1 Einleitung

1.1 Immuntherapie von Tumorerkrankungen

↓1

Dem Immunsystem wurde schon früh eine zentrale Rolle bei der Kontrolle und Bekämpfung von Tumorerkrankungen beigemessen. Paul Ehrlich stellte 1909 die These auf, daß „die Zerstörung von spontan auftretenden Tumoren, die ständig und gehäuft auftreten, eine der Aufgaben des Immunsystems“ sei. Auf die Bedeutung lymphoider Zellen bei der Abstoßung transplantierter Tumore in Tiermodellen wies 1926 J. B. Murphy (Murphy, 1926) hin. 1959 führte F. M. Burnet (Burnet, 1970) das Konzept der Immun überwachung ( immune surveillance ) von Tumoren ein, das vom Auftreten neuer Antigene auf den Tumorzellen und ihrer Erkennung durch T-Zellen ausging. Diese These wurde durch ein vermehrtes Auftreten von Tumoren nach Einsatz immunsupprimierender Medikamente oder nach Erkrankung an AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) gestützt. Diese Beobachtungen waren jedoch beschränkt auf seltene Tumorarten, wie UV-bedingte Hauttumore oder virusassoziierte Tumore (Boshoff und Weiss, 2002), und konnten nicht für die spontan auftretenden häufigen Tumorarten wie Brust-, Dickdarm- und Lungenkrebs bestätigt werden (Myking, 1969;Penn, 2000). Außerdem waren die experimentellen Maustumormodelle, auf deren Grundlage das Immunüberwachungskonzept entwickelt wurde, viel immunogener als natürliche humane Tumore. Bis heute wird kontrovers diskutiert, ob eine direkte und ständige Immunüberwachung spontan auftretender Tumore stattfindet und ihr Aussetzen die Ursache für die Tumorentstehung ist. Unumstritten ist dagegen, daß das Immunsystem über effiziente Mechanismen zur Erkennung und Bekämpfung von Tumorzellen verfügt (Dunn et al., 2002), auf deren Grundlage eine Vielzahl immunologischer Therapiestrategien zur Behandlung von Tumorerkrankungen entwickelt wurde.

Die unspezifische Stimulation des Immunsystems wird erfolgreich zur Stärkung gegen Infektionserkrankungen eingesetzt. Der abgeschwächte Mykobakterienstamm BCG (Bacille-Calmette-Guérin) und das Corynebacterium parvum sind potente Immunstimulatoren. Die unspezifische Stimulation des Immunsystems scheint eine präventive Wirkung bei Melanom- und Leukämieerkrankungen zu haben, die jedoch nur unzureichend belegt ist (Molife und Hancock, 2002).

Zytokine regulieren das Wachstum, die Aktivierung und die Differenzierung von Zellen. Das Zytokin Interleukin-2 (IL-2), das zytotoxische T-Zellen (CTL) und NK-Zellen stimuliert, wurde intensiv für die Behandlung von Tumorerkrankungen untersucht und erzielte bei immunogenen Tumorarten, wie Melanomen und Nierenzellkarzinomen, einige Erfolge (Dutcher, 2002). Bei großen Tumoren zeigt IL-2 dagegen praktisch keine Wirkung. Außerdem führt eine andauernde systemische IL-2-Applikation zu Gefäßschäden (endothelial leakage syndrome) und einer verstärkten Extravasation der Lymphozyten. Neben IL2 erzielten nur noch die Interferone IFN-α/-β eine signifikante Wirkung gegen Tumore (Belardelli et al., 2002).

↓2

Tumorvakzinierungsstrategien versuchen, eine spezifische Aktivierung des Immun-systems zu erreichen. Da Tumorzellen aus körpereigenen Zellen hervorgehen, ist die Überwindung der immunologischen Selbsttoleranz ein kritischer Faktor und eine tumorspezifische Immunantwort kann mit Autoimmunreaktionen einhergehen (Overwijk et al., 1999). Vakzinierungsstrategien setzen auf die Verwendung von Tumorzellysaten, tumorspezifischen Proteinen oder Peptiden, Tumorzell-mRNA oder die cDNA von Tumorantigenen, gegen die eine spezifische Immunantwort erzeugt werden soll. Diese Ansätze werden in den meisten Fällen mit potenten Adjuvanzien oder professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APCs), wie den dendritischen Zellen (DCs), kombiniert, um eine effiziente Stimulation des Immunsystems zu erreichen (Bordignon et al., 1999;Renner et al., 2001). Obwohl der Tumorvakzinierung ein großes Potential für die Behandlung von Tumoren beigemessen wird, ist ihr Erfolg sehr von den individuellen Eigenschaften des Patienten, wie HLA-Typ, Krankheitsverlauf und immunologischer Status, abhängig. Außerdem entwickeln fortgeschrittene Tumore häufig Mechanismen, einer gegen sie gerichteten Immunantwort auszuweichen oder sie zu supprimieren (siehe 1.4).

Antikörper spielen eine wichtige Rolle in der Tumordiagnostik beim Aufspüren von Tumormarkern und Tumorzellen. Tumorspezifische Antikörper werden auch zur Tumortherapie eingesetzt (Milenic et al., 2004;Silverman et al., 2004;von Mehren et al., 2003). Sie können über ihren konstanten Teil in Abhängigkeit von ihrem Isotyp andere immunologische Effektoren (z. B. Komplement, Immunzellen mit Fc-Rezeptoren) an die Tumorzellen binden. Trotzdem vermitteln Antikörper häufig nur eine geringe Antitumorwirkung, da sie schnell von der Oberfläche der Tumorzellen durch „Capping“, „Shedding“ oder Endozytose beseitigt werden. Die direkte Kopplung der Antikörper mit Effektoren, wie radioaktiven Isotopen, toxischen Molekülen (z. B. Chlorambucil, Ricin) oder Enzymen, die nichttoxische Vorstufen eines Chemotherapeutikums aktivieren, umgeht einen Teil dieser Probleme. Antikörper reichern sich jedoch nur sehr langsam in soliden Tumoren an, die meistens schwach und unvollständig vaskularisiert sind (verschlossene Kapillaren, arteriovenöse Anastomosen), einen erhöhten Innendruck (Turgor) besitzen und durch endotheliale Zellschichten vom Blut- und Lymphsystem isoliert sind. Antikörper wurden dagegen erfolgreich zur Behandlung von Leukämien eingesetzt (Jurcic, 2000;Jurcic, 2001). Um die Bildung von Anti-Maus-Antikörpern (HAMA, human anti-mouse antibodies) zu vermeiden (Schwartz et al., 1993), werden hauptsächlich humane bzw. humanisierte Antikörper verwendet. Informationen zu rekombinanten Antikörpern sind im Abschnitt 1.6 angegeben.

1.2 Adoptive zelluläre Immuntherapie

1.2.1 Prinzip der adoptiven Immuntherapie

In den frühen 60iger Jahren entdeckte J. L. Gowans, daß die Entfernung der Lymphozyten aus Ratten zum Verlust ihrer Immunität führte, die durch Rücktransfer der Lymphozyten wiederhergestellt werden konnte. Seine Transferexperimente identifizierten die Lymphozyten als die wichtigsten Vermittler der Immunantwort und als die Träger des immunologischen Gedächtnisses (Gowans und Uhr, 1966). Außerdem wurde gezeigt, daß sich durch den adoptiven Transfer von Lymphozyten die Immunkompetenz eines Individuums auf andere übertragen läßt. Auf diesem Prinzip basiert die adoptive zelluläre Immuntherapie. Im Gegensatz zu den zellulären Vakzinierungsstrategien werden durch den adoptiven Transfer von Lymphozyten die immunologischen Effektoren und deren Spezifität übertragen und nicht erst im Patienten erzeugt. Der adoptive Transfer tumorspezifischer Lymphozyten wurde in Tiermodellen erfolgreich demonstriert (Hanson et al., 2000;Hu et al., 1993;Rosenstein et al., 1984). Die Bereitstellung einer ausreichenden Zahl tumorspezifischer Lymphozyten für den Menschen ist dagegen immer noch äußerst kompliziert.

1.2.2 Adoptive Immuntherapie mit autologen LAK-Zellen und TILs

↓3

Autologe Lymphozyten wurden intensiv auf ihren Einsatz für eine adoptive Immuntherapie untersucht. Durch Aktivierung peripherer Blutlymphozyten (PBL) mit hohen IL-2-Konzentrationen werden Lymphokin-aktivierte-Killer-(LAK)-Zellen erzeugt, die in vitro ein breites Spektrum an Tumorzellen lysieren. Ihre Aktivierung und Wirkung ist jedoch in vivo zeitlich begrenzt. Die gleichzeitige Applikation von IL-2 verbessert die Effizienz der LAK-Zelltherapie. Trotzdem führt ihre mangelnde Spezifität nur zu einer geringen Anti-tumorwirkung (Bordignon et al., 1999). Möglicherweise wirken LAK-Zellen durch Zerstörung von DCs sogar einer adaptiven Tumorimmunität entgegen (Parajuli et al., 1999).

In vielen soliden Tumoren und tumornahen Lymphknoten werden tumor infiltrierende Lymphozyten (TILs) nachgewiesen. Die TILs enthalten häufig tumorspezifische T-Zellen mit eingeschänkten Effektorfunktionen, die sich ex vivo durch Stimulation mit IL-2 wiederherstellen lassen. Die Präparation von TILs ist aufwendig und scheitert oft an den mangelnden Tumorbiopsien (Topalian et al., 1989) oder der Aufbereitung des Patientenmaterials (Lewko et al., 2000). Autologe tumorspezifische T-Zellen konnten durchgehend nur aus Melanompatienten isoliert werden. TILs zeigten in Kombination mit IL-2 eine therapeutische Wirkung bei metastatischen Melanomen (Aebersold et al., 1991;Rosenberg et al., 1994;Yannelli et al., 1996) und Nierenzellkarzinomen (Bordignon et al., 1999). Für die ex-vivo-Expansion von LAK-Zellen und TILs wurden spezielle Bioreaktoren entwickelt (Knazek et al., 1990;Malone et al., 2001).

1.2.3 In-vitro-Sensitivierung von autologen T-Zellen

Die in-vitro-„Sensitivierung“ (wörtlich: „Empfindlichmachung“) von T-Zellen gegen Tumorantigene wurde in Tiermodellen demonstriert (Lipshy et al., 1997). Humane zytotoxische T-Zellen (CTL) konnten mit EBV-immortalisierten autologen B-Zellen in vitro stimuliert und präventiv gegen EBV-assoziierte lymphoproliferative Erkrankungen nach Knochenmarktransplantationen eingesetzt werden (Rooney et al., 1998;Rooney et al., 1995). Naive humane T-Zellen lassen sich dagegen nicht effizient gegen Tumorantigene in vitro aktivieren, da die Häufigkeit tumorspezifischer T-Zellen (precursor frequency) im Blut extrem gering ist und Tumorantigene im Gegensatz zu viralen Antigenen nur eine geringe Immunogenität aufweisen. Bei der Expansion von melanomspezifischen TILs (1.2.2) wurden in-vitro-Sensitivierungsstrategien zur Erhaltung ihrer Antigenspezifität eingesetzt (Leong et al., 1995).

1.2.4 Genmodifikation von Lymphozyten zur Verbesserung ihrer Erkennungs- und Effektoreigenschaften

↓4

Durch genetische Manipulation wurde versucht, die Effizienz von autologen T-Zellen zu verbessern. Der Gentransfer von Zytokingenen in TILs (Hwu et al., 1993) kann zur Steigerung ihrer Effektoreigenschaften führen. Einige Zytokine, wie GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor) und TNF-α (tumor necrosis factor α), förderten jedoch das Wachstum einiger Tumorarten in vivo (Bordignon et al., 1999). Der Gentransfer von TNF-α in T-Zellen führte außerdem zu deren Apoptose (Ebert et al., 1997).

Die Entwicklung rekombinanter T-Zellrezeptor-(TCR-)Genkonstrukte (Calogero et al., 2000;Chung et al., 1994;Eshhar, 1997;Gross et al., 1989) und effizienter retroviraler Gentransfersysteme für humane T-Zellen (Engels et al., 2003;Farson et al., 1999;Finer et al., 1994;Uckert et al., 1998;Weijtens et al., 1998) könnte die Einschränkungen der LAK- und TIL-Therapien überwinden, da auf diese Weise in kurzer Zeit große Mengen an tumorspezifischen T-Zellen generiert werden können. Das Targeting von humanen T-Zellen durch Transfektion mit rekombinanten TCR-Genen wurde erfolgreich gegen virusinfizierte Zellen und Tumorzellen in vitro (Daly et al., 2000;Hombach et al., 2000;Hwu et al., 1993;Patel et al., 1999;Ren Heidenreich et al., 2000;Weijtens et al., 1998) und in vivo (Haynes et al., 2002;Hwu et al., 1995;McGuinness et al., 1999;Moritz et al., 1994;Roessig et al., 2002) demonstriert (siehe Abschnitt 1.7). Neben der Transfektions effizienz spielt auch die Aktivierung und Kostimulation der transfizierten T-Zellen eine wichtige Rolle für ihre Antitumorwirkung (Brocker, 2000;Eshhar et al., 2001;Hwu et al., 1995;Ren Heidenreich et al., 2000)

Die klinische Wirksamkeit und Sicherheit von rezeptorgenmodifizierten T-Zellen erfordert noch umfangreiche Studien, da nur wenige langfristige Daten über ihr in-vivo-Verhalten im Menschen vorliegen (Walker et al., 2000). Die retrovirale Modifikation selbst scheint keine negativen Veränderungen in den T-Zellen zu bewirken (Rosenberg, 1991;Rosenberg et al., 1990). In einem syngenen BALB/c-Mausmodell wurde nach dem adoptiven Transfer keine „humorale“ Immunantwort gegenüber den genmodifizierten T-Zellen beobachtet (Altenschmidt et al., 1997). Im Gegensatz dazu wurden autologe humane T-Zellen nach dem retroviralen Gentransfer eines HIV-spezifischen Rezeptors durch rezeptorspezifische CTL eliminiert (Riddell et al., 1996). Der häufig verwendete retrovirale Vektor LXSN sensibilisierte die genmodifizierten T-Zellen gegenüber autologen Natürlichen Killer-(NK)-Zellen und antigenspezifischen CTL, verursacht durch die Expression des Selektionsmarkers neo (Bordignon et al., 1999;Liberatore et al., 1999)Viele Beobachtungen legen außerdem eine Veränderung der autologen T-Zellen bei längerer ex-vivo -Kultivierung nahe, die sie nach Re infusion in den Patienten als „fremd“ erscheinen lassen. Die Risiken verbunden mit dem onkogenen Restpotential von Retroviren (Hacein-Bey-Abina et al., 2003;Williams und Baum, 2003) scheinen durch Optimierungen an den retroviralen LTRs (long terminal repeats) beherrschbar zu sein. Alternativ können primäre T-Zellen auch über „nackte“ DNA, d. h. mit Plasmidvektoren, genetisch modifiziert werden (Jensen et al., 2000;Jensen et al., 2003).

1.2.5 Adoptive Immuntherapie mit autologen NK-Zellen

↓5

Eine weitere Quelle zytotoxischer Effektorzellen für eine adoptive Immuntherapie sind NK-Zellen (siehe 1.5). Sie lysieren ein breites Spektrum an virusinfizierten Zellen und Tumorzellen (Cervantes et al., 1996;Uharek et al., 1996;Vujanovic et al., 1995). NK-Zellen lassen sich im Gegensatz zu tumorspezifischen T-Zellen aus den meisten Menschen in ausreichender Menge isolieren. Trotzdem wurden bisher nur wenige klinische Studien mit autologen NK-Zellen durchgeführt (Lister et al., 1995). NK-Zellen scheinen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle akuter myeloischer Leukämien (AML) zu spielen (Lowdell et al., 2002;Pross und Lotzova, 1993). Aufgrund ihrer geringeren Tumorspezifität gelten jedoch für die NK-Zellen ähnliche Einschränkungen wie für die LAK-Zelltherapie (1.2.2). Die retrovirale Genmodifikation von NK-Zellen mit tumorspezifischen Rezeptoren ist aufgrund ihres geringen Proliferationspotentials nur begrenzt möglich. Außerdem scheinen retroviral transfizierte NK-Zellen eingeschränkte Effektorfunktionen aufzuweisen (Naylor et al., 2001).

1.2.6 Probleme autologer Strategien einer adoptiven Immuntherapie

Der Herstellungsprozeß autologer tumorspezifischer Lymphozyten ist für eine klinische Anwendung kritisch. Da viele Patienten aufgrund ihrer Erkrankung und der vorangegangenen Therapien immunsupprimiert sind, läßt sich die Erzeugung einer ausreichenden Menge funktioneller tumorspezifischer Lymphozyten weder in qualitativer und quantitativer noch in zeitlicher Hinsicht gewährleisten. Außerdem bedeutet die Entnahme von Lymphozyten einen zusätzlichen Streß für den abwehrgeschwächten Tumorpatienten. Ein weiteres Problem kann die Kontamination des Patientenblutes mit zirkulierenden Tumorzellen sein, die nach Reinfusion zu einem Rückfall der Tumorerkrankung führen könnte und als eine Ursache für die hohe Tumorrezidivrate autologer hämatopoetischer Transplantationen diskutiert wird.

1.2.7 Allogene Spenderlymphozyteninfusionen

Die Verwendung allogener Spenderlymphozyten könnte Vorteile gegenüber autologen Strategien bringen, da ihre Herstellung unabhängig vom Patienten erfolgt. Die Abstoßung allogener Lymphozyten beschränkt ihren Einsatz selbst bei hoher Gewebskompatibilität auf Patienten, deren Immunsystem supprimiert ist. Leukämiepatienten erhalten nach Chemotherapie (z. B. mit hochdosierten Alkylantien) oder Strahlentherapie (Ganzkörperbestrahlung mit 10 – 14 Gy) eine Knochenmark- oder Stammzelltransplantation (SCT, stem cell transplantation). Dabei wurde festgestellt, daß Patienten nach einer allogenen SCT eine bessere Prognose besaßen als Patienten nach einer autologen SCT. Der antileukämische Effekt (GvL, graft versus leukemia) wurde auf allogene Lymphozyten im Transplantat zurückgeführt (Horowitz et al., 1990;Jiang et al., 1991) und beruht wahrscheinlich auf Unterschieden in den Gewebskompatibilitätsfaktoren. Allogene T-Zellen verursachen jedoch auch die gegen den Empfänger gerichtete Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD), die zum Tode des Patienten führen kann (Giralt und Kolb, 1996;Szydlo et al., 1997). Die genetische Modifikation der allogenen Donorlymphozyten mit Suizidgenen (z. B. Thymidinkinase-Gen) kann die GvHD nur geringfügig mildern (Bordignon et al., 1999).

↓6

Die Infusion von NK-Zellen eines allogenen Spenders bei einer allogenen SCT bewirkt ebenfalls einen GvL-Effekt und wirkt der Transplantatabstoßung durch Eliminierung restlicher Immunzellen des Empfängers entgegen. Im Gegensatz zu allogenen T-Zellen verursachen allogene NK-Zellen jedoch keine GvHD (Ruggeri et al., 2001;Ruggeri et al., 2002). Allogene T-Zellen, die ihr Peptid-Antigen im Kontext mehrerer unterschiedlicher MHC-Moleküle erkennen (Stauss, 1999), können die Toleranz gegenüber Tumorantigenen überwinden (Stanislawski et al., 2001) und lösen ebenfalls keine GvHD aus (Gao et al., 1999).

1.2.8 Adoptive Immuntherapie mit tumorspezifischen Effektorzellinien

Die Verwendung primärer Lymphozyten erfordert individuelle Therapieansätze unabhängig davon, ob sie autologer oder allogener Herkunft sind. Der individuelle Herstellungsprozeß der tumorspezifischen Lymphozyten ist zeit- und kostenaufwendig und muß für jeden Patienten erneut durchgeführt werden. Allogene Effektorzellinien mit Antitumoreigenschaften könnten deshalb eine Alternative darstellen. Effektorzellinien sind unbegrenzt verfügbar und könnten zur Behandlung einer großen Patientengruppe bei bestimmten Tumorerkrankungen eingesetzt werden. Ihre patientenunabhängige Herstellung kann im großen Maßstab erfolgen, ermöglicht einen hohen Standardisierungsgrad und verringert den technischen, zeitlichen und finanziellen Aufwand erheblich. Auf Basis von Effektorzellinien könnte eine breite klinische Anwendung einer tumorspezifischen adoptiven Immuntherapie realisiert werden, die mit dem Einsatz immunopharmazeutischer Medikamente, wie Antikörpern oder Zytokinen, vergleichbar ist.

Allogene zytotoxische Zellinien mit Antitumoreigenschaften wurden im Rahmen präklinischer und klinischer Studien auf ihre Sicherheit untersucht. Die T-Zellinie TALL-104 (T-ALL, acute lymphoblastic leukemia), die Tumorzellinien MHC-unabhängig lysiert, wurde in Mäusen (Cesano et al., 1996;Cesano et al., 1996;Cesano et al., 1997), Hunden (Cesano et al., 1996;Visonneau et al., 1999) und in Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs eingesetzt (Visonneau et al., 2000). Die TALL-104-Zellen wurden von den Tumorpatienten gut toleriert. Es wurde keine zelluläre Immunisierung gegenüber der allogenen Effektorzellinie beobachtet. Die humane NK-Zellinie NK92 wird gegenwärtig auf ihre Sicherheit und Wirksamkeit bei Patienten mit fortgeschrittenen Tumoren getestet (Tonn et al., 2001). Da nur wenige humane tumorspezifische Effektorzellinien etabliert sind, könnte durch die genetische Modifikation dieser Zellinien das Spektrum an behandelbaren Tumoren erweitert werden. Die NK-Zellinie NK92 wurde mit einem ErbB2-spezifischen Rezeptorgenkonstrukt retroviral transfiziert und zeigte eine spezifische Zytotoxizität gegenüber ErbB2+ Tumorzellinien (Uherek et al., 2002).

1.3 Tumorassoziierte Antigene

1.3.1 Einteilung der Tumorantigene

↓7

Die Prozesse während der Tumorentwicklung führen zu einer veränderten Antigenexpression in den Tumorzellen, die ein potentielles Ziel für das Immunsystem oder eine Immuntherapie darstellt. Die Unterteilung tumorassoziierter Antigene (TAAs) kann nach unterschiedlichen Gesichtspunkten erfolgen und darf nicht als strikt angesehen werden.

Die Cancer-Testis -(CT)-Antigene sind in ihrer Expression auf Tumor- und Testisgewebe, gelegentlich die Plazenta, beschränkt. In diese Gruppe fallen die MAGE- (melano cyte antigen), BAGE- (B antigen) und GAGE-(G antigen) Proteinfamilien sowie NY-ESO-1 und die in jüngerer Zeit klonierten HAGE- (helicose antigens), SAGE- (sarcoma antigens), LAGE- (L antigens) und CT-Antigene. Andere relativ weitverbreitete Tumorantigene sind in verschiedenen gesunden Geweben vorhanden, sind aber in den Tumorzellen häufig überexprimiert. Zu dieser Gruppe gehören z. B. CAMEL (CTL-recognized antigen on melanoma), HER2/Neu (human epithelial receptor 2 / neurological) oder Mucin-1. Eine weitere Gruppe sind die onkofetalen Antigene, die auf der Reaktivierung embryonaler Gene beruhen und in den meisten adulten Geweben inaktiv sind, z. B. Alphafetoprotein (AFP, fetales α-Globulin). Differenzierungsantigene gehen häufig auf das Ursprungsgewebe der Tumorzellen zurück und müssen keine Bedeutung für die Onkogenese haben. Zu dieser TAA-Familie gehören z. B. die Melanozytenantigene MART-1 (melanocyte antigen recognized by T cells, auch Melan-A), gp100, Tyrosinase und TRP1/-2 (tyrosinase-related proteins). Die tumor spezifischen Transplantationsantigene (TSTAs) beruhen auf somatischen Genmutationen und sind tumorspezifisch. Sie sind aufgrund ihrer höheren Immunogenität für die Abstoßung von Tumortransplantaten in Mäusen verantwortlich.

Die meisten TAAs besitzen keine oder nur eine sehr geringe Immunogenität. Trotzdem können spezifische T-Zellen gegen die TAAs gebildet werden. TZellen erkennen Peptidepitope im Kontext bestimmter MHC-Moleküle. Deshalb lassen sich Tumorantigene auch hinsichtlich MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Restriktion der T-Zellerkennung einteilen (Renkvist et al., 2001). Eine Datenbank von T-Zellepitopen mit integrierten Voraussagealgorithmen ist unter http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com verfügbar.

↓8

Gegen eine Vielzahl von TAAs wurden spezifische Antikörper isoliert, die ein wichtiges Werkzeug für die Diagnose und Therapie sind. Die SEREX-Methode (serological identification of antigens by recombinant expression cloning) (Sahin et al., 1997) erlaubt die Identifikation unbekannter TAAs durch die Isolation von tumorspezifischen rekombinanten Antikörperfragmenten aus dem Repertoire der Immunglobulin-Gene eines Tumorpatienten (Chen et al., 1997;Scanlan et al., 1998;Tureci et al., 1996;Tureci et al., 1999). Eine Datenbank der SEREX-Daten ist unter http://www.licr.org/SEREX.html zugänglich.

Mit Antikörpern und Lektinen lassen sich tumor assoziierte Glykosylierungen nachweisen. Zu den tumorassoziierten Kohlenhydratstrukturen gehören die Lewis-Antigene (Nakagoe et al., 2001), die auch auf vielen Immunzellen vorkommen, und Glykane mit terminalen β1-Galaktosylresten, wie das Thomsen-Friedenreich-Antigen (Campbell et al., 1995;Chung et al., 1996;Reese und Chow, 1992;Yeatman et al., 1989). Ihnen wird eine große Bedeutung bei der Organlokalisation von Tumormetastasen beigemessen (Cao et al., 1995;Cornil et al., 1990;Shigeoka et al., 1999).

1.3.2 Das karzinoembryonale Antigen (CEA)

CEA (CEACAM5, CD66e) ist ein lange bekanntes Tumorantigen und wurde ursprünglich von Gold und Friedman um 1965 beschrieben (Thomson et al., 1969). Es gehört zu einer Familie von Adhäsionsmolekülen, die als CEACAM- (CEA cell adhesion molecules) oder CD66-Familie bezeichnet wird (Beauchemin et al., 1999;Hammarstrom, 1999). Diese Proteinfamilie gehört zur Immunglobulinsuperfamilie (IgSF) und umfaßt 8 Gene und 3 Pseudogene, die auf Chromosom 19q im LRC (leukocyte receptor cluster) genetisch lokalisiert sind (Khan et al., 1992). 50 – 60% des Molekulargewichts des 180 kDa-Glykoproteins CEA machen N-verknüpfte multiantennäre Glykosylierungen aus. CEA ist auf der Plasmamembran über Glykosylphosphatidylinositol (GPI) mit Phospholipiden verknüpft. Die GPI-Verankerung wird über eine C-terminale Signalsequenz vermittelt (Takami et al., 1988). Die kontroversen Ergebnisse der mRNA- und Protein-Level deuten eine Regulation der CEA-Expression auf posttranskriptionaler Ebene an (Boucher et al., 1989). CEA wird im adulten Menschen als Bestandteil der Glykokalyx auf der apikalen Seite reifender und ausdifferenzierter Enterozyten der Darmzotten exprimiert (Frangsmyr et al., 1999;Kuroki et al., 1988). Die Freisetzung von CEA in das Darmlumen erfolgt entweder in lipidgebundener Form über die Vesikulation der Mikrovilli oder in gelöster Form über die GPI-spezifische Phospholipase C (Matsuoka et al., 1991). CEA hat eine Bedeutung bei der Kotbildung und beim Schutz vor pathogenen Darmbakterien.

↓9

CEA wird häufig auf epithelialen Tumoren, insbesondere Adenokarzinomen des Verdauungstraktes (Kinugasa et al., 1998;Tachibana et al., 1998), aber auch der Brust, der Bauchspeicheldrüse und der Lunge nachgewiesen. CEA dient als ein empfindlicher, jedoch nicht als spezifischer diagnostischer Tumormarker. Patienten mit Kolonkarzinomen weisen häufig CEA-Serumkonzentrationen von 1 µg/mL, in seltenen Fällen von 4 µg/mL, auf (Moertel et al., 1986). Trotzdem ist ein individueller Abgleich des Basiswertes für jeden Patienten erforderlich, um falsch-positive Ergebnisse auszuschließen.

Abbildung 1 - Die CEACAM-Familie
Die Mitglieder der CEACAM-Familie besitzen homologe Proteindomänen und sind stark glykolysiert. Über die N-Domänen kann eine homotypische Aggregation der CEACAMs erfolgen. Einige CEACAMs verfügen über eine große Zahl von Spleißvarianten (modifiziert nachHammarstrom, 1999).

CEA-spezifische Antikörper zeigen häufig eine Kreuzreaktivität mit mehreren Mitgliedern der CEACAM-Familie (CD66abce, CD66acde, CD66ace, CD66ae, CD66ce, CD66de) aufgrund ihrer homologen Domänen (Nagel et al., 1993). CEA vermittelt über seine N-terminale IgV-ähnliche N-Domäne eine homotypische interzelluläre Adhäsion, die eine wichtige Rolle bei der Metastasierung spielen könnte. Tumorzellaggregate haben wahrscheinlich eine größere Chance, sich vom Primärtumor zu lösen, im Blutkreislauf zu überleben und sich in anderen Geweben zu verankern, um dort Metastasen zu etablieren, als einzelne Tumorzellen (Levin und Griffin, 1991). Obwohl Mäuse kein CEA exprimieren, bildeten sich in transgenen Mäusen, bei denen das SV40-T-Antigen unter Einfluß des humanen CEA-Promoters stand, multifokale Tumore am Pylorus des Magens. Diese Tumore zeigten ein invasives Verhalten vergleichbar mit humanen Magenkarzinomen (Thompson et al., 2000). Die Kreuzung mit CEA-transgenen Mäusen führte zu doppelt transgenen Nachkommen, deren Magentumore CEA exprimierten (Thompson et al., 1997). Prado et al. (Prado et al., 1995) zeigten eine inverse Korrelation der CEA-Expression und NK-Zellsensibilität von Tumoren, räumten aber auch weitere Eigenschaften als Ursache ein. Lösliches CEA inhibiert die LAK-Zellaktivität und könnte als immunsupprimierender Faktor wirken (Rivoltini et al., 1992). Eine direkte Bindung von CEA an die LAK-Zellen konnte aber nicht gezeigt werden.

1.3.3 CD33, ein Marker akuter myeloischer Leukämien

↓10

CD33 (Siglec-3) gehört zur Sialoadhesinfamilie, einer Familie Sialinsäure-bindender Ig-ähnlicher Lektine (Freeman et al., 1995), welche CD22 (Siglec-2) und p75AIRM (Siglec-7) einschließt. Diese Gene wurden zusammen mit NKG7 benachbart zur CD66-Familie auf Chromosomen 19q im LRC gefunden. CD33 ist ein Differenzierungsmarker auf myeloischen und lymphoiden Vorläuferzellen und geht bei der weiteren Differenzierung verloren. Bei etwa 80% der akuten myeloischen Leukämien (AML) und 20% der akuten lymphatischen Leukämien der B-Zellreihe (B-ALL) bleibt CD33 erhalten. Siglecs sind in die Hämatopoese involviert. Während CD22 eine wichtige Rolle bei der B-Zellentwicklung spielt, sind CD33 und p75/AIRM an regulatorischen Prozessen der Myelopoese beteiligt. „Crosslinking“ von CD33 mit Antikörpern verhindert die Generation von DCs aus Monozyten (Ferlazzo et al., 2000). Antikörper gegen CD33 und p75/AIRM inhibieren chronische myeloische Leukämiezellen aber auch hämatopoetische Vorläufer zellen (Mingari et al., 2001;Vitale et al., 1999) CD33-spezifische Antikörper wurden erfolgreich zur Therapie myeloischer Leukämien eingesetzt (Caron et al., 1998;Caron et al., 1994;Jurcic, 2000;Jurcic et al., 2002;Kossman et al., 1999;Matthews, 1998)

1.4 Immunologische „Escape-Mechanismen“ von Tumoren

1.4.1 Toleranzinduktion durch den Tumor

Trotz veränderter Antigenexpression der Tumorzellen bleibt in den meisten Patienten eine effektive Immunantwort gegen den Tumor aus. Eine Ursache könnte das „sneaking through“-Phänomen sein. Die nichtimmunogenen frühen Phasen und die schleichenden Veränderungen während der Tumorentwicklung werden vom Immunsystem nicht oder nicht rechtzeitig erkannt, wodurch der Tumor Mechanismen ausbilden kann, eine tumorspezifische Immunantwort zu unterlaufen oder aktiv zu hemmen (Finke et al., 1999). Diese „Immun-Escape-Mechanismen“ entstehen in einem selektiven Prozeß. Vermutlich führt schon die Konkurrenz der Tumorzellen untereinander um abnehmende Ressourcen zur Sekretion zytotoxischer Faktoren. Weitere selektive Drücke werden durch unvollständige Immunreaktionen gegen den Tumor ausgeübt. Mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, wie der Colitis ulcerosa, ist ein erhöhtes Darmkrebsrisiko assoziiert. Das frühe Auftreten von TP53-Mutationen bei UCACRCs (ulcerative colitis-associated colo rectal carcinomas) könnte aus dem apoptotischen Streß durch inflammatorische Zytokine resultieren. Tumore blockieren außerdem in den frühen Phasen und beim Übergang zu invasiven Stadien entzündliche Prozesse, die als Alarmsignal zur Initiation der Immunantwort dienen, und verschieben damit das Gleichgewicht des Immunsystems in Richtung Toleranzinduktion (Pardoll, 2003).

1.4.2 Veränderte MHC-Expression auf Tumoren

Viele fortgeschrittene Tumore regulieren ihre MHC-Moleküle oder bestimmte MHC-Allele herunter, um einer T-Zellantwort auszuweichen (Cordon Cardo et al., 1991;Garcia-Lora et al., 2003;Garrido et al., 1995). Die Antigenpräsentation kann auch durch TAP-Defekte (transporter associated with antigen processing) blockiert sein (Seliger et al., 1997). Da das Fehlen klassischer MHC-Ia-Haplotypen durch NK-Zellen erkannt wird, schützen sich viele Tumorzellen durch Expression von HLA-C und nichtklassischen MHC-Ib-Molekülen (HLAG, -E). Dieser Mechanismus dient auch den Trophoblastzellen der Plazenta als Schutz und Barriere vor den mütterlichen NK-Zellen (Biassoni et al., 1999;King et al., 2000).

1.4.3 Tumorinduzierte Immunmodulation und -suppression

↓11

Das Mikromilieu am und im Tumor spielt eine bedeutende Rolle beim Unterdrücken einer tumorgerichteten Immunabwehr. IL-10 kann die MHC- und TAP-Expression reduzieren (Matsuda et al., 1994;Salazar-Onfray et al., 1997), und TGF-β (tumor growth factor β) hemmt die IL-2 und IFN-γ-Produktion, zwei wichtigen Mediatoren von CTL- und NK-Zellantworten. In vielen Tumorpatienten wurden funktionelle Defizite in der Signaltransduktion der T-Zellen festgestellt, die die CD3 ζ-Kette, die Protein-Tyrosin-Kinasen p56lck und p59fyn sowie NF-κB p65 betrafen (Bukowski et al., 1998;Correa et al., 1997;Mizoguchi et al., 1992;Whiteside, 1999). Die CD3 ζ-Kette wird vermutlich proteolytisch durch die Caspasen 3 und 7 abgebaut, da keine Änderung des mRNA-Levels festgestellt wurde. Die ζ-Kette wird auch durch reaktive Sauerstoffspezies der Makrophagen oder eine chronische Antigenstimulation ohne Kostimulation herunterreguliert und oftmals durch die γ-Kette ersetzt. Die CD28-Kostimulation ist davon nicht betroffen (Finke et al., 1999). Viele Mammakarzinome bewirken eine Inaktivierung von NF-κB und eine veränderte Zytokinproduktion der TILs. Die erhöhte Sekretion von IL10 hemmt die für eine tumorspezifische CTL-Antwort notwendige Th1-Antwort (Rabinowich et al., 1996). Eine lange Exposition mit Th2-Zytokinen (IL4, IL6 und IL10) führt zum Verlust der Th1-Population in Mäusen mit Nierenzellkarzinomen (Ghosh et al., 1995). Der Anteil apoptotischer T-Zellen ist in Tumorinfiltraten deutlich erhöht (Reichert et al., 1998). Einige Kolon-, Nieren- und Ovarialkarzinome exprimieren außerdem Fas-Ligand (FasL), das die Apoptose fas + Lymphozyten auslösen könnte (Gastman et al., 1999;Rabinowich et al., 1998;Uzzo et al., 1999). Obwohl die Expression von FasL keinen Schutz vor einer CTL-Antwort bietet, da spezifisch aktivierte CTL unempfindlich gegenüber der fas-vermittelten Apoptose sind, werden möglicherweise tumorspezifische naive T-Zellen eliminiert, bevor sie spezifisch aktiviert werden konnten.

Die immunsupprimierende Wirkung von Tumoren korreliert mit dem Tumorvolumen und der Länge der ExpositionDie Signal transduktions defekte von TILs können nach ihrer Isolation ex vivo durch IL-2 beseitigt werden. Die chirurgische Entfernung von Tumoren oder die Reduktion der Tumormasse führen häufig zur Wiederherstellung der normalen NF-κB-Aktivität und CD3 ζ-Expression in den T-Zellen. Der Einsatz immunologischer Therapien erfordert die Berücksichtigung der „Immun-Escape“-Mechanismen von Tumorzellen und der tumorassoziierten Immunsuppression (Gratama et al., 1999).

1.5 Natürliche Killerzellen

1.5.1 Allgemeine Eigenschaften von NK-Zellen

NK-Zellen werden morphologisch zu den großen granulären Lymphozyten (LGL, large granular lymphocytes) gezählt und machen 10 – 15% der peripheren Blutlymphozyten aus. Sie werden außerdem in der Milz, im Thymus, in den Lymphknoten, in der lamina propria und als gewebsspezifische Populationen, z. B. in der Leber (Luo et al., 1999) , nachgewiesen. Anfänglich wurden NK-Zellen als „Nullzellen“ oder „third population cells“ bezeichnet, da ihnen keine spezifischen Immunmarker zugeordnet werden konnten. Die als „Natürliche Killer“-Aktivität bezeichnete von TCR-/CD3- CD56+ CD16+ LGLs „spontan“ vermittelte zelluläre Zytotoxizität gegenüber virusinfizierten Zellen und Tumorzellen führte schließlich zur Bezeichnung als „Natürliche Killerzellen“ (Herberman et al., 1976).

↓12

NK-Zellen und T-Zellen sind eng miteinander verwandt. Sie entwickeln sich aus einem gemeinsamen lymphoiden Knochenmarkvorläufer (Lanier et al., 1992). Bestimmte T-Zellpopulationen weisen NK-Zelleigenschaften auf und werden als NKT-Zellen bezeichnet (Brutkiewicz und Sriram, 2002). Im Gegensatz zu den T-Zellen differenzieren sich NK-Zellen unabhängig vom Thymus. Obwohl sie keine individualspezifischen Antigenrezeptoren exprimieren, stellen NK-Zellen eine sehr heterogene Lymphozytengruppe dar. NK-Zellen wirken komplementär zu den T-Zellen, indem sie MHC-I- Zellen lysieren, und synergistisch, indem sie die Th1-Antwort und die Bildung von Gedächtnis-T-Zellen fördern (Kelly et al., 2002). Die NK-Zellaktivität erreicht 1 – 3 Tage nach einer Erstinfektion ihr Maximum, während die primäre CTL-Antwort erst nach 7 – 9 Tagen erfolgt. NK-Zellen bilden im Gegensatz zu T-Zellen kein „immunologisches Gedächtnis“.

Die Freisetzung von Interferonen durch virusinfizierte Zellen führt zur Aktivierung der NK-Zellen. Die NK-Zellen reagieren außerdem auf die Herunterregulation von MHC-I-Molekülen und die Expression von Stressproteinen oder bestimmten viralen Komponenten auf Tumorzellen und virusinfizierten Zellen. NK-Zellen sekretieren daraufhin IFN-γ, GMCSF, und TNF-α. Diese inflammatorischen Zytokine aktivieren Makrophagen, die IL-12 sekretieren. IL12 stimuliert zusammen mit IFN-γ die Th1-Antwort und damit die Bildung antigenspezifischer CTL. IFN-γ bewirkt zusätzlich die Hochregulation der MHC-Expression auf virusinfizierten Zellen, eine wichtige Voraussetzung für die T-Zellerkennung. NK-Zellen interagieren auch mit den DCs, deren Bedeutung aber nicht völlig geklärt ist (Chiesa et al., 2003;Moretta et al., 2003). CD16+ NK-Zellen sind wichtige Effektoren für Antikörper (beim Menschen: IgG1 und IgG3) und die Vermittler der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC).

NK-Zellen werden durch Th1-Zytokine (IL2, IL12 und IFN-γ) aktiviert, wodurch Adhäsionsmoleküle und einige aktivatorische Rezeptoren hochreguliert werden. Das Zusammenwirken von IL-12 mit TNFα, IL-15 oder IL-18 fördert die NK-Zellaktivität. Inflammatorische Chemokine, wie MIPα/β (macrophage inflammatory protein) erhöhen ihre Migrationseigenschaften (Taub et al., 1995). In Gegenwart hoher IL-2-Konzentrationen (1000 IE/mL) entwickeln viele NK-Zellen einen adhärenten Phänotyp. Die adhärenten NK-Zellen zeichnen sich durch ein erhöhtes Migrationsverhalten und Effektorpotential gegenüber Tumorzellen und Metastasen aus (Vujanovic et al., 1995). Die IL-2-Aktivierung kann in vitro einige Wochen erhalten werden, führt aber zu einer veränderten Expression der Adhäsionsmoleküle und möglicherweise zu eingeschränkten migratorischen Fähigkeiten und Effektoreigenschaften (Maenpaa et al., 1993).

1.5.2 Erkennungsmechanismen der NK-Zellen

↓13

Die Zytotoxizität der NK-Zellen wird durch aktivatorische und inhibitorische NK-Zell rezeptoren (1.5.3) sowie durch Adhäsionsmoleküle (1.5.4) reguliert (Bakker et al., 2000;Moretta et al., 1995;Moretta et al., 2000). Die von Kärre und Ljungren vorgestellte missing-self “-Hypothese (Ljunggren und Karre, 1990) postulierte, daß das Fehlen klassischer MHC-Ia-Moleküle zu einer NK-Zellattacke führt, da NK-Zellen inhibitorische MHC-Rezeptoren (Tabelle 1) exprimieren. Umgekehrt schützen MHC-Klasse-Ia-Moleküle als „Selbst“-Moleküle die Körperzellen vor einer NK-Zellattacke ("express yourself or die",Karre, 1995). Auf NK-Zellklonen wird nur selten mehr als ein inhibitorischer NK-Zellrezeptor für MHC-Ia-Moleküle nachgewiesen, wodurch schon das Fehlen eines MHC-Ia-Allels durch eine bestimmte NK-Zellpopulation erkannt wird. Die „missing-self“-These kann jedoch nicht die Erkennung allogener MHC-Moleküle (allorecognition) und die Hybridresistenz allogener Knochenmarktransplantate vollständig erklären (Bennett et al., 1995;George et al., 1997). Die Entdeckung aktivatorischer NK-Rezeptoren für MHC-Klasse-Ia-Moleküle (Tabelle 2) führte zum „ On-Off “-Modell (Raulet und Held, 1995), der Aktivierung oder Hemmung der NK-Zellen in Abhängigkeit davon, ob die MHC-Ia-Liganden auf den Zielzellen durch aktivatorische oder inhibitorische NK-Zellrezeptoren erkannt werden. Die gleichzeitige Expression inhibitorischer und aktivatorischer Rezeptoren für denselben MHC-Typ erfordert jedoch komplexere Modelle. Gegenwärtig wird von einem Gleichgewicht inhibitorischer und aktivatorischer Signale in den NK-Zellen ausgegangen, das durch eine verringerte oder veränderte MHC-Ia-Expression auf den Zielzellen gestört wird. Die komplexen Interaktionen von NK- und Zielzellen schließen außerdem Adhäsionsmoleküle und Rezeptoren für nichtklassische MHC-Ib-Moleküle, virale Proteine und Streßproteine ein, die erst in ihrer Summe zur Aktivierung der NK-Zellzytotoxizität führen (siehe 1.5.3 - 1.5.6).

1.5.3 NK-Zellrezeptoren

Es werden zwei große NK-Zellrezeptorfamilien unterschieden (Moretta et al., 2000), zu denen inhibitorische Rezeptoren ( Tabelle 1 ) als auch aktivatorische Rezeptoren (Tabelle 2) gehören. Die KIRs ( killer cell Ig-like recepors ) gehören zur Immunglobulinsuperfamilie und sind im LCR-Locus (leukocyte Ig-like receptor) auf dem humanen Chromosom 19q13.4 lokalisiert. Sie erkennen MHC-Klasse-Ia-Moleküle (HLA-A/B/C) und nichtklassische MHC-Ib-Moleküle, wie HLA-G (Lopez Botet et al., 2000). Einige inhibitorische KIRs besitzen aktivatorische Spleißvarianten, die eine transkriptorische Regulation vermuten lassen (Moretta et al., 1995). Die Peptide in den MHC-I-Molekülen können die Bindung der KIRs beeinflussen (Malnati et al., 1995). Inhibitorische KIRs weisen deutlich höhere Affinitäten als ihre aktivatorischen Spleißvarianten auf (Biassoni et al., 1997). Strukturanalysen von KIRs mit ihren MHC-Liganden deuten zudem kinetische Aspekte an (Natarajan et al., 2002).

Tabelle 1 - Humane inhibitorische NK-Zellrezeptoren

KIRs

Anmerkungen

Liganden

p58.1, NKAT1 (CD158a)

KIR 2DL 1*

Spleißvariante von p50.1

HLA-Cw2,4,5,6 (Asn77-Lys80) **

p58.2, NKAT6 (CD158b1)

KIR2DL2

Spleißvariante von p50.2

HLA-Cw1,3,7,8(Ser77-Asn80) **

p58.3, NKAT2 (CD158b2)

KIR2DL3

Spleißvariante von p50.3

?

CD158d

KIR2DL4

auf allen NK-Zellen (?)

HLA-G

CD158f

KIR2DL5

 

?

p70, NKAT3, NKB1 (CD158e1)

KIR3DL1

 

HLA-B (Gumperz et al., 1997)

p140, NKAT4(4a/b) (CD158k)

KIR3DL2

Homodimer

HLA-A3,-A11

KIRC1 (CD158z)

KIR3DL7

 

?

KIR103AS

 

Homologien zu p58 und p70

? (Selvakumar et al., 1996)

ILT-2 (CD85j)

LIR-1

LIR-Familie (leukocyte Ig-like receptors)

UL18 - ein hCMV-kodiertes MHC-Klasse-I-Homolog

C-Typ Lektine

Anmerkungen

Liganden

CD94/NKG2A,B (CD159A,B)

Heterodimer, NKG2A/B sind Spleißformen

HLA-E

NKRP1A

Maus-NKRP1 ist aktivatorisch

?

* KIR 2D L 1 = 2 extrazelluläre Ig- D omänen, lange („ L ong“) zytoplasmatische Domäne = inhibitorischer KIR, KIR2D S 1 = kurze („ S hort“) zytoplasmatische Domäne = aktivatorischer KIR (siehe Tabelle 2)

**HLA-C-Dimorphismus in den Aminosäuren 77 und 80 der HLA-α1-Domäne

↓14

Die zweite große Gruppe NK-Zellrezeptoren gehört zur C-Typ Lektin-Familie und ist auf dem Locus 12p12.3-13.1 lokalisiert. NKG2A und B formen zusammen mit CD94 inhibitorische Rezeptoren, während NKG2C, -E und -F mit CD94 aktivatorische Rezeptoren bilden. Diese heterodimeren Rezeptoren erkennen das nichtklassische MHC-Ib-Molekül HLA-E, das Nonapeptide aus den Signalpeptiden anderer MHC-I-Moleküle präsentiert. Modelle postulieren, daß CD94 an die α1-Domäne und NKG2 an die α2-Domäne von HLA-E binden. Das eingelagerte Peptid wird von NKG2 erkannt und beeinflußt die Affinität des CD94/NKG2-Komplexes. Peptide aus den Leader-Sequenzen der meisten HLA-Klasse-I-Moleküle werden vom inhibitorischen CD94/NKG2A-Komplex mit höherer Affinität als vom aktivatorischen CD94/NKG2C-Komplex gebunden. Eine Ausnahme bilden Peptide aus dem HLA-G-Leader, die vom CD94/NKG2C-Komplex mit höherer Affinität erkannt werden (Llano et al., 1998).

Tabelle 2 - Humane aktivatorische NK-Zellrezeptoren

KIRs

Anmerkungen

Signalmolekül

Liganden

p50.1 (CD158h)

KIR2DS1

Spleißform von p58.1

DAP12

HLA-Cw2,-Cw4,-Cw5, -Cw6

p50.2 (CD158j)

KIR2DS2

Spleißform von p58.2

DAP12

HLA-Cw1,-Cw3,-Cw7, -Cw8

p50.3, NKAT8 (CD158i)

KIR2DS4

Spleißform von p58.3

DAP12

HLA-C-Allele

NKAT9 (CD158g)

KIR2DS5

 

DAP12

?

KIRX (CD158c)

KIR2DS6

 

DAP12

?

NKAT10 (CD158e2)

KIR3DS1

 

?

HLA-A/B-Allele

C-Typ Lektine

Anmerkungen

Signalmolekül

Liganden

NKG2C,E, F

Heterodimere mit CD94

DAP12

HLA-E

NKG2D

Homodimer, assoziiert nicht mit CD94, kann inhibitorische KIRs übertrumpfen

DAP10, ζ-Kette

MICA, ULBPs, Maus: RAE-1, H60 (Cosman et al., 2001)

NCRs

Anmerkungen

Signalmolekül

Liganden

Fc(γ)RIIIa (CD16a)

IgG-Fc-Rezeptor mit niedriger Affinität, vermittelt den ADCC

γ-, ζ-Kette

IgG (Fc-Teil, CH2-Domäne)

NKp30

 

γ-, ζ-Kette

unbek. nicht-MHC-Ligand

NKp44

de novo nach IL-2-Aktivierung

DAP12

nicht-MHC-Liganden: Influenza-Hämagglutinin (HA), Parainfluenza-HA/Neuramini-dase u. a.

NKp46

in allen NK-Zellen, unabhängig ob aktiviert oder nicht (erkennt auch Strukturen auf Mauszellen)

γ-, ζ-Kette

DAP10 (KAP10) ........ 10 kDa Adaptorprotein mit YNIM-Motiv (Bindungsstelle für die p85-Untereinheit der PI3K)

DAP12 (KARAP12) ... 12 kDa Adaptorprotein mit ITAM-Motiv (Signaltransduktion über Syk und ZAP70)

MICA/B … streßinduzierbare polymorphe MHC-Klasse-I-homologe Proteine auf vielen epithelialen Tumoren

ULBPs (UL16-binding proteins) … binden an das CMV-Glykoprotein UL16 (Kubin et al., 2001)

Neben den aktivatorischen MHC-Rezeptoren wurde eine Reihe aktivatorischer NK-Rezeptoren entdeckt, die Streßproteine und bestimmte virale Proteine erkennen und die Zytotoxizität der NK-Zellen auslösen (NCRs, natural killer cytotoxicity triggering receptors). Der Korezeptor 2B4 unterstützt das Signal einiger aktivatorischer NK-Zellrezeptoren (Chuang et al., 2000;Chuang et al., 2001;Johnson et al., 2000). Die humane NK-Zellinie YT erkennt und lysiert CD80+ Tumorzellen über CD28 (Azuma et al., 1992). Während Maus-NK-Zellen CD80+/CD86+ Tumorzellen ebenfalls über CD28 erkennen, werden für humane NK-Zellen andere Rezeptoren für CD80/86 vermutet (Lang et al., 1998;Wilson et al., 1999). Obwohl NK-Zellen Antigene über MHC-Klasse-I/-II präsentieren können und außerdem kostimulatorische Moleküle exprimieren (Roncarolo et al., 1991), ist die mögliche Funktion der NK-Zellen als APCs bisher unklar.

↓15

Tabelle 3 - Andere Rezeptoren, Korezeptoren und kostimulatorische Moleküle der NK-Zellen

(Ko-)Rezeptor

Anmerkungen

CD244 (2B4), CD2-Subfamilie**

Korezeptor für verschiedene NCRs (z. B. NKp46), Ligand CD48

NKp80

Homodimer, vermutlich Korezeptor (Vitale et al., 2001)

CD226 (DNAM-1)

assoziiert mit LFA-1, kann Zytotoxizität auslösen (Bottino et al., 2003;Shibuya et al., 1996;Shibuya et al., 1998;Shibuya et al., 1999)

CD69

C-Typ Lektin, unbekannter Ligand, erster Aktivierungsmarker

CD40L**

bindet CD40, löst Zytotoxizität der Maus-NK-Zellen aus (Martin-Fontecha et al., 1999)

CD28*,**

bindet an CD80/CD86, löst Zytotoxizität der Maus-NK-Zellen und der humanen NK-Zellinie YT aus

CD80 (B7.1), CD86 (B7.2)*,**

bewirkt Kostimulation von T-Zellen

MHC-Klasse-I/-II*,**

Antigenpräsentation

* auf der humanen NK-Zellinie YT

**auf der humanen NK-Zellinie NK92 (Maki et al., 2001)

1.5.4 Adhäsionsmoleküle

Adhäsionsmoleküle (Tabelle 4) spielen eine wichtige Rolle bei der NK-Zellzytotoxizität (Gahmberg et al., 1998). Die Zytotoxizität der NK-Zellen gegenüber bestimmten Tumorzellinien läßt sich durch Antikörper gegen CD18 (oder CD11a+b+c), CD54, CD2 und RGD-bindende Integrine teilweise oder bei gemeinsamer Gabe vollständig blocken (Timonen et al., 1990). Adhäsionsmoleküle vermitteln außerdem die Adhäsion der NK-Zellen an Endothelien und ihre Migration in Gewebe (Ferrara, 1996).

Tabelle 4 - Adhäsionsmoleküle auf NK-Zellen

Adhäsionsmoleküle

Ligand und Funktion, Anmerkungen

Integrine

α/β-Heterodimere, die an Zelladhäsionsmoleküle und an die Extra zellulär matrix binden (starke Adhäsion)

αLβ2 (CD11a/CD18, LFA-1)

ICAM-1, siehe DNAM-1 (Tabelle 3 )

αMβ2 (CD11b/CD18, Mac-1, CR-3)

ICAM-1, iC3b (Komplement), Fibrinogen, ICAM-2-Peptid (Li et al., 1995), Lyse iC3b-opsonylierter Bakterien und Zellen

αxβ2 (CD11c/CD18, p150.95, CR-4)

CD58 (LFA-3), iC3b

α4β7 (LPAM-1)

MAdCAM-1 (mucosal addressin cell adhesion molecule-1), NK-Zellen binden nur schwach (Rott et al., 1996)

αEβ7 (αE = CD103)

E-Cadherin (epithelial cadherin)

Adhäsionsmoleküle

Ligand und Funktion, Anmerkungen

Selektine

binden an Kohlenhydratepitope, vermitteln schwache Adhäsion an Endothelien („ Rolling “)

L-Selektin (MEL-14, CD62L)

sulfatiertes LewisX, GlyCAM-1, CD34 (Sialomucin), MAdCAM-1

RGD-bindende Integrine

Adhäsion an RGD-Matrixproteine

α1β1 (CD49a/CD29, VLA-1)

Kollagen, Laminin-1, auf aktivierten NK-Zellen

α2β1 (CD49b/CD29, VLA-2)

Kollagen, Laminin, auf aktivierten NK-Zellen

α3β1 (CD49c/CD29, VLA-3)

Laminin-5, Fibronektin, Kollagen, Entactin, Invasin, aktivierte NK-Zellen

α4β1 (CD49d/CD29, VLA-4)

Fibronektin (CS1-Peptid), VCAM-1 (CD106)

α5β1 (CD49e/CD29, VLA-5)

Fibronektin (Peptid: GRGDSP) (Gismondi et al., 1991)

α6β1 (CDw49f/CD29, VLA-6)

Laminin, Invasin, Merosin (Lowdell et al., 1995)

Immunglobulinfamilie

Zelladhäsion, Ziel für Integrine

CD2 (LFA-2)

LFA-3

CD50 (ICAM-3)

LFA-1

CD54 (ICAM-1)

LFA-1, Mac1

CD58 (LFA-3)

CD2

CD44-Familie

Zelladhäsion

CD44H (H-CAM, pgp-1)

Hyaluronsäure, auch Fibronektin, Kollagen und sulfatierte Proteoglykane

↓16

1.5.5 Signaltransduktion

Die aktivatorischen NK-Zellrezeptoren (Moretta et al., 2000;Moretta et al., 2001) der KIR- und C-Typ-Lektin-Familie zeichnen sich durch eine kurze zytoplasmatische Domäne aus und sind nichtkovalent mit Signalmolekülen, wie der CD3 ζ-Kette, der Fc-Rezeptor-γ-Kette, DAP10 oder DAP12 (Tabelle 2), assoziiert. Diese Signalmoleküle sind Transmembranproteine mit einem sehr kurzen extraplasmatischen Anteil. Sie bilden disulfidverknüpfte Homodimere, z. T. auch Heterodimere. γ-, ζ-Kette und DAP12 enthalten zytoplasmatische aktivatorische Signalmotive (ITAMs, immunoreceptor tyrosine activatory motifs) mit je 2 Tyrosinphosphorylierungsstellen ( Y xxL/I), die durch 6 – 8 AS getrennt sind. Kinasen der src-Familie, wie Syk und ZAP70 (-associated protein-70), binden über ihre SH2-Domänen (src homology 2) an die ITAMs und aktivieren eine Vielzahl von Signalwegen. Die Aktivierung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) steht im Zentrum der NK-Zellzytotoxizität (Jiang et al., 2000) und führt über den MAPK-(mitogen activated protein kinase)-Signalweg (Brumbaugh et al., 1997;Brumbaugh et al., 1996;Galandrini et al., 1999) zur ERK2-Aktivierung (extracellular signal regulatory kinase 2), die über das Zytoskelett die Mobilisation der zytotoxischen Granula in Richtung gebundener Zielzelle auslöst (Carretero et al., 2000;Trotta et al., 1998;Wei et al., 1998). Das YINM-Signalmotiv von DAP10 (YMNM bei CD28) bindet direkt an die p85-Untereinheit der PI3K (Abbildung 2).

Die inhibitorischen NK-Zellrezeptoren der KIR- und C-Typ-Lektin-Familie besitzen eine längere zytoplasmatische Domäne mit inhibitorischen Sequenzmotiven, den ITIMs (immuno receptor tyrosine inhibitory motifs). Die inhibitorischen ITIMs rekrutieren SHP-1 (SH2 containing protein tyrosine phosphatase). SHP-1 inaktiviert u. a. Vav-1, wodurch der MAPK-Signalweg und die NK-Zellzytotoxizität gehemmt werden (Abbildung 2).

↓17

Abbildung 2- Signaltransduktion in NK-ZellenDie aktivatorischen NK-Rezeptoren lösen über die PI3K und den MAPK-Signalweg die Aktivierung der ERK2-Kinase aus, die die Mobilisierung der zytotoxischen Granula bewirkt. Korezeptoren unterstützen diesen Signalweg. Inhibitorische NK-Rezeptoren inaktivieren über die Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-1 den Rac-1-Guanidin-Nukleotid-Austauschfaktor Vav-1 und hemmen den MAPK-Signalweg.

1.5.6 Zytotoxische Mechanismen der NK-Zellen

NK-Zellen und CTL verfügen über zwei Wege, ihre Zielzellen zu lysieren (Smyth, 1995). Sie können über Fas-Ligand (FasL, CD95L) die Apoptose in fas + (CD95, Apo-1) Zielzellen auslösen (Arase et al., 1995). FasL, das zur TNF-Familie gehört und Homotrimere bildet, bindet an trimere fas-Komplexe auf den Zielzellen, deren intrazelluläre „Death“-Domänen die Caspase-8 aktivieren und damit die Apoptose der Zelle einleiten.

Der zweite Mechanismus ist die sekretorische Perforin-vermittelte Lyse. Nach Verschmelzung der zytotoxischen Granula mit der Plasmamembran (Ca++-abhängig) werden die enthaltenen Perforine und Granzyme in Richtung Zielzelle ausgeschüttet. Aufgrund der engen Bindung der NK-Zellen an ihre Zielzellen (Abbildung 3 ) können die Perforine Löcher in der Membran der Zielzellen erzeugen, über die die Granzyme eingeschleust werden. Die Granzyme aktivieren durch partielle Proteolyse Caspasen und lösen die Apoptosekaskade aus. Die Perforation der Zellmembran führt außerdem zum Zusammenbrechen des Membranpotentials und zur direkten Lyse der Zielzellen (Nekrose).

↓18

Die Ablauf der Targetzellyse läßt sich wie folgt unterteilen (Djeu et al., 2002):

  1. Erkennung und Bindung an die Zielzellen (Targetzellerkennung)siehe  –  und
  2. Signaltransduktion in den NK-Zellensiehe Abschnitt und
  3. Austeilung des lethalen Schlages (Sekretion der zytotoxischen Faktoren)siehe Text
  4. Effektorzellunabhängige Phase der Lyse (Apoptose, Nekrose) Die abschließende Phase läuft unabhängig von den Effektorzellen in der Zielzelle ab und endet mit ihrer Apoptose oder Nekrose.
  5. Effektor- Recycling Im Gegensatz zu den CTL (Weijtens et al., 1996) verfügen NK-Zellen über kein effektives „Effektor-Recycling“, das die Lyse mehrerer Zielzellen durch eine Effektorzelle innerhalb weniger Stunden ermöglicht. Dieser Mangel wird durch die große Zahl und die breite Spezifität der NK-Zellen ausgeglichen.

Abbildung 3 - „Immunologische Synapse“ zwischen NK-Zelle und Zielzelle
Die NK-Zellen binden über Adhäsionsmoleküle an die Zielzellen, die sich im Zentrum der Kontaktstelle ansammeln. Um dieses Zentrum formiert sich ein Ring aus inhibitorischen NK-Rezeptoren. Dort werden ebenfalls die aktivatorischen NK-Rezeptoren und Korezeptoren vermutet. Die gemeinsame Lokalisation inhibitorischer und aktivatorischer Rezeptoren sowie die enge Verbindung von NK- und Zielzelle ermöglicht eine optimale Erkennung, Signaltransduktion und Lyse der Zielzellen mit geringen Kolateralschäden. T-Zellen bilden ähnliche immunologische „Synapsen“ mit APCs und Zielzellen aus.

1.5.7 Eigenschaften der humanen NK-Zellinie YT

↓19

In dieser Arbeit wird die humane NK-Zellinie YT (Yodoi et al., 1985) eingesetzt. YT-Zellen wachsen in vitro unbegrenzt und unabhängig von IL-2. Aus der NK-Zellinie NK-92 konnte erst nach Transfektion mit dem IL2-Gen die zytokinunabhängig wachsende Subline NK92ci hergestellt werden (Tam et al., 1999). YT-Zellen lysieren Tumorzellinien MHC-unabhängig über die Freisetzung von Perforinen und Granzymen (Bochan et al., 1995) oder über FasL (Montel et al., 1995). Eine Zytotoxizität gegenüber gesunden Geweben wurde nicht beschrieben. YT-Zellen besitzen einen aktivierten NK-Zellphänotypund sind CD7+, CD25+, CD28+, CD30+, CD45RO+, CD56+ und HLA-DR+ sowie CD2-, CD8-, CD11-, CD16- und CD57-. In der YT-Zellinie wurde ein 3,2 kB großer Abschnitt des EBV-Genoms gefunden, der möglicherweise für die Immortalisierung der Zellen verantwortlich ist (Yoneda et al., 1992). Eine Besonderheit der NK-Zellinie YT ist die Möglichkeit, sie mit Plasmidvektoren durch Elektroporation zu transfizieren (Bochan et al., 1995;Montel et al., 1995;Sorachi et al., 1992). Andere NK-Zellinien erfordern häufig einen retroviralen Gentransfer (Nagashima et al., 1998;Tran et al., 1995). Die Erkennungseigenschaften der YT-Zellinie konnten durch Transfektion mit Rezeptorgenen verändert werden (Liu et al., 1994;Schirrmann und Pecher, 2001).

1.6 Rekombinante Antikörper für ein Immuntargeting

1.6.1 Antikörper

Antikörper (Abbildung 4) sind aus zwei unterschiedlichen Immunglobulinketten aufgebaut, der leichten und der schweren Kette. Am N-Terminus jeder Kette befindet sich eine variable (V) Domäne mit 3 hypervariablen Abschnitten von 5 – 15 Aminosäuren, den CDRs (complementary determining regions). Die CDRs ragen als Loops aus den V-Regionen und vermitteln die Antigenbindung. Die CDRs werden durch ein Gerüst (frame work) aus rigiden β-Faltblattstrukturen (β-barrels) stabilisiert. An die V-Regionen schließen sich die konstanten (C) Regionen an, die über Disulfidbrücken die Immunglobulinketten verbinden, die V-Regionen stabilisieren und die Bindung immunologischer Effektoren vermitteln.

Abbildung 4 - Molekularstruktur eines IgG1-Antikörpers
Die Molekularstruktur des humanen IgG1 (modifiziert nachClark, 1997). Die VL- und VH-Domänen verfügen über 3 hypervariable Loops (CDRs, rot), die die Antigenbindung vermitteln. In der hinge-Region sind die schweren Immunglobulinketten über Disulfidbrücken verbunden. Die Bindungsorte für die Fc(γ)RIIIa-Kette der NK-Zellen und das Komplement C1q wurden angegeben (rechts – Van-der-Waals-Radien, links – Peptidrückgrat, V – variable Region, C – konstante Region, L – leichte Kette, H – schwere Kette).

↓20

Die große Diversität der Antikörper wird durch somatische Rekombination erreicht, die in jeder B-Zelle im Laufe ihrer frühen Entwicklung stattfindet. Dabei werden die V-Regionen beider Ketten aus mehreren Gensegmenten, die mit V (variable), J (joining) und D (diversity, nur schwere Kette) bezeichnet werden, auf genomischer Ebene zusammengesetzt. Ein Großteil der Antikörperspezifität geht auf die CDR3 der schweren Kette zurück (Xu und Davis, 2000). Die anfänglich geringe Affinität der Antikörper wird durch Oligomerisierung ausgeglichen (IgM). Während der B-Zellaktivierung in den Keimzentren der sekundären Follikel in Lymphknoten und Milz durchlaufen die B-Zellen Zyklen von Hypermutation in den Immunglobulingenen (Zentroblasten, dunkle Zone) und Affinitätsselektion gegenüber antigentragenden follikulären dendritischen Zellen (Zentrozyten, helle Zone). Diese Affinitäts reifung führt zu B-Zellen mit hochaffinen Antikörpern, die einen „class-switch“ der schweren Kette durch erneute somatische Rekombination durchlaufen und andere Antikörper-Isotypen bilden (IgM ♢ IgG, IgA oder IgE). Reife B-Zellen differenzieren zu Gedächtnis-B-Zellen oder zu Plasmazellen, den terminal ausdifferenzierten antikörperproduzierenden Zellen.

1.6.2 Erzeugung humaner Antikörper

Abbildung 5 - V-Regionen der humanisierten Antikörper BW431/26 und HuM195
Die Aminosäuresequenzen der V-Regionen der humanisierten Antikörper BW431/26 (obere Sequenz) und HuM195 (untere Sequenz) wurden mit den Konsensusbereichen (fett) humaner Antikörper dargestellt. Die CDRs (<->) wurden gekennzeichnet. Bei der VH-Region wurden die CDR-Definitionen nach Kabat (Längenpolymorphismus der hypervariablen Bereiche,Kabat et al., 1987;Wu und Kabat, 1970), die Definition nach Chothia (Antigenbindungsstellen,Chothia und Lesk, 1987;Chothia et al., 1989) und die AbM-Definition (Oxford Molecular’s antibody modelling software AbM) angegeben. Andere CDR-Definitionen werden aus Kristallographiedaten nach dem Antigenkontakt (MacCallum et al., 1996) oder mit mathematischen Methoden (Honegger und Pluckthun, 2001) festgelegt (nicht gezeigt).

Die meisten monoklonalen Antikörper wurden in der Maus mit der Hybridomtechnologie hergestellt. Sie beruht auf der Isolation von B-Zellen aus der Milz immunisierter Mäuse. Die B-Zellen werden mit immortalisierten Myelomzellinien zu Hybridomen fusioniert. Die Herstellung humaner Hybridome ist dagegen äußerst schwierig. Maus-Antikörper können durch Austausch des Frameworks der V-Regionen in einem aufwendigen „Reshaping“-Prozeß humanisiert werden (Abbildung 5). Die humanisierten Antikörper BW431/26 und HuM195 wurden auf diese Weise erzeugt (Caron und Scheinberg, 1993;Gussow und Seemann, 1991). Displaytechnologien ermöglichen die direkte Isolation humaner Antikörperfragmente (siehe 1.6.4).

1.6.3 Konstruktion von single-chain-Antikörper-Fragmenten

↓21

Die antigenbindenden Fv-Fragmente sind schwer durch Proteolyse zu erhalten, und ihnen fehlt die Stabilität der Fab’-Fragmente (Sharon und Givol, 1976). VH- und VL-Domäne können durch Vernetzung mit Glutaraldehyd (Glockshuber et al., 1990) oder durch Einfügen intermolekularer Disulfidbrücken mittels ortsgerichteter Mutagenese stabilisiert werden (Jung et al., 1994). Die Verknüpfung beider V-Regionen über einen Peptid-Linker zu einem single-chain Fv- (scFv-) Fragment (Abbildung 6) hat sich jedoch durchgesetzt (Bird et al., 1988;Owens und Young, 1994;Whitlow et al., 1993).

Abbildung 6 - Struktur eines single-chain-Fv-FragmentsFv-Fragmente von Antikörpern können über einem flexiblen und löslichen Peptid-Linker zu scFv-Fragmenten verbunden werden.

Die Konstruktion von scFv-Fragmenten umfaßt folgende Schritte:

↓22

  1. Isolation der cDNA der V-Regionen
  2. Konstruktion des scFv-Konstruktes (Verbindung von VH und VL über einen Linker)
  3. Expression, Reinigung und Analyse des scFv-Proteins

Die cDNA-Sequenzen der V-Regionen werden aus dem Hybridom isoliert. Aufgrund unterschiedlicher Allele müssen evtl. mehrere Kombinationen ausgetestet werden. Obwohl beide Orientierungen der V-Regionen (VH / Linker / VL oder VL / Linker / VH) für die Konstruktion von scFv-Fragmenten möglich sind, bevorzugen einige scFv-Konstrukte eine Anordnung hinsichtlich Expression und Affinität (Tsumoto et al., 1994). Es gibt jedoch keine allgemeine Präferenz (Breitling und Dübel, 1997).

Tabelle 5 - Linker-Sequenzen zur Konstruktion von scFv-Fragmenten

Länge

Linker -Sequenz

Referenzen

10-25

(GGGGS)n, n=2-5

(Chaudhary et al., 1989;Freund et al., 1993;Huston et al., 1993)

11

LLLIFPPSSEE

(Condra et al., 1990)

14 (19)

LLLIFPPSSGGGGS(GGGGS)

(Condra et al., 1990)

15

ESGRSGGGGSGGGGS

(Bird et al., 1988)

14

EGKSSGSGSESKST

(Batra et al., 1990)

14

EGKSSGSGSESKVD

(Batra et al., 1990)

13

EGLSSGSGESKST

(Bird et al., 1988)

14

SSPSVTLFPPSSNG

(Anand et al., 1991)

15

LTVSSGGGGSGGGGS

(Anand et al., 1991)

16

SSPSVTGGGGSGGGS

(Anand et al., 1991)

16

LTVSSALTTPPSVYPL

(Anand et al., 1991)

18

KESGSVSSEOLAQFRSLD

(Bird et al., 1988)

12

GKSSGSGSESKS

(Whitlow et al., 1993)

14

GSTSGSGKSSEGKG

(Whitlow et al., 1993)

18

GSTSGSGKSSEGSGSTKG

Linker-212 (Whitlow et al., 1993)

18

GSTSGSGKPGSGEGSTKG

Linker -218 (Whitlow et al., 1993)

↓23

Der Peptid-Linker (Tabelle 5) muß die Distanz von 3,5 nm zwischen C-Terminus und N-Terminus der V-Regionen im Fv-Fragment überwinden (Abbildung 6). Ausgehend von der Länge einer Peptidbindung von 0,38 nm sind mindestens 10 AS erforderlich. Linker mit 15 – 18 AS Länge scheinen optimal zu sein. Außerdem muß der Linker eine hohe Flexibilität (Gly) und eine hohe Löslichkeit (Ser, Thr) aufweisen. Einige Linker ersetzen einen Teil der konstanten Region des Antikörpers (Condra et al., 1990) oder sind von bestimmten Proteinen abgeleitet (Bird et al., 1988). In dieser Arbeit wurde der Linker-218 eingesetzt (Whitlow et al., 1993). Er hat eine Länge von 18 AS und enthält viele Gly-, Ser- und Thr-Reste. Zusätzlich wurden zwei positivgeladene Lys-Reste und ein negativgeladener Glu-Rest eingefügt. Der Lys-Rest nahe dem N-Terminus der VH-Domäne (Orientierung: VL / Linker / VH) ersetzt die positive Ladung, die in der VH-Region bei der scFv-Konstruktion verloren geht. Der Pro-Rest verbessert die proteolytischen Stabilität verglichen mit dem Linker-212.

1.6.4 Displaytechnologien zur Isolation von Antikörperfragmenten

Humane scFv-Fragmente können mittels Displaytechnologien, die auf der Kopplung von Gen und Genprodukt beruhen, direkt isoliert werden (Breitling und Dübel, 1997;Owens und Young, 1994). Das Phagendisplay ist am weitesten verbreitet. Der filamentöse E. coli-Phage M13 bindet über pIII an die F-Pili von E. coli (F‘-Stämme). In pIII können fremde Gensequenzen, z. B. für scFv-Fragmente, ohne größere Funktionsbeeinträchtigung eingebaut werden. Die infizierten E. coli bilden 100 – 200 sehr robuste Phagenpartikel. Durch wiederholte Zyklen von Selektion gegenüber dem Antigen und Infektion von E. coli werden Phagen mit antigenspezifischen scFv-Fragmenten angereichert. Die Isolation hochaffiner scFv-Fragmente erfordert jedoch häufig riesige Phagenbibliotheken. Die Phagendisplaytechnik hat bisher die klassische Hybridomtechnologie noch nicht verdrängt.

1.6.5 Expression von scFv-Fragmenten

Die Expression von scFv-Fragmenten wurde in Myelomzellinien, Baculoviren (Potter et al., 1993) und Hefen (Davis et al., 1991) beschrieben. Bei der bakteriellen Expression von scFv-Proteinen hat sich die periplasmatische Expression in E. coli durchgesetzt (Pluckthun, 1991;Skerra und Pluckthun, 1988). Die erforderliche N-terminale Leader-Sequenz (ompA, phoA, pelB, bla) wird beim Transfer ins Periplasma proteolytisch entfernt. Die Expression funktioneller scFv-Proteine hängt sehr von dem jeweiligen Konstrukt ab. Die Faltungeffizienz und Expression kann durch einzelne Positionen im Framework der V-Regionen aber auch in den antigenspezifischen CDRs beeinflußt werden (Ito et al., 1993). Außerdem verfügen Bakterien über eine andere Verteilung und Nutzung der Kodons (codon usage). Eine Neukodierung humaner cDNAs oder die Verwendung von E. coli-Stämmen mit zusätzlichen Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Genen kann die Expression verbessern (Kleber Janke und Becker, 2000). Disulfidbrücken werden aufgrund reduzierender Bedingungen im Zytoplasma von E. coli unterdrückt und erst nach Sekretion ins Periplasma gebildet. Neuere Daten weisen auch auf eine Oxidation im Zytosol hin (Fernandez und de Lorenzo, 2001). Die Bedeutung von Disulfidisomerasen für die korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken wurde in zellfreien Expressionssystemen demonstriert, während Chaperone nur die Gesamtausbeute an scFv-Protein beeinflußen (Ryabova et al., 1997). Die Koexpression des Chaperonins GroES/L oder die Überexpression der Peptidylprolyl-cis,trans-Isomerase FkPa fördert die periplasmatische Expression und die Ausbeute korrekt gefalteter scFv-Fragmente (Bothmann und Pluckthun, 2000;Duenas et al., 1994;Ramm und Pluckthun, 2000). Fremdproteine mit hydrophoben Anteilen werden meistens in den Einschlußkörperchen (inclusion bodies) abgelagert. Sie müssen durch vollständige Denaturierung in Lösung gebracht werden und durch langsamen Wechsel von denaturierenden reduktiven Bedingungen zu nativen oxidativen Bedingungen zurückgefaltet werden („refolding“). Dadurch kann die Ausbeute an funktionellem scFv-Protein extrem sinken. Trotzdem gibt es auch Bestrebungen, scFv-Fragmente im großen Maßstab zytoplasmatisch in E. coli zu exprimieren (Martineau et al., 1998;Sanchez et al., 1999).

1.6.6 Bispezifische Antikörper für ein Immuntargeting

↓24

Bispezifische Antikörper enthalten die Bindungsstellen von zwei unterschiedlichen Antikörpern. Die klassische Methode ist die Herstellung von Hybridom-Hybridomen (Quadrome), die jedoch auch nichtfunktionelle und monospezifische Varianten produzieren. Moderne Antikörpertechnologien umgehen dieses Problem. Bei der Herstellung bispezifischer „Dia bodies“ kann beispielsweise die Zusammenlagerung von scFv-Fragmenten, insbesondere mit kurzen Linker-Sequenzen (< 13 AS), zu Dimeren ausgenutzt werden (Atwell et al., 1999;Hudson und Kortt, 1999;Wu et al., 1996). Diabodies, die gleichzeitig an zytotoxische Lymphozyten und Tumorzellen binden, können für ein Tumortargeting (Abbildung 7) eingesetzt werden (Kipriyanov et al., 1998). Der therapeutische Einsatz bispezifischer Antikörper unterliegt jedoch den Einschränkungen der Antikörpertherapien (siehe 1.1).

Abbildung 7 - Immunologisches Targeting von CTL
CTL können über bispezifische Antikörper, die CD3 und ein Tumorantigen (TAA) binden, Tumorzellen erkennen und lysieren. Die effektive Wirkung der CTL erfordert die Kostimulation von CD28. NK-Zellen wurden mit CD16 x TAA- oder CD2 x TAA-bispezifischen Diabodies erfolgreich gegen Tumorzellen abgerichtet. Eine weitere Möglichkeit für ein Tumortargeting zytotoxischer Lymphozyten besteht in ihrer genetischen Modifikation mit tumorspezifischen Rezeptoren (Abschnitt 1.7).

1.7 Tumorspezifische Rezeptoren für ein Immuntargeting

1.7.1 Voraussetzungen an ein rezeptorvermitteltes Targeting

Das Tumortargeting zytotoxischer Effektorzellen ist auch durch Genmodifikation mit tumorspezifischen Rezeptoren möglich (Abbildung 7). Im Gegensatz zu bispezifischen Antikörpern wird die Tumorerkennung direkt mit den Effektorzellen gekoppelt. Die Transfektion des hepatischen Asialoglykoproteinrezeptors (Lodish, 1991) in die NK-Zellinie YT führte zu einer besseren Bindung an Tumorzellen mit terminalen β1-Galaktosylresten auf ihrer Oberfläche. Die Zytotoxizität erhöhte sich jedoch nur gegenüber den Tumorzellen, die schon durch die untransfizierten YT-Zellen lysiert wurden (Schirrmann und Pecher, 2001). Deshalb erfordert ein effektives Targeting der YT-Zellen Rezeptorkonstrukte, die ihre Erkennungseigenschaften über eine Signaldomäne an die zytotoxischen Eigenschaften der Effektorzellen koppeln.

1.7.2 Rekombinante T-Zellrezeptoren für das Targeting von NK-Zellen

↓25

Rekombinante T-Zellrezeptoren aus einer tumorspezifischen Bindungsdomäne und einer Signalkette, wie der CD3 ζ-Kette oder der Fc-Rezeptor-γ-Kette, ermöglichen das Targeting von T-Zellen (Calogero et al., 2000;Eshhar et al., 1993). Mit chimären CD4-ζ-Genkonstrukten konnten neben T-Zellen auch NK-Zellen spezifisch gegen gp120+ Zellen abgerichtet werden (Roberts et al., 1998;Roberts et al., 1994;Tran et al., 1995).

Chimäre Immunglobulin-T-Zellrezeptoren (cIgTCRs, Abbildung 8), die auch als „T-Bodies“ bezeichnet werden, sind eine besondere Gruppe rekombinanter TCRs, die die Antigenbindungseigenschaften von Antikörpern mit den Signaleigenschaften des TCR-Komplexes verbinden (Eshhar, 1997;Eshhar et al., 1996). Sie sind für ein Tumor targeting von NK-Zellen prädestiniert, da sich die Erkennungseigenschaften von Antikörpern mit den Effektoreigenschaften der NK-Zellen hervorragend ergänzen. Antikörper erkennen ihre Antigene MHC-unabhängig. Ihre Antigenerkennung ist deshalb unempfindlich gegenüber der Herabregulation von MHC-Molekülen auf Tumoren und nicht auf einen bestimmten MHC-Typ der Patienten beschränkt. Die MHC-Unabhängigkeit ist ein wichtiges Merkmal der NK-Zellzytotoxizität, und NK-Zellen nutzen die Antikörpererkennung beim ADCC. Antikörper können außerdem hohe Bindungsaffinitäten gegenüber ihrem Antigen vermitteln und erfordern keine Korezeptoren.

Chimäre Rezeptorkonstrukte mit einer TCR-basierten Bindungsdomäne (Willemsen et al., 2000) sind dagegen für ein Tumortargeting von NK-Zellen weniger geeignet. Die Antigenerkennung der α/β-TCRs erfordert die Präsentation eines Peptidantigens im Kontext von MHC-Molekülen, deren Expression inhibitorisch auf NK-Zellen wirken kann (Malnati et al., 1995). Außerdem binden α/β-TCRs an die MHC-Peptid-Komplexe mit geringerer Affinität und benötigen die Hilfe der Korezeptoren CD4 oder CD8, die auf der NK-Zellinie YT nicht exprimiert sind (Yodoi et al., 1985). Ein weiterer Nachteil ist die geringe Zahl bekannter tumorspezifischer TCR-Sequenzen. Im Gegensatz dazu sind Antikörper gegen viele Tumorantigene etabliert, und es existieren effiziente Methoden für ihre Isolation. Es wurden sogar Fab’-Fragmente erzeugt, die das Peptid eines intrazellulären Antigens im MHC-Kontext erkennen (Willemsen et al., 2001).

↓26

Abbildung 8 - Strategien zur Herstellung von cIgTCR-Konstrukten„T-Bodies“ werden aus den Antigenbindungsdomänen von Antikörpern und den Signalkomponenten des TCR-Komplexes konstruiert. Der Austausch der V-Regionen im TCR durch Antikörper-V-Regionen oder scFv-Fragmente erfordert die Expression von zwei Rezeptoruntereinheiten und die Assemblierung mit dem Signalkomplex des TCRs (unten links), so daß diese Strategie auf T-Zellen beschränkt ist. Einzelsträngige Rezeptorgenkonstrukte aus einem scFv-Fragment und einer Signalkette (unten rechts) können dagegen auch in anderen Immunzellen funktionell exprimiert werden. Häufig werden extrazelluläre „Spacer“-Domänen zwischen scFv-Fragment und Signalkette eingefügt.

1.7.3 Targeting von Lymphozyten mit rekombinanten TCR-Konstrukten

T-Bodies“, die durch Austausch der V-Regionen in den α/β-TCR-Ketten mit den V-Regionen der Antikörperketten konstruiert werden (Goverman et al., 1990;Gross et al., 1989) und mit den Signalkomponenten der TCR-Komplexes assemblieren müssen, sind nur in T-Zellen einsetzbar. Einzelsträngige cIgTCRs aus scFv-Fragment und Signalkette können dagegen auch in NK-Zellen exprimiert werden und erfordern die Transfektion nur eines Genkonstrukts. Zwischen scFv-Fragment und Signalkette werden häufig extraplasmatische „Spacer“-Domänen eingefügt, die die Expression, aber auch die Bindungs- und Signaleigenschaften der cIgTCR-Konstrukte unterstützen. In Tabelle 6 sind Beispiele für das Targeting von T- und NK-Zellen durch cIgTCR-Gentransfer angegeben.

Tabelle 6 - Targeting von Effektorzellen mit chimären Rezeptorgenen

Effektorzelltyp

Spezifität

Anmerkungen

Referenz

Maus-CTL-Hybridom MD45 (BALB/c)

2,4,6-Trinitrophenol (TNP)

TCR-Vα/Vβ durch Antikörper-VL/VH ersetzt

(Gorochov et al., 1992;Gross et al., 1989)

MD45

TNP

single-chain-Design (scFv-γ)

(Eshhar et al., 1993)

humane CD8+ TILs

Folat-bindendes Protein (FBP), TNP

scFv-γ

(Hwu et al., 1993)

MD45

Neu/HER2

 

(Stancovski et al., 1993)

Maus-CTL-Linie

CI96 (C57/BL6)

ErbB2

scFv-hinge-ζ, Lokalisation der genmodifizierten CTL im Tumor (Nude-Maus)

(Moritz et al., 1994)

CI96, Jurkat

ErbB2

scFv-hinge-ζ, „Spacer“-Domäne notwendig

(Moritz et al., 1994)

humane CTL

gp120 (HIV)

chimärer CD4-ζ-Rezeptor

(Roberts et al., 1994)

NK3.3-Klon

gp120 (HIV)

CD4-ζ funktioniert auch in NK-Zellen

(Tran et al., 1995)

Maus-CD8+ TILs

TNP, FBP

in vivo-Modell

(Hwu et al., 1995)

T-Zellen/Zellinien (Maus, Ratte)

ErbB2, -3, -4

Optimierung des retroviralen Rezeptorgentransfers in T-Zellen

(Altenschmidt et al., 1996)

humane CTL

G250

scFv-γ, hohes Effektor-Recycling

(Weijtens et al., 1996)

Maus-CTL-

Hybridom 27J

TNP

scFv-Syk, Syk fördert CBL-, aber nicht PLCγ-Phosphorylierung

(Fitzer Attas et al., 1997)

MD45

TAG72 (B72.3)

scFv-γ, keine Expression von scFv-ζ

(Hombach et al., 1997)

Maus-T-Zellen

ErbB2 (FRP5)

scFv-ζ, syngenes Maustumormodell, totale Tumorregression, keine Antikörper gegen genmodifizierte T-Zellen

(Altenschmidt et al., 1997)

Maus-CTL-Hybri-

dome

Kollagen-II (C2)

scFv-γ/CD3ζ-Heterodimere reduzieren Ag-Antwort und endogene ζ-Expression

(Annenkov et al., 1998)

27J

TNP

Syk liefert besseres Signal als ZAP70, TM-Domänen von CD4 und CD8 wirken ähnlich

(Fitzer Attas et al., 1998)

MD45

CD30 (HRS3)

γ-Kette, lösliches CD30 inhibiert nicht

(Hombach et al., 1998)

MD45

TAG72 (CC49)

scFv-Fc-γ oder ζ

(Hombach et al., 1998)

häm. Stammzellen, CD34+ Vorläufer

gp120 (HIV)

CD4-ζ, Differenzierung zu transgenen NK-Zellen und Neutrophilen

(Roberts et al., 1998)

Effektorzelltyp

Spezifität

Anmerkungen

Referenz

humane CTL

G250

STITCH-Vektorsystem, verschiedene cIgTCRs

(Weijtens et al., 1998)

humane T-Zellen

G250 (Nierenkarzinom)

scFv-Fc-γ, hohe cIgTCR-Expression und Adhäsionsmoleküle unterstützen Lyse

(Weijtens et al., 1998)

humane T-Zellen

gp120 (HIV)

 

(Patel et al., 1999)

MD45

CEA

scFv-Fc-γ, lösliches CEA hemmt nicht

(Hombach et al., 1999)

MD45

HMW-MAA (Melanoma)

 

(Reinhold et al., 1999)

humane T-Zellen

CEA

scFv-ζ, Fab’-ζ, scFv-ε und Fab’-ε

(Nolan et al., 1999)

MD45

ErbB2

Fas-vermittelte Lyse

(Haynes et al., 1999)

humane T-Zellen

TAG72 (Mucin-Ag, Adenokarzinome)

humaner Antikörper CC49, ζ-Kette, kein „Bystander-Killing“, Xenograft-Mausmodell

(McGuinness et al., 1999)

Maus-T-Zellen

EGP40 (Kolonkarzinome)

 

(Daly et al., 2000)

cIgTCR-transgene Mäuse

 

IL-2-Stimulation notwendig

(Brocker, 2000)

humane T-Zellen

melanomspez. TCR, HLA-A1

chimäre single- und two-chain TCRs (Cβ1-Domäne stabilisiert V-Domänen)

(Willemsen et al., 2000)

humane T-Zellen

TAG72, CEA, HIV-Hüllproteinepitope

bispezifische cIgTCRs, breitere Spezifität gegen den Verlust einzelner Antigenepitope

(Patel et al., 2000)

humane T-Zellen

G250

hohe cIgTCR-Expression ermöglicht Lyse auch bei geringer Antigenexpression

(Weijtens et al., 2000)

humane T-Zellen

CEA

scFv-Fc-ζ

(Hombach et al., 2000)

humane T-Zellen

EGP-2

scFv-hinge-γ besser als scFv-γ

(Ren Heidenreich et al., 2000)

syngene humane T-Zellen

gp120 (HIV)

CD4-ζ, klinische Studie an Zwillingspaar

(Walker et al., 2000)

humane T-Zellen

GD3 (Gangliosid)

keine Hemmung durch 100 µg/mL GD3

(Yun et al., 2000)

humane T-Zellen

CEA

 

(Beecham et al., 2000)

humane T-Zellen

TNP

scFv-hinge-CD28-γ

(Eshhar et al., 2001)

CD4+ T-Zellen

CEA, CD30

 

(Hombach et al., 2001)

autologe PBL

CD30

Überwindung der Toleranz gegen autologes T-Zellymphom (in vitro)

(Hombach et al., 2001)

PBL

CEA, CD30

CD28-Kostimulation beeinflußt IL-2-Sekretion, aber nicht IFN-γ-Sekretion, Zellproliferation und Zytotoxizität

(Hombach et al., 2001)

MD45

CEA

ζ-Kette liefert stärkeres Signal als γ-Kette

(Haynes et al., 2001)

EBV-spez. T-Zellen

CD19

duale Spezifität gegen EBV und CD19

(Roessig et al., 2002)

Maus-T-Zellen

CEA

scFv-CD28-ζ, kostimulatorisches Signal durch cIgTCR, erhöhte IFN-γ-Produktion, syn- und xenogenes Maustumormodell

(Haynes et al., 2002;Haynes et al., 2002)

humane T-Zellen

EGP-2

scFv-hinge-γ und scFv-hinge-ζ vergleichbar, keine Kostimulation notwendig

(Ren-Heidenreich et al., 2002)

humane T-Zellen

CEA

scFv-hinge-CD28-ζ

(Arakawa et al., 2002)

NK92-Zellinie

ErbB2

Targeting einer humanen NK-Zellinie

(Uherek et al., 2002)


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
28.10.2005