4 Ergebnisse

4.1 Konstruktion chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren

4.1.1 Konstruktion der CEA- und PhOx-spezifischen scFv-Fragmente

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Ausgangspunkt für die Erzeugung der cIgTCR-Genkonstrukte war die Konstruktion von scFv-Fragmenten aus den variablen Regionen tumorspezifischer Antikörper. Das CEA-spezifische scFv-Fragment wurde aus den V-Regionen des humanisierten Antikörpers BW431/26 (Bosslet et al., 1988;Gussow und Seemann, 1991) durch PCR amplifiziert. Bei diesem Schritt wurden die geeigneten Restriktionsschnittstellen für die Klonierung und die Sequenzen für den Linker-218, der die Peptidsequenz N‘-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-C’ kodiert (Whitlow et al., 1993), erzeugt. Mehrere Versuche einer „overlapping“-PCR führten zu keiner eindeutigen Bande des scFv-Fragments, obwohl eine komplementäre Überlappung von 16 bp in den 5’-Enden der „inneren“ Primer eingeplant worden war. Die VL-Region konnte jedoch über die im Linker-218 enthaltene Restriktionsschnittstelle SmaI mit der VH-Region fusioniert werden. Das resultierende scFv-Konstrukt mit der Konfiguration VL / Linker-218 / VH wurde mit scBW431/26 bezeichnet. Das scFv-Fragment PhOx-Yol mit einer Spezifität für das Hapten 2-Phenyl-2-oxazolin-5-on (PhOx) sollte als Kontrollkonstrukt verwendet werden, lag jedoch in der Konfiguration VH / Yol-Linker / VL vor. Der Yol-Linker kodiert die Peptidsequenz N’-SGSASAPKLEEGEFSEAR-C’ mit dem Epitop für den Antikörper Yol 1/34 aus dem α-Tubulin (unterstrichen). Durch wechselseitigen Austausch der V-Regionen von scBW431/26 und PhOx-Yol wurde das scFv-Fragment scPhOx mit der Konfiguration VL / Linker-218 / VH und das scFv-Fragment BW431/26-Yol mit der Konfiguration VH / Yol-Linker / VL konstruiert. Auf diese Weise wurden zwei CEA-spezifische scFv-Konstrukte mit unterschiedlichen Konfigurationen und die entsprechenden PhOx-spezifischen Kontrollkonstrukte erzeugt (Schemata siehe Abbildung 10).

Die Klonierung dieser scFv-Genkonstrukte erfolgte im Plasmid pOPE51, das für die periplasmatische Expression von scFv-Fragmenten in E. coli eingesetzt wird. Die scFv-Konstrukte waren in diesem Vektor am N-Terminus mit der Signalsequenz der Pektatlyase aus E. carotova (Pel B) fusioniert, die die periplasmatische Proteinexpression in E. coli ermöglicht. Am C-Terminus waren die scFv-Konstrukte mit einem c-myc/9E10-Tag (N’-EQKLISEEDL-C’) und einem (His)5-Tag fusioniert, die der Aufreinigung und dem Nachweis dienten.

Abbildung 10– Schemata der scFv-Konstrukte
Die Schemata zeigen den Aufbau der scFv-Konstrukte scBW431/26 und scPhOx mit der Konfiguration VL / Linker-218 / VH (a) und BW431/26-Yol und PhOx-Yol mit der Konfiguration VH / Yol-Linker / VL (b) inklusive der wichtigsten Restriktionsschnittstellen. Die scFv-Fragmente wurden in den bakteriellen Expressionsvektor pOPE51 kloniert. Die Plasmidkarte von pOPE51 ist im Anhang 0 angegeben ( * nicht bei BW431/26-Yol).

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Die scFv-Genkonstrukte standen im Plasmid pOPE51 unter der Kontrolle eines lac-Promoters, der in Gegenwart von Glykose in bestimmten E. coli-Stämmen reprimiert wird. Während die Verwendung der E. coli-Stämme DH5α und BL21 schon an der Transformation scheiterte, konnte der E. coli-Stamm XL1-Blue aufgrund seiner lacI q -Mutation, die eine Überexpression des lac-Repressors bedingt, für die Klonierung der scFv-Konstrukte eingesetzt werden, wenn 20 mM Glukose in das Inokulationsmedium und auf die Agarplatten gegeben wurde. Trotzdem wurde auch bei diesem E. coli-Stamm nach Transformation der pOPE51-Plasmide mit den scFv-Genkonstrukten ein verlangsamtes Wachstum beobachtet. Eine kleine Koloniengröße war sogar ein gutes Indiz für die erfolgreiche Klonierung der scFv-Fragmente, weil große Kolonien in den meisten Fällen pOPE51-Plasmide mit fehlendem oder unvollständigem scFv-Insert aufwiesen. Außerdem war die Ausbeute und Qualität der Plasmid-DNA relativ gering, wodurch Probleme bei der nachfolgenden Sequenzierung der scFv-Genkonstrukte auftraten. Beide Effekte wiesen auf eine unvollständige Repression des lac-Promoters im XL1-Blue-Stamm hin.

4.1.2 Bakterielle Expression and Bindungsanalyse der scFv-Fragmente scBW431/26, BW431/26-Yol, scPhOx und PhOx-Yol

Die scFv-Fragmente scBW431/26, BW431/26-Yol, scPhOx und PhOx-Yol wurden im E. coli-Stamm XL1-Blue exprimiert. Die Expression wurde mit 0,1 mM IPTG induziert und bei 26 – 28°C durchgeführt. Die Zugabe von 0,4 M Saccharose in das Medium während der Expression fördert die Freisetzung periplasmatischer scFv-Proteine ins Medium und ermöglicht die Isolation der scFv-Proteine aus dem Überstand (Kipriyanov et al., 1997).

Die beiden PhOx-spezifischen scFv-Konstrukte scPhOx und PhOx-Yol ließen sich gut mit diesem Expressionssystem produzieren und aus dem Kulturüberstand über eine Ni2+-NTA-Agarosesäule aufreinigen (Abbildung 11). Die Ausbeute des scFv-Fragments scPhOx (VL / Linker-218 / VH) war mit bis zu 1 µg/mL Bakterienkultur trotz unterschiedlicher Anordnung der V-Regionen und anderer Linker-Sequenz mit dem scFv-Fragment PhOx-Yol (VH / Yol-Linker / VL) vergleichbar. Das aufgereinigte Protein beider scFv-Fragmente zeigte im ELISA eine spezifische Bindung an PhOx-BSA (Abbildung 12  b).

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Die aus den V-Regionen des CEA-spezifischen Antikörpers BW431/26 konstruierten scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol konnten dagegen nur in sehr geringen Mengen nach bakterieller Expression aus dem Kulturüberstand isoliert werden (Abbildung 11). Außerdem konnte für die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol nach Reinigung über die Ni2+-NTA-Agarosesäule keine spezifische Bindung an CEA-Protein im ELISA nachgewiesen werden (Abbildung 12  a).

Abbildung 11 – Die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol wurden im Gegensatz zu scPhOx und PhOx-Yol nur in geringen Mengen periplasmatisch in E. coli exprimiert.
Die Überstände der Bakterienkultur wurden 36 h nach Induktion der scFv-Expression geerntet. Die scFv-Proteine wurden über ihren (His)5-Tag mit Ni2+-NTA-Agarose aufgereinigt. Der Nachweis erfolgte mit dem Antikörper 9E10 gegen das c-myc-Epitop der scFv-Konstrukte.

Abbildung 12 - Die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol zeigten im Gegensatz zu scPhOx und PhOx-Yol nach bakterieller Expression keine spezifische Bindung an ihr Antigen.
Die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol wurden nach periplasmatischer Expression in E. coli und nach Reinigung über eine Ni2+-NTA-Agarosesäule auf ihre Bindung gegenüber CEA-Protein (a) mittels ELISA analysiert. Die scFv-Fragmente scPhOx und PhOx-Yol wurden auf ihre Bindung gegenüber PhOx-BSA untersucht (b). Als Negativkontrolle wurden Ansätze mit BSA-Protein als Antigen durchgeführt. Der Nachweis der scFv-Fragmente erfolgte mit dem Antikörper 9E10.

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Abbildung 13 – Die scFv-Proteine scBW431/26 und BW431/26-Yol zeigten im Gegensatz zu scPhOx und PhOx-Yol keine definierte Bande nach einer nichtreduzierenden SDS-PAGE.
Nach Expression (1 mM IPTG, 4 h, 37°C) der scFv-Konstrukte scBW431/26 (Spur 1), BW431/26-Yol (Spur 2), scPhOx (Spur 3) und PhOx-Yol (Spur 4) wurden die Bakterienpellets mit reduzierendem (a) oder nichtreduzierendem SDS-Probenpuffer (b) vorbereitet und über ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die scFv-Proteine wurden im Westernblot mit dem Antikörper 9E10 nachgewiesen.

Die Untersuchung von Bakterienlysaten mittels SDS-PAGE und Westernblot ergab für jedes scFv-Konstrukt eine einzelne Bande entsprechend dem zu erwartenden Molekulargewicht, wenn die Proben mit βMercaptoethanol reduziert wurden (Abbildung 13  a). Wenn die Proben unter nichtreduzierenden Bedingungen vorbereitet wurden, war nur bei den scFv-Konstrukten PhOx-Yol und scPhOx ein definierte 30 kDa-Bande erkennbar. Die scFv-Konstrukte scBW431/26 und BW431/26-Yol zeigten dagegen schwache verschmierte Banden im Bereich von 20 bis 30 kDa (Abbildung 13 b).

4.1.3 Konstruktion von scFv-hFc-Fusionsproteinen aus den scFv-Fragmenten scBW431/26 und scPhOx

Die funktionelle Expression nichtbakterieller Proteine in E. coli hängt von vielen Faktoren ab und ist nicht immer erfolgreich durchführbar. Deshalb wurde auf ein Expressionssystem ausgewichen, das auf der sekretorischen Expression in der humanen embryonalen Nierenzellinie 293T beruhte. Die scFv-Fragmente wurden außerdem mit dem Fc-Teil (hinge-CH2-CH3) des humanen IgG1 (hFc) fusioniert. Dieser Ansatz ermöglichte die Expression und Analyse des gesamten extrazellulären Anteils der in dieser Arbeit erzeugten cIgTCR-Konstrukte, da der humane Fc-Teil in den Rezeptorkonstrukten als extrazelluläre Verbindungsdomäne zwischen scFv-Fragment und Signalkette zum Einsatz kam (Abbildung 20).

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Das Plasmid pCMX (Gao und Goldfarb, 1995) wurde für die Konstruktion und Expression der scFv-hFc-Fusionsproteine verwendet. Da die scFv-Fragmente keine eigene sekretorische Signalpeptidsequenz enthielten, wurden die scFv-Konstrukte N-terminal mit dem Signalpeptid der leichten IgGκ-Kette (Persic et al., 1997) fusioniert (Abbildung 15). Die Sequenzen für diese Signalpeptide (inkl. der Restriktionsschnittstellen) wurden mit zwei Oligonukleotiden erzeugt, die bei der PCR gleichzeitig als Template und Primer dienten (Abbildung 14). Es wurden zwei unterschiedliche Leader-Sequenzen erzeugt, die sich in der Fusionsschnittstelle zum scFv-Fragment unterschieden. Der Leader-A mit seiner ScaI-Schnittstelle erforderte die blunt-end-Klonierung der scFv-Genkonstrukte aus dem pOPE51-Plasmid und deshalb die Entfernung des 5’-Überhanges der 5’-terminalen NcoI-Schnittstelle der scFv-Konstrukte. Der Leader-C enthielt dagegen eine NcoI-Schnittstelle und ermöglichte die direkte Klonierung der scFv-Genkonstrukte aus dem pOPE51-Plasmid. Dadurch wurde jedoch zwischen dem Signalpeptid und dem scFv-Fragment ein zusätzlicher Methioninrest eingefügt, der N-terminal am scFv-Fragment nach dem Abspalten des Signalpeptids durch die Signalpeptidase erhalten bleibt (HUSAR, SignalSeq, http://genome.dkfz-heidelberg.de/).

Abbildung 15 – Signalpeptidsequenzen für die scFv-hFc- und cIgTCR-Konstrukte
Leader-A und Leader-C wurden aus dem Signalpeptid der humanen IgGκ-Kette abgeleitet. Sie unterschieden sich nur in der Klonierungsstelle für das scFv-Fragment. Der Leader-A erfordert aufgrund seiner ScaI-Schnittstelle die blunt-end-Klonierung der scFv-Fragmente. Der Leader-C läßt dagegen eine direkte Klonierung der scFv-Fragmente aus dem pOP51-Plasmid über die NcoI-Schnittstelle zu, erzeugt aber ein zusätzliches Methionin, das nach Abspaltung des Signalpeptides am N-Terminus der scFv-Fragmente erhalten bleibt.

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Die mit dem sekretorischen Signalpeptid ausgestatteten scFv-Fragmente scBW431/26 und scPhOx (VL / Linker-218 / VH) wurden an ihrem C-Terminus mit dem humanen Fc-Teil fusioniert. Die resultierenden scFv-hFc-Fusionskonstrukte wurden mit scBW431/26-hFc und scPhOx-hFc bezeichnet (Schema siehe Abbildung 20 a).

4.1.4 Expression und Analyse der Bindungseigenschaften der scFv-hFc-Fusionsproteine scBW431/26-hFc und scPhOx-hFc

Die 293T-Zellen lassen sich sehr effizient mittels der Kalziumphosphatmethode transfizieren. Die Transfektionseffizienz hing entscheidend von der Qualität des 2xHeBSP-Puffers ab. Der optimale pH-Wert des Puffers lag entgegen vieler Standardprotokolle bei pH 6,97 ± 0,02.

Die scFv-hFc-Genkonstrukte wurden in die 293T-Zellen transfiziert und die Kulturüberstände mittels Immunodotblot auf die Expression der scFv-hFc-Proteine untersucht. In den Überständen wurden bis zu 40 µg/mL scFv-hFc-Protein nachgewiesen (Abbildung 16). Die hohe Konzentration an scFv-hFc-Protein in den Kulturüberständen der transfizierten 293T-Zellen ermöglichte die direkte Untersuchung der Antigenbindungseigenschaften des scFv-hFc-Proteins durch ELISA oder FACS-Analyse. Eine Verkleinerung der Ansätze auf 6well-Gewebekulturplatten mit einem Kulturvolumen von 3 – 5 mL je Ansatz war für die meisten Analysen ausreichend. Die 293T-Zellen ließen sich sogar mit Plasmid-DNA aus Mini-Präparationen transfizieren, so daß im Anschluß an die Klonierung viele Klone auf die Expression und Bindungseigenschaften ihrer scFv-hFc-Konstrukte getestet werden konnten.

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Abbildung 16 – Die scFv-hFc-Konstrukte konnten in den 293T-Zellen sekretorisch exprimiert werden.Im oberen Teil des Dotblots wurden jeweils 10 µL der Zellkulturüberstände von 293T-Zellen, die mit den scFv-hFc-Genkonstrukten scBW431/26-hFc (1, 2, 3), scPhOx-hFc (4, 5, 6) oder scHuM195-hFc (7, 8) transfiziert waren, als Duplikate aufgetragen. Als Negativ-kontrolle wurde Medium verwendet. Im unteren Teil des Dotblots wurden Duplikate eines humanen IgG-Proteinstandards aufgetragen.

Im Gegensatz zur bakteriellen Expression des scFv-Fragments scBW431/26 konnte das scFv-hFc-Protein scBW431/26-hFc in den 293T-Zellen exprimiert werden. Im ELISA wurde unabhängig davon, ob der Leader-A oder der Leader-C in dem scBW431/26-hFc-Konstrukt verwendet wurde, eine vergleichbare und spezifische Bindung gegenüber CEA nachgewiesen (Abbildung 17 a). Das scBW431/26-hFc-Fusionsprotein wurde auch zur FACS-Analyse von CEA+ Tumorzellinien eingesetzt (siehe Abschnitt 4.2.2).

Das auf dem PhOx-spezifischen scFv-Fragment scPhOx basierende scFv-hFc-Konstrukt scPhOx-hFc wurde ebenfalls unabhängig von dem verwendeten Signalpeptid sekretorisch in den 293T-Zellen exprimiert und zeigte eine spezifische Antigenbindung gegenüber PhOx-BSA im ELISA (Abbildung 17 b). Das scPhOx-hFc-Fusionsprotein wurde außerdem zur FACS-Analyse phOx-markierter Zellinien und als Negativkontrolle für die anderen scFv-hFc-Proteine eingesetzt (siehe Abschnitt 4.2).

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Auf die Konstruktion von scFv-hFc-Fusionsproteine aus den scFv-Fragmenten BW431/26-Yol und PhOx-Yol wurde verzichtet, da eine spezifische Antigenbindung für die scFv-hFc-Proteine scBW431/26-hFc und scPhOx-hFc nachgewiesen worden war.

Abbildung 17 – Die scFv-hFc-Fusionsproteine scBW431/26-Fc und scPhOx-hFc zeigten eine spezifische Bindung an ihre Antigene.
Die Kulturüberstände der 293T-Zellen, die mit den Genkonstrukten für die scFv-hFc-Proteine scBW431/26-hFc (a) oder scPhOx-hFc (b) transfiziert worden waren, wurden im ELISA auf die Bindung an CEA (a) bzw. PhOx-BSA (b) getestet. Ansätze mit BSA als Antigen wurden als Negativkontrolle parallel in allen Versuchen durchgeführt. Kulturüberstände mock-transfizierter 293T-Zellen wurden als Kontrolle angegeben. Die scFv-hFc-Klone, die den Leader-A als Signalpeptid enthielten, wurden mit Ax bezeichnet, Klone mit dem Leader-C wurden mit Cx bezeichnet.

4.1.5 Konstruktion und Expression des scFv-hFc-Fusionsproteins scHuM195-hFc

Aufgrund der vorangegangenen Ergebnisse wurde die Konstruktion des scFv-Fragments aus den V-Regionen des humanisierten CD33-spezifischen Antikörpers HuM195 nicht mehr im bakteriellen Expressionsvektor pOPE51 durchgeführt. Das scFv-Fragment scHuM195 wurde analog zu den scFv-Fragmenten scBW431/26 und scPhOx mit der Konfiguration VL / Linker218 / VH erzeugt und mit dem Signalpeptid Leader-C und dem humanen Fc-Teil im Plasmid pCMX fusioniert (Schema siehe Abbildung 20 a). Das resultierende scFvhFc-Konstrukt wurde mit scHuM195-hFc bezeichnet. Das scHuM195-hFc-Protein konnte ohne Veränderungen oder Optimierungen am Expressionssystem erfolgreich in der Zellinie 293T sekretorisch exprimiert werden. Da kein CD33-Protein für ein ELISA zur Verfügung stand, wurde das scHuM195-hFc-Protein durch FACS-Analysen von CD33+-Leukämiezellinien getestet (siehe Abschnitt 4.2.3). Mit dieser Herangehensweise konnte die Konstruktion, Expression und Analyse des scFv-hFc-Konstruktes scHuM195-hFc innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden.

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Die scFv-hFc-Fusionsproteine scBW431/26-hFc, scPhOx und scHuM195-hFc waren in proteinhaltigen Medien (DMEM / 10% FCS, AIM-V, Xvivo-15) unter sterilen Bedingungen oder nach Zugabe von 0,01% NaN3 bei 4°C über Monate stabil und konnten in diesem Zeitraum für Immunfärbungen und andere Experimente eingesetzt werden.

4.1.6 Isolation der CD3 ζ-Kette

Die ζ-Untereinheit des CD3-Komplexes wurde aus der Gesamt-cDNA aktivierter PBL zweier nicht miteinander verwandter Probanden isoliert. Die Sequenzierung der CD3 ζ-cDNA ergab in beiden Fällen eine Basentransition (GA GC CC ♢ GA CG CC) im Vergleich zur ursprünglich publizierten Sequenz der CD3 ζ-Kette (genbank:g623041, Quelle: T-Zellinie Jurkat,Weissman et al., 1988). Die resultierende veränderte Aminosäuresequenz an Position 59 (E→D) und 60 (P→G) liegt außerhalb der für die Signaleigenschaften wichtigen ITAM-Sequenzmotive (Abbildung 19). Fünf von zehn cDNA-Klonen eines Probanden enthielten ein zusätzliches Glutaminkodon an Position 101 (Q101). Anfänglich wurden unterschiedliche Allele vermutet. An dieser Stelle befindet sich jedoch der Spleißort für die η-Kette, so daß die Q101-Form wahrscheinlich eine Spleißvariante (Isoform) der CD3 ζ-Kette ist. Das zusätzliche Q101 scheint eine mangelhafte Phospholipase-C-Aktivierung zu bewirken (Atkinson et al., 2003) und wurde deshalb nicht für die cIgTCR-Konstruktion verwendet.

Abbildung 18 – Die Isolation der CD3 ζ-Signalkette erfolgte mit einer verschachteltenPCR.Die cDNA der humanen CD3 ζ-Kette (a) wurde aus der Gesamt-cDNA aktivierter PBL voramplifiziert (Spur 1 - 25 Zyklen, Spur 2 - 30 Zyklen). Der zur Spur 1 gehörende PCR-Ansatz wurde 1:10 verdünnt und zur Amplifikation der Transmembrandomäne und des zytoplasmatischen Teils der CD3 ζ-Kette (b) eingesetzt (Spur 3 - 16 Zyklen, Spur 4 - 21 Zyklen).

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Abbildung 19 – Aminosäuresequenz der humanen CD3 ζ-Kette
Der für die cIgTCR-Konstrukte verwendete Anteil der CD3 ζ-Kette (AS 28 – 163, fett) umfaßte die Transmembrandomäne, inkl. der flankierenden positiv geladenen Aminosäuren und den gesamten zytoplasmatischen Anteil mit den drei ITAMs (a, b, c). Die ITAMs sind paarige Tyr-Phosphorylierungsmotive ( YxxL ) und rekrutieren je nach Phosphorylierungszustand zytoplasmatische Signal- und Adaptermoleküle, wie Syk und ZAP70. Unterschiede zur ursprünglich publizierten Sequenz (genbank) wurden angegeben. Die Q101-Isoform wurde nicht verwendet (siehe Text).

Eine mehrtägige Aktivierung der PBL mit PHA war vor der RNA-Isolation notwendig, da sich nur sehr geringe Mengen an mRNA aus ruhenden PBL isolieren ließen. Die Amplifikation der CD3 ζ-Kette aus der Gesamt-cDNA mit Primern, die zusätzliche 5‘-Sequenzen für Restriktionsschnittstellen enthielten, scheiterte. Deshalb wurde zuerst die gesamte cDNA der CD3 ζ-Kette mit einem „äußeren“ Primerpaar, das keine zusätzlichen 5’-Sequenzen enthielt, voramplifiziert. Mit einer zweiten PCR und „inneren“ Primern konnte das cDNA-Fragment für die Transmembrandomäne und den zytoplasmatischen Teil der CD3 ζ-Kette inklusive der Restriktionsschnittstellen isoliert werden (Abbildung 18).

4.1.7 Konstruktion der chimären Immunglobulin-T-Zellrezeptoren

Die cIgTCR-Genkonstrukte wurden erzeugt, indem die scFv-hFc-Konstrukte mit der CD3 ζ-Kette fusioniert wurden (Schema siehe Abbildung 20 b). Die Klonierung erfolgte im Expressionsvektor pCDNA3. Die cIgTCR-Konstrukte wurden entsprechend ihrer extrazellulären scFv-hFc-Anteile, die die Bindungseigenschaften dieser Rezeptoren definierten, mit scBW431/26-hFc, scHuM195-hFc und scPhOx-hFc bezeichnet. Damit standen zwei tumorspezifische cIgTCR-Genkonstrukte und ein Kontrollkonstrukt für die Genmodifikation der humanen NK-Zellinie YT zur Verfügung. Das sekretorische IgGκ-Signalpeptid der scFvhFc-Konstrukte wurde in den cIgTCR-Konstrukten weiterverwendet und ermöglichte deren Plasmamembranexpression.

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Abbildung 20 – Schemata der scFv-hFc- und der cIgTCR-Genkonstrukte
Die scFv-hFc-Fusionsproteine (a) wurden aus den scFv-Fragmenten scBW431/26, scHuM195 oder scPhOx (VL / Linker218 / VH) und dem Fc-Teil (hinge-CH2-CH3) des humanen IgG1 (hFc) konstruiert. Die cIgTCR-Konstrukte (b) wurden durch Fusion der scFv-hFc-Proteine mit der Transmembrandomäne (TM) und dem zytoplasmatischen Teil der humanen CD3 ζ-Kette konstruiert. Das Signalpeptid der humanen IgGκ-Kette (* Leader A ** Leader C) wurde sowohl für die sekretorische Expression der scFv-hFc-Proteine als auch für die Plasmamembranexpression der cIgTCRs benötigt. Die Plasmidkarten für pCMX und pCDNA3 sind im Anhang angegeben.

Die Expression der cIgTCR-Genkonstrukte wurde durch Transfektion der Zellinie 293T getestet (Abbildung 21). Der humane Fc-Teil der cIgTCR-„Spacer“-Domäne wurde auf einem großen Teil der transfizierten 293T-Zellen durch extrazelluläre FACS-Färbung nachgewiesen. Zusammen mit dem Nachweis der humanen CD3 ζ-Kette durch eine intrazelluläre Immunfärbung wurde die korrekte Lokalisation der cIgTCR-Konstrukte in der Plasmamembran bestätigt. Der geringere Anteil an gefärbten Zellen bei der intrazellulären FACS-Analyse wurde vermutlich durch die schlechtere Effizienz intrazellulärer Immunfärbungen verursacht.

Abbildung 21 – Die cIgTCR-Konstrukte wurden nach Transfektion auf Oberfläche der 293T-Zellen exprimiert.
Die Expression der cIgTCR-Konstrukte scBW431/26-hFcζ und scPhOx-hFcζ wurde durch Transfektion von 293T-Zellen getestet. Die extrazelluläre Färbung der humanen Fc-„Spacer“-Domäne der cIgTCR-Konstrukte wurde mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragment (linke Spalte, gefüllt) durchgeführt. Als Kontrolle wurde die Färbung mit einem Ziege-anti-Maus-IgG-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragment angegeben (linke Spalte, hellgrau, leer). Der intrazelluläre Anteil der cIgTCR-Konstrukte wurde mit dem Antikörper 1D4, der spezifisch für die humane CD3 ζ-Signalkette ist, nachgewiesen (rechte Spalte, gefüllt). Färbungen mock-transfizierter 293T-Zellen wurden als Negativkontrollen angegeben (grau, leer).

4.2 Antigenexpression auf den Tumorzellinien

4.2.1 Färbung PhOx-markierter Zellinien durch das scPhOx-hFc-Protein

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Für das scPhOx-hFc-Protein wurde eine spezifische Bindung an PhOx-BSA im ELISA nachgewiesen (Abschnitt 4.1.4). Da das Hapten PhOx auf Zellen nicht natürlich vorkommt, konnte das scPhOx-hFc-Protein als Negativkontrolle für die Immunfärbungen mit den scFv-hFc-Proteinen scBW431/26-hFc und scHuM195-hFc eingesetzt werden. Eine spezifische Färbung durch das scPhOx-hFc-Protein wurde nur gegenüber Zellinien erreicht, wenn deren Zelloberfläche künstlich mit dem Hapten PhOx markiert worden war (Abbildung 22).

Abbildung 22 – Das scPhOx-hFc-Protein färbte spezifisch PhOx-markierte Zellen.
Das scPhOx-hFc-Protein wurde zur Färbung von PhOx-markierten Zellen (gefüllt) und unbehandelten Zellen (leer) der ALL-Zellinie Reh eingesetzt.

4.2.2 FACS-Analyse von Tumorzellinien mit dem scBW431/26-hFc-Protein

Das CEA-spezifische scBW431/26-hFc-Protein wurde zur Analyse der CEA-Expression auf verschiedenen Tumorzellinien verwendet. Zum Vergleich wurde der CEA-spezifische monoklonale Antikörper CEJ065 eingesetzt.

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Die FACS-Analyse der CEA-transgenen Maus-Kolonkarzinomzellinie MC32A ergab vergleichbare Ergebnisse unabhängig davon, ob die Färbungen mit dem scBW431/26-hFc-Protein oder dem Antikörper CEJ065 durchgeführt wurden (Abbildung 23). Die Intensität der Färbungen mit dem scBW431/26-hFc-Protein könnte sogar als geringfügig intensiver eingeschätzt werden. Das scBW431/26-hFc-Protein zeigte mit dem Leader-A oder dem Leader-C als Signalpeptid identische Ergebnisse bei den Immunfärbungen. Aus der MC32A-Zellinie wurden Klone mit unterschiedlicher CEA-Expression durch „limited-dilution“-Klonierung isoliert. Der MC32A-Klon 6 zeigte eine höhere CEA-Expression als der MC32A-Klon 10. Die CEA- Zellinie MC38 wurde weder durch das scBW431/26-hFc-Protein noch durch den Antikörper CEJ065 gefärbt. Diese FACS-Analysen bestätigten erneut die CEA-Spezifität des scBW431/26-hFc-Proteins aus dem ELISA.

Abbildung 23 – Das scBW431/26-hFc-Protein und der Antikörper CEJ065 färbten spezifisch die CEA-transfizierte Zellinie MC32A.
Die Maus-Kolonkarzinomzellinie MC38 und die aus ihr abgeleiteten CEA-transfizierten MC32A-Klone 6 und 10 wurden mit dem scBW431/26-hFc-Protein (mit Leader A - linke Spalte; mit Leader C - mittlere Spalte) oder mit dem Antikörper CEJ065 (rechte Spalte) gefärbt (gefüllt). Als Negativkontrolle für das scBW431/26-hFc-Protein wurde das scPhOx-hFc-Protein mit entsprechenden Leader-Sequenzen (linke und mittlere Spalte: grau, leer) und das CD33-spezifische scHuM195-hFc-Protein (mittlere Spalte: hellgrau, leer) eingesetzt. Für den Antikörper CEJ065 wurde die Isotypenkontrolle angegeben (rechte Spalte: grau, leer).

Die FACS-Analyse humaner Tumorzellinien wurden in Abbildung 24 zusammengefaßt. Bei den Färbungen humaner Tumorzellinien zeigten sich im Gegensatz zu den Untersuchungen mit den CEA-transfizierten MC32A-Zellen deutliche Unterschiede zwischen dem scBW431/26-hFc-Protein und dem Antikörper CEJ065.

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Abbildung 24 – Das scBW431/26-hFc-Protein zeigte gegenüber humanen Tumorzellinien eine andere Spezifität als der Antikörper CEJ065.
Die Kolonkarzinomzellinien HT29, LoVo, LS174T, SW403, SW480, SW948, SW1222 und SW1417, die Pankreaskarzinomzellinien Capan2 und Panc89 wurden mit dem scBW431/26-hFc-Protein oder dem monoklonalen Antikörper CEJ065 gefärbt (gefüllt). Als Negativkontrollen wurden Färbungen mit dem scPhOx-hFc-Protein für das scBW431/26-hFc-Protein und Färbungen mit einem Isotypenantikörper für den Antikörper CEJ065 angegeben (grau, leer).

Die humanen Kolonkarzinomzellinien LoVo, LS175T, SW948 und SW1222 wurden durch das scBW431/26-hFc-Protein gefärbt, wobei der Anteil der gefärbten Tumorzellen und die Fluoreszenzintensität in allen Versuchen deutlich geringer ausfielen verglichen mit den Färbungen, bei denen der Antikörper CEJ065 eingesetzt wurde. Die humanen Kolonkarzinomzellinien HT29, SW403 und SW1417 wurden durch den Antikörper CEJ065 gefärbt, während das scBW431/26-hFc-Protein diese Zellinien nur geringfügig oder gar nicht färbte. Die humane Kolonkarzinomzellinie SW480 wurde weder durch das scBW431/26-hFc-Protein noch durch den Antikörper CEJ065 gefärbt.

Eine CEA-Expression wurde auch für andere Adenokarzinome, z. B. der Bauchspeicheldrüse, beschrieben. Deshalb wurden die Pankreaskarzinomzellinien Capan2 und Panc89 untersucht. Die Zellinie Panc89 wurde geringfügig durch den Antikörper CEJ065 jedoch nicht durch das scBW431/26-hFc-Protein gefärbt. Die Zellinie Capan2 wurde weder durch das scBW431/26-hFc-Protein noch durch den Antikörper CEJ065 gefärbt.

4.2.3 FACS-Analyse von myeloischen Leukämiezellinien mit dem scHuM195-hFc-Protein

↓85

Die Bindungseigenschaften des scHuM195-hFc-Konstruktes konnten nicht mittels ELISA getestet werden, da kein CD33-Protein zur Verfügung stand. Deshalb mußte die FACS-Analyse CD33+ myeloischer Leukämiezellinien Aufschluß über Bindungsspezifität des scHuM195-hFc-Proteins geben (Abbildung 25). Zum Vergleich wurde der CD33-spezifische monoklonale Antikörper WM54 eingesetzt. Die humane AML-Zellinie KG1 und die humane promyeloische Leukämiezellinie HL60 wurden durch das scHuM195-hFc-Protein und den Antikörper WM54 mit vergleichbarer Intensität gefärbt. CD33- Leukämiezellinien, z. B. Raji oder K562 wurden durch das scHuM195-hFc-Protein und den Antikörper WM54 nicht gefärbt (Daten nicht gezeigt). Keine dieser Leukämiezellinien wurde durch das PhOx-spezifische scPhOx-hFc-Protein gefärbt.

Die promyeloische Leukämiezellinie HL60 kann durch Zugabe von DMSO zur Differenzierung stimuliert werden und granulozytäre Eigenschaften entwickeln. Die CD33-Expression wurde durch die DMSO-induzierte Differenzierung nicht beeinflußt. Es wurde außerdem keine Veränderung der Expression der MHC-Klasse-Ia-Moleküle (HLA-A/B/C) und der kostimulatorischen Moleküle B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86) beobachtet (Daten nicht gezeigt). Die HL60-Zellen regulierten nach DMSO-Stimulation das Integrin CD11c hoch (Abbildung 26).

Abbildung 25 – Das scHuM195-hFc-Protein färbte spezifisch myeloische Leukämiezellinien.
Die myeloischen Leukämiezellinien KG1 und HL60 wurden mit dem scHuM195-hFc-Protein (linke Spalte) und dem CD33-spezifischen Antikörper WM54 (rechte Spalte) gefärbt (gefüllt). Außerdem wurden HL60-Zellen gefärbt, deren Differenzierung mit DMSO angeregt worden war. Als Negativkontrollen für das scHuM195-hFc-Protein wurden Färbungen mit dem scPhOx-hFc-Protein (linke Spalte: grau, leer) und dem scBW431/26-hFc-Protein (linke Spalte: hellgrau, leer) durchgeführt. Für den Antikörper WM54 wurde die Isotypenkontrolle (rechte Spalte: grau leer) angegeben.

↓86

Abbildung 26 – Die HL60-Zellen regulierten nach Stimulation mit DMSO das Integrin CD11c hoch.
HL60-Zellen wurden vor und nach einwöchiger DMSO-Stimulation mit einem CD11c-spezifischen Antikörper gefärbt (gefüllt). Die Isotypenkontrolle wurde angegeben (grau, leer).

4.3 Gentransfer der cIgTCR-Konstrukte in die humane NK-Zellinie YT

4.3.1 Elektroporation der YT-Zellen mit den cIgTCR-Genkonstrukten

Die YT-Zellen wurden erfolgreich mit den cIgTCR-Genkonstrukten durch Elektroporation transfiziert. Die höchste Transfektionsrate, entsprechend dem günstigsten Verhältnis zwischen überlebenden und transfizierten YT-Zellen, ergab sich bei 250 V und einer Kapazität von 975 µF. Die transienten Transfektionsraten lagen 48 h nach Elektroporation bei 1 – 2% (Abbildung 27 a) und einem Anteil vitaler Zellen von 40 – 60%. Eine Linearisierung der Plasmide (z. B. mit dem Restriktionsenzym ScaI im Ampicillin-Resistenzgen der Plasmide) wirkte sich nicht vorteilhaft für eine stabile Transfektion der YT-Zellen aus, da die Transfektionseffizienz gegenüber zirkulären Plasmiden deutlich vermindert war (Daten nicht gezeigt). In den weiteren Versuchen wurde deshalb auf eine Linearisierung der Plasmide verzichtet. Nach zwei Wochen Selektion mit 500 µg/mL G418 exprimierten 1 – 10% der YT-Zellen die cIgTCR-Konstrukte auf ihrer Oberfläche (Abbildung 27 b).

4.3.2 Immunologische Anreicherung der cIgTCR+ YT-Zellen

Die cIgTCR+ YT-Zellen konnten nach Transfektion und Selektion mit immunologischen Zellseparationsverfahren angereichert werden. Die Verwendung von biotinyliertem Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-F(ab‘)2-Fragment und magnetisch-gelabeltem Streptavidin zur Markierung der cIgTCR+ YT-Zellen führte bei der magnetischen Zellsortierung mit dem MACS®-System zu einer guten Anreicherung. Trotzdem waren einen Tag später nur noch wenige lebende cIgTCR+ YT-Zellen nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Dieser Effekt konnte durch die Verwendung eines FITC-gekoppelten Ziege-anti-human-IgG-Fcγ-F(ab‘)2-Fragments und eines magnetisch-gelabelten FITC-spezifischen Zweitantikörpers vermieden werden (Abbildung 27 c). Bei der durchflußzytometrischen Zellsortierung wurden die cIgTCR-transfizierten YT-Zellen mit dem FITC-konjugierten Anti-human-IgG-Fcγ-F(ab‘)2-Fragment gefärbt. Die durchflußzytometrische Zelltrennung war jedoch mit einem erheblich höheren Zeitaufwand und Streß für die Zellen als bei dem MACS®-Verfahren verbunden. Die cIgTCR+ YT-Zellen wurden nach zwei Wochen erneut angereichert.

↓87

Nach zweimaliger Anreicherung exprimierten mindestens 90% der transfizierten YT-Zellen das cIgTCR-Konstrukt auf ihrer Oberfläche (Abbildung 28). Die cIgTCR-transfizierten YT-Zellen wurden auch durch den CD3 ζ-spezifischen Antikörper 1D4 intrazellulär intensiver gefärbt als die mock-transfizierten YT-Zellen (Abbildung 29). Nach mehrwöchiger Kultivierung der cIgTCR+ YT-Zellen wurde trotz selektiver Bedingungen (500 µg/mL G418) eine Abnahme der cIgTCR-Expression beobachtet (Daten nicht gezeigt), die durch eine erneute Zellseparation korrigiert werden konnte.

Abbildung 27 – Der Gentransfer der cIgTCR-Konstrukte in die YT-Zellen erfolgte durch Elektroporation, Selektion und immunologische Anreicherung.
Die Abbildung zeigt die Expression des cIgTCR-Konstruktes scHuM195-hFcζ auf den YT-Zellen 48 h nach Elektroporation (a) und nach zweiwöchiger Selektion mit G418 (b). Außerdem wurde die erste immunologische Anreicherung der scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen durch MACS® (c) und die zweite Anreicherung mit einem Hochleistungs-FACS-Sorter (c) dargestellt. Die Färbungen vor (grau, leer) und nach (gefüllt) der Zellseparation wurden angegeben. Die FACS-Analysen wurden mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-human-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragment durchgeführt.

Abbildung 28 – Über 90% der cIgTCR-transfizierten YT-Zellen exprimierten nach zweifacher immunologischer Anreicherung ihr cIgTCR-Konstrukt auf der Oberfläche.
Nach zweifacher immunologischer Anreicherung wurden die cIgTCR-Konstrukte scPhOx-hFcζ, scBW431/26-hFcζ und scHuM195-hFcζ auf den cIgTCR-transfizierten YT-Zellen durch Färbung mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-human-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragment untersucht (gefüllt). Als Negativkontrolle wurde die Färbung mock-transfizierter YT-Zellen angegeben (leer).

↓88

Abbildung 29– Die Expression der CD3 ζ-Kette war in den cIgTCR+ YT-Zellen erhöht.
Die CD3 ζ-Kette wurde durch intrazelluläre Färbung von mock-transfizierten YT-Zellen, scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen und scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen mit dem Antikörper 1D4 analysiert (gefüllt). Die mock-Kontrolle zeigt die endogene Expression der ζ-Kette der YT-Zellen. Die Isotypenkontrollen wurden angegeben (leer).

4.4 Zytotoxizitätsstudien mit den cIgTCR+ YT-Zellen

4.4.1 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen

Das Ziel des Gentransfers tumorspezifischer cIgTCR-Genkonstrukte in die NK-Zellinie YT war die spezifische Lyse von Tumorzellen zu erreichen. Deshalb wurden die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen, die mit dem CEA-spezifischen cIgTCR-Konstrukt transfiziert waren, auf ihre Zytotoxizität gegenüber Tumorzellinien getestet, deren CEA-Expression mit dem scBW431/26-hFc-Protein untersucht worden war (siehe Abschnitt 4.2.2).

Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen erzielten eine Lyse von bis zu 50% gegenüber der CEA-transfizierten Tumorzellinie MC32A (Abbildung 30). Die Lyseaktivität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen war auch bei einem kleinen E : T-Verhältnis von 1,6 : 1 sehr effizient und betrug noch bis zu 40%. Bei E : T-Verhältnissen > 12,5 : 1 wurde in den meisten Versuchen keine weitere Zunahme der Lyse beobachtet. Die durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen vermittelte Zytotoxizität war von der Höhe der CEA-Expression auf den MC32A-Zellen abhängig. Der MC32A-Klon 6 mit einer hohen CEA-Expression wurde bei einem E : T-Verhältnis von 12,5 : 1 zu 50% durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen lysiert, während der MC32A-Klon 10, der geringe bis mittlere CEA-Level exprimierte, bei diesem E : T-Verhältnis zu 40% lysiert wurde (Abbildung 30 a, b). Die nichtklonierten MC32A-Zellen, die eine CEA- Subpopulation enthielten, wurden in Abhängigkeit vom Anteil CEA+ MC32A-Zellen von den scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen lysiert (Daten nicht gezeigt).

↓89

Die als Effektorzellkontrolle eingesetzten mock-transfizierten YT-Zellen und scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen wiesen keine Zytotoxizität gegenüber den CEA+ MC32A-Zellen auf. Die mit dem CD33-spezifischen cIgTCR-Konstrukt scHuM195-hFcζ transfizierten YT-Zellen zeigten ebenfalls keine Lyseaktivität gegenüber den CEA+ MC32A-Zellen. Die CEA- Urspungszellinie der MC32A-Zellen, die Zellinie MC38, wurde weder von den scBW431/36-hFcζ+ YT-Zellen noch von den verschiedenen Kontrolleffektorzellen lysiert.

Abbildung 30 – Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen vermittelten eine spezifische und effiziente Lyse der CEA-transfizierten Zellinie MC32A.
Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen (■) wurde mittels 6 h-51Cr-Freisetzungsassays gegenüber der Maus-Kolonkarzinomzellinie MC38 (c) und den aus ihr abgeleiteten CEA-transfizierten MC32A-Zellklonen, Klon 6 (a) und Klon 10 (b), untersucht. Bei den Kontrollansätzen wurden mock-transfizierte YT-Zellen (○), PhOx-spezifische scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen (Δ) und CD33-spezifische scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen (◊) als Effektorzellen eingesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben.

Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen zeigten gegenüber den humanen Kolonkarzinom-zellinien LoVo, LS174T, SW948 und SW1222 eine spezifische Zunahme der Zytotoxizität (Abbildung 31) verglichen mit den mock-transfizierten YT-Zellen und den scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen. 10 – 15% der Zellen dieser Kolonkarzinomzellinien wurden durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen lysiert. Die Lyse dieser humanen Tumorzellinien durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen lag in der Größenordnung des Anteils der Zellen, die bei den FACS-Analysen durch das scBW431/26-hFc-Protein gefärbt worden waren (siehe Abschnitt 4.2.2).

↓90

Abbildung 31 – Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen lysierten spezifisch humane Kolonkarzinomzellinien, die durch das scBW431/26-hFc-Protein gefärbt werden konnten.
Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen (■) wurden mit 6 h-51Cr-Freisetzungsassays auf ihre Zytotoxizität gegenüber den humanen Kolonkarzinomzellinien LoVo (a), LS174T (b), SW948 (c) und SW1222 (d) untersucht. Mock-transfizierte YT-Zellen (○) und scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen (Δ) wurden als Kontrolleffektorzellen in parallel durchgeführten Ansätzen eingesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben.

Abbildung 32 - Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen zeigten keine Zytotoxizität gegenüber humanen Tumorzellinien, die nicht mit dem scBW431/26-hFc-Protein gefärbt werden konnten.
Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen (■) wurden in 6 h-51Cr-Freisetzungsassays gegenüber den humanen Kolonkarzinomzellinien SW403 (a), SW480 (b), SW1417 (c), HT29 (d) und der humanen Pankreaskarzinomzellinien Capan2* (f) und Panc89 (g) untersucht. Mock-transfizierte YT-Zellen (○) und scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen (Δ) wurden in parallelen Ansätzen als Kontrolleffektorzellen eingesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben (*nur 4 h-51Cr-Freisetzungsassay).

Gegenüber den humanen Kolonkarzinomzellinien SW403, SW480, SW1417 und HT29 konnte keine oder nur eine geringe Zytotoxizität durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 32 a – d). Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen korrelierte auch bei diesen humanen Kolonkarzinomzellinien mit den Ergebnissen der FACS-Analysen, bei denen das scBW431/26-hFc-Protein zur Färbung der Tumorzellen eingesetzt worden war (siehe Abschnitt 4.2.2). Gegenüber den Zellinien SW403, SW1417 und HT29 wurde eine Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen von maximal 2 – 4% ermittelt. Gegenüber der Zellinie SW480 wurde keine Lyse durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen festgestellt. In den parallel durchgeführten Kontrollansätzen, in denen die mock-transfizierten YT-Zellen und die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen als Effektorzellen eingesetzt wurden, konnte gegenüber allen untersuchten humanen Kolonkarzinomzellinien keine Zytotoxizität nachgewiesen werden.

↓91

Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde auch gegenüber den humanen Pankreaskarzinomzellinien Capan2 und Panc89 getestet, die in den FACS-Analysen nicht durch das scBW431/26-hFc-Protein gefärbt worden waren (siehe Abschnitt 4.2.2). Beide Tumorzellinien wurden weder durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen noch durch die mock- und scPhOx-hFcζ-transfizierten YT-Zellen lysiert (Abbildung 32 e, f).

4.4.2 Zytotoxizität der scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen

Die mit dem CD33-spezifischen cIgTCR-Genkonstrukt transfizierten scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen vermittelten gegenüber der CD33+ AML-Zellinie KG1 eine Lyse von bis zu 15% (Abbildung 33 a). Die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen zeigten dagegen nur eine sehr geringe Lyse von 3% gegenüber der promyeloischen Leukämiezellinie HL60 (Abbildung 33 b), obwohl die HL60-Zellen wie die KG1-Zellen eine hohe CD33-Expression aufwiesen, die durch Färbung mit dem scHuM195-hFc-Protein ermittelt wurde (siehe 4.2.3). Trotzdem war ein geringfügiger Anstieg der Lyse verglichen mit den parallel durchgeführten Kontrollansätzen zu beobachten, bei denen mock-transfizierte YT-Zellen und scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen als Effektorzellen eingesetzt wurden. Diese Effektorzellkontrollen zeigten keine Zytotoxizität gegenüber den untersuchten myeloischen Leukämiezellinien. Nach Stimulation der HL60-Zellen mit DMSO zur Differenzierung granulozytärer Eigenschaften konnte eine leichte Erhöhung der Lyse durch die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen nachgewiesen werden, die sich jedoch mit zunehmenden E : T-Verhältnissen nicht deutlicher manifestierte. Die mock-transfizierten YT-Zellen und scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen vermittelten auch gegenüber den DMSO-stimulierten HL60-Zellen keine Lyse (Abbildung 33 c).

Abbildung 33 – Die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen vermittelten eine spezifische, aber geringe Zytotoxizität gegenüber CD33+ Leukämiezellinien.
Die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen (■) wurden in 6 h-51Cr-Freisetzungsassays auf ihre Zytotoxizität gegenüber den CD33+ Leukämiezellinien KG1 (a) und HL60 (b) untersucht. Außerdem wurden HL60-Zellen getestet, deren Differenzierung mit DMSO stimuliert worden war (c). Parallel wurden Ansätze mitgeführt, in denen mock-transfizierte YT-Zellen (○) oder scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen (Δ) als Effektorzellen eingesetzt wurden. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben.

4.4.3 Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen

↓92

In den vorangegangenen Zytotoxizitätsstudien wurden die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen, die mit dem PhOx-spezifischen cIgTCR-Konstrukt transfiziert waren, als Kontrolleffektorzellen eingesetzt. Um die Funktion des cIgTCR-Konstruktes scPhOx-hFcζ in diesen genmodifizierten YT-Zellen zu überprüfen, wurde eine Targetzellinie mit dem Hapten PhOx künstlich markiert, da dieses Hapten auf Zellen nicht natürlich vorkommt. Es konnte gezeigt werden, daß die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen spezifisch die PhOx-markierten Zellen der ALL-Zellinie Reh lysierten, während keine Zytotoxizität gegenüber den unbehandelten Zielzellen beobachtet wurde (Abbildung 34). Im Gegensatz zu den scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen vermittelten die CEA-spezifischen scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen keine Lyse gegenüber den PhOx-markierten Zielzellen. Bei diesen Versuchen wurde ein nichtradioaktiver durchflußzytometrischer Zytotoxizitätsassay eingesetzt.

Abbildung 34 – Die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen lysierten spezifisch PhOx-markierte Zellen.
Die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen wurden mit einem durchflußzytometrischen Zytotoxizitätsassay gegenüber PhOx-markierten (■) und unbehandelten (□) Zellen der ALL-Zellinie Reh auf ihre Zytotoxizität untersucht. Zum Vergleich wurden die CEA-spezifischen scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber PhOx-gelabelten Reh-Zellen (○) getestet. Die Targetzellyse wurde mit den Standardabweichungen angegeben.

4.4.4 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen in Gegenwart von gelöstem CEA-Protein

Abbildung 35 – Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde nicht durch gelöstes CEA-Protein gehemmt.
Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde in Gegenwart von 0,1 µg/mL (◊), 1 µg/mL (Δ) und 10 µg/mL (○) gelöstem CEA-Protein im Medium gegenüber der CEA+ Zellinie MC32A in einem 6 h-51Cr-Freisetzungsassay untersucht. Bei der Kontrolle (breite Linie, ■) wurde dem Medium kein CEA-Protein zugesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den Standard-abweichungen angegeben.

↓93

Die Bindungsdomänen von Antikörpern und Antigenrezeptoren können durch gelöstes Antigen blockiert werden. Deshalb konnte auch die Zytotoxizität der cIgTCR-transfizierten YT-Zellen in Gegenwart von freiem Antigen im Medium gehemmt werden. Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurden auf ihre Zytotoxizität gegenüber CEA+ Tumorzellen in Gegenwart von gelöstem CEA untersucht, da CEA häufig im Serum von Kolonkarzinompatienten in Konzentrationen von 1 µg/mL nachgewiesen wird. Eine Blockierung der Lyseeigenschaften der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen hätte deshalb eine besondere Relevanz für die Behandlung von CEA+ Tumoren. Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber den CEA+ MC32A-Tumorzellen wurde nicht in Gegenwart von bis zu 10 µg/mL an gelöstem CEA-Protein inhibiert (Abbildung 35).

4.4.5 Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen in Gegenwart von gelöstem PhOx-BSA-Protein mit einzelnen oder multiplen PhOx-Gruppen

Der Einfluß von gelöstem Antigen auf die Zytotoxizität cIgTCR-transgener Effektorzellen könnte davon abhängen, ob die gelösten Antigenmoleküle über einzelne oder multiple Bindungsepitope für das cIgTCR-Konstrukt verfügen. Aus diesem Grund wurde BSA mit einem zweifachen und einem 20-fachen molaren Überschuß an PhOx markiert, um Antigenmoleküle mit einzelnen und multiplen Epitopen zu erhalten.

Während das (PhOx)20-BSA schon ab einer Konzentration von 1 µg/mL eine starke inhibitorische Wirkung auf die Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber PhOx-markierten Zielzellen ausübte, war noch keine Hemmung durch das (PhOx)2-BSA bei einer Konzentration von 100 µg/mL zu beobachten (Abbildung 36). Höhere Antigenkonzentrationen wurden nicht untersucht. Unbehandeltes BSA-Protein zeigte bei einer Konzentration von 100 µg/mL keinen Einfluß auf die Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen. Das gelöste (PhOx)20-BSA mit den multiplen PhOx-Gruppen hatte eine mindestens 100-fach stärkere inhibitorische Wirkung auf die Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen als das gelöste (PhOx)2-BSA. Nach Berücksichtigung der Anzahl PhOx-Gruppen auf den gelösten Antigenmolekülen war die inhibitorische Wirkung des gelösten (PhOx)20-BSA noch um den Faktor 10 größer als die des gelösten (PhOx)2-BSA.

↓94

Abbildung 36 – Gelöstes Antigen mit multiplen PhOx-Gruppen hemmte die Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen bei geringeren Konzentrationen als Antigen mit einzelnen PhOx-Gruppen.
Die Zytotoxizität scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen wurde gegenüber PhOx-markierten Zellen der ALL-Zellinie Reh in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen an freiem PhOx-BSA mit einzelnen PhOx-Gruppen (grau) und multiplen PhOx-Gruppen (schwarz) untersucht. Im Diagramm wurde die Lyse (E : T = 10 : 1) im Verhältnis zur Kontrolle (= 100%), bei der kein gelöstes Antigen dem Medium hinzugefügt wurde (weiß), angegeben. Außerdem wurde ein Ansatz mit unbehandeltem 100 µg/mL BSA-Protein (schraffiert) durchgeführt.

4.4.6 Bindungsinhibition des scPhOx-hFc-Proteins in Gegenwart von freiem PhOx-BSA mit einzelnen oder multiplen PhOx-Gruppen

Die Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen war gegenüber PhOx-markierten Zielzellen nur in Gegenwart von gelöstem PhOx-BSA mit multiplen PhOx-Gruppen inhibiert worden. Deshalb wurde untersucht, wie sich das scPhOx-hFc-Protein in Gegenwart von freiem (PhOx)20-BSA und (PhOx)2-BSA verhält (Abbildung 37).

Aufgrund der unterschiedlichen Zahl an PhOx-Gruppen auf den Antigenmolekülen (PhOx)2-BSA und (PhOx)20-BSA war auch die Anzahl der Bindungsstellen für das scPhOx-hFc-Protein nach dem „Coating“ der ELISA-Platten mit (PhOx)2-BSA- bzw. (PhOx)20-BSA-Protein sehr verschieden. Deshalb wurden die Meßergebnisse der Bindungsstudie ins Verhältnis zur 100%igen Bindungsrate des scPhOx-hFc-Proteins an das oberflächengebundene Antigen gesetzt. Die 100%-Bindungsrate des scPhOx-hFc-Proteins wurde jeweils getrennt für oberflächengebundenes (PhOx)2-BSA und (PhOx)20-BSA in den Ansätzen ermittelt, in denen kein freies Antigen eingesetzt wurde.

↓95

Das gelöste (PhOx)20-BSA bewirkte bei einer 50 – 100-fach geringeren Konzentration die Hemmung der Antigenbindung des scPhOx-hFc-Proteins als das gelöste (PhOx)2-BSA. Eine 50%ige Bindungsinhibition des scPhOx-hFc-Proteins wurde in Gegenwart von 1 – 2 x 108 M an gelöstem (PhOx)20-BSA erzielt. Das gelöste (PhOx)2-BSA, das nur einzelne Bindungsstellen eines PhOx-hFc-Moleküls binden konnte, führte erst ab Konzentrationen von 5 x 10-7 – 1 x 10-6 M zu einer 50%igen Bindungshemmung des scPhOx-hFc-Proteins gegenüber dem oberflächengebundenen Antigen.

Abbildung 37 – Die Antigenbindung des scPhOx-hFc-Proteins wurde durch gelöstes Antigen mit multiplen PhOx-Gruppen bei erheblich geringeren Konzentrationen gehemmt als durch Antigen mit einzelnen PhOx-Gruppen.
Die ELISA-Platten wurden mit (PhOx)2-BSA (Quadrate) oder (PhOx)20-BSA (Kreise) beschichtet („Coating“). Die Antigenbindung des scPhOx-hFc-Proteins (= extrazellulärer Anteil des cIgTCR-Konstruktes scPhOx-hFcζ) wurde in Gegenwart von gelöstem (PhOx)20-BSA (leer) und (PhOx)2-BSA (gefüllt) gehemmt. Zur Berechnung der Molarität wurde für das Antigen unabhängig von der Zahl der PhOx-Gruppen ein Molekulargewicht von 65 kDa angenommen.

4.5 Studien mit γ-bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen

4.5.1 Wachstumsinhibition der YT-Zellen durch γ-Bestrahlung

Das unbegrenzte Wachstum der humanen NK-Zellinie muß für eine klinische Anwendung beschränkt werden. Die γ-Bestrahlung stellt ein wirksames Mittel zur Wachstumsbegrenzung von Zellen dar und wurde in dieser Arbeit untersucht. Zunächst wurde die Abhängigkeit des Wachstums der Zellinie YT nach Bestrahlung mit unterschiedlichen Dosen γ-Strahlung untersucht (Abbildung 38). Strahlungsdosen ab 2000 rad hemmten das Wachstum der YT-Zellen in allen Versuchen vollständig und irreversibel. Einen Tag nach Bestrahlung mit einer Dosis von mindestens 2000 rad waren noch 60 – 90% der YT-Zellen vital. Zwei Tage nach Bestrahlung nahm der Anteil an lebenden YT-Zellen weiter ab und sank auf 20 – 40% der Ausgangszellzahl. Nach insgesamt 6 – 8 Tagen wurde nur noch 1% der ursprünglich eingesetzten YT-Zellen nicht durch Trypanblau gefärbt. Zwei Wochen nach Bestrahlung mit mindestens 2000 rad ließen sich in der gesamten Zellkultur keine vitalen YT-Zellen mehr nachweisen.

↓96

Abbildung 38 – Das Wachstum der YT-Zellen wurde nach γ-Bestrahlung mit 2000 rad vollständig und irreversibel gehemmt.
Die YT-Zellen wurden mit unterschiedlichen Dosen γ-Strahlung behandelt und anschließend in Kultur genommen. Die Zellzahl wurde mehrere Tage bestimmt und im Verhältnis zur Ausgangszellzahl aufgetragen. Die eingesetzten Strahlungsdosen sind in der Abbildung angegeben.

4.5.2 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen nach γ-Bestrahlung

Die Zytotoxizität bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde gegenüber den CEA+ MC32A-Zellen in Abhängigkeit von der Strahlendosis und für unterschiedliche Zeitpunkte nach der Bestrahlung untersucht, um den Einfluß der Bestrahlung auf die Effektoreigenschaften der genmodifizierten YT-Zellen zu untersuchen. Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen nahm einen Tag nach γ-Bestrahlung nur bei Strahlungsdosen > 10000 rad geringfügig ab verglichen mit den unbestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen. Eine unspezifische Zytotoxizität der bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen konnte gegenüber den CEA- MC38-Zellen nicht beobachtet werden (Abbildung 39).

Abbildung 39 – Einen Tag nach γ-Bestrahlung der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen blieb deren CEA-spezifische Zytotoxizität erhalten.
Einen Tag nach γ-Bestrahlung wurde die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber der CEA-transfizierten Zellinie MC32A durch 4 h-51Cr-Freisetzungsassays untersucht. Um eine unspezifische Aktivierung durch die Bestrahlung auszuschließen, wurden auch die CEA- MC38-Zellen als Target untersucht. Die Strahlungsdosen und die Targetzellinien sind in der Abbildung angegeben.

↓97

Durch γ-Bestrahlung kann die Expression von Genen beeinträchtigt werden. Einen Tag nach γ-Bestrahlung mit 1000 – 15000 rad konnte nur eine geringe Abnahme der Oberflächenexpression des cIgTCR-Konstruktes auf den scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen beobachtet werden (Abbildung 40).

Abbildung 40 – Die Expression des cIgTCR-Konstruktes auf den scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen blieb einen Tag nach γ-Bestrahlung unverändert.
Die Expression des cIgTCR-Konstruktes auf den scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde einen Tag nach deren γ-Bestrahlung durch FACS-Analyse untersucht. Als Kontrollen sind die Färbungen von unbestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen und mock-transfizierten YT-Zellen dargestellt. Die Strahlungsdosen für die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen sind in der Abbildung angegeben.

Drei Tage nach Bestrahlung reduzierte sich die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber den CEA+ MC32A-Zellen bei einer Strahlendosis von 1000 rad auf die Hälfte, bei 3000 rad auf ein Drittel und bei 5000 – 10000 rad auf ein Viertel verglichen mit der Zytotoxizität unbestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen (Abbildung 41 a). Nach fünf Tagen lysierten nur die mit 1000 rad bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen noch 15% der CEA+ MC32A-Zellen verglichen mit 42% Lyse, die durch die unbestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen vermittelt wurden (E : T = 25 : 1). Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen, die mit 3000 – 10000 rad bestrahlt worden waren, zeigten dagegen keine signifikante Zytotoxizität gegenüber den CEA+ MC32A-Zellen (Abbildung 41 b).

↓98

Bei diesen Zytotoxizitätsuntersuchungen wurden nur vitale scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen verwendet, die über einen Lymphoprep-Dichtegradienten von den toten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen isoliert wurden. Wenn die zurückgehende Anzahl vitaler scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen berücksichtigt wird, ist die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber den CEA+ MC32A-Tumorzellen 3 – 5 Tage nach lethaler Bestrahlung noch stärker vermindert.

Abbildung 41 – Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen war schon drei Tage nach Bestrahlung gegenüber der CEA+ Zellinie MC32A deutlich reduziert.
Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde drei Tage (a) und fünf Tage (b) nach deren γ-Bestrahlung gegenüber der CEA+ Zellinie MC32A in 4 h-51Cr-Freisetzungsassays untersucht. Die Strahlungsdosen für die γ-Bestrahlung der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen sind angegeben.

4.6 Maustumormodell

4.6.1 Adoptiver Transfer bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen zur Behandlung minimaler CEA+ MC32A-Tumore in NOD/SCID-Mäusen

Die Wirkung bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde in einem NOD/SCID-Mausmodell gegenüber CEA+ MC32A-Tumoren untersucht. Die Bildung von MC32A-Tumoren in NOD/SCID-Mäusen wurde durch die gemeinsame subkutane Injektion von scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen, die mit einer Dosis von 5000 rad bestrahlt wurden, signifikant (Mann-Whitney U-Test, p < 0,05) im Vergleich zu den Kontrollgruppen gehemmt (Abbildung 42). Den Kontrollgruppen wurden PBS oder bestrahlte scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen zusammen mit den MC32A-Tumorzellen subkutan injiziert. Für die Überlebensanalyse wurden Mäuse mit einem Tumorvolumen > 1 cm3 als tot klassifiziert. Die 50%-Überlebensrate wurde durch die Koinjektion von MC32A-Tumorzellen mit den bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen 14 – 18 Tage später erreicht als in den Kontrollgruppen. Zwei von sechs Mäusen dieser Gruppe bildeten keinen Tumor aus (< 0,001 cm3). Nach Koinjektion von MC32A-Tumorzellen mit den bestrahlten scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen bildeten alle Mäuse MC32A-Tumore. In der PBS-Kontrollgruppe entwickelte eine von sechs Mäusen keinen MC32A-Tumor. In den weiteren Versuchen entwickelten sämtliche NOD/SCID-Mäuse MC32A-Tumore, wenn ihnen MC32A-Zellen allein subkutan injiziert wurden, so daß die überlebende Maus dieser PBS-Gruppe möglicherweise ein Artefakt ist (siehe Abschnitt 4.6.2).

↓99

Abbildung 42 – Die Koinjektion von CEA+ MC32A-Tumorzellen und bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen führte zur Hemmung des Tumorwachstums in NOD/SCID-Mäusen.
Am Tag 0 wurden sechs NOD/SCID-Mäusen je Gruppe 106 CEA+ MC32A-Tumorzellen (Klon 6) zusammen mit 107γ-bestrahlten CEA-spezifischen scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen, 107γ-bestrahlten PhOx-spezifischen scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen oder PBS (siehe Legende) subkutan injiziert. Die kumulativen Überlebensraten wurden angegeben. Die Mäuse wurden getötet, wenn der MC32A-Tumor ein Volumen von 1 cm3 überschritt und als tot klassifiziert.

4.6.2 Adoptiver Transfer bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen zur Bekämpfung etablierter CEA+ MC32A-Tumore

In einem weiteren experimentellen Ansatz wurden 12 NOD/SCID-Mäusen CEA+ MC32A-Tumorzellen subkutan implantiert. Sämtliche Mäuse entwickelten spätestens nach 19 Tagen palpable Tumore. Die zweimalige intratumorale Injektion von jeweils 107 bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen in sechs Mäuse am Tag 19 und 26 hatte keinen signifikanten Einfluß auf das Wachstum der MC32A-Tumore verglichen mit der Kontrollgruppe, denen bestrahlte scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen injiziert wurden (Abbildung 43). Am Tag 19 hatten einige Mäuse schon recht große MC32A-Tumore (0,20 ± 0,13 cm3) entwickelt, die ihr Tumorvolumen binnen weniger Tage verdoppelten. Bei Mäusen mit kleinen Tumoren konnte unmittelbar nach der intratumoralen Injektion der bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen eine geringfügige und zeitlich begrenzte Verlangsamung des Tumorwachstums beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 43 – Die intratumorale Injektion bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen hatte keinen signifikanten Effekt auf das Wachstum etablierter CEA+ MC32A-Tumore in NOD/SCID-Mäusen.
Am Tag 0 wurden jeweils sechs NOD/SCID-Mäusen pro Gruppe 106 CEA+ MC32A-Zellen subkutan injiziert. Am Tag 19 und 26 wurden je 107γ-bestrahlte scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen intratumoral in die MC32A-Tumore injiziert. Der Kontrollgruppe wurden 107γbestrahlte scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen intratumoral injiziert. Mäuse mit einem MC32A-Tumor > 1 cm3 Volumen wurden als tot klassifiziert.

4.7 Sensibilität der cIgTCR+ YT-Zellen gegenüber allogenen Lymphozyten

4.7.1 Abstoßung der cIgTCR+ YT-Zellen durch allogene PBL und NK-Zellen

↓100

Die Abstoßung einer allogenen Effektorzellinie durch das Immunsystem des Empfängers könnte ihren Einsatz für eine adoptive Immuntherapie einschränken. Aus diesem Grund wurden einige in-vitro-Studien durchgeführt, um die Empfindlichkeit der cIgTCR+ YT-Zellen gegenüber allogenen humanen PBL und NK-Zellen (> 90% CD3-, CD56+, CD16+) zu testen.

YT-Zellen, die mit einem cIgTCR-Genkonstrukt transfiziert waren, wurden maximal 1 – 3% stärker durch allogene PBL lysiert als die mock-transfizierten YT-Zellen (Abbildung 44 a). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn nur die aus den allogenen PBL isolierten NK-Zellen als Effektorzellen eingesetzt wurden (Abbildung 44 b). Eine höhere cIgTCR-Expression der transfizierten YT-Zellen schien eine geringfügig höhere Lyse durch die allogenen PBL und NK-Zellen zu bewirken. Die Zytotoxizität blieb jedoch in allen Versuchen unter 6% (E : T = 50 : 1). Die Ergebnisse konnten mit den PBL und NK-Zellen von unterschiedlichen allogenen Spendern bestätigt werden.

Abbildung 44 – Allogene PBL und NK-Zellen zeigten nur eine geringe Zytotoxizität gegenüber den mock- oder cIgTCR-transfizierten YT-Zellen.
Die Zytotoxizität frisch isolierter humaner PBL (a) und NK-Zellen (b) eines allogenen Spenders wurden als Effektorzellen gegenüber scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen (♦), scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen (▲) scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen (■) und mock-transfizierten YT-Zellen (○) in 4 h-51Cr-Freisetzungsassays untersucht. Die Targetzellyse wurde mit den Standardabweichungen angegeben.

4.7.2 Stimulation allogener Lymphozyten durch die cIgTCR+ YT-Zellen

↓101

YT-Zellen exprimieren kostimulatorische Moleküle und MHC-Klasse-I/-II, die eine spezifische Aktivierung von T-Zellen auslösen könnten. Humane allogene PBL wurden deshalb mit bestrahlten mock- oder cIgTCR-transfizierten YT-Zellen eine Woche lang inkubiert, bevor sie im Zytotoxizitätsassay als Effektorzellen eingesetzt wurden. Es wurde keine Zunahme der Zytotoxizität der stimulierten PBL gegenüber mock- oder cIgTCR-transfizierten YT-Zellen beobachtet. Außerdem wurden keine Unterschiede in der Lyse mock-transfizierter YT-Zellen, scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen oder scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen durch die stimulierten PBL festgestellt unabhängig davon, ob mock-, scBW431/26-hFcζ- oder scPhOx-hFcζ-transfizierte YT-Zellen als Stimulatorzellen eingesetzt wurden (Abbildung 45).

Abbildung 45 – Die Kokultivierung allogener PBL mit bestrahlten mock- oder cIgTCR-transfizierten YT-Zellen führte zu keiner Zunahme ihrer Zytotoxizität.
Allogene PBL wurden eine Woche mit bestrahlten mock-transfizierten YT-Zellen (a), scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen (b) oder scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen (c) stimuliert. Die stimulierten PBL wurden als Effektorzellen gegenüber mock-transfizierten YT-Zellen (○), scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen (♦) oder scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen (▲) in 4 h-51Cr-Freisetzungsassays eingesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben.


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28.10.2005