3 Material und Methoden

3.1 Allgemeine Geräte

↓28

CO2-Inkubator, Labotect

Labor-Technik-Göttingen

 

Sterilbank, Variolab Mobilien W90

Waldner-Laboreinrichtungen GmbH

 

temperierbares Wasserbad

Memmert

 

Heraeus Megafuge 3.0R, inkl. Schwing-Rotor und Einsätze für Mikrotiterplatten

Heraeus, Kendro

 

Biofuge 15

Heraeus, Kendro

 

N2-Container, K-Series

Harsco Taylor-Wharton

 

Ultralow Freezer (-80°C)

Sanyo

 

37°C-Schrank (aus dem Bestand der Akademie der Wissenschaften der DDR)

 

FACSort®, FACScan®

Becton Dickinson

temperierbarer Schüttler

Brunswick

3.2 Zellkultur

3.2.1 Zellinien

293T

M. Seidensticker, Max-Delbrück-Centrum für molekulare Medizin (MDC), Berlin

 

Capan2

ATCC HTB-80, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA

 

HL60

ATCC CCL-240

 

HT29

ATCC HTB-38

 

KG1

U. Karsten, MDC Berlin (Thomsen-Friedenreich Antigen negative Sublinie)

 

LoVo

ATCC, CCL-229

 

LS174T

ATCC, CL-188

 

MC38, MC32A

J. Schlom (National Cancer Institute (NIH), Bethesda, MD, USA)

 

Panc89

J. Kopp, Robert-Rössle-Klinik der Charité, Berlin

 

Reh

G. Moldenhauer (Virchow-Klinikum der Humboldt-Universität zu Berlin)

 

SW1222

V. Brinkmann (MDC)

 

SW1417

ATCC CCL-238

 

SW403

ATCC CCL-230

 

SW480

ATCC CCL-228, W. Kemmner, MDC, Berlin

 

SW948

ATCC, CCL-237

 

YT

J. Yodoi, Institut für Virus-Forschung, Kyoto, Japan

 

RPMI-1640 (RPMI)

Biowhittaker

DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium)

Biowhittaker

fetales Kälberserum (FCS) (500 mL-Flasche 1 h bei 56°C hitzeinaktivieren.)

Gibco

Gentamicin (Stammlösung 50 mg/mL)

Biowhittaker

Trypsin-Versene™ (1000 U/mL Trypsin und 0,2% EDTA in PBS)

Biowhittaker, Gibco

sterile Gewebekulturflaschen und platten und serologische Pipetten

TPP, Nunc, Greiner

sterile Polypropylenröhrchen (50 mL, 15 mL)

TPP

Zellkulturmedien:

RPMI / 10% (v/v) hitzeinaktiviertes FCS / 50 µg/mL Gentamicin

DMEM / 10% (v/v) hitzeinaktiviertes FCS / 50 µg/mL Gentamicin

↓29

Die Zellen und Zellinien wurden bei 37°C (5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit) kultiviert. Die humane NK-Zellinie YT und die humanen Leukämiezellinien KG1, HL60 und Reh wurden in RPMI / 10% FCS / 50 µg/mL Gentamicin kultiviert. Die humanen Kolonkarzinomzellinien HT29, LoVo, LS174T SW403, SW480, SW948, SW1222 und SW1417, die humanen Pankreaskarzinomzellinien Capan2 und Panc89, die transformierte humane embryonale Nierenzellinie 293T und die Maus-Kolonkarzinomzellinien MC38 und MC32A wurden in DMEM / 10% FCS / 50 µg/mL Gentamicin kultiviert. Die adhärent wachsenden Tumorzellinien wurden mit Trypsin-Versene™ abgelöst. Die Zellen wurden i. A. mit 1000 – 1200 U/min (200 – 300xg) bei 4°C in einer Megafuge 3.0R mit Schwingrotor zentrifugiert.

Die MC32A-Zellen sind aus der Zellinie MC38 durch Transfektion mit der cDNA des humanen CEA erzeugt worden (Fox et al., 1990) und wurden durch „limited dilution“ kloniert. Die Zellen wurden hierfür in einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen (wells) und flachem Boden auf 3, 1 und 0,3 Zellen/well verdünnt. Nach etwa 14 Tagen wurden die Klone in 6-well-Gewebekulturschalen umgesetzt und nach einer weiteren Woche auf die Expression von CEA analysiert.

3.2.2 Einfrieren und Auftauen von Säugerzellen

Cryo-1C-Freezing-Container (nach 5-maliger Verwendung Isopropanol austauschen)

Nunc, NALGE

1 mL- oder 2 mL-Cryo-Röhrchen

Nunc

DMSO (Hybri-Max™, Zellkulturgrad)

Sigma

Auftaumedium:

DMEM / 40% (v/v) FCS

Einfriermedium:

DMEM / 40% (v/v) FCS / 20% (v/v) DMSO

↓30

Die Zellen wurden vor dem Einfrieren einmal gewaschen und in kaltem DMEM / 40% FCS mit einer Zellkonzentration von 2 – 20 x 106 Zellen/mL resuspendiert. Unter Schütteln wurde schrittweise ein Volumen kaltes DMSO-haltiges Einfriermedium zugegeben. Zwischen den Schritten wurde die Zellsuspension 1 min auf Eis inkubiert. Durch diese Prozedur wurde die DMSO-Konzentration langsam auf 5 – 10% (v/v) erhöht. Die Zellsuspension wurde in Einfrierröhrchen aliquotiert und in einen 4°C-kalten Cryo-1C-Freezing-Container gestellt, der für mindestens 4 h bei 80°C (ca. -1 K/min) deponiert wurde. Langfristig wurden die Zellen in flüssigem N2 (-192°C) gelagert.

Die Kryokonserven wurden in einem 37°C-Wasserbad aufgetaut, sofort in ein 15 mL-Polypropylenröhrchen überführt und auf Eis gestellt. Umgekehrt zur Einfrierprozedur wurde durch schrittweise Zugabe von Auftaumedium (Beginn mit 1/10 Volumen) die DMSO-Konzentration auf unter 1% (v/v) verdünnt. Die Zellen wurden anschließend 10 min bei 700 U/min (4°C) abzentrifugiert und in ihrem Kulturmedium resuspendiert. Die Selektionsbedingungen für transfizierte Zellen wurden erst 24 h nach dem Auftauen wieder aufgenommen.

3.2.3 Isolation von humanen peripheren Blutlymphozyten

gepooltes humanes AB-Serum (Hitzeinaktivierung 45 min bei 52°C)

Biowhittaker

Liquemin® N 25000 (Heparin)

Hoffmann-La Roche AG

LymphoprepTM (1,077 g/mL bei 20°C)

Nycomed Pharma AG

OptiprepTM (Stammlösung 1,320 g/mL bei 20°C)

Nycomed Pharma AG

IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s modified Eagle‘s medium)

Biowhittaker

Ultrasaline A (HEPES gepufferte Saline)

Biowhittaker

Medien:

IMDM / 10% (v/v) AB-Serum

RPMI / 10% (v/v) AB-Serum / 50 µg/mL Gentamicin

Optiprep TM 1,063 g/mL (20°C):

Optiprep mit Ultrasaline A und einem Dichte-Aerometer auf 1,063 g/mL (20°C) einstellen und sterilfiltrieren

↓31

50 mL Blut wurden von den Probanden mit einer heparinisierten (100 IE/mL Heparin) 50 mL-Spritze (Braun) abgenommen. Das heparinisierte Vollblut wurde mit einem Volumen RPMI (RT) gemischt und auf einen Lymphoprep™-Dichtegradienten (1,077 g/mL, 20°C) aufgetragen. Die Zentrifugation wurde 30 min bei 1600 U/min (20°C) und abgeschalteter Bremse durchgeführt. Die weiß-gelbliche Schicht aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) und Thrombozyten wurde abgenommen, mit einem Volumen RPMI gemischt und 12 min bei 1300 U/min (20°C) abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 7 mL RPMI resuspendiert und auf 7 mL Optiprep™ 1.063 g/mL (20°C) aufgeschichtet. Die Zentrifugation wurde 15 min mit 1300 U/min (20°C) durchgeführt. Der Überstand wurde vorsichtig abgesaugt und das Zellpellet 1x mit kaltem RPMI gewaschen (15 min, 1000 U/min, 4°C). Wenn der Anteil an Thrombozyten > 10% war, wurden die Zellen 2x mit RPMI gewaschen. 5 x 106 PBMC je mL wurden in IMDM / 10% AB-Serum resuspendiert und in eine Zellkulturflasche (75 cm2 bei 5 – 10 x 107 PBMC) überführt. Die Monozytenadhärenz wurde über Nacht in einem CO2-Inkubator bei 37°C durchgeführt. Die nichtadhärenten PBL wurden abgenommen und mit einer Konzentration von 106 Zellen/mL in RPMI / 10% AB-Serum / 50 µg/mL Gentamicin in Kultur genommen.

3.2.4 Kalziumphosphattransfektion der 293T-Zellen

dH 2 O (für Zellkultur)

2,5 M CaCl 2 (steril)

  

2x HeBSP-Buffer:

10 g/L HEPES (Pufferan®)

(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonat)

0,31 g/L Na2HPO4 x 2H2O

16 g/L NaCl

0,74 g/L KCl

2 g/L Glukose

Roth

Serva

Sigma

Serva

Sigma

 

pH 6,95-6,97 (Der pH-Wert ist ein kritischer Parameter!)

durch 0.2 µm Celluloseacetat-(CA)-Filter sterilfiltrieren

 

Die 293T-Zellen wurden entsprechend Tabelle 7 am Vortag eingesät, um am folgenden Tag eine Konfluenz von 50 – 75% zu erreichen. 4 h vor Transfektion wurde das Kulturmedium durch frisches vorgewärmtes Medium ersetzt. Alle verwendeten Lösungen und Puffer wurden auf RT temperiert. Die Plasmid-DNA wurde nach Tabelle 7 in 250 mM CaCl2 verdünnt. Der 2x HeBSP-Puffer wurde tropfenweise hinzugegeben und anschließend gut gemischt. Die Suspension wurde 15 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde das Präzipitat gleichmäßig auf die Zellen verteilt und unter leichtem Schwenken der Schalen mit dem Kulturmedium vermischt. Die Zellen wurden mit dem Präzipitat 12 – 24 h inkubiert (5% CO2, 37°C). Das Medium wurde im Anschluß komplett ausgetauscht.

↓32

Tabelle 7 - Kalziumphosphattransfektionsansätze

Gewebekulturschale

30 mm

60 mm

150 mm

293T-Zellen (am Vortag eingesät)

2 x 105

8 x 105

2 – 4 x 106

Kulturvolumen (DMEM/ 10% FCS/ Gentamicin)

3 mL

6 mL

50 mL

DNA

1 – 2 µg

4 – 10 µg

25 – 50 µg

2,5 M CaCl 2

12,5 µL

25 µL

125 µL

dH 2 O

auf 125 µL

auf 250 µL

auf 1,25 mL

+ 2x HeBSP

125 µL

250 µL

1,25 mL

3.3 Antikörperfärbungen

Tabelle 8 – Übersicht über die verwendeten Antikörper

Antikörper

Allotyp, Stamm, Klon

Isotyp

 

CD3-FITC, -PE

Maus, BALB/c, UCHT-1

IgG1

Immunotech/ Coulter

CD3  ζ -Kette

Maus, 1D4

IgG1

Pharmingen/ Becton Dickinson

CD16-FITC

Maus, BALB/c, 3G8

IgG1

Immunotech/ Coulter

CD33-FITC

Maus, WM54

IgG1

Dako

CD56-PE

Maus, B159

IgG1κ

Pharmingen

CD66e

Maus, CEJ065

IgG1

Immunotech/ Coulter

CD80-FITC

Maus, BALB/c, MAB104

IgG1

Immunotech/ Coulter

CD86-PE

Maus, BALB/c, 2331 (FUN-1)

IgG1

Immunotech/ Coulter

c-myc-Tag

Maus, 9E10

IgG1

Sigma

HLA-ABC-FITC

Maus, BALB/c, B9.12.1

IgG2aκ

Immunotech/ Coulter

HLA-DR-FITC,-PE

Maus, BALB/c, B8.12.2

IgG2bκ

Immunotech/ Coulter

Isotypenkontrollen

Allotyp, Stamm

Isotyp

 

IgG1-FITC,-PE

Maus, BALB/c

IgG1κ

Immunotech/ Coulter

IgG1 κ

Maus, BALB/c

IgG1κ

Immunotech/ Coulter

IgG2a κ-PE

Maus

IgG2aκ-PE

Immunotech/ Coulter

IgG2b -PE

Maus

IgG2bκ-PE

Immunotech/ Coulter

Sekundärantikörper

 

Allotyp

 

Anti-Maus-IgG(H+L)-F(ab’) 2 -Fragment

(FITC- oder AP-konjugiert)

Ziege oder

Ratte

Dianova/ Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc.

Anti-human-Fc γ -F(ab’) 2 -Fragment

(FITC- oder HRPo-konjugiert)

Ziege (adsorbiert gegen Maus, Rind und Pferd)

Dianova/ Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc.

3.3.1 Durchflußzytometrische Analyse von Oberflächenmarkern

0,6 mL-Röhrchen, 96-well-Mikrotiterplatte (Spitzboden)

Greiner

6 ml-Röhrchen (Andere Röhrchen passen u. U. nicht an das FACS-Gerät!)

Falcon (Becton Dickinson)

Propidiumiodid (PI), NaN3, BSA (bovine serum albumin, Fraktion V)

Sigma

FACS-Flow™, -Rinse™ und Safe™

Becton Dickinson

PBS (Phosphate buffered Saline)

GIBCO

Kaninchenserum (Hitzeinaktivierung, 5x Gefrier-Auftau-Zyklen zur Bildung von Immunkomplexen, 1:10 in FACS-Puffer verdünnen)

Biowhittaker

FACS-Puffer:

PBS

0,5% (w/v) BSA

0,1% NaN3

2x PI-Puffer:

FACS-Puffer mit 2 µg/mL PI

↓33

5 x 104 – 5 x 105 Zellen/Ansatz wurden in 96-well-Spitzboden-Mikrotiterplatten übertragen und mit FACS-Puffer gewaschen (5 min, 1200 U/min, 4°C). Die Zellen wurden mit 10 µL 1:10 Kaninchenserum geblockt (15 min, 4°C). Anschließend wurde 10 µL Antikörper je Ansatz zugegeben und 15 min bei 4°C inkubiert. Die Ansätze wurden mit FACS-Puffer gewaschen. Bei ungelabelten Primärantikörpern wurde eine zweite Färbung mit einem Fluorochrom-konjugierten Zweitantikörper angeschlossen. Die gefärbten Zellen wurden in 200 µL FACS-Puffer resuspendiert und in 0,6 mL-FACS-Röhrchen überführt. Ein Volumen 2x PI-Puffer wurde zugegeben. Die Messung wurde an einem FACSort® oder FACScan® mit der Software Cellquest® 3.0 (Becton Dickinson) durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit Cellquest® 3.0 oder WinMDI2.8 (http://facs.scripps.edu) unter Ausschluß des Zellschrotts (SSC-FSC-Plot) und der PI-gefärbten toten Zellen (FL-3).

3.3.2 Intrazelluläre FACS-Analyse

Formalin (ca. 37% Formaldehyd)

Sigma

Saponin

Sigma

4% (v/v) Formaldehyd / PBS:

10,8 mL Formalin auf 100 mL mit PBS auffüllen

FACS-Puffer:

siehe 3.2.4

Saponinpuffer:

0,5% (w/v) Saponin in FACS-Puffer

Die Zellen wurden 2x mit PBS gewaschen und 2 x 106 Zellen/mL in PBS resuspendiert. Nach Zugabe von einem Volumen 4% Formaldehyd / PBS wurden die Zellen 20 min bei RT fixiert. Anschließend wurden die Zellen 2x mit PBS gewaschen, um das Formaldehyd vollständig zu entfernen. Alle Zentrifugationen nach der Fixierung wurden mit 1400 U/min durchgeführt, um ein festeres Zellpellet zu erhalten. Saponin ist ein Detergenz, das in der Zellmembran reversibel ca. 8 nm große Poren bildet, die bis zu 200 kDa große Moleküle, z. B. Antikörper (150 kDa), passieren können. 2 x 105 Zellen je Ansatz wurden in Saponinpuffer resuspendiert und 1x gewaschen. Die Antikörperfärbungen wurden in 30 – 50 µL Volumen Saponinpuffer bei RT durchgeführt. Erstantikörper wurden 60 min und Zweitantikörper 30 min bei RT inkubiert. Nach jeder Inkubation wurden die Zellen mit Saponinpuffer gewaschen und in 1 mL Saponinpuffer 30 min bei RT inkubiert, damit ungebundener Antikörper aus den Zellen herausdiffundiert. Am Ende wurden die Zellen in FACS-Puffer resuspendiert und in FACS-Röhrchen übertragen (ohne 2x PI-Puffer, da Zellen fixiert sind). Da sich die Poren nach Entfernen des Saponins in proteinhaltigen Medium wieder schließen, können im Anschluß noch Färbungen von Oberflächenmarkern durchgeführt werden (Assenmacher, 1992). Die Eignung der Antikörper für intrazelluläre Färbungen und die einzusetzenden Konzentrationen wurden ausgetestet.

3.4 Allgemeine molekularbiologische Methoden

3.4.1 Bakterienkultur

↓34

E. coli-Stämme

  

XL1-Blue (recA1 endA1 gyr96 (Nal r ) thi-1 hsdR17 (r K - m K + ) glnV44 (=supE44) relA1 lac [F‘ lacI q (lacZ)M15 proA + B + Tn10 (Tet r )]), K12-Stamm

Stratagene

 

Top-10F‘ (vergleichbar mit XL1-Blue, aus dem T/A-Cloning Kit)

Invitrogen

 

DH5 -F‘ (F‘ | recA1 endA1 gyr96 (Nal r ) thi-1 hsdR17 (r K - m K + ) glnV44 (=supE44) relA1 (lacIZYA-argF)U169 deoR ( 80 dlac (lacZ)M15)), K12-Stamm

GIBCO

 

Erlenmeyerkolben mit Einbuchtungen

Faust

 

SelectTM-Pepton, -Hefeextrakt und -Agar

GIBCO

 

Ampicillin

Boehringer Mannheim

 

NaCl, NaOH

Serva, Roth

 

45% Glukose in PBS (sterilfiltriert)

Sigma

 

Petrischalen

Greiner

 

LB-Medium: (Luria-Bertani)

10 g/L SelectTM-Pepton

5 g/L SelectTM-Hefeextrakt

5 g/L NaCl

1 mL 1N NaOH

2xTY-Medium:

16 g/L SelectTM-Pepton

10 g/L SelectTM-Hefe-extrakt

5 g/L NaCl

SOB-Medium:

2xTY-Medium

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

SOC-Medium:

SOB-Medium

20 mM Glukose (sterilfiltriert)

LB-Platten:

LB-Medium

15 g/L Select™-Agar

  

In dieser Arbeit wurden die E. coli-Stämme Top-10F‘, XL1-Blue und DH5α-F‘ verwendet. Diese recA - Stämme sind für die Präparation von Plasmiden geeignet. Der Stamm XL1-Blue wurde aufgrund seiner lacI q -Mutation auch zur Konstruktion und Expression der scFv-Fragmente in eingesetzt. Die Bakterien wurden in LB- oder 2xTY-Medium angeschüttelt (200 – 240 U/min, 37°C) und auf LB-Platten ausgestrichen. Das Antibiotikum Ampicillin wurde in einer Konzentration von 100 µg/mL zur Selektion eingesetzt. Bakterienstocks wurden aus einer logarithmisch wachsenden Bakteriensuspension durch Zugabe von einem Volumen 50%iger Glycerollösung in LB oder 2xTY hergestellt und bei 80°C gelagert.

Chemisch kompetente E. coli-Zellen wurden mit der RbCl-Methode (modifiziert nachHanahan, 1985) durchgeführt. Eine genaue Beschreibung ist im „Protocols and Applications Guide“ (Promega, 3rd Edition, P1610) zu finden. 1 – 50 ng Plasmid-DNA bzw. 5 – 10 µL eines Ligationsansatzes wurden in einem 1,5 mL-Reaktionsgefäß auf Eis vorgelegt. 100 µL kompetente Zellen wurden im Eisbad aufgetaut und zur DNA pipettiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde der Ansatz einem Hitzeschock von 45 – 60 s in einem 42°C-warmen Wasserbad unterzogen und danach für 5 min auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 1 mL SOC-Medium (ohne Antibiotika) wurden die Zellen 45 – 60 min bei 37°C mit 225 U/min geschüttelt und anschließend auf LB-Platten mit Antibiotikum (100 µg/mL Ampicillin) ausgestrichen. Die LB-Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert.

3.4.2 Allgemeine Methoden bei der DNA-Klonierung

↓35

Agarose (Elektrophoresegrad)

Serva, Biozym

Borsäure, Tris-Base (Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Trizma®), Tris-HCl

Sigma

Chloroform

Roth

Eisessigsäure (glacial acetic acid)

Sigma, Roth

Ethidiumbromid (10mg/mL)

Gibco

Harnstoff (urea)

GIBCO

Isopropanol, Ethanol

Roth

Maxi-DNA-Prep (QIA-Tip 500)

Qiagen

Maxi-DNA-Prep (Maxi-Pure-Prep)

GIBCO

Minigel-, Maxigelapparatur und Powerpack P25

Biometra

QIAexII Gelextraction Kit, QIAspin-DNA-Prep-Kit

Qiagen

Xylencyanol, Bromphenolblau (gesättigte Stammlösungen in Ethanol herstellen)

Serva

Natriumacetat, Natriumdodecylsulfat (SDS)

Sigma

49,5% / 49,5% / 1% (v/v/v) Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol

Roth

Ethanol

Roth

50x TAE:

242 g/L Tris-Base

57,1 g/L Eisessigsäure

37,1 g/L Na2EDTA x 2 H2O

pH-Wert nicht nachstellen!!!

10x DNA-Ladepuffer:

10 mM TrisHCl

100 mM EDTA

30% Glycerol (Sigma)

1% SDS

Farbstoffe*

* Die Farbstoffe Xylencyanol und Bromphenolblau wurden in einer möglichst geringen Konzentration eingesetzt.

Allgemeine Methoden im Umgang mit DNA sind in „Gentechnische Methoden“ (Hrsg. Gassen/ Schrimpf, 2. Auflage, Gustav-Fischer Verlag) ausführlich beschrieben. Plasmid-Mini-Präparationen (1 – 5 µg) wurden mit dem QIAspin-DNA-Prep-Kit nach Herstellerangaben durchgeführt. Plasmidpräparationen im großen Maßstab für die Transfektion von Zellinien erfolgten mit Anionenaustauschersäulen (QIA-Tip 500, Maxi-Pure-Prep) nach Herstellerangaben. Zur Analyse von DNA-Präparationen, Restriktionen und PCRs wurden 1 – 2,5%ige Agarosegele mit 1x TAE-Puffer (gleichzeitig Laufpuffer) hergestellt. DNA-Fragmente wurden aus den Agarosegelen mit dem QIAexII Gelextraction Kit nach Herstellerangaben extrahiert.

3.4.3 Enzymreaktionen bei der DNA-Klonierung

Restriktionsenzyme

New England Biolabs, Fermentas, Amersham

Y+/Tango-Universalpuffer

Fermentas

Uni-Buffer

Stratagene

10xBSA (0,1%)

New England Biolabs, Amersham

NEB-Puffer

New England Biolabs

SuRECut-Puffer

Boehringer Mannheim

Shrimps Alkaline Phosphatase (SAP)

Amersham

T4-Ligase und Reaktionspuffer (mit ATP)

Amersham

S1-Nuclease (aus Aspergillus oryzae)

Boehringer Mannheim (Roche)

↓36

Restriktion

Die DNA wurde mit 10 U Restriktionsenzym je µg DNA bei 37°C (SmaI bei 25°C) für mindestens 1 h inkubiert. Je nach verwendetem Puffer und der daraus resultierenden Aktivität der Enzyme wurden die Enzymmenge und die Inkubationszeit erhöht. Das Reaktionsvolumen wurde mindestens auf das 10-fache der eingesetzten Enzymmenge (insbesondere bei Enzymen mit Staraktivität) angesetzt, um die Glycerolkonzentration im Reaktionsansatz gering zu halten. Bei Ansätzen mit mehreren Enzymen wurde der geeignete Puffer nach Herstellertabellen ausgewählt oder ein Universalpuffer eingesetzt (Y/Tango+, Uni-Buffer). Einige Enzyme wurden 10 min bei 75°C hitzeinaktiviert oder mit Phenol / Chloroform extrahiert.

Dephosphorylierung von DNA

↓37

Zur Dephosphorylierung von 1 µg Vektor-DNA wurde 1 U SAP eingesetzt und die Reaktion 1 h bei 37°C durchgeführt. Das Enzym wurde anschließend 20 min bei 60°C inaktiviert. Bei Ligationen mit drei Insertionsfragmenten wurde auch das mittlere Fragment dephosphoryliert.

Ligation von DNA

10 – 50 ng dephosphorylierte Vektor-DNA wurden mit der 10-fachen molaren Menge an Insertionsfragmenten ligiert, ohne eine Gesamt-DNA-Menge von 100 ng in einem 20 µL-Ansatz zu übersteigen. Die Ligation wurde nach Zugabe von 1 U T4-Ligase gestartet und über Nacht bei 16°C durchgeführt.

↓38

Entfernung überstehender 5’-Enden mit S1-Nuclease

1x S1-Nuclease-Lagerungspuffer:

20 mM TrisHCl

50 mM NaCl

1 mM ZnCl2

50% (v/v) Glycerol

pH 7,5

10x S1-Nuclease-Reaktionspuffer:

500 mM Natriumacetat

10 mM Zinkacetat

2,5 M NaCl

500 µg/mL BSA

pH 4,6 mit Essigsäure einstellen

Die überstehenden 5‘-Enden von DNA-Fragmenten wurden mit der S1-Nuclease entfernt. Dieses Enzym schneidet einzelsträngige DNA, führt aber auch zum Fragmentieren der DNA, insbesondere bei niedrigen Salzkonzentrationen (< 50 mM NaCl). Deshalb wurden Ansätze mit 1, 10 und 100 U S1-Nuclease je µg DNA 30 min bei 37°C inkubiert. Im Anschluß wurden die Proben sofort mit 1/100 Volumen 0,5 M EDTA (pH 8.0) abgestoppt und eine Phenol/Chloroform-Extraktion durchgeführt.

3.4.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

↓39

Thermocycler TRIO-ThermoblockTM

Biometra

Pfu-Polymerase (tElongation = 2 min/kB)

Stratagene, Promega

CombiPol™-Mix (tElongation = 30 s/kB)

InViTek

Taq-Polymerase (tElongation = 30 s/kB)

Promega

dNTPs (2 mM von jedem dNTP)

Fermentas

Kundenspezifische Primer (50 µM Stammlösung)

Biotez

Die Standard-PCR-Ansätze wurden nach Tabelle 9 angesetzt. Die PCR-Reaktion wurde nach dem beschriebenen Ablauf Tabelle 10 durchgeführt. Die Polymerase wurde nach Denaturierung der DNA in die Ansätze gegeben („Hotstart“). Abweichungen von diesem Standardprotokoll wurden angegeben.

Tabelle 9 - PCR-Mix

Template-DNA:

0,1 – 100 ng (meistens 1 – 10 ng)

10x Reaktionspuffer:

1/10 verdünnen (1x)

Mg2+

1,5 mM (oder im Puffer enthalten)

dNTPs

0,1 µM (je dATP, dTTP, dGTP und dCTP)

Primer 1 und 2

je 0,1 µM

dH2O

Endvolumen 50 oder 100 µL

Zusätze

abhängig vom Enzym (z. B. Enhancer)

Enzym

1-2,5 U (Hotstart)

↓40

Tabelle 10 - Ablauf der Standard-PCR

3.4.5 Isolation der Gesamt-cDNA humaner Blutlymphozyten

Isolation der Total-RNA

Phytohämagglutinin-L (PHA)

Sigma

Diethylpyrocarbonat (DEPC) (zur Herstellung von RNase freien Lösungen)

Sigma

TRIzol®-Reagenz

GIBCO

TE-Puffer (pH 7,5):

10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (RNA ist empfindlicher als DNA gegenüber alkalischem pH.)

1 mM EDTA

↓41

PBL (Isolation siehe 3.2.3) wurden eine Woche mit 1 µg/mL PHA stimuliert. 107 PBL wurden mit 1 mL TRIzol®-Reagenz versetzt. Die Präparation der Total-RNA erfolgte nach Herstellerangaben. Die RNA wurde in TE-Puffer (RNAsefrei, pH 7,5) mit 0,5% SDS gelöst und bei 70°C gelagert.

Isolation der Poly-(A ) + -mRNA

Oligo(dT)-Zellulose

Sigma

 

LiCl, Glaswolle

Serva

 

1 mL-Einwegspritze, Dreiwegehahn

Braun

 

2x Ladepuffer:

1 M LiCl

40 mM TrisHCl, pH 7,5

2 mM EDTA

0,2% SDS

DEPC-dH2O

Waschpuffer:

0,1 mM LiCl

20 mM TrisHCl, pH 7,5

1 mM EDTA

0,1% SDS

DEPC-dH2O

Elutionspuffer:

TE, pH 7,5 (kein SDS!!! sonst Enzymreaktionen für die cDNA-Synthese gehemmt)

↓42

100 mg Oligo(dT)-Zellulose wurden in 1 mL 1x Ladepuffer über Nacht inkubiert. Eine 1 mL-Spritze, die mit sialinisierter Glaswolle gestopft wurde, wurde mit der Oligo(dT)-Zellulosesuspension befüllt und mit 10 Säulenvolumina 1x Ladepuffer gewaschen. Zum Verschließen der Säule wurde ein Dreiwegehahn verwendet. Die RNA wurde mit einem Volumen 70°C-heißen 2x Ladepuffer versetzt, 10 min bei 70°C denaturiert und auf die Säule gegeben. Das Eluat wurde aufgefangen, denaturiert und erneut aufgetragen. Die Säule wurde mit 3 mL Waschpuffer gewaschen. Die Poly(A+)-mRNA wurde mit 2 mL 50°C temperierten TE-Puffer (pH 7,5) eluiert und anschließend durch Ethanolpräzipitation gefällt.

Herstellung der cDNA aus der Poly(A + )-mRNA

Universal RiboClone ® cDNA-Synthese System, inkl. S-400-Säulen

Promega

TEN-Puffer:

TE-Puffer (pH 7,5) mit 100 mM NaCl

↓43

Die mRNA der humanen PBL wurde mit dem Universal RiboClone ® cDNA-Synthese System nach Herstellerangaben in cDNA umgeschrieben (Gubler und Hoffman, 1983;Okayama und Berg, 1982). Der (-)-Strang wurde an der mRNA mit der AMV-Reverse-Transkriptase (avian myeloblastoma virus) synthetisiert. Der (+)-Strang wurde durch die DNA-Polymerase I in Gegenwart von RNA-Polymerase H erzeugt und mit der T4-Polymerase vollendet. Die Gesamt-cDNA wurde über Sephacryl S-400-Säulen größenfraktioniert (> 400 bp), um einen hohen Anteil vollständiger cDNAs zu erhalten.

3.4.6 DNA-Sequenzierung

pOPE51-forward-Primer:

5’-GTGTTGACTTGTGAGCGGAT-3’

Biotez

pOPE51-reverse-Primer:

5’-TCTCCGGACACGATTACTAG-3’

Biotez

Pel B-Primer (Sequenzierungsprimer für das Plasmid pOPE51)

J. Schenk

c-myc-Primer (Sequenzierungsprimer für das Plasmid pOPE51)

J. Schenk

T3-Primer (Promoter)

InViTek

T7-Primer (Promoter)

InViTek

M13-reverse-Primer

InViTek

Die DNA-Sequenzierung wurde von der Firma InViTek durchgeführt. Für die Sequenzierung der scFv-Fragmente im Plasmid pOPE51 wurden die Oligonukleotide PelB, c-Myc, pOPE51-forward und pOPE51-reverse verwendet. Für die Sequenzierung der DNA-Fragmente in den Plasmiden pBSSK, pCMX und pCDNA3 wurden die Standardprimer T3, T7 und M13-reverse eingesetzt.

3.4.7 Immunodotblot

↓44

AEC (2-Amino-9-ethylcarbazol)

Sigma

BCIP (5-Brom-4-chlor-indolylphophat, p-Toluidinsalz)

Calbiochem

NBT (Nitrotetrazoliumblauchlorid)

Calbiochem

Caseinat, NaOH, NaCl, KCl, Na2HPO4, NaH2PO4

Serva

30%ige H2O2-Lösung, Dimethylformamid (DMF)

Sigma

Tween®-20 (Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat)

Sigma

Nitrozellulosemembranen

Boehringer Mannheim

Blockierungspuffer:

2,5% hydrolysiertes Caseinat in PBS

50 g Caseinat in 500 mL 0,3 N NaOH über Nacht bei RT hydrolysieren

5,96 g/L NaCl

0,27 g/L KCl

0,24 g/L NaH2PO4

1,44 g/L Na2HPO4

mit HCl auf pH 7,5 einstellen und auf 1 L auffüllen

Waschpuffer:

PBS mit 0,05% Tween-20

AEC-Stammlösung:

100 mg/mL AEC in N,N’-Dimethylformamid (DMF)

BCIP-Stammlösung:

100 mg BCIP in 1,9 mL DMF

NBT-Stammlösung:

100 mg NBT in 1,9 mL 70% (v/v) DMF lösen

Peroxidase-Nachweisreaktion

Alkalische Phosphatase-(AP)-Nachweisreaktion

AEC-Färbelösung:

in der angegebenen Reihenfolge und immer frisch ansetzen

100 µL AEC-Stammlösung in 5 mL 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5.5)

2 µL 30%ige H2O2-Lösung

AP-Substratpuffer:

100 mM TrisHCl (pH 9.5)

5 mM MgCl2

Stop-Puffer

5 mM EDTA (pH 8.0)

20 mM TrisHCl (pH 8.0)

BCIP/NBT-Färbelösung

5 mL AP-Substratpuffer

33 µL NBT-Stammlösung

17 µL BCIP-Stammlösung

1 – 10 µL der Proteinlösung wurden langsam auf definierte Stellen der Nitrozellulosemembran pipettiert und eingetrocknet. Anschließend wurde die Membran 1 – 4 h im Blockierungspuffer inkubiert. Die Antikörper wurden in Blockierungspuffer verdünnt (mindestens 1:1000) und 1 – 4 h mit der Membran inkubiert (RT). Nach der Inkubation wurde die Membran 3x 10 min in Waschpuffer gewaschen. Färbungen mit einem sekundären Antikörper wurden analog durchgeführt. Danach wurde die Membran in der Färbelösung inkubiert. Die Färbung wurde unter fließendem Wasser abgestoppt, wenn die Färbung intensiv genug war oder sich der Hintergrund zu verfärben begann. Die Dotblots wurden nach Einscannen mit dem Programm TINA (raytest Isotopenmeßgeräte GmbH) ausgewertet.

3.4.8 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)

p-Nitrophenolphosphat (pNPP, Sigma-Fast®, Substrat für die AP (alkaline phosphatase))

Sigma

o-Phenyldiamin-2 HCl (OPD, Sigma-Fast ® Substrat für die HRPo ( horse radish peroxidase ) )

Sigma

MgCl2, Diethanolamin

Sigma

NaHCO3 (Natriumbicarbonat)

Serva

HCl, H2SO4

Roth

96-well-Mikrotiterplatten mit Beschichtung für hohe Proteinbindung (NunclonTM)

Nunc

96-well-Platten mit 12 Streifen zu je 8 Ansätzen und einer Beschichtung für hohe Proteinbindung (Microlon 600TM)

Greiner

Coating -Puffer:

50 mM Natriumbicarbonatpuffer (pH 9,6)

Blockierungspuffer:

siehe Immunodotblot (3.4.7)

Waschpuffer:

PBS mit 0,05% Tween-20

Peroxidase-Substratpuffer:

Citrat-Phosphatpuffer pH 5,0

10 g/L Zitronensäure x H2O (Roth)

14 g/L wasserfreies Na2HPO4 (Serva)

40 µL 30%iges H2O2/100 mL (kurz vor Gebrauch)

Alkalische Phosphatase-Substratpuffer:

1 M Diethanolamin

mM MgCl 2

mit HCl auf pH 9,8 einstellen

Peroxidase-Stoplösung:

3 N HCl oder 3 N H2SO4

AP-Stoplösung:

3 N NaOH

↓45

1 – 4 µg/mL Antigen wurden mit 50 mM Bicarbonatpuffer (pH 9,6) verdünnt und 50 µL/well auf eine ELISA-Platte übertragen. Das „Coating“ wurde über Nacht (RT) durchgeführt. Danach wurde die Platte mehrfach mit PBS gewaschen und unspezifische Bindungsstellen mit 250 µL/well Blockierungspuffer mindestens 1 h (RT) blockiert. Der Blockierungspuffer wurde verworfen und 100 µL/well der scFv-Fragmente, scFv-hFc-Proteine oder Antikörper (Verdünnungen ggf. mit Blockierungspuffer durchführen) übertragen. Alle Ansätze wurden mindestens als Duplikate ausgeführt. Nach 1 h Inkubation (RT) wurde die Platte 4 – 5x mit Waschpuffer gespült. Danach wurde 100 µL/well eines Enzym-gekoppelten Nachweisantikörpers zugegeben (meistens 1:1000 in Blockierungspuffer). Die Inkubation wurde nach 1 h (RT) durch 4 – 5x Waschen beendet und 100 µL/well Färbelösung zugegeben. Die Reaktionen der Peroxidase (HRPo) wurden mit 1 – 4 mg/mL OPD in Citrat-Phosphatpuffer pH 5,0 durchgeführt und mit 50 µL/well 3 N HCl oder 3 N H2SO4 abgestoppt. Die Messung wurde nach Abstoppen bei 492 nm in einem ELISA-Reader durchgeführt. Reaktionen der Alkalischen Phosphatase (AP) wurden mit 1 – 4 mg/mL pNPP in Diethanolaminpuffer durchgeführt, mit 50 µL/well 3 N NaOH-Lösung gestoppt und bei 405 nm gemessen. Als Referenzfilter wurden 600 nm-, 620 nm- oder 690 nm-Filter verwendet.

3.4.9 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

vertikale PAGE-Apparatur für Minigele

GIBCO

Stromversorgungsgerät

Biometra

Natriumdodecylsulfat (SDS) (10% (w/v) SDS-Stammlösung)

Sigma

Bromphenolblau (gesättigt in 0,1% Ethanol), β-Mercaptoethanol (β-ME)

Sigma

n-Butanol

Roth

Dithiothreitol (DTT)

Calbiochem

Ammoniumpersulfat (APS) (10% (w/v) Stammlösung, kleine Aliquots bei –20°C)

Sigma

N,N,N‘,N’-Tetramethylenethylendiamin (TEMED)

Sigma, Serva

Saccharose (sucrose)

Serva

Protogel® - 30%ige Polyacrylamidlösung (PAA-Lösung, 30% (w/v) Acrylamid (AA) + 0,8% (w/v) N,N‘-Methylenbisacrylamid (BIS) = 37,5 : 1)

National Diagnostics

(Biozym)

Molekulargewichtsstandards (farbstoffmarkiert, Benchmark™)

Gibco

4x Sammelgel-puffer:

0,5 M Tris-HCl, pH 6.8

0,1% SDS

entgasen

4x Trenngel-puffer:

1,5 M Tris-HCl, pH 8.8

0,1% SDS

entgasen

10x Elektroden- und Lauf-puffer:

144 g/L Glycin

30 g/L Tris-Base

3 – 10 g/L SDS

auf 1 L mit dH2O auffüllen

ergibt pH 8.9 (nicht nachstellen)

3x Proben-puffer:

3,5 mL 4x Sammelgelpuffer

1,5 mL Glycerol

2,5 mL 20%iges (w/v) SDS

0,5 mL gesättigte Bromphenolblaustammlösung

0,5 ml β-ME oder 6,2% (w/v) DTT (für reduzierende Bedingungen!!!)

auf 10 mL mit dH2O

Die SDS-PAGE wurde nach Laemmli (Laemmli, 1970) durchgeführt. Eine Beschreibung ist in „Gentechnische Methoden“ (Hrsg. Gassen/Schrimpf, 2. Auflage, Gustav-Fischer Verlag) zu finden.

3.4.10 Westernblot

↓46

Nitrozellulosemembran, PVDF-Membran

Sartorius (Faust)

Blotting-Filter (0,2 – 0,4 mm)

Faust

Semidry-Blotting-Apparatur mit Graphitelektroden

Roth

Universal -Semidry -Transfer-Puffer:

25 mM (3,03 g/L) Tris-Base

192 mM (14,4 g/L) Glycin

10 – 20% (v/v) Methanol

pH 8.3 (für Graphitelektroden auf jeden Fall < pH 8.5, pH-Wert nicht nachstellen !!!)

6 – 8 Filterkartons wurden in Größe des Gels ausgeschnitten. Filterpapiere und Membran wurden im Transferpuffer equilibriert. PVDF-Membranen wurden vorher kurz mit Methanol benetzt. Das PAA-Gel wurde 3x 3 min im Transferpuffer equilibriert. Die Elektroden der Blotting-Apparatur wurden mit dH2O gewaschen und 3 – 4 eingeweichte Filterpapiere luftblasenfrei auf die untere Elektrode (Anode, +) gelegt. Darauf wurden in der angegebenen Reihenfolge die Membran, das Gel und 3 – 4 weitere Filterpapiere gelegt. Überschüssiger Transferpuffer wurde abgesaugt und die obere Elektrode (Katode, -) gleichmäßig auf das Blotting-Sandwich gelegt und festgeschraubt. Der Transfer wurde mit 1,5 – 3 mA/cm2 bei Minigelen (ca. 100 cm2) etwa 2 h durchgeführt. Die Membranen wurden nach dem Transfer vollständig getrocknet. PVDF-Membranen wurden vor der weiteren Verwendung erneut mit Methanol und Transferpuffer rehydratisiert. Die Antikörperfärbung und Nachweisreaktion wurden wie beim Immunodotblot (3.4.7) geführt. Eine ausführliche Beschreibung von Proteinoverlaytechniken ist in „Gentechnische Methoden“ (Hrsg. Gassen/Schrimpf, 2. Auflage, Gustav-Fischer Verlag) zu finden.

3.5 Konstruktion der single-chain-Fv-Fragmente

3.5.1 Konstruktion der CEA-spezifischen scFv-Fragmente scBW431/26 und scBW431/26-Yol

Plasmide

 

pUC19-LC (BW431/26-VL-Region)

pAB-431/26-V H -hum 3 (BW431/26-VH-Region)

K. Bosslet, Schering AG, Berlin

K. Bosslet

pOPE51-PhOx-Yol (enthält das humane scFv-Fragment PhOx-Yol mit der Konfiguration V H  / Yol- Linker  / V L)

S. Dübel, Institut für Biochemie und Biotechnologie, TU Braunschweig (Kontermann et al., 1995)

↓47

Die V-Regionen des humanisierten CEA-spezifischen Antikörpers BW431/26 wurden mittels PCR amplifiziert. Dabei wurden gleichzeitig der Linker-218 (Whitlow et al., 1993) und die Restriktionsschnittstellen für die Klonierung erzeugt. Die VL-Domäne wurde aus 2 ng pUC19-LC431 mit dem CombiPolTM-Mix (InviTek) und den Primern BW431/26-VL-1A und BW431/26-VL-2 (10 Zyklen mit TAnnealing = 74°C + 15 Zyklen mit TAnnealing = 78°C) amplifiziert. Die VH-Region wurde aus 1 ng pAB-431/26-VH-humΔγ3 mit den Primern BW431/26-VH-1A und BW431/26-VH-2 (10 Zyklen mit TAnnealing = 64°C + 25 Zyklen mit TAnnealing = 69°C) amplifiziert. Das VL-Fragment wurde mit SmaI (2 h, 25°C) und NcoI (2 h, 37°C) in NEB4-Puffer geschnitten. Das VH-Fragment wurde mit SmaI (2 h, 25°C, NEB4) und mit EagI (2 h, 37°C, 2xNEB4) geschnitten. Der Vektor pOPE51 wurde mit den Enzymen NcoI (4 h) und NotI (2 h) in NEB3-Puffer verdaut. Das Vektorfragment wurde mit SAP dephosphoryliert und mit den beiden V-Fragmenten ligiert. Die Transformation des Ligationsansatzes erfolgte im E. coli-Stamm XL1-Blue (20 mM Glykose im Medium und auf den LB-Platten!). Mehrere Klone wurden präpariert und sequenziert. Durch erneute Klonierung wurden Fragmente mit korrekter Sequenz zusammengefaßt. Silent-Mutationen wurden vernachlässigt. Das erhaltene scFv-Fragment mit der Konfiguration V L  /  Linker -218 / V H wurde mit scBW431/26 bezeichnet.

Aus den V-Regionen des Antikörpers BW431/26 wurde ein weiteres scFv-Fragment konstruiert, bei dem die VH-Region über den Yol-Linker mit der VL-Region fusioniert wurde. Die Klonierung erfolgte zusammen mit der Konstruktion des scFv-Fragments scPhOx (VL / Linker-218 / VH, siehe 3.5.2). Die BW431/26-VH-Region (VHBW431/26) wurde mit Eco81I (Y+/Tango) und PvuII (NEB2, Staraktivität!) aus dem Plasmid pOPE51-scBW431/26 herausgeschnitten und an die Stelle der VHPhOx-Region im Vektor pOPE51-PhOx-Yol kloniert. Das erhaltene Plasmid pOPE51-VHBW431/26 / Yol-Linker / VLPhOx wurde mit MluI und BamHI (1,5xUni-Puffer) geschnitten und die VLPhOx-Region durch die VLBW431/26-Region ersetzt, die aus dem Plasmid pUC19-LC431 mit den Primern BW431/26-VL-1B und 2 (10 Zyklen mit TAnnealing = 74°C + 15 Zyklen mit TAnnealing = 78°C, CombiPol™-Mix) amplifiziert wurde. Das erhaltene scFv-Fragment mit der Konfiguration V H  / Yol- Linker  / V L wurde mit BW431/26-Yol bezeichnet.

3.5.2 Konstruktion des phOx-spezifischen scFv-Fragments scPhOx

Die PhOx-Yol-VH-Region wurde aus dem Plasmid pOPE51-PhOx-Yol mit den Enzymen Eco81I und PvuII herausgeschnitten und an die Stelle der BW431/26-VH-Region im Plasmid pOPE51-scBW431/26 (siehe 3.5.1) kloniert. Das resultierende Plasmid pOPE51-VLBW431/26 / Linker-218 / VHPhOx wurde mit den Enzymen NotI (2xUni-Buffer) und BamHI (1,5xUni-Buffer) geschnitten und das Fragment Linker218 / VHPhOx isoliert. Die VLPhOx-Region wurde aus dem Plasmid pOPE51-PhOx-Yol mit den Primern PhOx-VL-1 und 2 und der Pfu-Polymerase (10 Zyklen mit TAnnealing = 70°C + 20 Zyklen mit TAnnealing = 75°C) amplifiziert und mit den Enzymen NcoI und BamHI (1,5x Uni-Buffer) geschnitten. Die Fragmente VLPhOx und Linker-218 / VHPhOx wurden über die NcoI- und NotI-Schnittstellen (NEB3) in das Plasmid pOPE51 kloniert. Das erhaltene scFv-Fragment mit der Konfiguration V L  /  Linker -218 / V H wurde mit scPhOx bezeichnet.

3.5.3 Expression und Westernblot-Analyse der scFv-Fragmente in E. coli

↓48

Glukose

Sigma

Isopropylthiogalactosid (IPTG)

Calbiochem

2x TY-Medium (3.4.1)

 

4x Saccharose (1,6 M Saccharose in PBS, sterilfiltrieren)

 

Die Expression der scFv-Fragmente erfolgte im E. coli-Stamm XL1-Blue. XL1-Blue-Zellen wurden mit den Plasmiden pOPE51-scBW431/26, BW431/26-Yol, -scPhOx oder -PhOxYol transformiert und in 5 mL 2x TY-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin und 20 mM Glukose inokuliert. 2,5 mL der Vorkultur wurden in 240 mL 2xTY mit 20 mM Glukose und 100 µg/mL Ampicillin in einem Erlenmeyerkolben (mit Einbuchtungen) bei 37°C und 250 U/min geschüttelt. Nach Erreichen einer OD600 von 0,5 wurden 80 mL 4x Saccharose (Endkonzentration 0,4 M) dem Medium hinzugegeben und die Expression mit 0,1 mM IPTG gestartet. Die Kultur wurde 36 h bei RT (ca. 26 – 28°C!!!) und 250 U/min geschüttelt. Die Suspension wurde 10 min bei 3500 U/min (JA10, Beckman) und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut zentrifugiert und zur Isolation der scFv-Fragmente (3.5.4) eingesetzt.

In einem weiteren Ansatz wurden XL1-Blue-Zellen, die mit den scFv-Konstrukten transformiert waren, wie beschrieben angeschüttelt und die Expression mit 1 mM IPTG induziert (keine Zugabe von Saccharose!). Nach 4 h Expression bei 37°C wurden die Bakterienpellets 2x mit PBS gewaschen und in 5 mL PBS resuspendiert. 200 µL der Bakterienpellets wurden mit reduzierendem oder nichtreduzierendem SDS-Probenpuffer aufgekocht. Nichtlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation entfernt. Die Proben wurden für die SDS-PAGE (3.4.9) und Westernblotanalyse (3.4.10) eingesetzt. Die Westernblotmembranen wurden mit dem Antikörper 9E10 (1:2000) und einem AP-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG(H+L)-F(ab’)2-Fragment (1:5000) gefärbt (3.4.7).

3.5.4 Reinigung und Bindungsanalyse der scFv-Fragmente

↓49

Peristaltikpumpe

Pharmacia

Dialyseschlauch mit MWCO 10000

Roth

Ni2+-NTA-Agarose-Suspension

Qiagen

Imidazol

Sigma

Lysepuffer:

50 mM NaH2PO4, pH 8,0

300 mM NaCl

5 mM Imidazol

Waschpuffer:

50 mM NaH2PO4, pH 8,0

300 mM NaCl

20 mM Imidazol

Elutionspuffer:

50 mM NaH2PO4, pH 8,0

300 mM NaCl

250 mM Imidazol

  

Die scFv-Fragmente enthielten einen C-terminalen (His)5-Tag, der die Aufreinigung über eine Ni2+-NTA-Agarosesäule ermöglichte. Der Überstand aus dem Expressionsansatz (3.5.3) wurde mit dem dreifachen Volumen Lysepuffer gemischt und auf die Ni2+-NTA-Agarosesäule aufgetragen, die an eine Peristaltikpumpe angeschlossen war (ca. 0,5 mL/min). Anschließend wurde die Säule mit 10 Säulenvolumina Waschpuffer gewaschen. Die Elution der (His)5-Tag-scFv-Proteine erfolgte mit 10 Säulenvolumina Elutionspuffer. Das Eluat wurde anfänglich in 0,5 mL-Fraktionen später in 1 mL-Fraktionen gesammelt. 5 µL jeder Fraktion wurden mit 45 µL 50 mM Bicarbonatpuffer (pH 9.6) versetzt undzum „Coating“ von ELISA-Platten verwendet. Die scFv-Proteine wurden durch ELISA (3.4.8) mit dem Antikörper 9E10 (1:1000) und einem AP-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG(H+L)-F(ab‘)2-Fragment (1:1000) nachgewiesen. Die Fraktionen mit dem höchsten Gehalt an scFv-Protein wurden gesammelt und gegen PBS dialysiert (MWCO < 10 kDa).

Die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol wurden auf ihre Bindung gegenüber CEA-Protein mittels ELISA (3.4.8) untersucht, während die scFv-Fragmente scPhOx und PhOx-Yol auf ihre Bindung gegenüber PhOx-BSA (Herstellung von PhOx-BSA siehe 3.10.7) getestet wurden. Der Nachweis der scFv-Fragmente erfolgte mit dem Antikörper 9E10 (1:1000) und einem AP-konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG(H+L)-F(ab‘)2-Fragment (1:1000).

3.6 Konstruktion der scFv-hFc-Fusionsproteine

3.6.1 Konstruktion des sekretorischen Signalpeptids

↓50

Die Signalpeptidsequenzen (Leader) für die sekretorische Expression der scFv-hFc-Proteine wurden mit Primern erzeugt, die gleichzeitig als PCR-Template dienten. Die Primer wurden mit 1/10 der Standardkonzentration eingesetzt (20 nM). Nach Denaturierung wurden 2,5 U Taq-Polymerase in den Ansatz gegeben. Der erste Zyklus wurde bei 66°C Annealing (15 s Elongation) und die nachfolgenden 10 Zyklen wurden bei 78°C Annealing (15 s Elongation) durchgeführt. Nach dem Auffüllen der Enden wurden die Ansätze auf 80°C erhitzt, mit 1/10 Volumen 10x DNA-Ladepuffer versetzt und die PCR-Fragmente in einem 2,5%iges Agarosegel isoliert (Leader-A = 85 bp, Leader-C = 84 bp).

3.6.2 Isolation des humanen IgG1-Fc-Teils

Plasmide

 

pCMX-sFGFR4-hFc

M. Seidensticker, MDC (Gao und Goldfarb, 1995)

pCDNA3

Invitrogen

2 ng des Plasmids pCMX-sFGFR4-hIgG-hFc wurden mit den Primern hFc-1 und hFc2 und der Pfu-Polymerase amplifiziert (10 Zyklen mit TAnnealing = 60°C + 20 Zyklen mit TAnnealing = 76°C). Das PCR-Fragment wurde nach Aufreinigung mit den Enzymen HindIII und XbaI (NEB2, BSA) verdaut und in das Plasmid pCMX-sFGFR4-hFc anstelle des sFGFR4-hFc-Fusionsrezeptorgens kloniert. Der erhaltene Vektor wurde mit pCMX-hFc bezeichnet.

↓51

Analog wurde der humane Fc-Teil mit der 3‘-BamHI-Fusionsschnittstelle über die Primer hFc-1 und hFc2B amplifiziert. Das PCR-Fragment wurde mit den Enzymen HindIII und XhoI (NEB2, BSA) in den Vektor pCDNA3 kloniert. Das Produkt wurde mit pCDNA3-hFcB bezeichnet.

3.6.3 Konstruktion der scFv-hFc-Proteine scBW431/26-hFc und scPhOx-hFc

Das PCR-Fragment des Leader -A (aus 3.6.1) wurde mit HindIII und ScaI (SuRECut B) geschnitten. Die Plasmide pOPE51-scBW431/26 und pOPE51-scPhOx wurden mit dem Enzym NcoI (NEB3) geschnitten und die überhängenden 5’-Enden mit der S1-Nuclease entfernt (3.4.3). Die scFv-Genfragmente wurden anschließend durch Restriktion mit NotI (NEB3) isoliert. Der Leader-A wurde zusammen mit dem jeweiligen scFv-Fragment in die HindIII- und NotI-Schnittstellen des Plasmids pCMX-hFc kloniert. Der Leader -C (aus 3.6.1) wurde mit den Enzymen HindIII und NcoI (NEB2) geschnitten. Die scFv-Konstrukte scBW431/26 und scPhOx wurden mit NcoI und NotI (NEB3) aus den Plasmiden pOPE51-scBW431/26 und pOPE51-scPhOx isoliert. Die Klonierung des Leader-C erfolgte zusammen mit den scFv-Fragmenten in die HindIII- und NotI-Schnittstellen des Vektors pCMX-hFc. Die scFv-hFc-Konstrukte wurden mit scBW431/26-hFc und scPhOx-hFc bezeichnet. Die Klone erhielten in Abhängigkeit vom verwendeten Leader die Bezeichungen Ax oder Cx (x = Nummer).

3.6.4 Konstruktion des scHuM195-hFc-Proteins

Plasmide

 

pUC18-HuM195.VL

pUC18-HuM195.VH

Man Sung Co (Protein Design Labs Inc.), David Scheinberg (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center), New York, USA

↓52

Die VL-Region wurde mit den Primern HuM195-VL-1 und -2 aus dem Plasmid pUC18-HuM195.VL mit der Pfu-Polymerase amplifiziert (10 Zyklen mit T Annealing = 66°C, tAnnealing  = 30 s + 15 Zyklen mit T Annealing = 76°C, tAnnealing  = 60 s). Unter denselben Bedingungen wurde die Amplifikation der HuM195-VH-Region aus dem Plasmid pUC18-HuM195.VH mit den Primern HuM195-VH-3 und 4 durchgeführt. Die VL-Region wurde mit den Enzymen SmaI (25°C, NEB4, BSA, 1 h, unvollständiger Verdau wegen zweiter SmaI-Schnittstelle in der VL-Region) und ApaLI (37°C, NEB4, BSA) geschnitten und das 400 bp-Fragment isoliert. Die VH-Region wurde mit den Enzymen SmaI (25°C) und BamHI (NEB4) verdaut. Die Signalpeptidsequenz Leader-C wurde aus dem Plasmid pCMX-scBW431/26-hFc durch Restriktion mit HindIII und ApaLI (NEB2) isoliert. Das Leader-C-Fragment und die PCR-Fragmente der beiden HuM195-V-Regionen (inkl. Linker-218) wurden in die HindIII- und Bgl II-Schnittstellen (Y+/Tango) des Plasmids pCMX-hFc ligiert. Das scFv-Fragment des resultierenden scFv-hFc-Konstruktes scHuM195-hFc lag in der Konfiguration V L  / Linker-218 / V Hvor.

3.6.5 Expression und Analyse der scFv-hFc-Proteine

CEA (aus der Kolonkarzinomzellinie SW1116; Kat-Nr. 219369)

Calbiochem

humaner IgG-Proteinstandard

Dianova

Die Plasmide pCMX-scBW431/26-hFc, pCMX-scPhOx-hFc (Leader-A/C) und pCMXscHuM195-hFc (nur Leader-C) wurden mittels Kalziumphosphattransfektion (3.2.4) in die 293T-Zellen transfiziert. Die Überstände wurden nach drei Tagen abgenommen. 10 µL der Überstände wurden für den Immunodotblot (3.4.7) zum Nachweis der sekretorischen Expression der scFv-hFc-Fusionsproteine eingesetzt. Um die Konzentration des scFv-hFc-Proteins quantitativ zu bestimmen, wurde ein humaner IgG-Proteinstandard eingesetzt. Die Dotblots wurden mit einem Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-human-Fc(γ)-Antikörper (1:1000) gefärbt. Die scBW431/26-hFc-Fusionsproteine wurde im ELISA (3.4.8) auf ihre Bindung gegenüber CEA-Protein analysiert. Die scPhOx-hFc-Fusionsproteine wurden auf ihre Bindung gegenüber PhOx-BSA (Herstellung siehe 3.10.7) untersucht. Als Kontrollantigen diente BSA. Der Nachweis erfolgte mit einem Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-Antikörper (1:1000). Das scFv-hFc-Protein scHuM195-hFc wurden durch die FACS-Analyse von myeloischen Leukämiezellinien auf seine Bindungseigenschaften getestet (3.8.3).

3.7 Herstellung chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren

3.7.1 Isolation der cDNA der humanen CD3 ζ-Kette

↓53

Die cDNA der gesamten humanen ζ-Kette des TCR-CD3-Komplexes wurde aus 1 ng Gesamt-cDNA aktivierter PBLs (siehe 3.4.5) mit den Primern ζ-1A und 2A und der Pfu-Polymerase (20, 25 und 30 Zyklen bei TAnnealing = 60°C, tElongation = 150 s) amplifiziert. 1/10 dieser PCR-Ansätze wurde mit den Primern ζ-1B und -2B (16 oder 21 Zyklen bei TAnnealing = 60°C, tElongation = 120 s) amplifiziert, um das Fragment zu erhalten, das die Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen der CD3 ζ-Kette umfaßt. Das PCR-Fragment wurde mit BamHI und HindIII (SuRE-Cut B) geschnitten und in den Vektor pBS/SK(-)-CD8αhinge kloniert.

3.7.2 Konstruktion der chimären Immunglobulin-T-Zellrezeptorkonstrukte

Die cIgTCR-Konstrukte wurden durch Fusion der scFv-hFc-Genkonstrukte mit der CD3 ζ-Kette erzeugt. Das Fragment für die Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen der CD3 ζ-Kette wurde mit den Enzymen BamHI und XhoI (NEB2, BSA) aus dem Plasmid pBS/SK-CD8αhinge-ζ (aus 3.7.1) herausgeschnitten und in das Plasmid pCDNA3-hFcB (aus 3.6.2) kloniert. Das resultierende Plasmid pCDNA3-hFcζ enthielt jedoch 2 HindIII-Schnittstellen, so daß das hFcζ-Fragment aus dem Plasmid pCDNA3-hFcζ mit den Enzymen NotI und XhoI (NEB3) noch einmal isoliert werden mußte. Die scFv-Fragmente scBW431/26 und scPhOx (inkl. der Signalpeptidsequenzen Leader-A/-C) wurden mit den Enzymen HindIII (NEB2, 2 h) und NotI (NEB3, 2 h) aus den Plasmiden pCMX-scBW431/26-hFc und pCMX-scPhOx-hFc isoliert und zusammen mit dem hFcζ-Fragment in die HindIII- und XhoI-Schnittstellen (NEB2, BSA) des Vektors pCDNA3 kloniert. Die cIgTCR-Konstrukte wurden entsprechend ihrer scFv-Fragmente mit scBW431/26-hFc und scPhOx-hFc bezeichnet.

Das scFv-Fragment scHuM195 (inkl. Leader-C) wurde mit den Enzymen BlpI (NEB2, 2 h) und NotI (NEB3, 2 h) aus dem Vektor pCMX-scHuM195-hFc herausgeschnitten und in das Plasmid pCDNA3-hFcζ kloniert. Das resultierende cIgTCR-Konstrukt wurde mit scHuM195-hFc bezeichnet.

3.7.3 Expression und Analyse der cIgTCR-Konstrukte in den 293T-Zellen

↓54

Die Plasmide pCDNA3-scPhOx-hFcζ, pCDNA3-scBW431/26-hFcζ und pCDNA3-scHuM195-hFcζ wurden mittels Kalziumphosphattransfektion in die 293T-Zellen transfiziert (3.2.4). Ein bis zwei Tage nach Transfektion erfolgte die Messung der cIgTCR-Expression mittels FACS-Analyse (3.2.4). Die Zellen wurden abgelöst und mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-F(ab‘)2-Fragment (1:100) gefärbt. Als Negativkontrolle wurden 293T-Zellen mit dem Leervektor pCDNA3 mock-transfiziert und analysiert. Außerdem wurde die CD3 ζ-Kette der cIgTCR-Konstrukte mit dem Antikörper 1D4 (1:100) und einem FITC-konjugierten Ratte-anti-Maus-IgG(H+L)-F(ab’)2-Fragment (1:100) durch intrazelluläre FACS-Färbung (3.3.2) untersucht. Als Isotypenkontrolle wurde der Antikörper MOPC21 eingesetzt (Antikörper siehe 3.2.4).

3.8 Antigenexpression auf Tumorzellen

3.8.1 FACS-Analyse phOx-markierter Zellen mit dem scPhOx-hFc-Protein

106 Zellen der ALL-Zellinie Reh wurden mit 10 µg PhOx (4-Ethoxymethylen-2-phenyl-2-oxazolin-5-on, siehe 3.10.7) in 1 mL PBS 30 min bei RT im Dunkeln markiert. Die Zellen wurden 3x mit serumhaltigen Medium gewaschen, mit 50 µL scPhOx-hFc-Protein (Kulturüberstand aus 3.6.5) und einem FITC-konjugierten Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-F(ab‘)2-Fragment (1:100) gefärbt und im FACS analysiert (3.3.1). Als Negativkontrolle wurden ungelabelte Reh-Zellen eingesetzt.

3.8.2 FACS-Analyse von Tumorzellinien mit dem scBW431/26-hFc-Protein

Das scBW431/26-hFc-Protein wurde zur durchflußzytometrischen Analyse (3.2.4) der Maus-Kolonkarzinomzellinie MC38 und der aus ihr abgeleiteten CEA-transfizierten Zellinie MC32A (Klon 6 und 10) eingesetzt. Bei dieser Untersuchung wurden 50 µL scBW431/26-hFc-Protein mit den Signalpeptiden Leader-A und Leader-C (Kulturüberstand aus 3.6.5) eingesetzt. Das scPhOx-hFc-Protein (Leader-A und C) und das scHuM195-hFc-Protein (nur Leader-C) wurden als Kontrollen eingesetzt. Der Nachweis erfolgte mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-F(ab‘)2-Fragment (1:100). Zu Vergleichszwecken wurden Färbungen mit dem CEA-spezifischen Antikörper CEJ065 (1:50) und eine geeignete Isotypenkontrolle durchgeführt. Als Sekundärantikörper wurde ein FITC-konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG(H+L)-F(ab’)2-Fragment (1:100) verwendet (Antikörper siehe 3.3).

↓55

Die humanen Kolonkarzinomzellinien HT29, LoVo, LS174T, SW403, SW480, SW948, SW1222 und SW1417 und die Pankreaskarzinomzellinien Capan2 und Panc89 wurden in gleicher Weise mit dem scBW431/26-hFc-Protein (nur Leader-A) und dem Antikörper CEJ065 gefärbt. Färbungen mit dem scPhOx-hFc-Protein und einem Isotypenkontrollantikörper dienten als Negativkontrollen.

3.8.3 FACS-Analyse von Leukämiezellinien mit dem scHuM195-hFc-Protein

Die FACS-Analyse (3.2.4) der humanen myeloischen Leukämiezellinien KG1 und HL60 wurde mit 50 µL scHuM195-hFc-Protein (Kulturüberstand aus 3.6.5) und einem FITC-konjugiertem Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-F(ab‘)2-Fragment durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde das scPhOx-hFc-Protein (Leader-C) verwendet. Zum Vergleich wurden Färbungen mit dem FITC-konjugierten CD33-spezifischen Antikörper WM54 und einer geeigneten Isotypenkontrolle durchgeführt. Außerdem wurden HL60-Zellen untersucht, die eine Woche mit 1% (v/v) DMSO im Kulturmedium stimuliert wurden. Die HL60-Zellen wurden vor und nach DMSO-Stimulation mit Antikörpern gegen die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86, MHC-Klasse-I (HLA-ABC) und das Integrin CD11c gefärbt (Antikörper siehe 3.3).

3.9 Genmodifikation der humanen NK-Zellinie YT

3.9.1 Gentransfer der cIgTCR-Konstrukte in die YT-Zellen

Elektroporationsküvette (0,4 cm Elektrodenabstand!!!)

Eurogentec

BioPulser mit externer Kapazität

BioRad

G418-Sulfat (Stammlösung in 100 mM HEPES)

Calbiochem

↓56

Die Plasmide pCDNA3, pCDNA3-scBW431/26-hFcζ, pCDNA3-scPhOx-hFcζ und pCDNA3-scHuM195-hFcζ wurden mittels Elektroporation in die YT-Zellen transfiziert. 107 YT-Zellen wurden 1x mit RPMI (4°C) gewaschen und in 800 µL kaltem RPMI resuspendiert. Nach Überführen in die Elektroporationsküvette wurden 10 – 20 µg Plasmid-DNA (1 µg/µL) zugegeben und gemischt. Die Küvetten wurden auf Eis gestellt und nach 5 min bei 250 V und 975 µF im Elektroporationsgerät gepulst. Die Küvette wurde anschließend wieder auf Eis gestellt und die Zellsuspension nach 1 – 2 min noch einmal durch mehrfaches Anschnipsen gemischt, um den entstandenen pH-Gradienten zu beseitigen. Nach weiteren 5 min auf Eis wurden die Zellen in 50 mL Kulturmedium aufgenommen. Die Selektion mit 500 µg/mL G418 wurde 48 h nach Elektroporation aufgenommen. Die toten YT-Zellen wurden nach etwa einer Woche über einen Lymphoprep™-Dichtegradienten (1.077g/mL, 20 min, 1400 U/min, 20°C) entfernt.

3.9.2 Analyse der cIgTCR-Expression der transfizierten YT-Zellen

Die Analyse der cIgTCR-Expression auf den transfizierten YT-Zellen erfolgte wie unter 3.7.3 beschrieben. Als Negativkontrolle wurden mock -transfizierte YT-Zellen, die mit dem Leervektor pCDNA3 transfiziert worden waren, eingesetzt.

3.9.3 Immunologische Anreicherung der cIgTCR+ YT-Zellen

FACS-Vantage®

Becton Dickinson

Microbead®-gekoppelter Anti-FITC-Antikörper

Miltenyi Biotech

Mini- oder Midi-MACS®-Magnet + Ständer

Miltenyi Biotech

MS-Säulen (für Mini-MACS®), LS-Säulen (für Midi-MACS®)

Miltenyi Biotech

MACS-Puffer:

PBS

0,5% (w/v) BSA

2 mM EDTA

sterilfiltrieren (0,2 µm) und vor Verwendung entgasen!!!

↓57

Die cIgTCR+ YT-Zellen wurden über FACS(fluorescent activated cell sorting) oder MACS® (magnetic activated cell sorting) angereichert. Dabei wurden Antikörper spezifisch für die Fc-„Spacer“-Domäne der cIgTCR-Konstrukte eingesetzt. Beim FACS-Sorting wurden 107 cIgTCR-transfizierte YT-Zellen mit 200 µL eines FITC-konjugierten Ziege-anti-human-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragments (1:100 in MACS-Puffer) 15 min bei 4°C gefärbt. Die Zellen wurden gewaschen, in 3 – 4 mL MACS-Puffer resuspendiert und auf Eis gestellt. Die Zellen wurden mit einem FACS-Vantage®-Hochleistungs-FACS-Sorter bei einer maximalen Durchflußrate von 4000 Zellen/s getrennt. Das „Gate“ für die positive Fraktion (cIgTCR+ YT-Zellen) wurde im Histogramm-Plot in der FL-1 festgelegt. Aufgrund des offenen Systems konnten nur semisterile Bedingungen erreicht werden. Kontaminationen wurden jedoch nicht beobachtet.

Beim MACS® wurden 107 cIgTCR-transfizierte YT-Zellen mit 200 µL eines FITC-konjugierten Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-F(ab‘)2-Fragments (1:100 in MACS-Puffer) 15 min bei 4°C gefärbt. Nach einem Waschschritt wurden die Zellen mit 200 µL eines Microbead®-gekoppelten anti-FITC-Antikörpers (1:10 in MACS-Puffer) 30 min bei 4°C gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden 1x gewaschen, in 500 µL MACS-Puffer resuspendiert und auf die magnetisierte MS-Säule (im Mini-MACS®-Magnet) aufgetragen, die zuvor mit 2 mL MACS-Puffer equilibriert wurde. Die magnetisierte Säule wurde anschließend 3x mit 3 mL MACS-Puffer gewaschen. Danach wurde die Säule aus dem Magneten genommen und die gebundenen cIgTCR+ YT-Zellen mit 5 mL MACS-Puffer eluiert. Die cIgTCR+ YT-Zellen wurden abzentrifugiert und in Kultur genommen. Die angereicherten cIgTCR+ YT-Zellen wurden weiterhin unter selektiven Bedingungen (500 µg/mL G418) kultiviert. Die Anreicherung der cIgTCR+ YT-Zellen wurde nach etwa zwei Wochen wiederholt (Antikörper siehe 3.3).

Die Verwendung von biotinyliertem Ziege-anti-human-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragment (1:100, Dianova) und Microbead®-gekoppeltem Streptavidin (1:10, Miltenyi Biotec) war zum Anreichern der cIgTCR+ YT-Zellen mit dem MACS®-System nicht geeignet (siehe Ergebnisse 4.3.2).

3.10 Zytotoxizitätsstudien

3.10.1  51Cr-Freisetzungsassay

↓58

[51Cr]-Natriumchromat (37 Mbq/mL in PBS, steril, t½ = 28 d)

NEN Dupont

Triton®X-100 (t-Octylphenylpolyethylenglycol)

Sigma

Spitzbodenplatten mit 96 Vertiefungen

Greiner

Lumaplate™-96, Topseal™-Film

Packard Instruments

β-Szintillationszähler Topcount

Packard Instruments

IMDM / 10%FCS (IMDM ist besser als RPMI gepuffert.)

RPMI / 10%FCS

2% (w/v) Triton ® X-100 in dH 2 O

Die Zielzellen wurden in 50 µL RPMI resuspendiert und mit 20 – 50 µL [51Cr]-Natriumchromat 90 min bei 37°C markiert. Die Röhrchen wurden alle 10 – 15 min geschüttelt, um eine gleichmäßige Markierung der Zielzellen zu gewährleisten. Danach wurden die Ansätze mit 10 mL RPMI / 10% FCS aufgefüllt, abzentrifugiert und erneut mit 10 mL RPMI / 10% FCS gewaschen. Die markierten Targetzellen wurden in 2 – 5 mL RPMI / 10% FCS resuspendiert und für 20 min bei RT inkubiert. Während dieser Zeit wurden die Targetzellen gezählt. Die benötigte Menge an Targetzellen wurde entnommen, gewaschen und 4 x 104 Zellen/mL in IMDM / 10%FCS resuspendiert. Während der Targetzellmarkierung wurden die Effektorzellen vorbereitet. Sie wurden gewaschen und auf 2 x 106 Zellen/mL in IMDM / 10% FCS eingestellt. Ausgehend von dieser Zellkonzentration wurde eine Verdünnungsreihe in Halbverdünnungsschritten erzeugt und jeweils 75 µL als Triplikate oder Quadruplikate in Spitzbodenplatten mit 96 Vertiefungen vorgelegt. Anschließend wurden 75 µL (= 3000 Zellen) der gelabelten Targetzellen zu den Effektorzellen pipettiert, was einem Effektor : Targetzellverhältnis (E : T) von 50:1, 25:1, 12,5:1 … entsprach. Zur Ermittlung der spontanen [51Cr]-Freisetzung wurde 75 µL Medium anstelle der Effektorzellen eingesetzt („0%-Lyse“). Die „100%-Lyse“ der Targetzellen wurde durch Ansätze ermittelt, denen 75 µL 2% (v/v) Triton®X-100 anstelle der Effektorzellen zugegeben wurde. Der Zytotoxizitätsassay wurde 4 – 6 h bei 37°C im CO2-Inkubator durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die Platten 2 min (vorsichtig!) geschüttelt. Anschließend wurden die Platten 5 min bei 1200 U/min abzentrifugiert und 50 µL Überstand je Ansatz in eine LumaPlate TM-96-Szintillatorplatte übertragen. Die anfallenden radioaktiven Abfälle wurden nach den Strahlenschutzrichtlinien gesondert gesammelt und entsorgt. Die Szintillatorplatten wurden über Nacht unter einem Abzug getrocknet und mit Topseal TM-Film eingeschweißt. Die Messung wurde in einem β-Szintillationszähler durchgeführt. Die Targetzellyse wurde nach Formel 1 ermittelt. Die Standardabweichungen wurden aus den Triplikaten bzw. Quadruplikaten berechnet. Die Fehler der „0%-Lyse“ und „100%-Lyse“ wurden dabei vernachlässigt.

↓59

… Lyse der Targetzellen in %

… Targetzellyse gemessen in cpm (counts per minute)

… Mittelwert der spontanen 51Cr-Freisetzung in cpm (Medium)

↓60

… Mittelwert der 100%ige Lyse in cpm (1% Triton® X-100)

Formel 1 – Berechnung der Targetzellyse beim 51Cr-Freisetzungsassay

3.10.2 Durchflußzytometrischer Zytotoxizitätsassay

CFSE (5- und 6-Carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester-Diacetat, Stammlösung 10 mg/mL in DMSO)

Molecular Probes

IMDM (ohne Phenolrot) / 10% (v/v) FCS

 

Stoplösung: PBS / 0,6% (w/v) NaN3

 

PI-Lösung: 15 µg/mL PI in PBS

 

↓61

Ein durchflußzytometrischer Zytotoxizitätsassay (modifiziert nachMattis et al., 1997) wurde bei einigen Versuchen verwendet. Am Vortag wurden 107 Zielzellen mit 10 µg des Fluoreszenzfarbstoffs CFSE (1:1000) in 1 mL PBS markiert (5 min, 37°C). CFSE dringt in die Zellen ein, wird dort durch intrazelluläre Esterasen gespalten (Vitalfärbung!) und reagiert mit freien Aminogruppen von Proteinen (kein Tris-Puffer verwenden!). Die Zellsuspension und das Zellpellet entwickelt dabei eine intensive gelbliche Färbung. Anschließend wurden die Zellen 2x mit serumhaltigem Medium gewaschen und über Nacht in Kultur genommen. Am nächsten Tag wurden die CFSE-markierten Zielzellen abzentrifugiert und 2,5 x 105 Zellen/mL in IMDM ohne Phenolrot resupendiert. 100 µL dieser Suspension wurden in 0,6 mL-Röhrchen (Greiner) vorgelegt, die in eine 96-well-Platte platziert waren. 100 µL Effektorzellen wurden in einem geeigneten E : T-Verhältnis zugegeben. Die spontane Lyse wurde durch Ansätze ohne Effektorzellen ermittelt. Alle Ansätze wurden als Triplikate ausgeführt. Nach 5 h Inkubation im CO2-Inkubator bei 37°C wurde 50 µL/Ansatz PBS / 0,6% NaN3 zugegeben und die Ansätze auf Eis gestellt, um eine weitere Lyse der Zielzellen zu unterbinden. Die Messung wurde direkt im Anschluß an einem FACS-Gerät durchgeführt, um eine geringe spontane Lyse zu erhalten. Vor der Messung wurde 50 µL PI-Lösung zugegeben und die Proben kräftig gevortext. Es wurden mindestens 1000 CFSE+ Zielzellen (FL-1) gemessen. Die Targetzellyse wurde aus dem Verhältnis der toten Zielzellen (CFSE+ und PI+) und der Gesamtzahl an CFSE+ Zielzellen ermittelt (Abbildung 9 und Formel 2).

Abbildung 9 - Durchflußzytometrischer ZytotoxizitätsassayIn der Abbildung ist die Auswertung des durchflußzytometrischen Zytotoxizitätsassays dargestellt. Die PhOx-markierten Zielzellen (ALL-Zellinie Reh) wurden vor (a) und nach (b) der Markierung mit dem Farbstoff CFSE und nach 5 h Inkubation mit den scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen (E : T-Verhältnis = 20 : 1) (c) im FACS-Gerät gemessen. Durch die CFSE-Markierung (FL-1) konnten Effektor- und Zielzellen eindeutig in der FL1 unterschieden werden (c). Die toten Zellen wurden durch den Farbstoff PI (FL-3) angefärbt.

↓62

R2 + R3… Gesamtzahl der CFSE-markierten Zielzellen

R2… Zahl der toten (PI+) CFSE-markierten Zielzellen

Formel 2 – Bestimmung der Targetzellyse aus Abbildung 9

3.10.3 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen

↓63

Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen, die mit dem CEA-spezifischen cIgTCR-Genkonstrukt transfiziert waren, wurden in 6 h-51Cr-Freisetzungsassays (3.10.1) gegenüber der Maus-Kolonkarzinomzellinie MC38 und der aus ihr abgeleiteten CEA-transgenen Zellinie MC32A (Klone 6 und 10) untersucht. Die mock-transfizierten YT-Zellen, scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen und scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen wurden in parallel durchgeführten Ansätzen als Effektorzellkontrollen eingesetzt. Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde außerdem gegenüber den humanen Kolonkarzinomzellinien HT29, LoVo, LS174T, SW403, SW480, SW948, SW1222 und SW1417 und den Pankreaskarzinomzellinien Capan2 (nur 4 h-Assay) und Panc89 untersucht. Die mock-transfizierten YT-Zellen und die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen dienten als Effektorzellkontrollen.

3.10.4 Zytotoxizität der scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen

Die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen, die mit dem CD33-spezifischen cIgTCR-Genkonstrukt transfiziert waren, wurden in 6 h51Cr-Freisetzungsversuchen (3.10.1) auf ihre Zytotoxizität gegenüber den myeloischen Leukämiezellinien KG1 und HL60 untersucht. Außerdem wurden HL60-Zellen als Zielzellen eingesetzt, deren Differenzierung eine Woche durch 1% (v/v) DMSO stimuliert wurde. Als Effektorzellkontrollen wurden mock-transfizierte YT-Zellen und scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen eingesetzt.

3.10.5 Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen

Die Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen wurde mit dem durchflußzytometrischen Zytotoxizitätsassay (3.10.2) gegenüber PhOx-markierten Zellen getestet. Die Leukämiezellinie Reh wurde mit CFSE markiert. Am nächsten Tag wurden die CFSE-markierten Reh-Zellen aufgeteilt und eine Hälfe mit dem Hapten PhOx markiert (3.8.1). Die PhOx-gelabelten und nichtgelabelten Reh-Zellen wurden als Zielzellen für die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen eingesetzt. Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurden als Effektorzellkontrolle gegenüber den PhOx-markierten Zielzellen eingesetzt.

3.10.6 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen in Gegenwart von freiem CEA-Protein

↓64

Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde in einem 6 h-51Cr-Freisetzungsassay (3.10.1) gegenüber der CEA+ Tumorzellinie MC32A in Gegenwart von 0,1 µg/mL, 1 µg/mL und 10 µg/mL an gelöstem CEA-Protein getestet. Das eingesetzte CEA-Protein stammte aus derselben Charge, die zuvor für die Bindungsstudien des scBW431/26-hFc-Proteins eingesetzt wurden (siehe 3.6.5). Zum Vergleich wurden parallel Ansätze ohne CEA-Protein durchgeführt.

3.10.7 Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen in Gegenwart von gelöstem PhOx-BSA mit einzelnen und multiplen PhOx-Gruppen

4-Ethoxymethylen-2-phenyl-2-oxazolin-5-on (PhOx), MW = 217 Da

(10 mg/mL Stammlösung in DMSO, frisch herstellen)

Sigma

BSA (Fraktion V), MW ca. 65 kDa

Sigma

Herstellung von (PhOx) 20 -BSA

(= PhOx-BSA mit multiplen PhOx-Gruppen)

10 mg/mL BSA

0,67 mg/mL PhOx

in 100 mM NaHCO3-Puffer (pH 8.5)

2 – 4 h schütteln (RT, im Dunkeln)

Dialyse gegen PBS

bei -20°C dunkel lagern

Herstellung von (PhOx) 2 -BSA

(= PhOx-BSA mit einzelnen PhOx-Gruppen)

wie (PhOx)20-BSA jedoch mit 0,067 mg/mL PhOx

Die Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen wurde gegenüber PhOx-markierten Reh-Zellen (siehe 3.10.5) mit dem durchflußzytometrischen Zytotoxizitätsassay (3.10.2) in Gegenwart von 0,1 µg/mL, 1 µg/mL, 10 µg/mL und 100 µg/ml (PhOx)20-BSA sowie von 1 µg/mL, 10 µg/mL und 100 µg/ml (PhOx)2-BSA bei einem E : T = 10 : 1 untersucht. Außerdem wurde ein Ansatz mit 100 µg/mL BSA durchgeführt. Als Kontrolle wurden Ansätze ohne gelöstes Antigen (nur Medium) durchgeführt, die zur Festlegung der maximalen Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber den phOx-markierten Zielzellen dienten. Alle Ergebnisse wurden ins Verhältnis zu dieser Kontrolle gesetzt.

3.10.8 Wirkung von gelöstem PhOx-BSA mit einzelnen und multiplen PhOx-Gruppen auf die Antigenbindung des scPhOx-hFc-Proteins

↓65

Die Antigenbindung des scPhOx-hFc-Proteins wurde in Gegenwart von gelöstem PhOx-BSA mit einzelnen und multiplen Epitopen (Herstellung siehe 3.10.7) untersucht. Der Kulturüberstand mit dem scPhOx-hFc-Protein (10 – 20 µg/mL, aus 3.6.5) wurde aufgeteilt. Zu diesen Ansätzen wurde jeweils ein Volumen aus einer Verdünnungsreihe von gelöstem (PhOx)20-BSA oder (PhOx)2-BSA zugegeben, um bei konstanter scPhOx-hFc-Proteinkonzentration unterschiedliche Konzentrationen an gelöstem Antigen im Bereich von 1 ng/mL bis 10 mg/ml zu erhalten. Jeweils 100 µL/well wurden in ELISA-Platten übertragen, die mit (PhOx)20-BSA oder mit (PhOx)2-BSA beschichtet worden waren. Nach 1 h Inkubation (RT) wurden die Platten gewaschen und das gebundene scPhOx-hFc-Protein mit einem Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-Antikörper (1:1000) nachgewiesen (ELISA siehe 3.4.8). BSA-beschichtete Ansätze dienten als Hintergrundkontrolle und wurden von den Meßwerten abgezogen. Die 100%-Bindungsrate des scPhOx-hFc-Proteins wurde durch Ansätze ohne gelöstes Antigen bestimmt und alle Ergebnisse auf diesen Wert normalisiert.

3.11 Studien mit bestrahlten cIgTCR+ YT-Zellen

3.11.1 Bestrahlung der YT-Zellen

Blutbestrahlungsgerät OB29 (137Cs-Quelle), Strahlungdosis von 8 Gy/min 10 cm über der Basis (20.11.1997; -3,6% am 09.06.1999)

Steuerungstechnik & Strahlungsschutz (STS) GmbH, Braunschweig

Die γ-Bestrahlung wurde als Methode der Wachstumsinhibition für die YT-Zellen untersucht. Als Strahlenquelle diente eine 137Cs-Quelle. Die YT-Zellen wurden abzentrifugiert und das Zellpellet auf Eis gestellt. Um eine homogene Strahlenbehandlung zu erreichen, wurden die Zellen grundsätzlich als Pellet bestrahlt. Die Röhrchen wurden in den entsprechenden Einsätzen so positioniert, daß sich das Zellpellet 10 cm über der Basis befand. Die Strahlendosis wurde über die Bestrahlungszeit eingestellt. Nach der Bestrahlung wurden die YT-Zellen wieder auf Eis gestellt und zügig in Kultur genommen. Die Selektion der cIgTCR+ YT-Zellen mit G418 wurde nach Bestrahlung nicht fortgesetzt.

3.11.2 Bestimmung der lethalen Strahlendosis für die YT-Zellinie

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Trypanblaulösung (0,4% (w/v) in PBS)

Sigma

Jeweils 106 YT-Zellen wurden mit verschiedenen Dosen (100 – 15000 rad) γ-Strahlung bestrahlt (siehe 3.11.1). Die bestrahlten Zellen wurden im Kulturmedium resuspendiert und in Gewebekulturschalen übertragen. Die Zahl vitaler YT-Zellen wurde durch Trypanblau-Ausschluß-Färbung so lange bestimmt bis die Zellzahl wieder zunahm oder keine vitalen Zellen mehr nachweisbar waren. Bei einer geringen Zahl vitaler Zellen wurden die Zellen durch Zentrifugation angereichert, um überlebende YT-Zellen ausschließen zu können.

3.11.3 Zytotoxizität der bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen

Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde 1, 3 und 5 Tage nach Bestrahlung mit unterschiedlichen Dosen γ-Strahlung (siehe 3.11.1) gegenüber der CEA+ Zellinie MC32A in 4 h-51Cr-Freisetzungsassays (siehe 3.10.1) ermittelt. Um eine unspezifische strahlungsbedingte Aktivierung der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen ausschließen zu können, wurde einen Tag nach Bestrahlung der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen zusätzlich die Zellinie MC38, die CEA- Ursprungszellinie der MC32A-Zellen, als Target untersucht. Für die Untersuchungen wurden nur vitale bestrahlte scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen als Effektorzellen eingesetzt, die zuvor mittels Lymphoprep™-Gradienten (1.077g/mL, 20 min, 1400 U/min, 20°C) von den toten Zellen getrennt wurden.

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Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurden außerdem einen Tag nach Bestrahlung auf die cIgTCR-Expression in Abhängigkeit von der eingesetzten Strahlendosis untersucht. Die Zellen wurden wie unter 3.9.2 gefärbt. Unbestrahlte mock-transfizierte YT-Zellen und scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurden als Kontrollen eingesetzt.

3.12 Maustumormodell

3.12.1 Etablierung des Maustumormodells

weibliche NOD/SCID-Mäuse (nonobese diabetic/ severe immunodefiency)

Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld

Alle Tierexperimente wurden nach den Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt. Weibliche NOD/SCID-Mäuse wurden unter standardisierten pathogenfreien Bedingungen (20°C, 50% relative Luftfeuchtigkeit und 12 h-Hell-Dunkel-Rhythmus) bei der Epo GmbH (Berlin) gehalten. 106 CEA+ MC32A-Tumorzellen (Klon 6) wurden subkutan in die rechte Seite der NOD/SCID-Mäuse implantiert. Ein Injektionsvolumen von 200 µL (PBS) wurde in keinem Experiment überschritten. Das Tumorvolumen wurde näherungsweise nach folgender Formel ermittelt:

↓68

Tumorvolumen = a x b x 0,5 cma ... größter Durchmesser, b ... kleinster Durchmesser

Formel 3 – Berechnung des Tumorvolumens (Näherungsformel)

3.12.2 Adoptiver Transfer bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen zur Behandlung minimaler CEA+ MC32A-Tumore

Es wurden 3 Gruppen mit je 6 NOD/SCID-Mäusen gebildet, denen am Tag 0 jeweils 106 CEA+ MC32A-Zellen (Klon 6) zusammen mit 107 bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen, 107 bestrahlten scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen oder mit PBS subkutan injiziert wurden. Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen und die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen wurden mit einer Dosis von 5000 rad bestrahlt (3.11.1). Die MC32A-Tumorzellen wurden mit den bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen oder den bestrahlten scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen jeweils für die gesamte Gruppe direkt vor der Injektion gemischt. Das Tumorvolumen wurde nach dem ersten Auftreten palpabler („fühlbarer“) Tumore an der Injektionsstelle mindestens 2x wöchentlich gemessen (3.12.1). Nachdem das Tumorvolumen 1 cm3 (ca. 10% des Körpervolumens) überschritten hatte, wurden die Mäuse getötet. Das Überschreiten von 1 cm3 Tumorvolumen wurde als Zeitpunkt des Todes für die Überlebensanalyse (3.12.2) gewertet.

3.12.3 Adoptiver Transfer von scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen zur Bekämpfung etablierter CEA+ MC32A-Tumore

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Am Tag 0 wurden 106 Zellen CEA+ MC32A-Zellen (Klon 6) subkutan in 12 NOD/SCID-Mäusen injiziert. Am Tag 19 hatten sämtliche Mäuse mindestens palpable MC32A-Tumore gebildet. 107 scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen oder 107 scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen, die mit 5000 rad bestrahlt worden waren (3.11.1), wurden jeweils 6 Mäusen pro Gruppe intratumoral injiziert. Das Tumorvolumen und die Auswertung erfolgten wie unter 3.12.2 beschrieben.

3.12.4 Statistik

Die kumulativen Überlebensraten (survival analysis) wurden mit der Statistiksoftware NCS2000 (http://ncss.com) analysiert. Die Module „Survival Analysis“ - „Log Rank Tests“ wurden verwendet. Aufgrund der geringen Größe der Gruppen wurden χ2-Tests basierend auf der Weibull-Verteilung (Peto/Wilcoxon und Gehans/Wilcoxon) verwendet, da sie sich an unterschiedliche Verteilungen besser approximieren. Die angewendeten Tests sind Verallgemeinerungen des Mann-Whitney U-Tests. Die Daten wurden so transformiert, daß die Tage, an denen ein Tumorvolumen > 1 cm3 gemessen wurde, als Zeitpunkt des Todes der jeweiligen Maus definiert wurden. Die Beobachtung der Mäuse wurde nach 90 Tagen abgebrochen, wenn kein Tumor nachgewiesen wurde. Zwei Gruppen eines Experimentes wurden als signifikant unterschiedlich angenommen, wenn der Wahrscheinlichkeit für die Identität ihrer Verteilungen < 5% (p < 0,05, p-value, probability) war.

3.13 Abstoßung der cIgTCR+ YT-Zellen durch allogene Lymphozyten

3.13.1 Zytotoxizität allogener PBL und NK-Zellen gegenüber den cIgTCR+ YT-Zellen

NK-Zellisolationskit, BS-MACS®-Säule, Vario-MACS®

Miltenyi Biotech

Injektionsnadel G23 (0,6 mm), Dreiwegehahn

Braun

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Um die Sensibilität der YT-Zellen vor und nach cIgTCR-Gentransfer gegenüber allogenen Lymphozyten zu untersuchen, wurden frisch isolierte humane PBL (Isolation siehe 3.2.3) mehrerer Spender als Effektorzellen gegenüber mock-transfizierten, scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen, scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen und scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen in 4 h-51Cr-Freisetzungsassays (3.10.1) eingesetzt. Aus einem Teil der isolierten PBL wurden NK-Zellen mit dem NK-Zellisolationskit und dem Vario-MACS®-System nach Herstellerangaben isoliert und ebenfalls als Effektorzellen in 4 h-51Cr-Freisetzungsassays gegenüber den mock-transfizierten YT-Zellen, scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen, scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen und scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen untersucht.

3.13.2 Zytotoxizität allogener PBL nach Kokultivierung mit bestrahlten cIgTCR+ YT-Zellen

AIM-V (serumfreies Lymphozytenmedium)

GIBCO

humanes AB-Serum

Biowhittaker

In einer 24well-Zellkulturplatte wurden pro well 6 x 105 PBL (Isolation siehe 3.2.3) zusammen mit 6 x 104 γ-bestrahlten (5000 rad) mock-transfizierten YT-Zellen, scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen oder scPhOx-hFcζ+ YT-Zellenin 1 mL AIM-V / 10% AB-Serum 7 Tage kokultiviert. Anschließend wurden die unterschiedlich „stimulierten“ PBL auf ihre Zytotoxizität gegenüber mock-transfizierten YT-Zellen, scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen und scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen in 4 h-51Cr-Freisetzungsassays (3.10.1) untersucht.


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28.10.2005