Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Tumorspezifisches Targeting der humanen Natürlichen Killerzellinie YT durch Gentransfer chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Diplom-Biochemiker Thomas Schirrmann
geb. am 23.04.1973 in Berlin

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Thomas Buckhout

Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfgang Uckert
2. Prof. Dr. Stefan Dübel
3. PD Gabriele Pecher

eingereicht:8.11.2004

Datum der Promotion:18.03.2005

Zusammenfassung

Die spezifische adoptive Immuntherapie ist ein hoffnungsvoller Ansatz zur Behandlung von Tumoren. Die aufwendige individuelle Bereitstellung primärer Effektor lymphozyten könnte durch den Einsatz etablierter tumorantigen spezifischer Effektor zellinien vermieden werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich ein Tumortargeting der humanen Natürlichen Killer-(NK)-Zellinie YT durch den Gentransfer chimärer Immun globulin-T-Zell rezeptoren (cIgTCRs) erreichen läßt. Die cIgTCR-Konstrukte wurden aus single-chain- Fv-Fragmenten (scFv), dem IgG1-Fc-Teil und der CD3 ζ-Signalkette erzeugt. Die scFv-Fragmente wurden aus den humanisierten Antikörpern BW431/26 und HuM195, die spezifisch für das karzinoembryonale Antigen (CEA) bzw. CD33 sind, konstruiert und zeigten als scFv-hFc-Fusions proteine eine spezifische Bindung an Tumorzellen. Die YT-Zellen wurden mit den cIgTCR-Gen konstrukten über Elektroporation transfiziert und über immunologische Verfahren angereichert. In-vitro -Studien ergaben eine spezifische Lyse von CEA + Kolon karzinom zellinien durch die scBW431/26-hFc ζ + YT-Zellen. Die Zytotoxizität korrelierte mit der Expression des cIgTCR-Antigens auf den Tumor zellen und wurde durch zirkulierendes CEA nicht gehemmt. Die scHuM195-hFc + YT-Zellen zeigten eine spezifische Lyse der CD33 + myeloischen Leukämie zellinie KG1. Die γ-Bestrahlung wurde zur Wachstums begrenzung der YT-Zellen eingesetzt. Die spezifische Zytotoxizität der scBW431/26-hFc ζ + YT-Zellen gegenüber CEA + Tumor zellen war einen Tag nach Bestrahlung unverändert. Die Koinjektion von CEA + Tumor zellen mit bestrahlten scBW431/26-hFc ζ + YT-Zellen führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums in NOD/SCID-Mäusen. Die cIgTCR + YT-Zellen zeigten in vitro eine geringe Sensibilität gegenüber allogenen Blut lymphozyten.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Zytotoxizität der NK-Zellinie YT tumor antigen spezifisch durch cIgTCR-Gentransfer erweitert werden kann und ein Potential zur Behandlung von minimalen Tumor erkrankungen besteht.

Eigene Schlagworte: Gentransfer, Natürliche Killerzellen, chimäre Immunglobulin-T-Zell, rezeptoren, adoptive Immuntherapie, Tumortargeting

Abstract

The specific adoptive immunotherapy is a promising strategy for cancer treatment. The utilization of established tumor antigen specific effector cell lines could bypass the expendable individual preparation and often limited specificity of primary effector lymphocytes. This study investigated the tumor targeting of the human Natural Killer (NK) cell line YT by gene transfer of chimeric immunoglobulin T cell receptors (cIgTCRs). The cIgTCR constructs were generated of single chain antibody fragments (scFv), the IgG1 Fc part and the CD3 ζ chain. The scFv fragments were constructed of the humanized antibodies BW431/26 and HuM195 with specificity for the carcinoembryonic antigen (CEA) and CD33, respectively, and showed as scFv-Fc fusion proteins a specific binding to tumor cells. YT cells were transfected with the cIgTCR gene constructs by electroporation and enriched by immunological cell separation. In vitro studies revealed a specific lysis of CEA + colon carcinoma cell lines by scBW431/26-hFcζ + YT cells. The cytotoxicity correlated with the expression of the cIgTCR antigen on the tumor cells and was not inhibited in the presence of soluble CEA. The scHuM195-hFcζ + YT cells mediated a specific lysis of the CD33 + myeloic leukemia cell line KG1. The γ-irradiation was used to limit the growth of the YT cell line. The specific cytotoxicity of the scBW431/26-hFcζ + YT cells against CEA + tumor cells was unaltered one day after irradiation. The coinjection of CEA + tumor cells and irradiated scBW431/26-hFcζ + YT cells led to a significant growth inhibition in NOD/SCID mice. The cIgTCR + YT cells showed a low susceptibility to the cytotoxicity of allogeneic blood lymphocytes in vitro . The results demonstrated that the cytotoxicity of the human NK cell line YT can be specifically extended to tumor antigens by cIgTCR gene transfer. The employment of receptor gene modified YT cells could be a useful tool for the adoptive immunotherapy of minimal tumor diseases.

Keywords: Gene transfer, Natural Killer cells, chimeric immunoglobulin T cell receptors, adoptive immunotherapy, tumor targeting

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28.10.2005