Schilling , Tom: Morphologische, immunphänotypische und elektrophysiologische Eigenschaften deaktivierter muriner Mikroglia in vitro

Aus dem Johannes Müller Institut für Physiologie
des Universitätsklinikums Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Morphologische, immunphänotypische und elektrophysiologische Eigenschaften deaktivierter muriner Mikroglia in vitro

Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Tom Schilling ,
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. U. Heinemann
Prof. Dr. P. Grafe
Prof. Dr. F. Dreyer

Eingereicht: 04.10.2000

Datum der Promotion: 16.07.2001

Abstrakt

Murine Mikrogliakulturen wurden mit Astrozyten-konditioniertem Medium (ACM) in einen deaktivierten Zustand überführt. Dies wurde anhand morphologischer (Grad der Ramifizierung) und immunologischer (Expression von Adhäsionsmolekülen) Parameter verifiziert. Durch den Einsatz von Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (M-CSF), Granulozyten/Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF), transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGF-beta) und den gegen sie gerichteten Antikörpern wurde gezeigt, daß alle untersuchten Zytokine in unterschiedlichem Maße an der Deaktivierung der Mikrogliazellen durch ACM beteiligt sind. Außerdem wurde nach Stimulation mit ACM an murinen Mikrogliazellen eine transiente Hochregulation eines Kaliumauswärtsstromes beobachtet Das Auftreten dieses Kaliumstromes nach Inkubation der Mikrogliazellen mit ACM konnte auf die Wirkung von TGF-beta, welches im ACM enthalten ist, zurückgeführt werden. Der durch ACM in deaktivierter Mikroglia induzierte Kaliumkanal entsprach in seinen kinetischen und pharmakologischen Eigenschaften am ehesten dem klonierten Kanal Kv1.3. Die Kv1.3 Expression durch TGF-beta oder ACM war durch den unspezifischen Proteinkinaseinhibitor H7 unterdrückbar. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Expression des Kv1.3 Kanals nicht, wie bisher angenommen, ein Indikator für aktivierte Mikroglia ist.

Schlagwörter:
Gehirnmakrophage, Ionenkanal, TGF-beta, Kv1.3

Abstract

Murine microglial cultures were deactivated with astrocyte-conditioned medium (ACM). The deactivation process was verified measuring morphological (ramification index) and immunological (expression level of adhesion molecules) parameters. By using macrophage-colony stimulating factor (M-CSF), granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), transforming growth factor beta (TGF-beta) and their corresponding antibodies it was shown, that to a different extent all of these cytokines influence the deactivation process of microglial cells by ACM. ACM treatment of microglial cultures also lead to a transient upregulation of a delayed potassium outward current. This upregulation was due to the impact of TGF-beta contained in ACM. The ACM induced potassium channel resembled in its kinetic and pharmacological properties the cloned Kv1.3 channel. Expression of Kv1.3 in microglial cells by TGF-beta or ACM was inhibited by the unspecific protein kinase inhibitor H7. These results show, that expression of Kv1.3 channels is not a special feature of activated microglia, which has been proposed in recent publications.

Keywords:
brain macrophage, ion channel, TGF-beta, Kv1.3


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteMorphologische, immunphänotypische und elektrophysiologische Eigenschaften deaktivierter muriner Mikroglia in vitro
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1.1Morphologische und immunologische Eigenschaften der Mikrogliazellen
1.2Interaktion von Mikrogliazellen mit Neuronen und Gliazellen
1.3Pathophysiologische Implikationen
1.4Ionenkanäle in Mikrogliazellen
2 Material und Methoden
2.1Herstellung von Mikrogliazellkulturen
2.1.1Präparation der Primär- und Sekundärkulturen
2.1.2Behandlung der Mikrogliazelllinie BV-2
2.1.3Behandlung der Mikrogliazellkulturen mit Astrozyten-konditioniertem Medium (ACM) und Zytokinen
2.2Elektrophysiologische Untersuchungen
2.2.1Anfertigung der Patchpipetten
2.2.2Durchführung der Patch-clamp-Messungen
2.2.3Extra- und intrazelluläre Lösungen
2.2.4Pharmakologische Untersuchungen
2.2.5Datenaufzeichnung und -analyse
2.2.6Systematische Fehler und deren Behebung
2.3Immunzytochemische Untersuchungen
2.4Morphometrische Quantifizierung
3 Ergebnisse
3.1Morphologische und immunphänotypische Charakterisierung der Mikrogliazellkulturen
3.2Identifikation der astrozytären Faktoren, welche die morphologischen Veränderungen bewirken
3.3Elektrophysiologische Analyse spannungsaktivierter Kaliumkanäle in ruhender Mikroglia
3.4Bestimmung des astrozytären Faktors, der den spannungsaktivierten Kaliumauswärtsstrom induziert
3.5Untersuchung der einwärts gleichrichtenden Kaliumströme an TGF-beta behandelten Mikrogliazellen
3.5.1Vergleich der Stromdichten
3.5.2Pharmakologische Charakterisierung der Einwärtsströme
3.6Detaillierte Beschreibung des durch TGF-beta induzierten Kaliumauswärtsstromes IDR
3.6.1Vergleich der Stromdichten
3.6.2Kinetische Charakteristika des Kaliumauswärtsstromes
3.6.2.1zeitabhängiges Aktivierungs- und Inaktivierungsverhalten
3.6.2.2Steady-state Aktivierungs- und Inaktivierungsverhalten
3.6.2.3frequenzabhängiges Verhalten des IDR
3.6.3Ermittlung der pharmakologischen Eigenschaften des induzierten Kaliumauswärtsstromes
3.6.4Untersuchungen zur intrazellulären Signalkaskade der Induktion des IDR durch TGF-beta
3.6.4.1Untersuchungen zur Induzierbarkeit von Kaliumauswärtsströmen mit Aktivatoren von Proteinkinasen
3.6.4.2Einfluß des Proteinkinaseinhibitors H7 auf die Induktion der Kaliumauswärtsströme
3.6.4.3Beeinflussung der TGF-beta-induzierten Auswärtsströme durch Inhibitoren von Proteinkinasen
4 Diskussion
4.1Deaktivierung der Mikrogliazellen mit ACM
4.2Identifikation der für die morphologischen Veränderungen verantwortlichen Zytokine
4.3Veränderung der Kaliumkanalexpression bei deaktivierter Mikroglia
4.4Bestimmung der Kaliumkanaltypen in deaktivierten Mikrogliazellen
4.5Einfluß von Proteinkinasen auf den durch TGF-beta induzierten Kaliumauswärtsstrom
4.6Funktionelle Bedeutung des Kaliumauswärtsstromes in deaktivierter Mikroglia
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Chemikaliennachweis
Anhang A Erklärung zur Vorabveröffentlichung von Ergebnissen
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Ionenkanäle in Mikrogliazellen (nach )
IC50: halbmaximale Inhibition des Stromes; NTX: Noxiustoxin; MTX: Margatoxin; TEA+: Tetraethylammonium; 4-AP: 4-Aminopyridin; TTX: Tetrodotoxin; DIDS: 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonsäure; SITS: 4-acetamino-4'-isothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonsäure; NPPB: 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoinsäure; IAA-94, 6,7-dichloro-2-cyclopentyl-2,3-dihydro-2-methyl-1-oxo-1H-inden-5-yl(oxy)essigsäure
Tabelle 2 Biophysikalische und pharmakologische Eigenschaften klonierter K+-Kanäle (aus und ); n.b.: nicht bestimmt; IK TGF-beta: durch TGF-beta in Mikroglia induzierter Kaliumauswärtsstrom; * siehe Gleichung 5 ; ** bestimmt von DeCoursey und Kollegen

Abbildungsverzeichnis

sieheGleichung 1 allgemeine Formel zur Bestimmung des elektrischen Stromflusses
sieheGleichung 2 Bestimmung der Stromdichte
sieheGleichung 3 mathematisches Äquivalent des Hodgkin-Huxley-Modells vom Typ n4j1
sieheGleichung 4 Berechnung der Kaliumleitfähigkeit gK aus der gemessenen Spitzenamplitude I, dem Kaliumumkehrpotential EK und dem angelegten Testpotential E
sieheGleichung 5 Boltzmannfunktion zur Beschreibung des Aktivierungs- und steady-state Inaktivierungsverhaltens
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Ganzzellkonfiguration mit elektrischem Ersatzschaltbild (nach )
sieheGleichung 6 allgemeine Gleichung zur Bestimmung des elektrischen Längswiderstandes
sieheGleichung 7 Ermittlung der Ströme, die über dem Serien- und Eingangswiderstand entsprechend Abbildung 1 fließen
sieheGleichung 8 Minderung der Kommandospannung durch Eingangs- und Serienwiderstand
sieheGleichung 9 mathematische Beschreibung des kapazitiven Stromflusses
sieheGleichung 10 Ermittlung der Zeitkonstante bei kapazitivem Stromfluß
sieheGleichung 11 Verschiebung der Potentialdifferenz durch das Liquid Junction Potential
sieheGleichung 12 theoretische Ermittlung des Liquid Junction Potentials
Abbildung 2 Illustration der zur Berechnung des Ramifikationsindexes verwendeten Flächen
Abbildung 3 Auslösung des Ramifikationsprozesses durch ACM: A-sekundäre Mikrogliakultur nach eintägigen Kontrollbedingungen (Kalibrationsbalken entspricht 100 µM); B-morphologische Veränderungen nach eintägiger Zugabe von ACM; C+D-Fixierung der Sekundärkultur nach fünftägiger ACM-Inkubation (D: täglicher Wechsel des Mediums)
Abbildung 4 Mittelwerte der Ramifikationsindizes nach Zugabe von ACM für verschiedene Zeiträume
Abbildung 5 immunzytochemische Färbung zur Detektion von MHC Klasse II Molekülen auf Mikrogliazellen; A-Expression des Antigens unter Kontrollbedingungen (Kalibrationsbalken: 50 µm); B-keine Veränderung der MHC-Färbung nach eintägiger ACM-Inkubation, jedoch deutliche Ramifizierung; C-nach fünftägiger Kultivierung in ACM Reduktion der Färbung durch Herunterregulierung der Antigene
Abbildung 6 Färbungsintensitäten verschiedener Oberflächenantigene nach fünf Tagen unter Kontrollbedingungen oder nach Zugabe von ACM; die Angaben in Klammern entsprechen der Anzahl der untersuchten Zellen
Abbildung 7 Wirkung von neutralisierenden Antikörpern auf durch ACM beeinflußte Ramifikationsindizes sekundärer Mikrogliakulturen
Abbildung 8 Einfluß von eintägiger Zytokinzugabe auf den Ramifikationsindex der sekundären Mikrogliakulturen
Abbildung 9 Beispiele für die Morphologie von Mikroglia nach Zugabe von Zytokinen: A-GM-CSF 50 ng/ml (Kalibrationsbalken: 100 µm); B-M-CSF 50 ng/ml; C-GM-CSF (50 ng/ml) +M-CSF (50 ng/ml) +TGF-beta1 (50 ng/ml); D-ACM
Abbildung 10 Typische Kaliumstrommuster der Ein- und Auswärtsströme bei Mikrogliazellen: A-Kontrolle; B-nach eintägiger ACM-Exposition
Abbildung 11 Anteil der Mikrogliazellen, die einen Kaliumein- (offene Balken) bzw. -auswärtsstrom (geschlossene Balken) ohne oder mit ACM-Inkubation aufwiesen; Beschriftung analog zu Abbildung 3 und Abbildung 4
Abbildung 12 mittlere Stromdichte Irho der Kaliumauswärtsströme muriner Mikroglia nach eintägiger ACM-Exposition; Konzentration der neutralisierenden Antikörper: 100 ng/ml
Abbildung 13 Auftreten der Kaliumeinwärtsströme an Mikrogliazellen; A-IIR bei unbehandelter Kontrolle; B-Einwärtsstrom nach eintägiger Inkubation mit TGF-beta1 (10 ng/ml); C-Kaliumeinwärtsstrom bei sekundärer Mikroglia nach Kultivierung mit TGF-beta2 (10 ng/ml); D-Ermittlung der mittleren Stromdichten bei einem Potential von -150 mV für die Bedingungen entsprechend A-C
Abbildung 14 Wirkung von Barium und delta-Dendrotoxin auf den Einwärtsstrom TGF-beta1 behandelter Zellen (Darstellung der leaksubtrahierten Kurven); A-Aktivierung eines Einwärtsstromes bei Hyperpolarisation; B-Blockierung des Stromes derselben Zelle nach Applikation von 1 mM Ba2+ über eine Perfusionspipette; C-IIR einer anderen Mikrogliazelle; D-keine Veränderung des Strombildes nach Superfusion von 100 nM delta-DTX
Abbildung 15 Kaliumeinwärtsströme ruhender Mikroglia bei einem Haltepotential von 0 mV in natriumfreier Extrazellulärlösung (Darstellung nicht leaksubtrahiert); A-Einwärtsströme auf 200 ms lange hyperpolarisierende Pulse von 0 bis -160 mV in 20 mV Schritten; B-durch dasselbe Pulsprotokoll ausgelöste Einwärtsströme nach Superfusion mit 0,1 mM Ba2+; C-Strommessung nach Superfusion mit 1 mM Ba2+
Abbildung 16 Hochregulation der Kaliumauswärtsströme an Mikrogliazellen durch TGF-beta; A-leaksubtrahierte Darstellung der Stromantwort auf depolarisierende Pulse bei Kontrollzellen; B-Auftreten eines Auswärtsstromes nach eintägiger Inkubation mit 10 ng/ml TGF-beta1; C-IDR nach Kultivierung mit 10 ng/ml TGF-beta2 für einen Tag; D-Vergleich der mittleren Stromdichten bei +30 mV für die in A-C genannten Bedingungen
Abbildung 17 Bestimmung der Aktivierungszeitkonstanten des durch TGF-beta induzierten Auswärtsstromes unter Annahme des Hodgkin-Huxley-Modells; A-Beispiel für die Stromantworten einer Mikrogliazelle auf depolarisierende Pulse von -30, 0 und +30 mV, der Fit der Datenpunkte entsprechend der HH-n4j1-Kinetik wird von den durchgezogenen Linien veranschaulicht; B-Darstellung der mittleren Aktivierungszeitkonstanten taun als Funktion des applizierten Potentials in semilogarithmischer Skalierung
Abbildung 18 Auswertung der zeitabhängigen Inaktivierung des von TGF-beta ausgelösten IDR mit Hilfe des Hodgkin-Huxley-Modells (siehe auch Gleichung 3 ); A-Veranschaulichung der Inaktivierung des Auswärtsstromes bei Potentialdifferenzen von -10, +10 und +30 mV, Darstellung der Rohdaten und der angefitteten Kurven des HH-Modells; B-Abnahme der mittleren Inaktivierungszeitkonstante in Relation zum angelegten Potential
Abbildung 19 Aktivierungs- und steady-state Inaktivierungsverhalten des durch TGF-beta1 an Mikroglia induzierten Kaliumauswärtsstromes; A-Aktivierung des Stromes ausgehend von einem Haltepotential von -60 mV durch depolarisierende Pulse; B-Inaktivierung des durch eine Depolarisation auf +30 mV ausgelösten Stromes bei stufenweiser Änderung des Haltepotentials von -90 mV auf +20 mV; C-Anpassung der normalisierten Leitfähigkeiten der Aktivierungskurve (Quadrate) bzw. der Inaktivierungskurve (Punkte) an eine Boltzmannfunktion
Abbildung 20 Abnahme der Stromamplitude bei repetitiver Depolarisation muriner Mikroglia; A-Beispiel für die Amplitudenverminderung des IDR bei wiederholtem Auslösen des Stromes, die Zahlen rechts neben den Kurven entsprechen der Pulsnummer, der zeitliche Abstand zwischen zwei Pulsen betrug 1 s; B-Mittelwerte der normalisierten Amplituden als Funktion der Pulsnummer (n=17), zusätzlich ist eine biexponentielle Funktion den Werten angepaßt worden
Abbildung 21 Wirkung verschiedener Peptidtoxine auf den nach Inkubation mit TGF-beta1 exprimierten Kaliumauswärtsstrom muriner Mikroglia; A-Reduktion der Amplitude nach Superfusion mit 1 nM Charybdotoxin; B-Amplitudenverminderung des IDR durch 1 nM Kaliotoxinlösung; C-geringfügige Verkleinerung der Amplitude durch 10 nM alpha-Dendrotoxin; D-Mittelwerte der Amplitudenabnahme nach Superfusion mit CTX (n=8), KTX (n=8) und alpha-DTX (n=13), die gestrichelte Linie repräsentiert eine Reduktion auf die Hälfte des Kontrollwertes
Abbildung 22 Veränderungen der mittleren Stromdichte des IDR durch Aktivatoren der Proteinkinase A (dBcAMP) oder der Proteinkinase C (PMA); offene Balken - Kontrolle, geschlossene Balken - Proteinkinaseaktivatoren
Abbildung 23 Effekt von H7 auf die mittlere Stromdichte der Kaliumauswärtsströme nach Stimulation mit TGF-beta1
Abbildung 24 Änderung der mittleren Stromdichte von durch TGF-beta induzierten Kaliumauswärtsströmen nach Zugabe von spezifischen Proteinkinaseinhibitoren; offene Balken - 10 ng/ml TGF-beta; geschlossene Balken - 10 ng/ml TGF-beta + Proteinkinaseinhibitor
Abbildung 25 intrazellulärer Signalweg der Aktivierung durch TGF-beta (nach ): TGF-beta bindet an den Typ II Rezeptor, wodurch dieser mit einer Serin-/Threoninkinasedomäne den Typ I Rezeptor in einem glyzin-/serinreichen Teil nahe der Zellmembran phosphoryliert (A); der Rezeptorkomplex phosphoryliert die intrazytoplasmatischen SMAD-Moleküle 1, 2, 3, 5 oder 8 (B) und diese die SMAD-Moleküle 4 (C); der SMAD-Komplex diffundiert in den Zellkern und aktiviert über den Transkriptionsfaktor FAST-1 die Erzeugung der zellspezifischen Genprodukte (D)

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Thu Oct 4 13:28:19 2001