Prognostische Bedeutung des p53/Bax/p16INK4a-Signalwegs bei Patienten mit kolorektalem KarzinomKatharina Schelwies 3417248#40381.11.1.19101.1.21.211121.3131.414151.51.5.11.5.1.1161.5.1.2171.5.2181.6191.6.120622#4342122231.6.224624#379251.6.32627364#415281.6.4291.6.4.130311.6.4.2321.6.4.333341.72352.1362.22.2.1372.2.22.2.338392.2.440412.2.542432.2.6442.2.7452.32.3.1462.3.22.3.3472.3.3.12.3.4482.3.52.3.63493.1408#324503.2586#2953.351512#20152622#451533.4528#20554606#4925556623#4953.557623#1813.63.6.1528#233583.6.2624#2523.6.359623#258603.6.4561#248613.6.5623#2633.6.662623#2503.6.763644654.14.1.166674.1.268694.1.3704.1.471724.1.5734.1.6744.24.2.1754.2.27677784.3 Literaturverzeichnis7980818283848586878889909192 Abkürzungsverzeichnis9394 ERKLÄRUNG AN EIDES STATT95deInhaltsverzeichnisHilfeAus der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt
Hämatologie, Onkologie und Tumorimmunologie
Campus Berlin Buch
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin BerlinDissertationPrognostische Bedeutung des p53/Bax/p16<sup>INK4a</sup>-Signalwegs<br/>bei Patienten mit kolorektalem Karzinomzur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr.med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlinvon


Katharina Schelwies

aus Stuttgart Bad Cannstatt Prof. Dr. med. Martin Paul Prof. Dr. med. P. Daniel Prof. Dr. R. Greil Prof. Dr. rer. nat. S. Wesselborg Datum der Promotion: 19.11.2004 Zusammenfassung

Die Dysregulation von Zelltod-Signalwegen ist häufig bei malignen Tumoren. Inaktivierung von Apoptose-Signalwegen und gleichzeitige Unterbrechung der Zellzyklusregulation bestimmen nicht nur die Tumorentstehung, sondern auch intrinsische und erworbene Therapieresistenz sowie die Prognose der Erkrankung. Das Ziel dieser Studie war daher, den prognostischen Wert der Bax- und p16INK4a-Proteinexpression in Korrelation zum Mutationsstatus des p53-Tumorsuppressorgens in einem Kollektiv von primären kolorektalen Adenokarzinomen zu analysieren.

Methoden: Die retrospektive Analyse wurde an 116 Patienten durchgeführt, welche in kurativer Intention an einem kolorektalen Karzinom (CRC) operiert und für ein Minimum von 5 Jahren oder bis zum Tod nachbeobachtet worden waren (UICC Stadium III: 59 Patienten; UICC Stadium IV: 57 Patienten). Die Profile der Bax- und p16INK4a-Proteinexpression wurden mittels Immunhistochemie, die Bindungsdomäne des p53-Gens (Exon 5 - 8) mittels Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)-PCR auf Mutationen untersucht. Die gewonnenen Daten wurden mit klinisch-pathologischen Daten korreliert und statistisch analysiert

Ergebnisse: Das mediane Gesamtüberleben betrug 17 Monate. Wie zu erwarten, lebten die Patienten mit Stadium III-Tumoren länger als Patienten im fortgeschrittenen Stadium IV: 69 vs. acht Monate (p<0,0001). Stadium III-Tumore mit schwacher Bax-Expression waren mit einem signifikant ungünstigeren Überleben assoziiert als Tumore mit starker Bax-Expression (p=0,009). p53-Mutationen oder p16INK4a-Expression hatten keinen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben. Die kombinierte Analyse des p53/Bax-Signalwegs für Stadium III-Tumore zeigte den ungünstigsten Verlauf für Patienten mit defektem Signalweg (p53 mutiert/Bax schwach; p=0,004). Im Gegensatz dazu hatte der p53/Bax-Status in Stadium IV-Tumoren keine Bedeutung für das Überleben.

Schlussfolgerung: Die Unterbrechung des p53/Bax-Signalwegs in primären kolorektalen Adenokarzinomen ist ein unabhängiger prognostisch ungünstiger Faktor nach kurativer R0-Resektion von Stadium III-Tumoren. Die Unterbrechung des p53/Bax-Signalwegs könnte zur Identifikation von Patientengruppen mit hohem Risiko beitragen, welche in der Zukunft von Risiko adaptierten adjuvanten Therapien profitieren könnten.

 Apoptose Bax p53 Prognose Abstract

Deregulation of cell death pathways is a frequent event in cancer. Inactivation of apoptosis pathways in concert with disruption of cell cycle regulation not only contributes to tumor development and the clinical course of cancer disease but also determines intrinsic and acquired resistance to cancer therapy and disease prognosis. Therefore, the purpose of this study was to analyse the prognostic value of Bax and p16INK4a protein expression in correlation to the mutational status of the p53 tumorsuppressor gene in primary colorectal adenocarcinoma.

Methods: Retrospective analysis was performed in a cohort of 116 patients undergoing surgery for colorectal adenocarcinoma (CRC) with curative intention. Patients were followed-up for a minimum of five years or until death (UICC Stage III: 59 patients, UICC Stage IV: 57 patients). Protein expression profiles of Bax and p16INK4a were analysed by immunhistochemistry, the binding-domaine of the p53-gene (exon 5 - 8) was screened for mutations by Single-Strand-Conformation-Polymorphism (SSCP)-PCR. Data was correltated with clinical and pathological parameters and analysed statistically.

Results: Overall median survival was 17 months. As expected, patients with stage III malignancies survived longer than stage IV patients: 69 months vs. 8 months (p<0,0001). Stage III tumors with high Bax expression were associated with a significantly better prognosis than Bax low expressing tumors (p=0,009). p53-mutational status or p16INK4a-expression was of no significance for overall survival. Combined analysis of p53/Bax pathway analysis for stage III carcinomas revealed the worst outcome for patients with a disrupted pathway (mutated p53/Bax low; p=0,004). In contrast no significant effect of the p53/Bax status was found in stage IV tumors.

Conclusions: Disruption of the p53/Bax pathway, i.e. low Bax expression in primary colorectal adenocarcinoma is an independent negative prognostic factor after curative R0-resection in stage III patients. Furthermore the prognostic power of a disrupted p53/Bax pathway may be helpful to define subgroups of patients at high risk who may benefit from risk-adapted adjuvant therapies in the future.

 apoptosis bax p53 prognosis Inhaltsverzeichnis

  • 1  Einleitung

    • 1.1 Molekulargenetik und Pathogenese

      • 1.1.1 Genese des sporadischen Adenokarzinoms

      • 1.1.2 Genese des hereditären Adenokarzinoms

    • 1.2  Klinik und Diagnostik des CRC

    • 1.3 Stadieneinteilung

    • 1.4  Prognose

    • 1.5 Therapie des CRC im Stadium III und IV

      • 1.5.1 Adjuvante Therapie

        • 1.5.1.1 Kolonkarzinom

        • 1.5.1.2 Rektumkarzinom

      • 1.5.2 Palliative Therapie

    • 1.6  Apoptose- und Zellzyklusregulation

      • 1.6.1 Apoptosesignalwege

      • 1.6.2 Zellzyklusregulation

      • 1.6.3  Zellzyklus und Apoptose

      • 1.6.4 Inaktivierung von Apoptose- und Zellzyklusregulatoren in Tumoren

        • 1.6.4.1 p53 reguliert Apoptose- und Zellzyklussignalwege

        • 1.6.4.2 Bax ist ein proapoptotisches Mitglied der Bcl-2 Familie

        • 1.6.4.3  p16INK4ahemmt die Cyclin-abhängigen Kinasen CDK 4/6

    • 1.7 Fragestellung

  • 2  Material und Methoden

    • 2.1 Patienten und Tumorgewebe

    • 2.2 Methoden

      • 2.2.1 Übersicht

      • 2.2.2 Präparation der genomischen DNA

      • 2.2.3  Amplifikation der p53-Bindungsdomäne (Exon 5-8)

      • 2.2.4 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)

      • 2.2.5 Immunhistochemische Färbung

      • 2.2.6 Quantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbung

      • 2.2.7 Statistische Analyse

    • 2.3 Geräte, Zubehör und Reagenzien

      • 2.3.1 Geräte und Zubehör

      • 2.3.2 Reagenzien

      • 2.3.3  Puffer

        • 2.3.3.1 Kits

      • 2.3.4  Enzyme und Nukleotide

      • 2.3.5 Antikörper und Zelllinien

      • 2.3.6 Computersoftware

  • 3  Ergebnisse

    • 3.1 Follow up

    • 3.2 Analyse der p53-Mutationen

    • 3.3  Analyse der Bax-Expression

    • 3.4 Analyse der p16INK4a-Expression

    • 3.5 Zusammenhang zwischen p53-Mutationen und Bax-Expression

    • 3.6 Einfluss von p53, Bax und p16INK4aauf das Gesamtüberleben

      • 3.6.1 p53-Mutationsstatus und Gesamtüberleben

      • 3.6.2 Bax-Expression und Gesamtüberleben

      • 3.6.3 p53/Bax-Status und Gesamtüberleben

      • 3.6.4 p16INK4a-Expression und Gesamtüberleben

      • 3.6.5 p53/p16INK4a-Status und Gesamtüberleben

      • 3.6.6  Bax/p16INK4a-Status und Gesamtüberleben

      • 3.6.7 Uni- und Multivariate Regressionsanalyse

  • 4  Diskussion

    • 4.1 Prognostische Relevanz von Apoptose- und Zellzyklus- regulatoren für CRC

      • 4.1.1 p53-Mutationen sind für die Prognose nicht entscheidend

      • 4.1.2 Verminderte Bax-Expression korreliert mit schlechter Prognose

      • 4.1.3 Der p53/Bax-Signalweg ist von prognostischer Relevanz

      • 4.1.4 p16INK4a ist kein unabhängiger Prognosefaktor für das CRC

      • 4.1.5 p53-Status, Bax- und p16INK4a-Expression sind keine Prognosefaktoren im Stadium IV

      • 4.1.6 Repräsentativität der Stichprobe

    • 4.2 Relevanz der Apoptose- und Zellzyklusregulation  für die Therapie maligner Tumore

      • 4.2.1 TNM-Klassifikation

      • 4.2.2 Apoptosesignaldefekte und Therapieresistenz

    • 4.3 Schlussfolgerung

  • Literaturverzeichnis

  • Abkürzungsverzeichnis

  • ERKLÄRUNG AN EIDES STATT

Tabellen

  • Tabelle 1: Anatomische Verteilung des kolorektalen Karzinoms (Schmoll et al., 1997)

  • Tabelle 2: Amsterdam-Kriterien (nach CAO, AIO, ARO, 1999)

  • Tabelle 3: Bethesda-Kriterien (nach CAO, AIO, ARO, 1999)

  • Tabelle 4: TNM- und Dukes-Klassifikation kolorektaler Karzinome

  • Tabelle 5: TNM-Stadieneinteilung des CRC nach UICC 1977

  • Tabelle 6: 5-Jahresüberlebensraten des CRC

  • Tabelle 7: Palliative Therapieschemata für das Kolonkarzinom

  • Tabelle 8: Klinisch-pathologische Daten des Patientenkollektivs

  • Tabelle 9: PCR-Primer für die p53-Mutationsanalyse

  • Tabelle 10: PCR-Reagenzien für p53-Mutationsanalyse

  • Tabelle 11: PCR-Protokoll für 35 Zyklen

  • Tabelle 12: nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel (10 %)

  • Tabelle 13: Immunhistochemische Bax-Färbung von UICC III- und IV-Tumoren

  • Tabelle 14: Immunhistochemische p16INK4a-Färbung von UICC III- und IV-Tumoren

  • Tabelle 15: Bax-Färbung in Abhängigkeit vom p53-Status

  • Tabelle 16: 1-, 2- und 5-Jahresüberlebensrate und p53- und Bax-Status

  • Tabelle 17: Univariate Regressionsanalyse für UICC III (n=59)

  • Tabelle 18: Multivariate Regressionsanalyse für UICC III (n=59)

  • Tabelle 19: Univariate Regressionsanalyse für UICC IV (n=57)

Bilder

  • Abbildung 1: Prozentuale Anteile der häufigsten Krebsformen an der Gesamtzahl 1997 im Saarland

  • Abbildung 2: Apoptosesignalwege (Daniel, 2003a).

  • Abbildung 3: Zellzyklusregulation durch Cycline und cyclinabhängige Kinasen (CDK) (Daniel, 2003a)

  • Abbildung 4: Vernetzung von Zellzyklus- und Apoptoseregulation, p14ARF/p53-Signalweg (Daniel, 2003a).

  • Abbildung 5: Kumulatives Überleben im Stadium III und IV.

  • Abbildung 6: SSCP-PCR.

  • Abbildung 7: Immunhistochemische Färbung des Bax-Proteins in kolorektalen Adenokarzinomen 200x, 400x

  • Abbildung 8: Boxplotanalyse des Bax-Färbeindex (FI) in Relation zum pT-, bzw. pN-Stadium und dem Differenzierungsgrad

  • Abbildung 9: Immunhistochemische Färbung des p16INK4a-Proteins in kolorektalen Adenokarzinomen 200x, 400x

  • Abbildung 10: Boxplotanalyse des p16INK4a-FI (Färbeindex) in Relation zu pT-, pN-Stadium und Differenzierungsgrad

  • Abbildung 11: Boxplotanalyse der prozentualen p16INK4a-Expression in Relation zu pT-, pN-Stadium und Differenzierungsgrad

  • Abbildung 12a,b,c: Boxplotanalyse des Bax-FI in Relation zum p53-Mutationsstatus von UICC III und IV-, UICC III- und UICC IV-Tumoren.

  • Abbildung 13a,b: p53-Mutationsstatus und kumulatives Gesamtüberleben

  • Abbildung 14a,b: Überleben im Stadium III und IV nach Kaplan-Meier

  • Abbildung 15a,b: p53-Status/Bax-Expression und kumulatives Überleben

  • Abbildung 16a,b: p16INK4a-Expression und kumulatives Überleben

  • Abbildung 17a,b: p53/p16INK4a-Status und Überleben im Stadium III und IV

  • Abbildung 18a,b: Bax/p16INK4a-Status und Überleben im Stadium III und IV