). Möglicherweise kann Bax auch noch durch einige mutierte p53-Varianten transkriptionell aktiviert werden. Das Bax-Gen kann weiterhin auch über p53-unabhängige Signalwege induziert werden. In p53-mutierten Tumoren könnte so die insuffiziente p53-Funktion umgangen werden und Bax anderweitig induziert werden. Umgekehrt ist es wahrscheinlich, dass eine reduzierte Bax-Expression in p53-kompetenten Tumoren durch die Aktivierung redundanter nachgeschalteter Signalwege von anderen Genen substituiert werden kann, wie z.B. p73 oder p63.

4.1.4 p16INK4a ist kein unabhängiger Prognosefaktor für das CRC

Die p16INK4a-Expression hat keine unabhängige prognostische Bedeutung für fortgeschrittene CRC. Es besteht weiterhin kein Zusammenhang zwischen p16INK4a-Expression und den untersuchten klinisch-pathologischen Parametern bei Tumoren im Stadium III. Eine tendenziell verminderte p16INK4a-Expression ist in pT4- gegenüber pT1-Tumoren zu beobachten. Im Gegensatz dazu hat der p53/p16INK4a-Status einen Einfluss auf die Prognose (Wilcoxon-Test p=0,0409; Mantel-Cox Log-Rang-Test p=0,09). p53-Wildtyp und hohe p16INK4a-Expression gehen mit einer besseren Prognose einher. Diese Tumore zeigen zudem eine höhere mediane p16INK4a- Expression als die mutierten Tumore. Es besteht jedoch keine Korrelation von p16INK4a- und Bax-Expression.

Bei der Tumorentstehung und Progression ist die Dysregulation des Zellzyklus von zentraler Bedeutung. Innerhalb dieses Signalwegs hat das p16INK4a-Gen eine regulatorische Funktion. p16INK4a wird von p53 bei zytotoxischem Stress wie DNA-Schäden oder Hypoxie induziert. Es verhindert die Assoziation von CDK4 und CDK6 mit den D-Typ-Cyklinen und führt so über die Regulation der Rb-Aktivität zum G1-Arrest. Die Inaktivierung des p16INK4a-Gens ist ein häufiges Ereignis in humanen Tumoren und kann als Folge von Deletionen, Frameshift-Mutationen, Promotorhypermethylierung und Punktmutationen entstehen. Die meisten dieser genetischen und epigenetischen Verände[Seite 71↓]rungen resultieren in einer verminderten oder fehlenden p16INK4a-Expression (Reed et al.,1996; Papdimitrakopoulou et al.,1997). Zellen mit verminderter oder fehlender p16INK4a-Expression sind resistenter gegenüber DNA-Schäden, welche bei Zellen mit intaktem p16INK4a und Rb-Protein zum Wachstumsarrest führen würden (Shapiro et al.,1998). Des Weiteren scheinen p53 und p16INK4a bei der Apoptoseinduktion zu kooperieren (Sandig et al., 1997). p16INK4a kann somit die Funktion eines Tumorsuppressors übernehmen (Sharpless et al.,1999). Bei der Signalweganalyse ist deshalb auch die prognostische Bedeutung der p53/p16INK4a-Dysregulation von Interesse.

Insgesamt war die p16INK4a-Expression der untersuchten Tumore gering. Die Beurteilung von p16INK4a-Verlusten in den immunhistochemisch gefärbten Gewebeschnitten wurde dadurch erschwert. Möglicherweise sind Schwankungen des p16INK4a-Gehalts während der verschiedenen Zellzyklusphasen eine Ursache. Andererseits mag ein anderer CDK-Inhibitor wie p21Waf1/Cip1, p27 oder ein anderes Mitglied der INK4-Familie von größerer Bedeutung sein. Grundsätzlich exprimieren Normal- und Primärtumorgewebe wenig p16INK4a-Protein (Ruas und Peters, 1998; Geradts et al.,1995), am wenigsten während der G0- und frühen G1-Phase. Zudem ist die Expression von p16INK4a gewebeabhängig. In Kolonkarzinomzellen scheint sie niedrig zu sein (Geradts et al.,1995). Für verschiedene Tumorgewebe werden trotzdem p16INK4a-Expressionsverluste beschrieben (Kratzke et al., 1996; Reed et al., 1995). Obwohl Verlust der p16INK4a-Expression in kolorektalen Karzinomen ein seltenes Ereignis zu sein scheint (Geradts et al., 1995), wiesen die Tumorproben eine hohe Schwankungsbreite zwischen sowohl hoher als auch geringer p16INK4a-Expression auf.

Obwohl bei verschiedenen Tumoren ein prognostischer Einfluss der Proteinexpression auf den Krankheitsverlauf beobachtet werden kann, ist die p16INK4a-Expression für sich genommen kein prognostischer Faktor für dieses CRC Patientenkollektiv. Bekannt ist, dass der Verlust von p16INK4a-Protein bei malignen Melanomen (Reed et al.,1995) mit Tumorprogression korreliert. Verlust von p16INK4a-Protein kann als prognostisch ungünstiger Faktor für NSCLC (Kratzke et al.,1996) und Plattenepithelkarzinome des Ösophagus (Sturm et al., 2001) beschrieben werden. In einer Studie zur Hypermethylierung des p16INK4a-Promotors kolorektaler Karzinome im Stadium III geht p16INK4a-Inaktivierung mit kürzerem Überleben einher (Liang et al., 1999). Da hier jedoch nur eine tendenziell schlechtere Prognose für Patienten mit schwacher p16INK4a-Expression beobachtet werden kann, ist möglicherweise die Wahl von Methode und Stichprobe von entscheidender Bedeutung. Alternativ hierzu könnte bei der Studie von Liang et al. die [Seite 72↓]Methylierung weiterer therapeutisch relevanter Gene Grund für die prognostische Relevanz dieser monogenetischen Studie sein.

Andererseits ist der p53/p16INK4a-Status möglicherweise von prognostischer Bedeutung. p53-Wildtyp und hohe p16INK4a-Expression gehen mit einer besseren Prognose einher. Diese Tumore zeigen zudem eine höhere mediane p16INK4a-Expression als die mutierten Tumore. Bei der Analyse der prognostischen Relevanz des p16INK4a/p53/p14ARF-Signalwegs für aggressive Non-Hodgkin-Lymphome konnte die Dysregulation dieses Signalwegs als unabhängiger prognostischer Faktor definiert werden (Gronbaek et al., 2000). Das gleichzeitige Vorliegen von p16INK4a und p53/p14ARF-Mutationen geht dort mit einer signifikant schlechteren Prognose einher.

Obwohl p53 und p16INK4a bei der Apoptoseinduktion über Bax und den mitochondrialen DISC zu kooperieren scheinen (Sandig et al., 1997), besteht keine Korrelation von p16INK4a- und Bax-Expression für CRC im Stadium III. Bei der Signalweganalyse von Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus hatten die Patienten mit intaktem Bax/p16INK4a-Signalweg die beste Prognose (Sturm et al., 2001). In einer zusätzlichen multigenen Signalweganalyse wurden Cyclin D, Bax und p16INK4a als unabhängige Prognosefaktoren für das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus definiert (Güner et al., 2002). Im gegenwärtigen Kollektiv kolorektaler Karzinome hatten die Patienten mit niedriger Bax- und p16INK4a-Proteinexpression die tendenziell schlechteste Prognose, schlechter als für niedrige Bax-Expression allein. Da das Ergebnis lediglich grenzwertig signifikant ist, kann dieser Zusammenhang letztlich jedoch nur vermutet werden. Ob die beiden Parameter innerhalb eines Signalwegs kooperieren oder unabhängig voneinander Apoptose induzieren und inwieweit Zellzyklusarrestkontrolle durch p16INK4a hier eine Rolle spielt ist noch unklar.

4.1.5 p53-Status, Bax- und p16INK4a-Expression sind keine Prognosefaktoren im Stadium IV

Im Stadium IV konnte keine prognostische Relevanz des p53-Status oder der Bax- und p16INK4a-Expression nachgewiesen werden. Bei der Korrelation von p16INK4a-Expression und den untersuchten klinisch-pathologischen Parametern konnte lediglich eine tendenzielle Zunahme der Proteinexpression in Tumoren mit fortgeschrittenem Lymphknotenstatus von pN0 zu pN4 sowie auch bei Entdifferenzierung von G2 zu G3 beobachtet wer[Seite 73↓]den.

Im Gegensatz zu einer vorangegangenen Arbeit zum Gesamtüberleben nach Lebermetastasenresektion bei CRC, hat die Bax-Expression im Stadium IV keinen Einfluss auf die Prognose (Sturm et al., 1999). Anders als bei den untersuchten Leber-metastasen stellen die hier untersuchten Tumore im Stadium IV eine heterogene Gruppe dar, die sich beträchtlich hinsichtlich der Lokalisation, Anzahl und Ausprägung der Fernmetastasen unterscheidet. Somit sind die Daten nur schwer vergleichbar. Wahrscheinlich überwiegen hier die Vielzahl und Heterogenität individueller maligner Ereignisse und minimieren so den proapoptotischen Effekt von Bax.

Ob die verstärkte p16INK4a-Expression in fortgeschrittenen Tumoren einen realen Trend darstellt oder ein statistisches Artefakt ist, bleibt unklar. Auch hierzu kann aufgrund der Heterogenität der Tumore keine zuverlässige Aussage getroffen werden. Für weitere Analysen der Tumore im Stadium IV sollten deshalb Lokalisation, Anzahl und Ausprägung der Fernmetastasen berücksichtigt werden.

4.1.6 Repräsentativität der Stichprobe

In dieser Analyse wurden neben den „konventionellen“ bzw. etablierten prognostischen Faktoren der TNM-Klassifikation auch molekulare Regulatoren mit potentieller prognostischer klinisch-pathologischer Relevanz für das CRC untersucht. Einer dieser konventionellen Faktoren ist die Tumorlokalisation. Es ist bekannt, dass die Prognose rektaler Adenokarzinome ungünstiger ist als die von Kolonkarzinomen. Auch in dieser Kohorte ist die Prognose für rektale Karzinome schlechter als für Kolonkarzinome. In der univariaten Analyse ist die Tumorlokalisation im Rektum mit dem höchsten relativen Risiko verbunden, an der Erkrankung frühzeitig zu versterben. Dies gilt auch für die multivariate Analyse, in der das relative Risiko an einem rektalen Karzinom früh zu versterben, um den Faktor 5,4 erhöht ist. Weitere mögliche Risikofaktoren wie hohes Lebensalter und männliches Geschlecht sind nicht mit einem erhöhten relativen Risiko verbunden. Der Lymphknotenstatus ist als einziger Parameter der TNM-Klassifikation mit einem erhöhten Sterberisiko verbunden, nicht jedoch die Infiltrationstiefe des Primärtumors oder der Differenzierungsgrad.

Ein Grund dafür ist möglicherweise die geringe Fallzahl der Studie. Die insgesamt 116 Patienten wurden aufgrund der statistisch unterschiedlichen Überlebensraten auf die [Seite 74↓]Stadien III und IV aufgeteilt werden. Der Stichprobenumfang der einzelnen Gruppen wurde so auf 59 im Stadium III und 57 im Stadium IV reduziert. Durch Verkleinerung des Stichprobenumfangs verändert sich die Power eines statistischen Tests. Die statistische Power gibt die Wahrscheinlichkeit an, eine wahre Differenz der Überlebenskurven zu erkennen (Glantz, 1998). Sie ist von verschiedenen Faktoren abhängig: der Größe des zu erkennenden Unterschieds, vom Fehler erster Art, dem Risiko für ein falsch positives Ergebnis, und von der Größe der Stichprobe (Glantz, 1998). Andererseits ist der zum Erkennen des Unterschieds benötigte Stichprobenumfang von der Power und dem Fehler erster Art abhängig. Wird die Power durch Verkleinerung der Fallzahl geringer, steigt zusätzlich die Wahrscheinlichkeit für einen Fehler zweiter Art, ein falsch negatives Ergebnis, an. Dabei wird ein existenter Unterschied nicht erkannt. Deshalb sollte die Signifikanz der in dieser Analyse als nicht signifikant bewerteten Parameter an größeren Patientenkollektiven überprüft werden; insbesondere die Relevanz des p16INK4a-, p53/Bax-, p53/p16INK4a- und Bax/p16INK4a-Status für die Prognose der Patienten mit CRC im Stadium III und IV.

4.2 Relevanz der Apoptose- und Zellzyklusregulation
für die Therapie maligner Tumore

4.2.1 TNM-Klassifikation

Die stadienadaptierte Behandlung CRC orientiert sich an der TNM-Klassifikation der UICC. Diese Klassifikation bietet Ärzten eine Methode zur Therapieplanung, Prognoseabschätzung und Bewertung des Krankheitsverlaufs. Bis heute basiert die Klassifikation ausschließlich auf der anatomischen Tumorausbreitung, die als Infiltrationstiefe, Lymphknoteninfiltration und Fernmetastasen in die Stadieneinteilung eingehen. Die Stadieneinteilung der TNM-Klassifikation wird den Therapiezielen und auch der Prognoseabschätzung als Grundlage für die spezifische Behandlung CRC allerdings nicht immer gerecht. So konnten Greene et al. signifikante Unterschiede der 5-Jahresüberlebensrate von 5988 Patienten mit Rektumkarzinom im Stadium III beschreiben (Greene et al, 2003). Die subgruppenspezifische Untergliederung des Stadium III in ein Stadium IIIa (T1/2, N1), b (T3/4, N1) und c (jedes T, N2) wies signifikant unterschiedliche 5-Jahresüberlebensraten unabhängig von den adjuvanten Therapien auf.


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Ein Anliegen dieser Arbeit war es deshalb, die prognostische Relevanz von Apoptose- und Zellzyklusregulatoren für Patienten mit fortgeschrittenem CRC hinsichtlich der Identifikation von Subgruppen mit unterschiedlicher Prognose zu überprüfen. Die Patienten wurden nach Stadien getrennt untersucht, da sich die Prognose aufgrund der Fernmetastasierung im Stadium IV deutlich verschlechterte. Für das CRC im Stadium III können die zytoplasmatische Bax-Proteinexpression sowie die Deregulation des p53/Bax-Signalwegs als prognostische Faktoren angenommen werden. Patienten mit niedriger Bax-Expression sowie p53-Mutation und niedriger Bax-Expression haben eine signifikant ungünstigere Prognose. Da die Fallzahl dieser Analyse niedrig ist, sollte das Ergebnis an größeren Patientengruppen validiert werden. Dann wäre eine Orientierung an diesem Parameter für spezifischere Therapien und Prognoseabschätzung möglich. Des Weiteren müsste insbesondere die mögliche Unterteilung des TNM-Stadium III in ein Stadium IIIa, mit p53-Wildtyp und starker Bax-Expression sowie IIIb, mit p53-Mutation und niedriger Bax-Expression überprüft werden.

4.2.2 Apoptosesignaldefekte und Therapieresistenz

Die Therapie kolorektaler Karzinome mit kurativer Zielsetzung basiert auf zwei Säulen, den primär chirurgischen Maßnahmen und den nicht chirurgischen Therapien. Auf die Bedeutung der Apoptose- und Zellzyklusregulatoren für nicht chirurgische Therapien soll hier näher eingegangen werden.

Nahezu alle adjuvanten und neoadjuvanten Therapien basieren auf dem Prinzip, Zellzyklusarrest und Apoptose in Tumorzellen auszulösen. Zytotoxische Therapien induzieren auf den verschiedenen Ebenen der Apoptosesignalkaskade Zelltod. Therapeutisch relevant ist der mitochondriale DISC (Wieder et al., 2001). Infolge der Inaktivierung dieses Signalwegs können Tumorzellen Anti-Tumor-Therapien überleben und resistent werden. Neben verschiedenen metabolischen Entgiftungsmechanismen der Resistenzentwicklung kann Resistenz von Zellen gegenüber Apoptosesignalwegen Chemotherapieresistenz bedingen (Wu und El-Deiry, 1996). Dies ist in allen erwähnten Signalwegen der Zelltodregulation als Folge von Funktionsverlust apoptosefördernder Gene oder der Überaktivität apoptosehemmender Signale möglich (Daniel, 2003a). Diese Ergebnisse wurden bisher vorwiegend in vitro nachgewiesen. Eine Zuordnung von spezifischen Defekten zu einer bestimmten Tumorart, welche eine zukünftige individuelle Anpassung [Seite 76↓]von Therapiekonzepten erlauben könnte, ist noch nicht möglich. Hier liefert die vorliegende Studie einen wichtigen Baustein.

Auch Schäden von zellulären Reparaturmechanismen sind für Therapieresistenz verantwortlich. Bei Inaktivierung des ATM (Ataxia-teleangiectasia mutated)-Gens ist die Sensitivität der Tumorzelle gegenüber DNA-Schädigung reduziert. Die ATM-Kinase wird bei strahleninduzierter DNA-Schädigung aktiviert und induziert über die Phosphorylierung von Substraten (p53, c-Abl, Rad519) die Aktivierung von Zellzyklusarrest und Escapemechanismen. Dies kann zur Ausbildung von resistenten Phänotypen führen. Die Relevanz von verschiedenen Defekten der Apoptoseinduktion für die Entstehung von Therapieresistenzen wird derzeit intensiv untersucht.

Die Inaktivierung des p53-Signalwegs sowie der nachgeschalteten Regulatoren, insbesondere der DNA-Reparaturmechanismen, der Zellzyklus-Checkpunkte und der Apoptosesignalkaskade sind dabei von zentralem Interesse. Therapieresistenz bedingt durch Mutationen des p53-Gens kann bei B-CLL-Zellen in vitro beobachtet werden (Sturm et al., 2003). Diese Mutationen gehen außerdem mit schlechterer Prognose einher und sind in vitro mit Apoptoseresistenz gegenüber Alkylantien, Fludarabin und ionisierender Strahlung korreliert (Sturm et al., 2003). p53-Mutationen treten dabei häufiger bei Patienten auf, die mit Alkylantien vortherapiert worden sind. In experimentellen Modellen kann durch Alkylantien p53-Inaktivierung als Folge von Mutationen ausgelöst werden. Therapieresistenz kann möglicherweise durch p53-Inaktivierung in Folge von DNA-schädigender Therapie entstehen.

Auch das Bax-Protein ist bei der Entstehung von Chemotherapieresistenzen von Bedeutung. Die Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika kann durch Bax-Überexpression in Mammakarzinomzellen verstärkt werden (Wagener et al., 1996). Reduzierte Bax-Expression geht mit einer verminderten Empfindlichkeit gegenüber Anthrazyklinen (Doxorubicin, Epirubicin), Alkylantien (Chlorambucil, Mafosfamid) und Vincristin bei Patienten mit B-CLL einher (Bosanquet et al., 2002). Zum CRC gibt es nur wenige Daten. In vitro scheint die Therapieresistenz gegenüber 5-Fluoruracil (5-FU 5-Fluoruracil) vom p53/Bax-Signalweg abhängig zu sein. Bei der Analyse 5-FU-induzierter Apoptose in kolorektalen Zelllinien konnte eine Abhängigkeit der Resistenz vom p53/Bax-Status beobachtet werden (Violette et al., 2002). Die Langzeitbehandlung von p53-Wildtypzellen mit 5-FU ging bei gleichzeitig verminderter Bax-Proteinexpression mit Apoptoseresistenz der Zellen einher. Außerdem resultierte in p53-Wildtyp und p53-[Seite 77↓]mutierten Zellinien hohe Bcl-2- und Bcl-xL-Proteinexpression sowie niedrige Bax-Expression in verstärkter Chemoresistenz gegenüber 5-FU. In vivo Daten zum Rektumkarzinom zeigten hingegen, dass der p53/Bax-Status bei einer kombinierten Behandlung mit Bestrahlung sowie 5-FU mit und ohne Hyperthermie für das Ansprechen keine Rolle spielt. Vermutlich können Defekte im p53/Bax-Signalweg durch die Kombinationstherapie umgangen werden (Rau et al., 2003). Möglicherweise sind aber auch Zellzyklusregulatoren wie p21Waf1/Cip1 an der Resistenzentwicklung von Rektumkarzinomen beteiligt. Nach zytotoxischer Therapie und Bestrahlung hatten die Patienten mit posttherapeutisch reduzierter p21Waf1/Cip1-Expression eine bessere Prognose als Patienten mit posttherapeutisch angestiegener p21Waf1/Cip1-Expression (Rau et al., 2003). Auch bei der Deregulation des p53/p16INK4a/p14ARF-Signalwegs scheinen CDK-Inhibitoren für die Resistenzentwicklung von Bedeutung zu sein. Im Mausmodell konnte die Ausbildung von aggressiven Lymphomentitäten durch Inaktivierung des INK4a Genlokus beobachtet werden (Schmitt et al., 1999).

Obwohl das Verständnis der spezifischen Resistenzmechanismen maligner Tumore noch lange nicht ausreichend ist, wird dennoch nach Möglichkeiten gesucht, die bislang bekannten Mechanismen zu revertieren und gezielt zu umgehen. Die molekularen Grundlagen bieten dabei diverse Ansatzmöglichkeiten.

Der p53-vermittelte Signalweg zur Aktivierung des mitochondrialen DISC, des Apoptosoms, kann auf verschiedenen Ebenen aktiviert werden. Durch den Einsatz von niedermolekularen Substanzen kann beispielsweise mutiertes und dadurch missgefaltetes p53-Protein in eine funktionelle Form zurückgefaltet werden (Foster et al., 1999). Das antiapoptotische Bcl-2 kann durch Antisense-Oligonukleotide inaktiviert werden (Klasa et al., 2001). Auch das mitochondriale Apoptosom kann über den peripheren Benzodiazepin-Rezeptor und dessen Inhibitoren in seiner Aktivität moduliert werden (Maaser et al., 2001). Signaldefekte in Tumoren können auf den verschiedenen Ebenen spezifisch modifiziert und so normale Zellen vor zytotoxischen Nebenwirkungen geschützt werden. Flavopiridol, ein Kinaseinhibitor, kann CDK hemmen und so, wie auch der bei CML erfolgreich eingesetzte Tyrosinkinaseinhibitor STI-571 (Imatinib), Zellzyklusarrest und Apoptose auslösen (Senderowicz et al., 2000).

Gentherapeutische Ansätze, die über die Einschleusung von Apoptose fördernden sowie Zellzyklus hemmenden Genen in die Zelle verabfolgt werden, sind jedoch noch weit von der klinischen Anwendung entfernt. Mit Hilfe von viralen Gentherapievektoren kön[Seite 78↓]nen die proapoptotischen Bcl-2-Homologe Bax, Bak, Nbk/Bik (Radetzki et al., 2002) und Pro-Caspase 3 (Friedrich et al., 2001) in Zellen eingeschleust werden und Apoptose induzieren bzw. Therapieresistenz revertieren. Zellzyklushemmende Gene wie p16INK4a, p53 oder p14ARF (Hemmati et al., 2002) können ebenfalls über virale Vektoren in Tumorzellen eingeschleust werden und deren Wachstum hemmen. Diese Ansätze werden aber derzeit, mit Ausnahme von p53, nicht in klinischen Studien getestet. Der Grund dafür sind ungelöste Probleme zum viralen Gentransfer in vivo.

Letztendlich gilt aber auch für diese neuen, selektiven molekularen Therapiestrategien von malignen Tumoren, dass die genaue Kenntnis der molekularen Mechanismen bei der Tumorentstehung und Progression von zentraler Bedeutung ist, um optimale Anwendung und Wirksamkeit in Abhängigkeit von therapeutischen Zielstrukturen und Signalkaskaden zu gewährleisten. Besonderer Wert sollte hierbei auf die Analyse möglichst kompletter Signalkaskaden gelegt werden, um auch komplexe Störungen und Inaktivierung von Signalwegen und Resistenzmechanismen auf multiplen Ebenen zu erfassen.

4.3 Schlussfolgerung

Die Analyse von Schlüsselgenen der Apoptose- und der Zellzyklusregulation zeigte in dieser Studie prognostische Bedeutung für Patienten mit CRC im Stadium III. Insbesondere geringe Bax-Expression ist ein unabhängiger prognostisch ungünstiger Faktor für Patienten mit CRC im Stadium III. Durch kombinierte Analyse von p53 und Bax konnte die prognostische Aussagekraft weiter verbessert werden. Ebenso hatten Patienten mit intakter p16INK4a-Expression und Wildtyp p53 eine bessere Prognose. Hingegen hatte die monogenetische Analyse von p16INK4a bzw. p53 keine prognostische Relevanz. Bei der Untersuchung etablierter klinisch-pathologischer Parameter waren der Lymphknotenstatus (pN2,3) und die Tumorlokalisation im Rektum von unabhängiger prognostischer Relevanz. Diese Studie unterstützt das Konzept der multigenen oder „Multimarker“-Analyse von Genen der Apoptose- und Zellzyklusregulation, welche aufeinanderfolgend bzw. synergistisch wirken und dadurch von Vorteil gegenüber monogenen Analysen sind. Diese „neuen“ molekularen Marker könnten nach weiterer Untersuchung und Validierung in prospektiven Studien etablierte klinisch-pathologische Prognosefaktoren ergänzen und so zur Therapieoptimierung beitragen.


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26.01.2005