Morphologische, immunphänotypische und elektrophysiologische Eigenschaften deaktivierter muriner Mikroglia in vitro
Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix
Murine Mikrogliakulturen wurden mit Astrozyten-konditioniertem Medium (ACM) in einen deaktivierten Zustand überführt. Dies wurde anhand morphologischer (Grad der Ramifizierung) und immunologischer (Expression von Adhäsionsmolekülen) Parameter verifiziert. Durch den Einsatz von Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (M-CSF), Granulozyten/Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF), transformierenden Wachstumsfaktor 
(TGF-) und den gegen sie gerichteten Antikörpern wurde gezeigt, daß alle untersuchten Zytokine in unterschiedlichem Maße an der Deaktivierung der Mikrogliazellen durch ACM beteiligt sind. Außerdem wurde nach Stimulation mit ACM an murinen Mikrogliazellen eine transiente Hochregulation eines Kaliumauswärtsstromes beobachtet Das Auftreten dieses Kaliumstromes nach Inkubation der Mikrogliazellen mit ACM konnte auf die Wirkung von TGF-, welches im ACM enthalten ist, zurückgeführt werden. Der durch ACM in deaktivierter Mikroglia induzierte Kaliumkanal entsprach in seinen kinetischen und pharmakologischen Eigenschaften am ehesten dem klonierten Kanal Kv1.3. Die Kv1.3 Expression durch TGF- oder ACM war durch den unspezifischen Proteinkinaseinhibitor H7 unterdrückbar. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Expression des Kv1.3 Kanals nicht, wie bisher angenommen, ein Indikator für aktivierte Mikroglia ist.
Murine microglial cultures were deactivated with astrocyte-conditioned medium (ACM). The deactivation process was verified measuring morphological (ramification index) and immunological (expression level of adhesion molecules) parameters. By using macrophage-colony stimulating factor (M-CSF), granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), transforming growth factor (TGF-) and their corresponding antibodies it was shown, that to a different extent all of these cytokines influence the deactivation process of microglial cells by ACM. ACM treatment of microglial cultures also lead to a transient upregulation of a delayed potassium outward current. This upregulation was due to the impact of TGF- contained in ACM. The ACM induced potassium channel resembled in its kinetic and pharmacological properties the cloned Kv1.3 channel. Expression of Kv1.3 in microglial cells by TGF- or ACM was inhibited by the unspecific protein kinase inhibitor H7. These results show, that expression of Kv1.3 channels is not a special feature of activated microglia, which has been proposed in recent publications.
Inhaltsverzeichnis |
| Titelseite | Morphologische, immunphänotypische und elektrophysiologische Eigenschaften deaktivierter muriner Mikroglia in vitro |
| Abkürzungsverzeichnis
| Abkürzungsverzeichnis |
| 1
| Einleitung |
| 1.1 | Morphologische und immunologische Eigenschaften der Mikrogliazellen |
| 1.2 | Interaktion von Mikrogliazellen mit Neuronen und Gliazellen |
| 1.3 | Pathophysiologische Implikationen |
| 1.4 | Ionenkanäle in Mikrogliazellen |
| 2
| Material und Methoden |
| 2.1 | Herstellung von Mikrogliazellkulturen |
| 2.1.1 | Präparation der Primär- und Sekundärkulturen |
| 2.1.2 | Behandlung der Mikrogliazelllinie BV-2 |
| 2.1.3 | Behandlung der Mikrogliazellkulturen mit Astrozyten-konditioniertem Medium (ACM) und Zytokinen |
| 2.2 | Elektrophysiologische Untersuchungen |
| 2.2.1 | Anfertigung der Patchpipetten |
| 2.2.2 | Durchführung der Patch-clamp-Messungen |
| 2.2.3 | Extra- und intrazelluläre Lösungen |
| 2.2.4 | Pharmakologische Untersuchungen |
| 2.2.5 | Datenaufzeichnung und -analyse |
| 2.2.6 | Systematische Fehler und deren Behebung |
| 2.3 | Immunzytochemische Untersuchungen |
| 2.4 | Morphometrische Quantifizierung |
| 3
| Ergebnisse |
| 3.1 | Morphologische und immunphänotypische Charakterisierung der Mikrogliazellkulturen |
| 3.2 | Identifikation der astrozytären Faktoren, welche die morphologischen Veränderungen bewirken |
| 3.3 | Elektrophysiologische Analyse spannungsaktivierter Kaliumkanäle in ruhender Mikroglia |
| 3.4 | Bestimmung des astrozytären Faktors, der den spannungsaktivierten Kaliumauswärtsstrom induziert |
| 3.5 | Untersuchung der einwärts gleichrichtenden Kaliumströme an TGF- behandelten Mikrogliazellen |
| 3.5.1 | Vergleich der Stromdichten |
| 3.5.2 | Pharmakologische Charakterisierung der Einwärtsströme |
| 3.6 | Detaillierte Beschreibung des durch TGF- induzierten Kaliumauswärtsstromes IDR |
| 3.6.1 | Vergleich der Stromdichten |
| 3.6.2 | Kinetische Charakteristika des Kaliumauswärtsstromes |
| 3.6.2.1 | zeitabhängiges Aktivierungs- und Inaktivierungsverhalten |
| 3.6.2.2 | Steady-state Aktivierungs- und Inaktivierungsverhalten |
| 3.6.2.3 | frequenzabhängiges Verhalten des IDR |
| 3.6.3 | Ermittlung der pharmakologischen Eigenschaften des induzierten Kaliumauswärtsstromes |
| 3.6.4 | Untersuchungen zur intrazellulären Signalkaskade der Induktion des IDR durch TGF- |
| 3.6.4.1 | Untersuchungen zur Induzierbarkeit von Kaliumauswärtsströmen mit Aktivatoren von Proteinkinasen |
| 3.6.4.2 | Einfluß des Proteinkinaseinhibitors H7 auf die Induktion der Kaliumauswärtsströme |
| 3.6.4.3 | Beeinflussung der TGF--induzierten Auswärtsströme durch Inhibitoren von Proteinkinasen |
| 4
| Diskussion |
| 4.1 | Deaktivierung der Mikrogliazellen mit ACM |
| 4.2 | Identifikation der für die morphologischen Veränderungen verantwortlichen Zytokine |
| 4.3 | Veränderung der Kaliumkanalexpression bei deaktivierter Mikroglia |
| 4.4 | Bestimmung der Kaliumkanaltypen in deaktivierten Mikrogliazellen |
| 4.5 | Einfluß von Proteinkinasen auf den durch TGF- induzierten Kaliumauswärtsstrom |
| 4.6 | Funktionelle Bedeutung des Kaliumauswärtsstromes in deaktivierter Mikroglia |
| 5
| Zusammenfassung |
| Bibliographie
| Literaturverzeichnis |
| Anhang A
| Chemikaliennachweis |
| Anhang A
| Erklärung zur Vorabveröffentlichung von Ergebnissen |
| Danksagung | |
| Selbständigkeitserklärung | |
Abbildungsverzeichnis |
 | Gleichung 1 allgemeine Formel zur Bestimmung des elektrischen Stromflusses |
| Gleichung 2 Bestimmung der Stromdichte |
| Gleichung 3 mathematisches Äquivalent des Hodgkin-Huxley-Modells vom Typ n4j1 |
| Gleichung 4 Berechnung der Kaliumleitfähigkeit gK aus der gemessenen Spitzenamplitude I, dem Kaliumumkehrpotential EK und dem angelegten Testpotential E |
| Gleichung 5 Boltzmannfunktion zur Beschreibung des Aktivierungs- und steady-state Inaktivierungsverhaltens |
| Abbildung 1 | Schematische Darstellung der Ganzzellkonfiguration mit elektrischem Ersatzschaltbild (nach ) |
| Gleichung 6 allgemeine Gleichung zur Bestimmung des elektrischen Längswiderstandes |
| Gleichung 7 Ermittlung der Ströme, die über dem Serien- und Eingangswiderstand entsprechend Abbildung 1
fließen |
| Gleichung 8 Minderung der Kommandospannung durch Eingangs- und Serienwiderstand |
| Gleichung 9 mathematische Beschreibung des kapazitiven Stromflusses |
| Gleichung 10 Ermittlung der Zeitkonstante bei kapazitivem Stromfluß |
| Gleichung 11 Verschiebung der Potentialdifferenz durch das Liquid Junction Potential |
| Gleichung 12 theoretische Ermittlung des Liquid Junction Potentials |
| Abbildung 2 | Illustration der zur Berechnung des Ramifikationsindexes verwendeten Flächen |
| Abbildung 3 | Auslösung des Ramifikationsprozesses durch ACM: A-sekundäre Mikrogliakultur nach eintägigen Kontrollbedingungen (Kalibrationsbalken entspricht 100 µM); B-morphologische Veränderungen nach eintägiger Zugabe von ACM; C+D-Fixierung der Sekundärkultur nach fünftägiger ACM-Inkubation (D: täglicher Wechsel des Mediums) |
| Abbildung 4 | Mittelwerte der Ramifikationsindizes nach Zugabe von ACM für verschiedene Zeiträume |
| Abbildung 5 | immunzytochemische Färbung zur Detektion von MHC Klasse II Molekülen auf Mikrogliazellen; A-Expression des Antigens unter Kontrollbedingungen (Kalibrationsbalken: 50 µm); B-keine Veränderung der MHC-Färbung nach eintägiger ACM-Inkubation, jedoch deutliche Ramifizierung; C-nach fünftägiger Kultivierung in ACM Reduktion der Färbung durch Herunterregulierung der Antigene |
| Abbildung 6 | Färbungsintensitäten verschiedener Oberflächenantigene nach fünf Tagen unter Kontrollbedingungen oder nach Zugabe von ACM; die Angaben in Klammern entsprechen der Anzahl der untersuchten Zellen |
| Abbildung 7 | Wirkung von neutralisierenden Antikörpern auf durch ACM beeinflußte Ramifikationsindizes sekundärer Mikrogliakulturen |
| Abbildung 8 | Einfluß von eintägiger Zytokinzugabe auf den Ramifikationsindex der sekundären Mikrogliakulturen |
| Abbildung 9 | Beispiele für die Morphologie von Mikroglia nach Zugabe von Zytokinen: A-GM-CSF 50 ng/ml (Kalibrationsbalken: 100 µm); B-M-CSF 50 ng/ml; C-GM-CSF (50 ng/ml) +M-CSF (50 ng/ml) +TGF-1 (50 ng/ml); D-ACM |
| Abbildung 10 | Typische Kaliumstrommuster der Ein- und Auswärtsströme bei Mikrogliazellen: A-Kontrolle; B-nach eintägiger ACM-Exposition |
| Abbildung 11 | Anteil der Mikrogliazellen, die einen Kaliumein- (offene Balken) bzw. -auswärtsstrom (geschlossene Balken) ohne oder mit ACM-Inkubation aufwiesen; Beschriftung analog zu Abbildung 3
und
Abbildung 4
|
| Abbildung 12 | mittlere Stromdichte I der Kaliumauswärtsströme muriner Mikroglia nach eintägiger ACM-Exposition; Konzentration der neutralisierenden Antikörper: 100 ng/ml |
| Abbildung 13 | Auftreten der Kaliumeinwärtsströme an Mikrogliazellen; A-IIR bei unbehandelter Kontrolle; B-Einwärtsstrom nach eintägiger Inkubation mit TGF-1 (10 ng/ml); C-Kaliumeinwärtsstrom bei sekundärer Mikroglia nach Kultivierung mit TGF-2 (10 ng/ml); D-Ermittlung der mittleren Stromdichten bei einem Potential von -150 mV für die Bedingungen entsprechend A-C |
| Abbildung 14 | Wirkung von Barium und  -Dendrotoxin auf den Einwärtsstrom TGF-1 behandelter Zellen (Darstellung der leaksubtrahierten Kurven); A-Aktivierung eines Einwärtsstromes bei Hyperpolarisation; B-Blockierung des Stromes derselben Zelle nach Applikation von 1 mM Ba2+ über eine Perfusionspipette; C-IIR einer anderen Mikrogliazelle; D-keine Veränderung des Strombildes nach Superfusion von 100 nM -DTX |
| Abbildung 15 | Kaliumeinwärtsströme ruhender Mikroglia bei einem Haltepotential von 0 mV in natriumfreier Extrazellulärlösung (Darstellung nicht leaksubtrahiert); A-Einwärtsströme auf 200 ms lange hyperpolarisierende Pulse von 0 bis -160 mV in 20 mV Schritten; B-durch dasselbe Pulsprotokoll ausgelöste Einwärtsströme nach Superfusion mit 0,1 mM Ba2+; C-Strommessung nach Superfusion mit 1 mM Ba2+ |
| Abbildung 16 | Hochregulation der Kaliumauswärtsströme an Mikrogliazellen durch TGF-; A-leaksubtrahierte Darstellung der Stromantwort auf depolarisierende Pulse bei Kontrollzellen; B-Auftreten eines Auswärtsstromes nach eintägiger Inkubation mit 10 ng/ml TGF-1; C-IDR nach Kultivierung mit 10 ng/ml TGF-2 für einen Tag; D-Vergleich der mittleren Stromdichten bei +30 mV für die in A-C genannten Bedingungen |
| Abbildung 17 | Bestimmung der Aktivierungszeitkonstanten des durch TGF- induzierten Auswärtsstromes unter Annahme des Hodgkin-Huxley-Modells; A-Beispiel für die Stromantworten einer Mikrogliazelle auf depolarisierende Pulse von -30, 0 und +30 mV, der Fit der Datenpunkte entsprechend der HH-n4j1-Kinetik wird von den durchgezogenen Linien veranschaulicht; B-Darstellung der mittleren Aktivierungszeitkonstanten  n als Funktion des applizierten Potentials in semilogarithmischer Skalierung |
| Abbildung 18 | Auswertung der zeitabhängigen Inaktivierung des von TGF- ausgelösten IDR mit Hilfe des Hodgkin-Huxley-Modells (siehe auch Gleichung 3
); A-Veranschaulichung der Inaktivierung des Auswärtsstromes bei Potentialdifferenzen von -10, +10 und +30 mV, Darstellung der Rohdaten und der angefitteten Kurven des HH-Modells; B-Abnahme der mittleren Inaktivierungszeitkonstante in Relation zum angelegten Potential |
| Abbildung 19 | Aktivierungs- und steady-state Inaktivierungsverhalten des durch TGF-1 an Mikroglia induzierten Kaliumauswärtsstromes; A-Aktivierung des Stromes ausgehend von einem Haltepotential von -60 mV durch depolarisierende Pulse; B-Inaktivierung des durch eine Depolarisation auf +30 mV ausgelösten Stromes bei stufenweiser Änderung des Haltepotentials von -90 mV auf +20 mV; C-Anpassung der normalisierten Leitfähigkeiten der Aktivierungskurve (Quadrate) bzw. der Inaktivierungskurve (Punkte) an eine Boltzmannfunktion |
| Abbildung 20 | Abnahme der Stromamplitude bei repetitiver Depolarisation muriner Mikroglia; A-Beispiel für die Amplitudenverminderung des IDR bei wiederholtem Auslösen des Stromes, die Zahlen rechts neben den Kurven entsprechen der Pulsnummer, der zeitliche Abstand zwischen zwei Pulsen betrug 1 s; B-Mittelwerte der normalisierten Amplituden als Funktion der Pulsnummer (n=17), zusätzlich ist eine biexponentielle Funktion den Werten angepaßt worden |
| Abbildung 21 | Wirkung verschiedener Peptidtoxine auf den nach Inkubation mit TGF-1 exprimierten Kaliumauswärtsstrom muriner Mikroglia; A-Reduktion der Amplitude nach Superfusion mit 1 nM Charybdotoxin; B-Amplitudenverminderung des IDR durch 1 nM Kaliotoxinlösung; C-geringfügige Verkleinerung der Amplitude durch 10 nM  -Dendrotoxin; D-Mittelwerte der Amplitudenabnahme nach Superfusion mit CTX (n=8), KTX (n=8) und -DTX (n=13), die gestrichelte Linie repräsentiert eine Reduktion auf die Hälfte des Kontrollwertes |
| Abbildung 22 | Veränderungen der mittleren Stromdichte des IDR durch Aktivatoren der Proteinkinase A (dBcAMP) oder der Proteinkinase C (PMA); offene Balken - Kontrolle, geschlossene Balken - Proteinkinaseaktivatoren |
| Abbildung 23 | Effekt von H7 auf die mittlere Stromdichte der Kaliumauswärtsströme nach Stimulation mit TGF-1 |
| Abbildung 24 | Änderung der mittleren Stromdichte von durch TGF- induzierten Kaliumauswärtsströmen nach Zugabe von spezifischen Proteinkinaseinhibitoren; offene Balken - 10 ng/ml TGF-; geschlossene Balken - 10 ng/ml TGF- + Proteinkinaseinhibitor |
| Abbildung 25 | intrazellulärer Signalweg der Aktivierung durch TGF- (nach ): TGF- bindet an den Typ II Rezeptor, wodurch dieser mit einer Serin-/Threoninkinasedomäne den Typ I Rezeptor in einem glyzin-/serinreichen Teil nahe der Zellmembran phosphoryliert (A); der Rezeptorkomplex phosphoryliert die intrazytoplasmatischen SMAD-Moleküle 1, 2, 3, 5 oder 8 (B) und diese die SMAD-Moleküle 4 (C); der SMAD-Komplex diffundiert in den Zellkern und aktiviert über den Transkriptionsfaktor FAST-1 die Erzeugung der zellspezifischen Genprodukte (D) |
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