5 Diskussion

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Patienten mit fortgeschrittenen Tumorerkrankungen weisen häufig einen Mangel an funktionellen tumorspezifischen Lymphozyten auf (Finke et al., 1999). Das Aussetzen der Immunabwehr könnte durch den adoptiven Transfer tumorspezifischer Lymphozyten kompensiert werden. Deshalb gilt die gezielte adoptive Immuntherapie als ein hoffnungsvoller Ansatz für die Behandlung von Tumorerkrankungen. Eine wesentliche Voraussetzung für den Erfolg dieser Strategie ist die Bereitstellung einer ausreichenden Menge an Lymphozyten mit hoher Tumorspezifität und potenten Effektoreigenschaften.

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Adoptive Immuntherapien mit autologen LAK-Zellen oder TILs erzielten nur eine begrenzte klinische Wirkung bei wenigen Tumorarten (Bordignon et al., 1999). Die Erzeugung tumorspezifischer T-Zellen durch retroviralen Gentransfer (Engels et al., 2003;Farson et al., 1999;Finer et al., 1994;Uckert et al., 1998;Weijtens et al., 1998) von rekombinanten TCR-Konstrukten (Calogero et al., 2000;Eshhar, 1997) könnte die Einschränkungen von LAK- und TIL-Therapien, wie mangelnde Spezifität oder komplizierte Isolation und Expansion der Effektorlymphozyten, überwinden. Trotzdem bleibt die individuelle Herstellung genmodifizierter T-Zellen für den einzelnen Patienten kompliziert, zeitaufwendig und kostenintensiv. Allogene Ansätze einer adoptiven Immuntherapie ermöglichen eine patientenunabhängige Herstellung tumorspezifischer Effektorlymphozyten, sind jedoch nur im Rahmen immunrekonstituierender Therapien, beispielsweise nach einer allogenen Stammzelltransplantation, einsetzbar. Außerdem verursachen allogene Spenderlymphozyten neben ihrer antileukämischen Wirkung (Horowitz et al., 1990;Jiang et al., 1991) eine gegen den Empfänger gerichtete Immunreaktion (GvHD), und Abstoßungsreaktionen beschränken den Einsatz allogener Lymphozyten auf MHC-kompatible Empfänger, so daß wieder nur individualisierte Therapieansätze möglich sind.

Tumorspezifische Effektorzellinien besitzen verglichen mit primären Effektorlymphozyten einige Vorteile für die adoptive Immuntherapie. Effektorzellinien können im Gegensatz zu primären Lymphozyten unbegrenzt expandiert werden. Ihre Herstellung ist patientenunabhängig, kann im großen Maßstab erfolgen und ermöglicht einen hohen Standardisierungsgrad sowie eine erhebliche Verringerung des technischen, zeitlichen und finanziellen Aufwandes. Außerdem sind die Einsatzmöglichkeiten allogener Effektorzellinien nicht wie bei den primären Lymphozyten auf den einzelnen Patienten beschränkt. Im Rahmen präklinischer und klinischer Studien wurden die zytotoxischen Zellinien TALL104 und NK92 in Patienten mit fortgeschrittenen Tumorerkrankungen eingesetzt (Tonn et al., 2001;Visonneau et al., 2000). Diese Untersuchungen zeigen, daß die Verträglichkeit allogener Effektorzellinien in unterschiedlichen Patienten gewährleistet werden kann. Die Anwendung allogener tumorspezifischer Effektorzellinien zur gezielten adoptiven Immuntherapie könnte deshalb zukünftig sogar eine breitere klinische Anwendung im Sinne eines „zellbasierten Medikamentes“ zu lassen.

In dieser Arbeit wurde untersucht, ob durch den Gentransfer tumorspezifischer Rezeptorgenkonstrukte die Spezifität der humanen NK-Zellinie YT (Yodoi et al., 1985) auf CEA+ und CD33+ Tumorzellen erweitert werden kann. Die YT-Zellinie ist eine unbegrenzt wachsende NK-Zellinie. Sie zeichnet sich gegenüber anderen NK-Zellinien darin aus, daß sie unabhängig von IL-2 wächst und trotzdem über potente zytotoxische Effektoreigenschaften verfügt. Außerdem lassen sich die YT-Zellen über Plasmidvektoren durch Elektroporation genetisch modifizieren, während andere NK-Zellinien in den meisten Fällen einen retroviralen Gentransfer erfordern. Aus diesen Gründen erfüllt die NK-Zellinie YT günstige Voraussetzungen für die Erzeugung einer genmodifizierten tumorspezifischen Effektorzellinie zur adoptiven Immuntherapie von Tumorerkrankungen.

5.1 Tumorspezifische chimäre Immunglobulin-T-Zellrezeptoren für ein Targeting der NK-Zellinie YT

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Rezeptoren für ein Tumortargeting der NK-Zellinie YT

Das Tumortargeting der humanen NK-Zellinie YT durch Rezeptorgentransfer stellt bestimmte Anforderungen an die einzusetzenden Rezeptoren. In einer früheren Studie mit den YT-Zellen wurde gezeigt, daß eine verbesserte Bindung an die Zielzellen ohne ein zytotoxisches Signal keine Lyse von neuen Tumorarten ermöglichte (Schirrmann und Pecher, 2001). Rezeptoren für ein effizientes Tumor targeting der YT-Zellen müssen deshalb neben der tumorspezifischen Bindungsdomäne eine Signalkette enthalten oder mit Signalmolekülen assoziieren, die die Zytotoxizität dieser NK-Zellinie auslösen können. In dieser Arbeit wurden chimäre Rezeptorkonstrukte aus einer antikörperbasierten Bindungsdomäne und der CD3 ζ-Signalkette des humanen TCR-Komplexes hergestellt. Diese chimären Immunglobulin-T-Zellrezeptoren (cIgTCRs) oder „T-Bodies“ verbinden die Antigenbindungseigenschaften von Antikörpern mit den Signaleigenschaften des TCR-Komplexes. Die cIgTCRs wurden als einzelsträngige Genkonstrukte aus tumorspezifischen single-chain-Antikörperfragmenten, dem humanen IgG1-Fc-Teil und der humanen CD3 ζ-Signalkette realisiert.

single-chain -Antikörper-Fragmente als Rezeptor bindungs domänen

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Die Antigenbindungsdomäne von Antikörpern ist auf die variablen Regionen der leichten und schweren Immunglobulin-Ketten verteilt, deren Assemblierung erst durch B-zellspezifische Mechanismen effizient erfolgt (Foy und Matsuuchi, 2001;Knarr et al., 1995;Leitzgen et al., 1997;Vanhove et al., 2001). Um die Antikörperbindungseigenschaften in einem einzelsträngigen Rezeptorkonstrukt nutzen zu können, müssen die V-Regionen des Antikörpers über einen flexiblen und löslichen Peptid-Linker zu einem scFv-Fragment fusioniert werden (Bird et al., 1988). Da die Bindungseigenschaften bei der scFv-Konstruktion zerstört werden können (Asano et al., 2000), war eine Expression und Analyse der scFv-Fragmente erforderlich, bevor sie zur Konstruktion der cIgTCR-Konstrukte eingesetzt werden konnten.

Das scFv-Fragment scBW431/26 wurde aus den V-Regionen des CEA-spezifischen humanisierten Antikörpers BW431/26 konstruiert, indem die VL-Region mit der VH-Region über den Linker-218 (Whitlow et al., 1993) fusioniert wurde. Da die Anordnung der V-Regionen und der verwendete Peptid-Linker die Expressions- und Bindungseigenschaften der scFv-Fragmente beeinflussen können (Tsumoto et al., 1994), wurde zusätzlich das scFv-Fragment BW431/26-Yol konstruiert, bei dem die VH-Region mit der VL-Region über den Yol-Linker verknüpft war. Außerdem wurden zwei phOx-spezifische scFv-Fragmente mit diesen Konfigurationen bereitgestellt oder konstruiert, die als Kontrollen für die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol dienen sollten.

Zur Überprüfung der Bindungseigenschaften wurden die scFv-Fragmente exprimiert. Die periplasmatische Expression gilt als erfolgreichste Methode, um einen hohen Anteil an funktionellen scFv-Fragmenten in E. coli zu produzieren (Kazemier et al., 1996;Pluckthun, 1991;Skerra und Pluckthun, 1988). Die Expression wurde mit 0,1 mM IPTG induziert und bei 26 – 28°C durchgeführt. Durch die schwache Induktion des lac-Promoters und Temperaturen zwischen 25 – 30°C wird die Expression der scFv-Proteine verlangsamt, wodurch die Aggregation und Ablagerung in den „inclusion bodies“ vermindert und die Sekretion ins Periplasma gefördert werden (Breitling und Dübel, 1997). Die Zugabe von 0,4 M Saccharose während der Expressionsphase fördert die Anreicherung der scFv-Proteine im Periplasma und deren Freisetzung ins Medium und ermöglicht die Isolation der scFv-Fragmente aus dem Kulturüberstand (Kipriyanov et al., 1996;Kipriyanov et al., 1997;Sawyer et al., 1994).

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Die scFv-Fragmente scPhOx (VL / Linker-218 / VH) und PhOx-Yol (VH / Yol-Linker / VL) ließen sich mit diesem Expressionssystem in großen Mengen funktionell exprimieren und aufreinigen. Im Gegensatz dazu konnten nur sehr geringe Mengen der scFv-Fragmente scBW431/26 (VL / Linker-218 / VH) und BW431/26-Yol (VH / Yol-Linker / VL) periplasmatisch in E. coli exprimiert werden. Das aufgereinigte Protein dieser scFv-Fragmente zeigte keine spezifische Bindung gegenüber CEA. Als Ursache für die geringe Ausbeute und die fehlende Funktionalität der scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol konnte eine fehlerhafte Faltung und inkorrekte Ausbildung der Disulfidbrücken bei der bakteriellen Expression vermutet werden.

Die Ergebnisse ließen jedoch keinen eindeutigen Schluß zu, ob der Verlust der Bindungseigenschaften der scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol durch das Design der scFv-Konstrukte oder durch die bakterielle Expression verursacht wurde. Da die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol analog zu scPhOx und PhOx-Yol konfiguriert waren, scheint die funktionelle bakterielle Expression dieser scFv-Fragmente weniger durch die Anordnung der V-Regionen oder die verwendeten Linker-Sequenzen als durch die V-Regionen selbst beeinflußt worden zu sein. Für diese Erklärung spricht die Herkunft der V-Regionen dieser scFv-Fragmente. Das PhOx-Yol-Konstrukt wurde aus einem scFv-Fragment hergestellt, das aus einer humanen Phagendisplaybibliothek isoliert und durch „chain shuffling“ optimiert wurde (Marks et al., 1992). Mit diesem Prozeß ist eine Selektion und Optimierung gegenüber bakteriellen Expressionsbedingungen verbunden (Deng et al., 1994). Die V-Regionen des Antikörpers BW431/26 wurden dagegen durch Humanisierung eines Maus-Antikörpers hergestellt (Gussow und Seemann, 1991) und für die Konstruktion eines humanen Antikörpers eingesetzt, der in Myelomzellinien exprimiert wurde (Bosslet et al., 1992;Bruynck et al., 1993). Dementsprechend waren die V-Regionen des Antikörpers BW431/26 nicht hinsichtlich einer bakteriellen Expression selektiert und optimiert.

Probleme und Optimierungen der bakteriellen scFv-Expression

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Die Ausbeute korrekt gefalteter rekombinanter Antikörperfragmente gilt bei der bakteriellen Expression als nicht vorhersagbar und kann durch viele Faktoren beeinflußt werden (Breitling und Dübel, 1997). Die Optimierung von scFv-Konstrukten für die bakterielle Expression kann sehr aufwendig sein und ist in vielen Fällen nicht übertragbar (siehe 1.6.5). In einigen scFv-Fragmenten konnte durch den Austausch einzelner Aminosäuren die funktionelle Expression erheblich gesteigert werden (Kipriyanov et al., 1997). Einige Modifizierungen des Expressionsvektors pOPE51 könnten jedoch zu einer allgemeinen Verbesserung der bakteriellen scFv-Expression beitragen. Die Beseitigung des ungepaarten Cys-Restes vor dem (His)5-Tag im pOPE51-Plasmid führt zu einer erhöhten Expression und Ausbeute an funktionellem scFv-Protein (Schmiedl et al., 2000). Anstelle des lac-Promoters könnte ein T7/lac-Promoter (Matthey et al., 1999) oder ein Tetrazyklin-Promoter (Griep et al., 1999) eine bessere Expressionskontrolle erlauben und die Beschränkung auf E. coli-Stämme mit lacI q -Mutation aufheben.

Ein entscheidender Nachteil der E. coli-Expression ist die Bildung von scFv-Dimeren (Atwell et al., 1999;Hudson und Kortt, 1999;Wu et al., 1996) durch Aggregation der V-Regionen bei höheren Konzentrationen. Die Bildung von scFv-Dimeren kann falsch-positive Bindungseigenschaften monomerer scFv-Fragmente vortäuschen und sich problematisch auf die Herstellung von cIgTCR-Konstrukten auswirken.

scFv-hFc-Fusionsproteine als Alternative zu scFv-Fragmenten

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Mit einem eukaryotisches Expressionssystem werden viele Probleme der bakteriellen Expression umgangen. Die scFv-Expression wurde für Insektenzellen (Choo et al., 2002;Kretzschmar et al., 1996), Pflanzenzellen (Tavladoraki et al., 1999) und Säugerzellen (Jost et al., 1994) beschrieben. In dieser Arbeit wurde die transformierte humane embryonale Nierenzellinie 293T verwendet, da sie mittels Kalziumphosphattransfektion sehr effizient transfiziert werden kann. Die sekretorische Expression in einer humanen Zellinie erfordert ein Signalpeptid, das die Translation des Transkripts in das endoplasmatische Retikulum lenkt. Die scFv-Konstrukte wurden deshalb am N-Terminus mit dem Signalpeptid der humanen IgGκ-Kette fusioniert (Persic et al., 1997). Dieses Signalpeptid (Leader-A/-C) ermöglicht gleichzeitig auch die Plasmamembranexpression von Typ-I-Transmembranproteinen wie den cIgTCR-Konstrukten.

Am C-Terminus wurden die scFv-Fragmente mit dem Fc-Teil (hinge-CH2-CH3-Domänen) des humanen IgG1 fusioniert (Kato et al., 1995), der die Dimerisierung der scFv-hFc-Fusionsproteine bewirkt. Der humane Fc-Teil wurde in den cIgTCR-Rezeptorkonstrukten als extrazelluläre Verbindungsdomäne zwischen dem scFv-Fragment und der Signalkette eingesetzt, so daß die Expression der scFv-hFc-Proteine die Analyse der Bindungseigenschaften des gesamten extrazellulären Anteils der auf ihnen basierenden cIgTCR-Konstrukte ermöglichte.

Die scFv-hFc-Fusionsproteine scBW431/26-hFc und scPhOx-hFc, die aus den scFv-Fragmenten scBW431/26 und scPhOx konstruiert wurden, konnten in den 293T-Zellen in großen Mengen sekretorisch exprimiert werden. Die scFv-hFc-Proteine zeigten eine spezifische Bindung an ihre Antigene im ELISA. Damit bestätigte sich der Verdacht, daß die Bindungseigenschaften des scFv-Fragments scBW431/26 durch die bakterielle Expression und nicht aufgrund des gewählten scFv-Designs verloren gegangen waren. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde aus den V-Regionen des humanisierten CD33-spezifischen Antikörpers HuM195 direkt das scFv-hFc-Konstrukt erzeugt. Die Konstruktion des scHuM195-hFc-Proteins, seine sekretorische Expression in den 293T-Zellen und die Analyse seiner Bindungseigenschaften konnten in kurzer Zeit durchgeführt werden.

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Die Konstruktion von scFv-hFc-Proteinen und deren Expression in der Zellinie 293T hatte viele Vorteile gegenüber der bakteriellen Expression von scFv-Fragmenten. Die scFv-hFc-Proteine wurden unabhängig von ihren Antikörper-V-Regionen funktionell exprimiert. Die scFv-hFc-Proteine entsprachen außerdem dem gesamten extrazellulären Anteil der cIgTCR-Konstrukte und gaben deren Bindungseigenschaften genauer als die scFv-Fragmente wieder. Die scFv-hFc-Proteine waren zudem über Monate sehr stabil und konnten wie normale Antikörper zur Färbung von Tumorzellen eingesetzt werden.

Der humane Fc-Teil als extrazelluläre „ Spacer “-Domäne der cIgTCR-Konstrukte

Der humane Fc-Teil der scFv-hFc-Proteine wurde in den cIgTCR-Konstrukten als extrazelluläre Verbindungsdomäne zwischen den scFv-Fragmenten und der Transmembrandomäne der Signalkette eingesetzt, wo er als Abstandshalter („Spacer“) für die Antigenbindungsdomäne zur Plasmamembran fungierte. Außerdem bewirkt der Fc-Teil eine stabile Dimerisierung der cIgTCR-Konstrukte (Hombach et al., 1999;Hombach et al., 1998) und unterdrückt die Interaktion mit der endogenen ζ-Kette. cIgTCR-Konstrukte ohne Dimerisierungsdomäne sind dagegen oft mit der endogenen ζ-Kette assoziiert, was ihre Funktion jedoch nicht einzuschränken scheint. Trotzdem können ihre Bindungs- und Signaleigenschaften beeinflußt werden (Hombach et al., 2000). Heterodimere aus scFv-γ-Rezeptor und endogener ζ-Kette führten zu einer verringerten Antigenantwort und einer Reduktion der endogenen ζ-Kette in CTL-Hybridomen (Annenkov et al., 1998).

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Neben dem Fc-Teil wurden auch CD4-Domänen (D3/D4-Domänen), die CD8α-hinge-Region (Moritz und Groner, 1995;Ren Heidenreich et al., 2000) oder CD28-Domänen (Eshhar et al., 2001) als „Spacer“-Domänen eingesetzt. Das Einfügen dieser extraplasmatischen Domänen stabilisierte bei einigen cIgTCR-Konstrukten die Oberflächenexpression (Patel et al., 1999) und ermöglichte erst eine effektive Antigenerkennung und T-Zellaktivierung (Fitzer Attas et al., 1998;Moritz und Groner, 1995). Allgemein profitieren cIgTCR-Konstrukte mit der CD3 ζ-Kette mehr von diesen „Spacer“-Domänen als cIgTCR-Konstrukte mit der γ-Kette (Patel et al., 1999).

CD3 ζ-Kette als Signalkette der cIgTCR-Konstrukte

In den cIgTCR-Konstrukten dieser Arbeit wurde die humane CD3 ζ-Kette als Signalkette eingesetzt. Sie lieferte die Transmembrandomäne und die zytoplasmatischen Signaldomänen. Die Transmembrandomäne der ζ-Kette verankert nicht nur die Rezeptoren in der Plasmamembran, sondern kann auch an der Assoziation mit anderen Signalkomponenten beteiligt sein. Trotzdem ist die Transmembrandomäne der ζ-Kette nicht essentiell für ihre Signaltransduktion (Romeo et al., 1992). Unterschiedliche Wirkungen der Transmembrandomänen von CD4 und CD8 in cIgTCR-Konstrukten wurden jedoch beschrieben (Fitzer Attas et al., 1998;McGuinness et al., 1999;Roberts et al., 1994;Tran et al., 1995).

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Die Signaltransduktion der CD3 ζ-Kette wird über die zytoplasmatischen ITAM-Sequenzmotive vermittelt. Obwohl die ζ-Kette im Gegensatz zu den anderen Signalkomponenten des TCR-Komplexes drei ITAMs aufweist, scheint die hohe Zahl dieser aktivatorischen Sequenzmotive nicht allein maßgebend für eine effiziente Signaltransduktion zu sein (Nolan et al., 1999;Ren-Heidenreich et al., 2002;Romeo et al., 1992;van Oers et al., 1998). Der Phosphorylierungszustand der CD3 ζ-Kette hängt von der Differenzierung und dem Status der T-Zellen ab (Love et al., 2000;Love und Shores, 2000). Die einzelnen ITAMs werden durch unterschiedliche Signalmoleküle in Abhängigkeit vom Phosphorylierungszustand der anderen ITAMs erkannt (Zenner et al., 1996). Die ζ-Kette fördert effizienter als die γ-Kette die Positivselektion und T-Zellreifung (Shores et al., 1997), während sie bei der Vermittlung der T-Zellentwicklung und -Funktion gleichwertig zu sein scheinen. Bei der Kontrolle von Tumoren weisen cIgTCR-transfizierte T-Zellen eine größere Kapazität auf, wenn die ζ-Kette anstelle der γ-Kette in den cIgTCR-Konstrukten verwendet wird (Haynes et al., 2001).

5.2 Antigenexpression auf den Tumorzellen

Anwendung der scFv-hFc-Fusionsproteine als „Mini“-Antikörper

Die scFv-hFc-Fusionsproteine entsprechen IgG1-Antikörpern, deren Fab’-Fragmente durch scFv-Fragmente ersetzt worden sind, und könnten im gesamten Spektrum der Antikörperapplikationen eingesetzt werden. Die Einsparung von CL- und CH1-Domänen reduziert ihr Molekulargewicht um 50 kDa gegenüber IgG1-Antikörpern, woraus verbesserte Verteilungseigenschaften für diagnostische oder therapeutische Anwendungen resultieren können.

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In dieser Arbeit wurden die scFv-hFc-Fusionsproteine scBW431/26-hFc und scHuM195-hFc für die FACS-Analyse von Tumorzellinien eingesetzt, um sie auf die Expression der Antigene CEA und CD33 zu untersuchen. Mit den scFv-hFc-Proteinen scBW431/26-hFc und scHuM195-hFc wurden die exakten Antigenepitope nachgewiesen, die durch die cIgTCR-Konstrukte scBW431/26-hFcζ und scHuM195-hFcζ erkannt werden. Als Negativkontrolle wurde das phOx-spezifische scPhOx-hFc-Protein verwendet, das keine auf Zellen natürlich vorkommenden Strukturen erkennt. Mit dem scPhOx-hFc-Protein wurden nur Zellen gefärbt, deren Oberfläche mit dem Hapten PhOx künstlich markiert worden war. Das scHuM195-hFc-Protein färbte spezifisch CD33+ myeloische Leukämiezellinien mit derselben Intensität wie der zum Vergleich eingesetzte Antikörper WM54, so daß sich die Spezifität des scHuM195-hFc-Proteins für CD33 durch die FACS-Analysen bestätigen ließ. Im Gegensatz dazu zeigte das scBW431/26-hFc-Protein eine mit dem zum Vergleich eingesetzten Antikörper CEJ065 unterschiedliche Färbung humaner Tumorzellinien.

Erkennungseigenschaften des scBW431/26-hFc-Proteins

Das scBW431/26-hFc-Protein färbte die CEA-transgene Maus-Kolonkarzinomzellinie MC32A mit vergleichbarer Intensität wie der Antikörper CEJ065. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die FACS-Analysen humaner Kolon- und Pankreaskarzinomzellinien erheblich in ihrer Intensität und dem Anteil gefärbter Zellen in Abhängigkeit davon, ob das scBW431/26-hFc-Protein oder der Antikörper CEJ065 für die Färbung eingesetzt wurden. In diesen Versuchen zeigte das scBW431/26-hFc-Protein immer eine strengere Spezifität als der Antikörper CEJ065. Obwohl eine CEA-Expression für die Kolonkarzinomzellinien HT29, SW403 und SW1417 beschrieben ist (Chen et al., 1995;Philben et al., 1986;Shawler et al., 2002), wurden sie nur durch den Antikörper CEJ065, aber nicht durch das scBW431/26-hFc-Protein, gefärbt. Für diese kontroversen Ergebnisse gibt es mehrere Erklärungen. Viele „CEA-spezifische“ Antikörper zeigen Kreuzreaktionen mit anderen Mitgliedern der CEACAM-Proteinfamilie aufgrund homologer Domänen (Murakami et al., 1995). Für den zum Vergleich eingesetzten Antikörper CEJ065 wurde vom Hersteller eine Kreuzreaktivität mit CD66c (NCA90) angegeben. Die exakte Spezifität CEA-spezifischer Antikörper ist deshalb kritisch für die Beurteilung anderer Publikationen.

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Für den Ursprungsantikörper des scBW431/26-hFc-Proteins, den Antikörper BW431/26, wurde mehrfach eine Spezifität für membrangebundenes CEA beschrieben (Bosslet et al., 1992;Bosslet et al., 1988;Hombach et al., 1999), ohne jedoch sein Antigenepitop eindeutig definieren zu können. Eine Involvierung von Kohlenhydratstrukturen wurde jedoch ausgeschlossen (Bosslet et al., 1985). Ein besonderes Epitop der CEA-Membranform gegenüber gelöstem CEA ist nur schwer vorstellbar, da CEA über einen GPI-Anker mit Phospholipiden der Zellmembran verbunden ist.

Für CEA wurde die Bildung homodimerer Komplexe auf der Plasmamembran durch Interaktion seiner N-terminalen IgV-ähnlichen Domäne beschrieben. Weiterhin wird vermutet, daß CEA mit anderen Mitgliedern der CEACAM-Familie über diese N-Domäne heterodimere Komplexe bildet (Hammarstrom, 1999). Die Bildung heterodimerer Komplexe könnte durch Kompetition die Bildung von homodimeren CEA-Komplexen auf der Zelloberfläche unterdrücken. Wenn das scBW431/26-hFc-Protein erst durch Nutzung beider Antigenbindungsstellen eine stabile Bindung mit CEA eingeht, würde es spezifisch an homodimere CEA-Komplexe, aber nicht an heterodimere CEA-Komplexe, binden. Entscheidend für diese Hypothese sind eine geringe Affinität und eine hohe Avidität des scBW431/26-hFc-Proteins gegenüber CEA. Bei einer hohen Affinität würden homodimere und heterodimere CEA-Komplexe fest gebunden und bei einer Immunfärbung nicht unterschieden. Die zur Literatur widersprüchlichen FACS-Ergebnisse der CEA-Expression auf den humanen Kolonkarzinomzellinien könnten deshalb mit der Expression unterschiedlicher CEA-Komplexe erklärt werden. Hochaffine CEA-spezifische Antikörper erkennen gleichermaßen alle Arten von CEA-Komplexen auf der Oberfläche von Tumorzellen, während das scBW431/26-hFc-Protein und sein Ursprungsantikörper BW431/26 nur an Tumorzellen mit homodimeren CEA-Komplexen binden.

Die vergleichbaren FACS-Analysen der CEA-transfizierten Maus-Kolonkarzinomzellinie MC32A nach Färbung mit dem scBW431/26-hFc-Protein und dem Antikörper CEJ065 widersprechen dieser Hypothese nicht. Da es kein CEA-Pendant in der Maus gibt und die Maus-CEACAMs Unterschiede in ihren N-Domänen zu den humanen CEACAMs aufweisen, sollte das humane CEA auf den CEA-transfizierten MC32A-Zellen nur homodimere Komplexe bilden, die von dem scBW431/26-hFc-Protein und dem Antikörper CEJ065 erkannt werden. Die Bindung des scBW431/26-Proteins an das CEA-Protein im ELISA ist dadurch erklärbar, daß sich die N-Domänen von CEA bei erhöhten Konzentrationen homotypisch zusammenlagern (Krop-Watorek et al., 1998). Bei der Adsorption an der Plastikoberfläche sollten sich dementsprechend CEA-Aggregate ausbilden, die von dem scBW431/26-hFc-Protein und seinem Ursprungsantikörper BW431/26 erkannt werden.

5.3 Genetische Modifikation der humanen NK-Zellinie YT

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Gentransfer der cIgTCR-Konstrukte in die YT-Zellinie

Der Gentransfer der tumorspezifischen cIgTCR-Konstrukte scBW431/26-hFcζ und scHuM195-hFcζ sowie des phOx-spezifischen Kontrollkonstruktes scPhOx-hFcζ erfolgte mittels Elektroporation in die NK-Zellinie YT. Obwohl nur geringe transiente Transfektionsraten von 1 – 2% erzielt wurden, konnten in allen Versuchen cIgTCR+ YT-Zellen mit G418 selektiert werden. Durch die Selektion stieg der Anteil cIgTCR-exprimierender YT-Zellen auf maximal 10% an. Im Gegensatz zu Hefen (Hinnen et al., 1978) können die Zellen höherer Organismen nur einen geringen Anteil der transfizierten Plasmide stabil in ihr Genom integrieren. Die chromosomale Integration von Plasmid-DNA beruht auf „illegitimen“ Rekombinationsmechanismen und führt nicht zwangsläufig zum gemeinsamen Einbau von Transgen und Selektionsmarker, der für die antibiotische Selektion transgener Zellen notwendig ist. Die Linearisierung der Plasmid-DNA kann die gemeinsame chromosomale Integration von Transgen und Selektionsmarker fördern, führte jedoch in dieser Arbeit zu keiner Verbesserung des stabilen Gentransfers.

Der Integrationsort, die Methylierung und die Chromatinzugänglichkeit des Transgens üben einen großen Einfluß auf die Höhe und Stabilität seiner Expression aus (Feng et al., 2001;Garrick et al., 1996;Schubeler et al., 2000). Außerdem kann die genomische Insertion von Fremd-DNA wichtige zelluläre Gene beeinflussen oder zerstören. Die Wahrscheinlichkeit für eine chromosomale Integration von Plasmid-DNA und deren Lokalisation kann durch flankierende homologe Genomsequenzen von mehreren tausend bp (Li und Baker, 2000) oder durch bestimmte virale Sequenzen, z. B. aus dem adenoassoziierten Virus (AAV), erhöht werden (Koduri et al., 2001;Kogure et al., 2001).

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Eine stabile Transfektion wird auch mit episomal replizierenden Plasmiden erreicht. Diese autonom replizierenden Plasmide erzeugen mehrere Kopien, die während der Zellteilung zufällig auf die Tochterzellen verteilt werden. EBV-abgeleitete episomal replizierenden Plasmidvektoren, die den viralen Origin ori p und den an ihn bindenden Replikationsfaktor EBNA-1 (EBV nuclear antigen-1) enthielten (Mucke et al., 1997), wurden erfolgreich zum Gentransfer in die YT-Zellinie verwendet (Schirrmann und Pecher, 2001). Der Nachteil dieser Vektoren besteht in der Expression eines viralen Antigens und der geringeren Stabilität der Transgenexpression.

Einige NK-Zellinien wurden retroviral transfiziert (Nagashima et al., 1998;Tran et al., 1995). Retrovirale Vektoren ermöglichen einen stabilen Gentransfer, da sie ihr Erbgut in das Genom der infizierten Zellen integrieren. Trotzdem ist die Herstellung von Retroviren für den Gentransfer mit einem höheren Aufwand verbunden.

Immunologische Anreicherung der cIgTCR + YT-Zellen

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Die cIgTCR+ YT-Zellen wurden effektiv durch immunologische Zellseparation mit einem Antikörper, der spezifisch für den humanen Fc-„Spacer“ der cIgTCR-Konstrukte ist, angereichert. Das MACS®-System (Miltenyi et al., 1990) zeichnete sich gegenüber der durchflußzytometrischen Strategie durch die schnelle Trennung großer Zellzahlen und den geringeren Streß für die Zellen aus. Bei der immunologischen Anreicherung ist eine zu starke Vernetzung der cIgTCR+ YT-Zellen, z. B. durch Verwendung eines Biotin/Streptavidin-Systems, zu vermeiden, da daraus wahrscheinlich eine gegenseitige Lyse der angereicherten cIgTCR+ YT-Zellen resultiert.

Immunologische Anreicherungsverfahren wurden auch für cIgTCR-transfizierte T-Zellen beschrieben (Beecham et al., 2000;Hombach et al., 2001;Nolan et al., 1999;Weijtens et al., 1998). Die durch Antikörper bedingte Kreuzvernetzung („cross linking“) der cIgTCR-Moleküle bei diesen Verfahren kann zur unspezifischen Aktivierung der transfizierten T-Zellen führen, die nicht nur zur Sekretion bestimmter Zytokine (Daly et al., 2000;Eshhar et al., 1993;Hombach et al., 1999;Hombach et al., 2001;Hombach et al., 2000;Moritz et al., 1994;Stancovski et al., 1993), sondern auch zum aktivierungsbedingten Zelltod (AICD, activation induced cell death), führen könnte. T-Zellen unterliegen dem AICD, wenn die Stimulation von TCR oder CD3 bei fehlender CD28-Kostimulation erfolgt (Li et al., 2000). NK-Zellen, die mit IL-2 oder IL-12 stimuliert wurden, unterliegen ebenfalls dem AICD, ausgelöst durch CD16-„crosslinking“ (Jewett, 2001;Ortaldo et al., 1995).

Die Notwendigkeit einer CD28-Kostimulation ist bei cIgTCR-transfizierten T-Zellen umstritten (Hombach et al., 2001;Ren-Heidenreich et al., 2002). In cIgTCR-Konstrukten, die zusätzlich zur ζ-Kette mit CD28-Domänen ausgestattet wurden, konnte eine Kopplung von zytotoxischen und kostimulatorischen Signalen realisiert werden (Eshhar et al., 2001;Haynes et al., 2002;Haynes et al., 2002). Derartige cIgTCR-Konstrukte könnten auch das Effektorpotential der YT-Zellen erhöhen, da YT-Zellen über CD28 in der Lage sind, CD80+ Tumorzellen zu erkennen und zu lysieren (Azuma et al., 1992;Montel et al., 1995;Teng et al., 1996).

↓116

Expression der cIgTCR-Konstrukte auf den transfizierten YT-Zellen

Nach zweifacher Anreicherung exprimierten über 90% der cIgTCR-transfizierten YT-Zellen das Rezeptorkonstrukt auf ihrer Oberfläche. Die cIgTCR-Expression nahm nach einigen Wochen Zellkultur geringfügig ab. Dieser Rückgang der cIgTCR-Expression könnte auf einen Wachstumsvorteil der YT-Zellen zurückgehen, die nur den Selektionsmarker neo in ihr Genom integriert hatten. Außerdem werden cDNA-basierte Transgene häufig herunterreguliert oder inaktiviert. Durch Verwendung genomischer Sequenzen anstelle reiner cDNA-Sequenzen könnte eine Stabilisierung und Erhöhung der Expression des Transgens erreicht werden (McKnight et al., 1995). Alternativ kann durch das Einfügen von Intronsequenzen in ein Transgen dessen Expression stabilisiert werden (Yew et al., 1997).

5.4 Zytotoxizität der genmodifizierten cIgTCR+ YT-Zellen

Zytotoxizität der scBW431/26-hFc + YT-Zellen gegenüber CEA + Tumorzellinien

↓117

Ein wichtiges Kriterium für ein erfolgreiches Tumortargeting der cIgTCR-transfizierten YT-Zellen ist der Nachweis der spezifischen Lyse von Tumorzellen. Die scBW431/26-hFcζ-transfizierten YT-Zellen lysierten 50% der CEA-transgenen MC32A-Zellen. Die Lyse war auch bei kleinen E : T-Verhältnissen sehr effizient. Die CEA- Ursprungszellinie der MC32A-Zellen, die Zellinie MC38, wurde dagegen durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen nicht lysiert. Die CEA-spezifische Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen konnte nur auf den Gentransfer des cIgTCR-Konstrukts zurückgeführt werden, da die mock-transfizierten YT-Zellen, die phOx-spezifischen scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen und die CD33-spezifischen scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen keine Zytotoxizität gegenüber den CEA+ MC32A-Zellen vermittelten.

Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen erzielten gegenüber den humanen Kolonkarzinomzellinien eine geringere Zytotoxizität als gegenüber den CEA-transgenen MC32A-Zellen. Eine Lyse von 10 – 15% gegenüber den humanen Kolonkarzinomzellinien LoVo, LS174T, SW948 und SW1222 durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen war für ein „Tumor targeting“ unspektakulär. Trotzdem korrelierte die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen in allen Versuchen mit den FACS-Analysen, in denen die Tumorzellinien mit dem scBW431/26-hFc-Protein gefärbt wurden. Die Immunfärbungen mit dem Antikörper CEJ065 zeigten dagegen keine Korrelation zur Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen. Deshalb lassen nur Immunfärbungen mit dem scBW431/26-hFc-Protein Aussagen über die potentielle Wirkung der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen zu. Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen könnte gegenüber klinischen Tumoren größer sein, weil der Ursprungsantikörper BW431/26 erfolgreich zur Färbung von Tumorbiopsien (Batge et al., 1986) und zur in-situ-Radiodiagnostik zum Nachweis von Kolorektalkarzinomen und anderen CEA+ Adenokarzinomen eingesetzt wurde (Baum et al., 1989;Baum et al., 1989;Boeckmann et al., 1990;Hertel et al., 1990). Weitere Untersuchungen müssen noch zeigen, ob klinische CEA+ Tumore effizienter durch die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen erkannt und lysiert werden.

Hombach et al. (Hombach et al., 1999;Hombach et al., 2000) ermittelten nach dem retroviralen Gentransfer von T-Zellen mit einem CEA-spezifischen cIgTCR-Konstrukt eine mit dieser Arbeit vergleichbare Zunahme der Zytotoxizität gegenüber den Kolonkarzinomzellinien LoVo und LS174T. Bei diesen Studien zeigten die mock-transfizierten T-Zellen eine hohe unspezifische Hintergrundlyse, die durch die Aktivierung der T-Zellen mit IL-2 verursacht wird (Beecham et al., 2000;Eshhar et al., 2001). Im Gegensatz dazu wurde keine unspezifische Zytotoxizität durch den cIgTCR-Gentransfer in die YT-Zellen festgestellt, da mock- und scPhOx-hFcζ-transfizierte YT-Zellen in den parallel durchgeführten Ansätzen keine Lyse gegenüber den untersuchten Kolonkarzinomzellinien vermittelten.

↓118

Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ + YT-Zellen gegenüber phOx-markierten Zellen

Die als Effektorzellkontrollen eingesetzten scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen wurden ebenfalls auf die Funktionalität ihres cIgTCR-Konstruktes untersucht. Dafür wurden Tumorzellen mit dem Hapten PhOx chemisch markiert. Die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen lysierten spezifisch nur die PhOx-gelabelten Zielzellen. T-Zellen wurden erfolgreich mit cIgTCR-Konstrukten spezifisch für das Hapten 2,4,6-Trinitrophenol (TNP) gegen TNP-markierte Zellinien abgerichtet (Eshhar et al., 2001;Eshhar et al., 1993;Goverman et al., 1990). Durch eine gezielte Markierung von Tumorzellen mit Haptenen wäre ein therapeutischer Einsatz haptenspezifischer Effektorzellen denkbar. Neben künstlichen Haptenen gibt es auch biologische Haptene, wie protein- und lipidassoziierte Kohlenhydrate. Yun et al. (Yun et al., 2000) transfizierten T-Zellen mit einem cIgTCR-Konstrukt spezifisch für das Gangliosid GD3 und erreichten die spezifische Lyse von GD3+ Melanomen.

Einfluß von freiem CEA auf die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ + YT-Zellen

↓119

Die Antikörperbindungsstellen können durch gelöstes Antigen blockiert werden. Dieses Problem wurde auch für cIgTCR-Konstrukte beschrieben (Daly et al., 2000;Eshhar et al., 1993;Goverman et al., 1990) und hat eine besondere Bedeutung, wenn Tumorantigene erkannt werden, die im Serum zirkulieren. Patienten mit Kolorektalkarzinomen weisen häufig CEA-Serumspiegel von 1 µg/mL (= 5,5 nM) auf (Moertel et al., 1986). Höhere Konzentrationen müssen am Ort des Tumors angenommen werden.

Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde in Gegenwart von bis zu 10 µg/mL (= 55 nM) an freiem CEA nicht gehemmt. In dieser Arbeit wurden keine höheren CEA-Konzentrationen getestet. Hombach et al. (Hombach et al., 1999) ermittelten bei Konzentrationen von 25 µg/mL (= 140 nM) an gelöstem CEA im Medium keine Hemmung der antigenspezifischen Aktivierung der Maus-CTL-Linie MD45, die mit einem CEA-spezifischen cIgTCR-Konstrukt transfiziert war. Die Zytotoxizität von T-Zellen, die mit einem GD3-spezifischen cIgTCR-Konstrukt transfiziert waren, wurde sogar durch 100 µg/mL gelöstes GD3-Gangliosid nicht gegenüber GD3+ Melanomzellen gehemmt (Yun et al., 2000).

Konkurrenz des gelösten CEA-Proteins mit den cIgTCR-Antigen-Bindungen zwischen Effektor- und Zielzellen

↓120

Eine Ursache, warum die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen durch das gelöste CEA-Protein nicht gehemmt wurde, besteht darin, daß das gelöste Antigen mit vielen cIgTCR-Antigen-Bindungen zwischen den Effektor- und Zielzellen konkurrieren muß. Das zytotoxische Signal wird auch dann noch ausgelöst, wenn ein Teil der cIgTCR-Antigen-Interaktionen durch das freie Antigen blockiert wurde. Eine derartige Signalschwelle zeigt sich auch bei den scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen, da deren Zytotoxizität von der Intensität der CEA-Expression auf den verschiedenen MC32A-Klonen abhing.

Beecham et al. (Beecham et al., 2000) haben diese Fragestellung ausführlich diskutiert. Sie wiesen für T-Zellen, die mit einem CEA-spezifischen cIgTCR-Genkonstrukt transfiziert waren, ebenfalls keine Inhibition der Zytotoxizität in Gegenwart von 10 µg/mL an gelöstem CEA nach. Das scFv-Fragment dieses cIgTCR-Konstruktes wurde eingehend als Immunotoxin getestet (Akamatsu et al., 1998). Mittels Scatchard-Plot-Analyse wurden 5 x 104 – 5 x 105 CEA-Moleküle auf der Oberfläche von Tumorzellen mit einer mittleren bis hohen CEA-Expression ermittelt. Die Autoren schätzten daraus (wahrscheinlich unter Annahme von 1000 µm2 Oberfläche je Zelle x 0,1 µm näherer Umgebung = 10–7 µL)eine CEA-Konzentration von 1 – 10 µM an der Oberfläche der Tumorzellen ab, die erheblich über den im nanomolaren Bereich liegenden CEA-Serumkonzentrationen liegt. Eine 50%ige Inhibition des Immunotoxins gegenüber CEA+ Tumorzellen wurde durch 4 µg/mL (= 20 nM) gelöstes CEA erzielt und entspricht der Dissoziationskonstante des scFv-Fragments (KD = 21 nM). Demnach blockieren 10 µg/mL (= 55 nM) an gelöstem CEA, das entspricht dem 2,5-fachen KD-Wert des scFv-Fragments, etwa 80% der cIgTCR-Bindungsstellen auf den cIgTCR+ T-Zellen, ohne jedoch deren Zytotoxizität zu hemmen.

Trotzdem können sich physiologisch relevante Konzentrationen an zirkulierendem Antigen hemmend auf die Zytotoxizität der cIgTCR-transfizierten Effektorzellen auswirken, wenn nur wenige Antigenbindungen mit den Zielzellen möglich sind. Weijtens et al. (Weijtens et al., 2000) zeigten, daß transfizierte T-Zellen mit einer hohen cIgTCR-Expression auch gegenüber Zielzellen mit geringer Antigenexpression eine Lyse vermitteln, während bei geringer cIgTCR-Expression nur Tumorzellen mit hoher Antigenexpression lysiert werden. Deshalb ist bei einer geringen cIgTCR-Expression auf den Effektorzellen oder einer geringen Antigenexpression auf den Zielzellen, ein stärkerer Einfluß von freiem Antigen zu erwarten. Eine hohe cIgTCR-Expression auf den genmodifizierten Effektorzellen kann durch den Herstellungsprozeß erreicht werden. Einige Tumorantigene werden durch bestimmte Zytokine heraufreguliert. IFN-γ verstärkt die CEA-Expression auf einigen Tumorzellinien (Yan et al., 1992). Ob die IFN-γ-Sekretion der YT-Zellen diesen Effekt auf die verwendeten Kolonkarzinomzellinien ausübt, wurde jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht.

↓121

Einfluß von Affinität und Avidität des scBW431/26-hFcζ-Rezeptors auf die Hemmung durch zirkulierendes CEA

Neben der Zahl der cIgTCR-Antigen-Bindungen zwischen Effektor- und Zielzellen können weitere Faktoren die Inhibition durch freies Antigen verhindern. Bei der Analyse der Tumorzellinien wurde bereits angenommen, daß das scBW431/26-hFc-Protein spezifisch an homodimere CEA-Komplexe bindet. Bei physiologischen Konzentrationen bildet gelöstes CEA keine Dimere und sollte deshalb nur schwach an das scBW431/26-hFc-Protein binden. Für den Ursprungsantikörper BW431/26 wurde ebenfalls die Irrelevanz von zirkulierendem CEA im Serum von Patienten beschrieben. Ein 20-facher molarer Überschuß an gelöstem CEA konnte seine Antigenbindung im ELISA nicht blockieren (Bosslet et al., 1988). Bei den meisten CEA-spezifischen Antikörpern wurde dagegen eine Hemmung bei geringeren CEA-Konzentrationen festgestellt (Murakami et al., 1996).

Aufgrund vergleichbarer Bindungseigenschaften des scBW431/26-hFc-Proteins und des cIgTCR-Konstruktes scBW431/26-hFcζ sollten die gelösten CEA-Monomere nur schwach an die scBW431/26-hFcζ-Rezeptoren auf den genmodifizierten YT-Zellen binden und deren Zytotoxizität nicht blockieren. Gleichzeitig kann vermutet werden, daß eine effektive Antigenerkennung der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen erst aufgrund der Dimerisierung der cIgTCR-Konstrukte über ihre humane Fc-„Spacer“-Domäne möglich wurde. Dadurch wurde zwar das Zielspektrum der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen auf Tumorzellen mit homodimeren CEA-Komplexen eingeschränkt, aber andererseits einer inhibitorischen Wirkung von zirkulierendem CEA entgegengewirkt.

↓122

Hombach et al. (Hombach et al., 2000) bewerteten das Einfügen des Fc-Teils in ihr CD30-spezifisches cIgTCR-Konstrukt und die damit verbundene Homodimerisierung des Rezeptors hinsichtlich einer inhibitorischen Wirkung durch das gelöste Antigen kritisch. Sie ermittelten, daß die scFv-Fc-γ-transfizierten T-Zellen (mit Fc-„Spacer“-Domäne) bei einer 5 – 10-fach geringeren Konzentration an freiem CD30 gehemmt wurden verglichen mit T-Zellen, die mit dem scFv-γ-Rezeptorkonstrukt (ohne Fc-„Spacer“-Domäne) transfiziert waren. Die Autoren erwähnten in ihrer Diskussion jedoch nicht, daß sie ein CD30-Fc-Fusionsprotein als gelöstes Antigen einsetzten. Das CD30-Fc-Dimer kann mit den homodimeren scFv-Fc-γ-Rezeptoren eine bivalente Bindung und mit den monomeren scFv-γ-Rezeptoren nur eine schwache monovalente Bindung eingehen. Die im Serum zirkulierenden CD30-Monomere können dagegen nur monovalent an beide cIgTCR-Arten binden. Deshalb sollte die über den Fc-„Spacer“ vermittelte Dimerisierung des scFv-Fc-γ-Konstruktes unter physiologischen Bedingungen keinen Nachteil bezüglich einer Hemmung durch freies CD30 spielen.

Die Dimerisierung der cIgTCR-Konstrukte könnte jedoch in Abhängigkeit von ihrer Affinität und Avidität sowie von der Struktur des Antigens in seiner membrangebundenen und gelösten Form einen großen Einfluß auf die Inhibition durch gelöstes Antigen ausüben.

Einfluß von gelöstem Antigen mit multiplen Epitopen auf die Zytotoxizität der cIgTCR + -YT-Zellen

↓123

Die Ausführungen des vorigen Abschnitts legen nahe, daß homodimere cIgTCRs durch gelöstes Antigen mit multiplen Epitopen bei physiologischen Konzentrationen blockiert werden könnten. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde die Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber phOx-markierten Zielzellen in Gegenwart von gelöstem PhOx-BSA mit einzelnen oder multiplen PhOx-Gruppen untersucht. Das BSA-Protein wurde hierfür mit dem zweifachen oder 20-fachen molaren Überschuß an PhOx gelabelt. Außerdem wurde die Bindungshemmung des scPhOx-hFc-Proteins bei verschiedenen Konzentrationen dieser gelösten Antigene untersucht, um Rückschlüsse auf die Anzahl blockierter cIgTCRs auf den scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen ziehen zu können.

Die Lyse der PhOx-markierten Zielzellen durch die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen wurde bei einer Konzentration von 1 µg/mL (= 1 – 2 x 108 M) an gelöstem (PhOx)20-BSA fast vollständig blockiert, während bei der 100-fachen Konzentration an gelöstem (PhOx)2-BSA noch keine Hemmung der Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen beobachtet wurde. Nach Einbeziehung der unterschiedlichen Zahl an PhOx-Gruppen auf den gelösten Antigenmolekülen übt das gelöste PhOx-BSA mit multiplen PhOx-Gruppen immer noch eine mindestens zehnfach stärkere inhibitorische Wirkung auf die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen aus als das PhOx-BSA mit einzelnen PhOx-Gruppen.

Die 50%ige Bindungshemmung des scPhOx-hFc-Proteins erforderte die 50 – 100-fache Konzentration an gelöstem (PhOx)2-BSA verglichen mit gelöstem (PhOx)20-BSA. Nach Berücksichtigung der PhOx-Gruppen auf den Antigenmolekülen entspricht das einem Faktor 5 – 10. Diese Ergebnisse bestätigen, daß das gelöste Antigen mit multiplen Epitopen bei deutlich geringeren Konzentrationen als das Antigen mit einzelnen Epitopen eine Hemmung der Antigenbindung des scFv-hFc-Proteins und der Zytotoxizität der cIgTCR+ YT-Zellen bewirkt.

↓124

Da das gelöste (PhOx)20-BSA mehrere cIgTCR-Komplexe auf den scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen binden kann, konnte aus der Bindungshemmung des scPhOx-hFc-Protein durch das gelöste (PhOx)20-BSA nicht der Prozentsatz an blockierten Antigenbindungsstellen auf den scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen abgeleitet werden. Im Gegensatz dazu bindet das freie (PhOx)2-BSA nur an einzelne cIgTCR-Moleküle auf den scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen, so daß aus der Bindungshemmung des scPhOx-hFc-Proteins durch das gelöste (PhOx)2-BSA eine Aussage über den Anteil blockierter Antigenbindungsstellen auf den scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen getroffen werden kann. Bei einer Konzentration von 100 µg/mL an freiem (PhOx)2-BSA wurden 60 – 80% des scPhOx-hFc-Proteins an der Antigenbindung gehindert. Bei dieser Konzentration an gelöstem (PhOx)2-BSA wurde noch keine Hemmung der Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen nachgewiesen. Dementsprechend resultierte aus der Blockierung von mindestens 60 – 80% der cIgTCR-Komplexe auf den scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen durch das gelöste (PhOx)2-BSA keine Inhibition der Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen. Wie bei den cIgTCR-transfizierten T-Zellen (Beecham et al., 2000) genügen den cIgTCR+ YT-Zellen 20 – 40% der cIgTCR-Antigen-Bindungen, um eine uneingeschränkte Zytotoxizität zu vermitteln.

Zytotoxizität der scHuM195-hFc + YT-Zellen gegenüber CD33 + myeloischen Leukämiezellinien

Nach dem Gentransfer des CD33-spezifischen cIgTCR-Konstruktes scHuM195-hFcζ in die NK-Zellinie YT wurde eine spezifische Zytotoxizität gegenüber der CD33+ AML-Zellinie KG1 nachgewiesen. Gegenüber der promyeloischen Leukämiezellinie HL60 wurde nur eine Lyse von 3% durch die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen festgestellt. Diese geringe Lyse konnte nicht auf die Erkennungseigenschaften des scHuM195-hFcζ-Rezeptors zurückgeführt werden, da sowohl KG1-Zellen als auch HL60-Zellen durch das scHuM195-hFc-Protein gefärbt wurden. HL60-Zellen werden durch DMSO zur Differenzierung eines granulozytären Phänotyps angeregt (Collins et al., 1978;Collins et al., 1979). Daraus resultierte eine geringfügige Erhöhung der Lyse durch die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen, während die mock- oder scPhOx-hFcζ-transfizierten Effektorzellkontrollen weiterhin keine Zytotoxizität vermittelten. Die DMSO-Stimulation der HL60-Zellen hatte keinen Einfluß auf Expression von CD33, MHC-Klasse Ia und den kostimulatorischen Molekülen CD80/86, die die Zunahme der Lyse erklären könnte. Im Zusammenhang mit der DMSO-Stimulation wurde jedoch auf einem großen Teil der HL60-Zellen eine Hochregulation des Integrins CD11c nachgewiesen und die Hochregulation weiterer Adhäsionsmoleküle beschrieben (Burchard et al., 1992;Goldberger et al., 1994). Adhäsionsmoleküle spielen eine wichtige Rolle bei der Zytotoxizität der NK-Zellen (Heiskala et al., 1990) und der YT-Zellinie (Liu et al., 1994). Sie unterstützen auch die Zytotoxizität cIgTCR-transfizierter T-Zellen (Weijtens et al., 1998).

↓125

Inhibitorische Mechanismen und effektorzellunabhängige antileukämische Effekte

Die Studien mit den scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen lieferten keine eindeutige Erklärung für die geringe Zytotoxizität gegenüber der promyeloischen Leukämiezellinie HL60. Deshalb kann an dieser Stelle nur spekuliert werden, wodurch ein effektives Targeting der scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen verhindert wurde. Verschiedene Körpergewebe aber auch Tumorzellen können sich vor einer NK-Zellattacke schützen. Die Expression des nichtklassischen MHC-Klasse-Ib-Moleküls HLA-G auf Tumorzellen führt zur Inhibition der Zytotoxizität der YT-Zellen (Rouas Freiss et al., 1997), während keine Hemmung auf die Expression der klassischen MHC-Klasse-Ia-Moleküle zurückgeführt werden konnte (Paul et al., 1998). HLA-G wird nur selten auf Tumorzellinien nachgewiesen (Polakova und Russ, 2000). In vielen myeloischen Leukämien wird jedoch die mRNA von HLA-G nachgewiesen, ohne daß HLA-G auf der Oberfläche exprimiert wird (Amiot et al., 1996). Die Oberflächenexpression von HLA-G kann auf AML-Blasten durch IFN-γ angeregt werden (Amiot et al., 1998;Mizuno et al., 2000). In dieser Arbeit konnte nicht mehr untersucht werden, ob die IFN-γ-Sekretion der YT-Zellen (Chuang et al., 2000) die HLA-G-Expression auf myeloischen Leukämiezellen anregt und ob daraus die geringe Zytotoxizität der scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber den HL60-Zellen resultiert.

Antikörper gegen das in die regulatorischen Prozesse der Myelopoese involvierte CD33 führen zur Hemmung der Proliferation von chronischen myeloischen Leukämiezellen und hämatopoetischen Vorläuferzellen (Mingari et al., 2001;Vitale et al., 1999) und können die Apoptose in CD33+ myeloischen Zellinien auslösen (Vitale et al., 2001). Derartige effektorzellunabhängige antileukämische Effekte werden als eine Ursache für die Erfolge der Therapien mit dem Antikörper HuM195 bei promyeloischen Leukämien diskutiert (Caron et al., 1998;Caron und Scheinberg, 1993). Die in dieser Arbeit angewendeten 51Cr-Freisetzungsassays können derartige antiproliferative und apoptotische Effekte nicht oder nur begrenzt identifizieren, so daß eine antileukämische Wirkung des CD33-spezifischen scHuM195-hFcζ-Rezeptors der transfizierten YT-Zellen nicht ausgeschlossen werden kann.

5.5 Studien mit bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen

↓126

Wachstumsinhibition der YT-Zellinie durch -Bestrahlung

Die klinische Anwendung von Effektorzellinien für eine adoptive Immuntherapie erfordert Maßnahmen, die ihr unbegrenztes Wachstum im Patienten beschränken. In dieser Arbeit wurde die γ-Bestrahlung zur Wachstumsinhibition der YT-Zellen eingesetzt. In Abhängigkeit von der Dosis schädigt die γ-Strahlung das Erbgut von Zellen in einem Maße, daß sie ihre Teilungsfähigkeit vollständig verlieren und weitere Zellteilungen zur Apoptose oder Nekrose der bestrahlten Zellen führen.

Nach einer Bestrahlung mit 2000 rad (= 20 Gy) wurde kein weiteres Wachstum der YT-Zellen beobachtet. In allen Versuchen wirkte sich diese Strahlungsdosis nach wenigen Tagen lethal auf alle bestrahlten YT-Zellen aus. Das frühe Absterben der YT-Zellen nach lethaler Bestrahlung ist auf ihre hohe Proliferationsrate zurückzuführen. Für den klinischen Einsatz der YT-Zellinie muß die Strahlendosis ausreichend hoch gewählt werden, da strahlenresistente Subpopulationen und eine höhere Strahlungstoleranz verursacht durch Streß (Weinfeld et al., 2001) berücksichtigt werden müssen.

↓127

Einfluß der -Bestrahlung auf die Zytotoxizität der scBW431/26-hFc + YT-Zellen

Die Bestrahlung könnte weitere Zelleigenschaften beeinflussen. Die Zytotoxizität der CEA-spezifischen scBW431/26-hFcζ YT-Zellen gegenüber den CEA+ MC32A-Zellen war einen Tag nach γ-Bestrahlung mit der unbestrahlter scBW431/26-hFcζ YT-Zellen vergleichbar. Nur bei sehr hohen Strahlungsdosen (> 10000 rad) war eine geringe Abnahme der Lyse zu beobachten, die möglicherweise im Zusammenhang mit der leichten Herunterregulation der cIgTCR-Expression stand. Die Zahl lebender scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen nahm drei Tage nach lethaler Bestrahlung beträchtlich ab und die verbliebenen vitalen scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen vermittelten nur eine deutlich reduzierte Zytotoxizität. Fünf Tage nach lethaler Bestrahlung war nahezu keine Zytotoxizität der bestrahlten scBW431/26-hFcζ+YT-Zellen gegenüber den CEA+ Tumorzellen nachweisbar. Deshalb kann ein effektives Wirken lethal bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen nur innerhalb der ersten beiden Tage nach der Bestrahlung erwartet werden. Eine sichere Wachstumsinhibition der cIgTCR+ YT-Zellen durch γ-Bestrahlung ist nur bei gleichzeitiger Einschränkung ihres Effektorpotentials möglich.

Trotzdem stellt die Bestrahlung gegenwärtig die einzige sichere Methode zur Wachstumsinhibition von Zellen und Zellinien dar. Einige Studien zeigen den Einsatz der zytotoxischen T-Zellinie TALL-104, die nach Bestrahlung mit 4000 rad in Mäusen (Cesano et al., 1996;Cesano et al., 1996;Cesano et al., 1997), Hunden (Cesano et al., 1996;Visonneau et al., 1999) und Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs (Visonneau et al., 2000) eingesetzt wurde. Bestrahlte (1000 rad) NK92-Zellen wurden zum Purging von Knochenmarkproben aus Leukämiepatienten verwendet (Klingemann und Miyagawa, 1996;Klingemann et al., 1996;Maki et al., 2003). Außerdem laufen Studien mit bestrahlten NK92-Zellen zur adoptiven Immuntherapie von Patienten mit fortgeschrittenen Tumorerkrankungen (Tonn et al., 2001).

5.6 Maustumormodell

↓128

Der adoptive Transfer bestrahlter scBW431/26-hFcζ + YT-Zellen zur Bekämpfung minimaler CEA + Tumore

Die Wirkung der bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurde nach den in-vitro-Studien in einem Maustumormodell in vivo untersucht. Da Mäuse ein xenogenes System für die humane NK-Zellinie YT darstellen, wurden immundefiziente NOD/SCID-Mäuse verwendet, die weder T- und B-Zellen noch NK-Zellen besitzen. Als Tumormodell wurden die CEA-transfizierten MC32A-Zellen verwendet, die sich in den in-vitro-Studien als ein gutes Target für die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen erwiesen hatten. Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen wurden vor dem adoptiven Transfer mit einer Dosis von 5000 rad lethal bestrahlt.

Im ersten Ansatz wurde die Wirkung bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen auf minimale MC32A-Tumore untersucht. 106 MC32A-Tumorzellen wurden direkt vor der Injektion mit 107 bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen gemischt und anschließend sofort in die NOD/SCID-Mäuse subkutan injiziert. Die Bildung von CEA+ MC32A-Tumoren wurde durch die gemeinsame Injektion von MC32A-Tumorzellen und bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen signifikant gehemmt. Den Kontrollgruppen wurden MC32A-Tumorzellen zusammen mit PBS oder bestrahlten PhOx-spezifischen scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen injiziert. Die Mäuse überlebten durch den gemeinsamen adoptiven Transfer von Tumorzellen und bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen 14 – 18 Tage länger als die Kontrollgruppen. Zwei Mäuse dieser Gruppe entwickelten im Gegensatz zu den Kontrollgruppen keinen MC32A-Tumor. Obwohl die Ergebnisse signifikant waren, wirken sich einzelne Abweichungen aufgrund der geringen Gruppengröße überproportional aus.

↓129

Der gewählte experimentelle Ansatz ist außerdem sehr künstlich, da niemals Effektorzellen zusammen mit Tumorzellen in einen Patienten injiziert werden. Ein Mausmodell läßt zudem nur eine begrenzte Beschreibung des adoptiven Transfers der humanen cIgTCR+ YT-Zellinie, besonders in Bezug auf eine klinische Anwendung im Menschen, zu. Trotzdem wurde durch diesen Versuch die Wirkung der bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen gegenüber CEA+ Tumorzellen in vivo gezeigt.

Vergleichbare Experimente wurden von anderen Gruppen mit rezeptorgenmodifizierten CTL durchgeführt. McGuiness et al. (McGuinness et al., 1999) konnten drei von vier NOD/SCID-Mäusen durch den adoptiven Transfer humaner T-Zellen, die mit einem TAG72-spezifischen cIgTCR-Konstrukt transfiziert waren, vor der Bildung von TAG72+ LS174T-Tumoren schützen, wenn Tumor- und Effektorzellen subkutan koinjiziert wurden. Die intraperitoneale Koinjektion der genmodifizierten TAG72-spezifischen T-Zellen verhinderte bei vier von vier NOD/SCID-Mäusen die Bildung von TAG72+ KLE-B-Zelltumoren. Untransfizierte T-Zellen hatten dagegen keinen Effekt auf die Tumorbildung. Bei diesen Experimenten wurden die cIgTCR-transfizierten T-Zellen im Gegensatz zu den scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen dieser Arbeit nicht bestrahlt.

Adoptiver Transfer bestrahlter scBW431/26-hFcζ + YT-Zellen zur Bekämpfung etablierter CEA + Tumore

↓130

In einem weiteren Experiment wurden bestrahlte scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen intratumoral in etablierte CEA+ MC32A-Tumore injiziert. Zum Zeitpunkt der ersten Injektion waren viele der subkutan implantierten MC32A-Tumore schon relativ groß (0,20 ± 0,13 cm3). Die zweimalige intratumorale Injektion von jeweils 107bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen im Abstand von einer Woche hatte keinen signifikanten Effekt auf das Wachstum der MC32A-Tumore in den NOD/SCID-Mäusen. Bei kleineren MC32A-Tumoren wurde eine geringfügige Verlangsamung des Wachstums während der Behandlungsphase mit den bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen beobachtet.

Die geringe Wirkung der bestrahlten scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen auf die etablierten CEA+ MC32A-Tumore kann darauf zurückgeführt werden, daß die MC32A-Tumore zum Zeitpunkt der ersten Injektion an die NOD/SCID-Mäuse adaptiert waren und ihr Volumen binnen weniger Tage verdoppelten. Im Gegensatz dazu waren die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen nicht an die Bedingungen in den NOD/SCID-Mäusen angepaßt und durch ihre γ-Bestrahlung in ihrem Wirkungspotential erheblich eingeschränkt.

Die Behandlung etablierter Tumore durch den adoptiven Transfer tumorspezifischer Effektorlymphozyten ist ein noch ungelöstes Problem. In einem syngenen Maussystem konnte eine kinetische Abhängigkeit zwischen der Tumorgröße und der Anzahl an adoptiv transferierten antigenspezifischen Maus-CTL, die einen tumorspezifischen TCR exprimierten, bei der Behandlung von Tumoren gezeigt werden. Es konnten sogar größere Tumore effektiv bekämpft werden (Hanson et al., 2000). Die Abhängigkeit von Tumorvolumen und der Anzahl adoptiv transferierter Effektorzellen wurde auch für bestrahlte Zellen der zytotoxischen T-Zellinie TALL-104 gezeigt. Sie bewirkten nach multiplen intraperitonealen Applikationen, daß kleinere subkutan implantierte humane Tumore (< 150 mg) lokal um 50 – 75% reduziert wurden und die Ausbildung von Lungenmetastasen unterdrückt wurde (Cesano et al., 1998). Deshalb könnte eine erhöhte Zahl an scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen und eine erhöhte Frequenz der Behandlungen zu einer stärkeren Hemmung kleinerer Tumore führen. Eine komplette Beseitigung größerer Tumore ist dagegen unwahrscheinlich.

↓131

Die durchgeführten Mausexperimente können aufgrund der geringen Zahl an Tieren pro Gruppe nur ein vorläufiges Ergebnis sein. Tiermodelle beinhalten eine Vielzahl unbekannter Faktoren, die sich erst durch größere Gruppen statistisch erfassen lassen. Die Behandlung von Mäusen mit etablierten Tumoren ist abhängig vom Tumorvolumen, so daß eine Klassifizierung der Tumore nach ihrer Größe erforderlich ist. Gleichzeitig ermöglichen größere Gruppen schwer standardisierbare Methoden, wie die intratumorale Injektion der Effektorzellen, auszugleichen. Die intratumorale Injektion von tumorspezifischen Effektorlymphozyten ist ebenfalls ein künstlicher Ansatz mit einer begrenzten Relevanz für die klinische Anwendung, da ein gut lokalisierbarer Tumor gut durch Operation oder eine gezielte Bestrahlung behandelt werden kann. Trotzdem könnte eine Nachbehandlung des Patienten durch Injektion tumorspezifischer Effektorlymphozyten in den behandelten Tumor bzw. an den Ort des entfernten Tumors eine sinnvolle Ergänzung zur konventionellen Tumortherapie darstellen. Auf die Kombination von konventionellen Tumortherapien und der adoptiven Immuntherapie wird in einem späteren Abschnitt näher eingegangen.

5.7 Allogene Abstoßung der cIgTCR+ YT-Zellen

Abstoßung der cIgTCR + YT-Zellen durch allogene Lymphozyten und NK-Zellen

Die Effektivität einer allogenen Effektorzellinie für eine adoptive Immuntherapie ist auch von der Abstoßungsreaktion durch das Immunsystem des Tumorpatienten abhängig. In früheren Experimenten wurde eine geringe Empfindlichkeit der YT-Zellinie gegenüber primären allogenen Lymphozyten beobachtet. Obwohl YT-Zellen fas auf ihrer Oberfläche exprimieren, werden sie nicht über den FasL-fas-Mechanismus zerstört (persönliche Mitteilungen von Mike Ziegner). Die Ursache für diese Unempfindlichkeit ist für die YT-Zellinie noch nicht eingehend untersucht worden. Mögliche Ursachen könnten die Wirkung von Anti-Apoptose-Genen, wie Bcl-2 oder Bcl-XL (Eischen et al., 2001), der FLIP/FLICE-Mechanismus (Kataoka et al., 1998) oder Defekte in der Death-Domäne von fas sein. Eine Unempfindlichkeit gegenüber der fas-induzierten Apoptose wurde auch für T-Zellen in Abhängigkeit von ihrer Quelle und Aktivierung gezeigt (Shiraki et al., 1997;Walker et al., 2000;Walker et al., 1997). Die TAG72+ Kolonkarzinomzellinie LS174T, die FasL auf ihrer Oberfläche exprimiert, induzierte keine Apoptose humaner fas + T-Zellen, die mit einem TAG72-spezifischen cIgTCR transfiziert waren (McGuinness et al., 1999).

↓132

In der vorliegenden Arbeit wurde nur eine sehr geringe Lyse der YT-Zellen durch frisch isolierte periphere Lymphozyten oder NK-Zellen festgestellt. Die Lyse durch allogene PBL und NK-Zellen war gegenüber den cIgTCR-transfizierten YT-Zellen geringfügig erhöht und schien von der Höhe der cIgTCR-Expression abzuhängen. Wahrscheinlich wurde die Lyse durch CD16+ T- oder NK-Zellen vermittelt, die die humane Fc-„Spacer“-Domäne der cIgTCR-Konstrukte erkennen. Die Erkennungsorte für den Fc(γ)RIIIa-Rezeptor (CD16) sind in der CH2-Domäne des humanen IgG1-Fc-Teils lokalisiert. In der CH2-Domäne ist auch die Erkennungsstruktur für den Komplementfaktor C1q vorhanden, so daß eine hohe cIgTCR-Expression auf den YT-Zellen die Komplementreaktion aktivieren könnte. Eine mögliche Komplementaktivierung durch die cIgTCR+ YT-Zellen wurde nicht untersucht, jedoch schützen sich viele Körperzellen vor der low-Level-Aktivierung des Komplements im Serum durch Expression von CD55 (DAF, decay-accelerating factor), CD59 (Protectin) und CD46 (MCP, membrane cofactor protein).

McGuiness et al. (McGuinness et al., 1999) konstruierten ein cIgTCR-Konstrukt, dessen IgG1-hinge-Region unter Deletion der CH2-Domäne direkt mit der CH3-Domäne fusioniert war. Die Expression und Funktion dieses cIgTCR-Konstruktes wurde in humanen T-Zellen demonstriert. Die Entfernung der CH2-Domäne aus den cIgTCR-Konstrukten ist auch für die Genmodifikation der YT-Zellinie sinnvoll, um einer Attacke von CD16+ zytotoxischen Lymphozyten und Neutrophilen sowie einer möglichen Komplementreaktion aus dem Weg zu gehen.

Stimulation allogener Lymphozyten durch die cIgTCR + YT-Zellen

↓133

YT-Zellen exprimieren wie andere NK-Zellen kostimulatorische Moleküle und MHC-Moleküle (Klasse-I und -II) und könnten potentiell als antigenpräsentierende Zellen wirken (Roncarolo et al., 1991). Die Kokultivierung allogener PBL mit bestrahlten mock-transfizierten oder cIgTCR+ YT-Zellen führte zu keiner Zunahme der Zytotoxizität der „stimulierten“ PBL gegenüber den mock- und cIgTCR-transfizierten YT-Zellen. Im Rahmen dieses Ansatzes wurde keine spezifische Stimulation der allogenen PBL durch die mock-transfizierten YT-Zellen oder cIgTCR+ YT-Zellen nachgewiesen.

Diese in-vitro-Experimente lassen nur begrenzte Aussagen zu, ob und wie schnell cIgTCR+ YT-Zellen vom Immunsystem eines Patienten eliminiert werden und wie stark ihre Wirkung dadurch eingeschränkt wird. Der adoptive Transfer von bis zu 108 Zellen je kg Körpergewicht der allogenen zytotoxischen T-Zellinie TALL-104 in Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs wurde gut toleriert und nach wiederholten Injektionen keine zelluläre Immunisierung gegenüber der fremden Effektorzellinie beobachtet (Visonneau et al., 2000).

Obwohl die Allogenität der YT-Zellen viele Angriffspunkte für eine Abstoßung durch das Immunsystem des Patienten bietet, kann auch die Genmodifikation der YT-Zellen kritisch sein. Insbesondere nichthumane Gene können aufgrund ihrer höheren Immunogenität zu einer Immunreaktion führen. In diesem Zusammenhang kann auch der Selektionsmarker des Vektors problematisch sein (Bordignon et al., 1999;Liberatore et al., 1999). Die in dieser Arbeit konstruierten cIgTCRs wurden aus humanen Komponenten erzeugt und sollten nicht immunogen sein. Aufgrund der humanisierten V-Regionen der scFv-Fragmente können keine HAMAs (human anti-mouse antibodies) auftreten, die die cIgTCRs blockieren. Die Bildung von blockierenden Anti-Idiotypen-Antikörpern oder Antikörpern gegen den Linker der scFv-Fragmente sind damit jedoch nicht ausgeschlossen.

5.8 Potential der cIgTCR+ YT-Zellen für die klinische Anwendung

↓134

„Bystander-Killing“ und multispezifische Effektorzellen

Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, daß die Spezifität der humanen NK-Zellinie YT durch den Gentransfer tumorspezifischer cIgTCR-Konstrukte auf andere Tumorarten erweitert werden kann. Trotzdem stellen sich noch viele Fragen, die im Zusammenhang einer möglichen klinischen Anwendung der cIgTCR+ YT-Zellen von Bedeutung sind.

Der Gentransfer der cIgTCR-Konstrukte in die YT-Zellen führte zur spezifischen Lyse der Zielzellen, die das Antigen des Rezeptors auf ihrer Oberfläche exprimierten. Antigennegative Tumorzellen wurden dagegen durch die cIgTCR+ YT-Zellen nicht erkannt und scheinen unbeeinflußt weiterzuwachsen. Dieses geringe „Bystander-Killing“ wurde auch für cIgTCR-transfizierte humane T-Zellen beschrieben (McGuinness et al., 1999). Einerseits werden gesunde Gewebe nicht in Mitleidenschaft gezogen, so daß cIgTCR+ YT-Zellen auch zur Behandlung von Tumoren in kritischen Organen, z. B. dem Gehirn, eingesetzt werden könnten. Andererseits ist die Wirkung der cIgTCR+ YT-Zellen auf den Teil der Tumorzellen begrenzt, die das Antigen des Rezeptors exprimieren. Die heterogene Antigenexpression auf Tumoren führt bei der Behandlung mit antigenspezifischen cIgTCR+ Effektorzellen zur Selektion antigennegativer Tumorzellen (Beecham et al., 2000).

↓135

Durch Verwendung multispezifischer Effektorzellen könnte dieses Problem verhindert werden, weil sich dadurch die Wahrscheinlichkeit verringert, daß einzelne Tumorzellen keines der Tumorantigene exprimieren. Allogen immunisierte T-Zellen, die mit einem tumorspezifischen cIgTCR-Konstrukt transfiziert worden waren, zeigten eine cIgTCR-Antigenspezifität gepaart mit Alloreaktivität und eine Antitumorwirkung in vivo (Kershaw et al., 2002). Die Transfektion EBV-spezifischer T-Zellen mit einem CD19-spezifischen cIgTCR-Konstrukt führte zu einer dualen Antigenspezifität (Roessig et al., 2002;Rossig et al., 2002). Der Gentransfer von zwei unterschiedlichen cIgTCR-Konstrukten in T-Zellen führte ebenfalls zur Erweiterung ihrer Erkennungseigenschaften (Patel et al., 2000). Genmodifizierte Maus-T-Zellen, die zwei unterschiedliche TCRs mit einer Spezifität für ein Peptid aus dem Ovalbumin (ova257) und dem Lymphozyten-Choriomeningitis-Virus-Glykoprotein gp33 exprimierten, konnten nach adoptivem Transfer das Wachstum von ova257+ und gp33+ B16-Melanomen supprimieren (Gladow et al., 2004).

Der stabilen Expression von mehreren Transgenen in einer Zelle sind in der Praxis Grenzen gesetzt. Deshalb erscheint der Einsatz von unterschiedlichen YT-Zellen, die jeweils mit einem anderen cIgTCR-Konstrukt transfiziert worden sind, sinnvoller, als die YT-Zellinie mit mehreren Rezeptorgenen auszustatten. Ein Gemisch aus unterschiedlichen rezeptorgenmodifizierten YT-Zellen könnte sogar individuell für den Patienten zusammengestellt werden.

Verbesserung der Effektoreigenschaften der YT-Zellen

↓136

Die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen erzielten gegenüber den myeloischen Leukämiezellinien nur eine geringe Lyse, obwohl das Rezeptorantigen auf den Zielzellen mit dem scHuM195-hFc-Protein nachgewiesen werden konnte. Deshalb können große Reserven im Effektorpotential der YT-Zellen vermutet werden. Die Expression von inhibitorischen und aktivatorischen NK-Zellrezeptoren wurde für die YT-Zellinie noch nicht umfassend durchgeführt. Trotzdem wurden aus den YT-Zellen Subzellinien mit unterschiedlichen zytotoxischen Eigenschaften isoliert (Lin Chua und Brahmi, 2002;Montel et al., 1995;Su et al., 1994).

Die Genmodifikation der YT-Zellinie kann nicht nur zur Erweiterung ihrer Spezifität sondern auch zur Verbesserung ihrer Effektoreigenschaften genutzt werden. Auf diese Weise könnten inhibitorische NK-Zellrezeptoren oder deren Signalwege inaktiviert oder herab-reguliert werden (z. B. durch RNAi) oder aktivatorische Rezeptoren und ihre Signalwege verstärkt werden. Die Transfektion von Zytokingenen in Lymphozyten kann deren Effektoreigenschaften steigern (Hwu et al., 1993), führt jedoch in einigen Fällen zur Apoptose der genmodifizierten Lymphozyten (Ebert et al., 1997). Außerdem können Zytokine, die in vitro zytotoxisch auf Tumorzellen wirken, in vivo aufgrund komplexer modulatorischer Funktionen das Wachstum von Tumoren fördern oder die Tumorimmunität supprimieren (Bordignon et al., 1999). Ein lysosomales Protein-Targeting durch spezielle Signalsequenzen wurde für den löslichen TNF-Rezeptor-1 in der YT-Zellinie demonstriert und verhindert eine konstitutive TNFR-1-Sekretion (Hansson et al., 2003). Dieser Ansatz könnte zur Anreicherung anderer zytotoxischer Proteine in den Granula der YT-Zellen genutzt werden, die erst an den Zielzellen freigesetzt werden sollen. Die Transfektion von CD16 in die YT-Zellinie führte zu allgemein verbesserten zytotoxischen Eigenschaften und einer verstärkten IFN-γ-Sekretion (Deaglio et al., 2002).

Tumortaxis und Applikation der cIgTCR + YT-Zellen

↓137

Eine wichtige Eigenschaft von Effektorzellen für eine adoptive Immuntherapie ist die Fähigkeit, zum Ort des Tumors wandern zu können. Eine tumorgerichtete Chemotaxis ist die Voraussetzung für eine intravenöse Applikation der Effektorzellen. In einem Vorexperiment mit fluoreszenzmarkierten YT-Zellen konnte keine spezifische Anreicherung der CEA-spezifischen scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen in CEA+ MC32A-Tumoren, die in NOD/SCID-Mäusen etabliert wurden, festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Eine Chemotaxis im Menschen und gegenüber humanen Tumoren ist damit jedoch nicht ausgeschlossen.

Moritz et al. (Moritz et al., 1994) ermittelten nach intravenöser Injektion fluoreszenzmarkierter Zellen der Maus-CTL-Linie CI96, die mit einem ErbB2-spezifischen cIgTCR transfiziert war, eine spezifische Lokalisation in etablierten ErbB2-transgenen NIH3T3-Tumoren. Das Wachstum dieser Tumore wurde sogar geringfügig gehemmt. Eine über die ζ-Signalkette vermittelte Chemotaxis ist jedoch fraglich und andere Mechanismen des Maus-T-Zellhybridoms CI96 müssen diskutiert werden. Biodistributionsversuche mit radioaktiv markierten TALL-104-Zellen, die intravenös in Mäusen injiziert wurden, ergaben zuerst eine Anreicherung in der Lunge, später in der Leber, der Milz und der Niere. Eine beständige Akkumulation der TALL-104-Zellen wurde auch im Tumor und in den Metastasen festgestellt (Cesano et al., 1999).

Wenn die YT-Zellen über keine tumorgerichtete Chemotaxis verfügen und damit eine intravenöse Applikation der scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen zur Behandlung von soliden CEA+ Tumoren und Metastasen ausscheidet, müßte ihre Injektion intratumoral erfolgen, um sie an ihren Wirkungsort zu bringen. Dieser Ansatz macht jedoch wenig Sinn, da er auf gut lokalisierbare Tumore beschränkt ist, die effektiv chirurgisch entfernt werden können. Die scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen könnten jedoch an den Ort des chirurgisch entfernten Tumors appliziert werden, um dort restliche Tumorzellen aufzuspüren und zu vernichten.

↓138

Eine weitere Möglichkeit besteht im Gentransfer oder der Aktivierung von Chemokinrezeptorgenen in den YT-Zellen. Chemokinrezeptoren nehmen in Abhängigkeit von der Konzentration ihrer Liganden über G-Protein-vermittelte Signalwege Einfluß auf die Polarität und Motilität der Zelle (Mellado et al., 2001;Power, 2003). Die Sekretion verschiedener Chemokine, z. B. IL-8, wurde für Melanome beschrieben (Payne und Cornelius, 2002) und im Überstand von Tumorzellinien nachgewiesen (Takamori et al., 2000). Viele Chemokine werden auch durch andere Prozesse induziert und sind deshalb meistens nicht tumorspezifisch. Die Chemotaxis in das Körpergewebe, wo der Tumor lokalisiert ist, könnte genügen, die YT-Zellen nahe genug an ihren Wirkungsort zu bringen. Neuronale Stammzellen folgen Tumorzellen über einen noch unbekannten Mechanismus und werden als Vehikel für Chemotherapeutika diskutiert (Aboody et al., 2000;Yip et al., 2003). Fusionsproteine aus Antikörperbindungsdomäne und Chemokinanteil können die Erkennung tumorspezifischer Antikörper mit den chemotaktischen Eigenschaften von Chemokinen koppeln (Challita-Eid et al., 1998).

Neovaskularisierung solider Tumore – Barriere oder Ziel?

Solide Tumore bilden häufig komplexe Strukturen und müssen ab einer Größe von 1 – 2 mm eigene Blutgefäße für ihre Sauerstoff- und Nährstoffversorgung bilden. Diese tumor-assoziierten Gefäße werden durch Rekrutierung von Endothelzellen erzeugt und verhindern den direkten Kontakt von Immunzellen oder Antikörpern aus Blut und Lymphe mit dem Tumor. Die bei der Neovaskularisierung hervorgebrachten Endothelzellen unterscheiden sich durch die Expression von VEGF/VEGF-Rezeptorkomplexen (vascular endothelial growth factor) gegenüber den Endothelien normaler Gefäße (Brekken und Thorpe, 2001). Eine Zerstörung tumorassoziierter Gefäße durch VEGF-Rezeptor-Inhibitoren (Shaheen et al., 1999) könnte neben der Antitumorwirkung auch einen direkten Zugang für Lymphozyten aus dem Blut ermöglichen. Endzündliche Prozesse als eine Folgereaktion des Tumorwachstums führen zusammen mit der Freisetzung von inflammatorischen Mediatoren und Zytokinen zur Hochregulation von Adhäsionsmolekülen auf den lokalen Endothelzellen und Leukozyten (Oberyszyn et al., 1998). IFN-γ, TNF-α und IL-1β regulieren ICAM-2 herunter, wodurch die Durchlässigkeit zwischen den Endothelzellen erhöht und die Extravasation von Immunzellen erleichtert wird (McLaughlin et al., 1998). Tumorassoziierte neovaskularisierte Endothelien reagieren jedoch schwächer auf diese endzündlichen Prozesse (Griffioen et al., 1996). Die humanen NK-Zellinien YT und NK92 exprimieren VEGF-β und seinen Rezeptor VEGFR-1 (Flt-1) und adhärieren in vitro unter Einfluß von Angiogenesefaktoren an neugebildete humane Mikrogefäße (Chen et al., 2002). Trotzdem fehlen noch Daten, die ihre Adhäsion an Tumorgefäßen und ihre Migration in das Tumorgewebe in vivo belegen.

↓139

Ein Targeting der YT-Zellen gegen tumorassoziierte Gefäße könnte durch Gentransfer rekombinanter Rezeptoren erreicht werden. Die Transfektion eines chimären Rezeptors mit Spezifität für den angiogenen Endothelzellrezeptor KDR in Lymphozyten führte zur Lyse von KDR+ Zellen. Außerdem wurde die Sekretion des Chemokins IL-8 und die Expression der Adhäsionsmoleküle VCAM und E-Selektin in HUVECs (human umbilical vein endothelial cells) induziert, die eine wichtige Rolle für die Immunantwort am Tumor spielen (Kershaw et al., 2000). Die Konstruktion eines Fusionsrezeptors aus dem Disintegrin Kistrin, das hochaffin an das Integrin αVβ3 auf angiogenen Endothelzellen bindet, mit der Transmembrandomäne des Adhäsionsmoleküls CD31 (PECAM-1) führte nach Transfektion in Lymphozyten zu deren Akkumulation im Tumor (Wiedle et al., 1999). Als weitere Ziele neovaskularisierter Gefäße werden CD44 (Griffioen et al., 1997) oder der Tissue-Faktor (Ran et al., 1998;Rickles et al., 2001) diskutiert.

Behandlung von myeloischen Leukämien mit den scHuM195-hFcζ + YT-Zellen

Die Zytotoxizität der CD33-spezifischen scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen war gegenüber den myeloischen Leukämiezellinien aus noch ungeklärten Gründen gering. Weiterhin ist für eine klinische Anwendung problematisch, daß CD33 kein „tumorspezifisches“ Antigen ist. CD33 wird auf myelomonozytären Vorläuferzellen exprimiert und geht erst auf reifen Granulozyten verloren (Kansas et al., 1990). Gesunde CD33+ Leukozyten können die Wirkung der scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen zusätzlich einschränken. Nebenwirkungen aufgrund der Zerstörung gesunder CD33+ Vorläuferzellen durch die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen sollten dagegen nur vorrübergehend auftreten, da sie aus CD33- hämatopoetischen Stammzellen regeneriert werden. Antikörpertherapien zeigen, daß eine CD33-spezifische Therapiestrategie bei myeloischen Leukämien trotz eingeschränkter Tumorspezifität durchführbar und wirksam ist (Burke et al., 2002;Caron et al., 1995;Caron und Scheinberg, 1993;Kossman et al., 1999). Die scHuM195-hFcζ+ YT-Zellen könnten auch zur Behandlung des myelodysplastischen Syndroms (MDS) eingesetzt werden, das ein hohes Leukämierisiko besitzt (Matthews, 1998;Schwartz et al., 1993). Zum Zielspektrum der NK-Zellinie YT gehören B-Zellinien, so daß die YT-Zellen zur Behandlung von B-Zelltumoren eingesetzt werden könnten.

↓140

Alternativen zur Wachstumsinhibition der YT-Zellen

Die Wachstumsinhibition der cIgTCR+ YT-Zellen durch γ-Bestrahlung ist mit einer erheblichen Verringerung ihres Effektorpotentials verbunden. Unbestrahlte cIgTCR+ YT-Zellen verfügen über eine größere Effektorwirkung, sind aber in ihrem klinischen Einsatz nicht sicher. Eine alternative Methode zur γ-Bestrahlung der cIgTCR+ YT-Zellen könnte durch ihre stabile Transfektion mit Suizidgenen erreicht werden (Lal et al., 2000), die nichttoxische Vorstufen (prodrugs) in zytotoxische Verbindungen umsetzen. Die Cytosindesaminase (Wirkstoff: 5‘Fluorouracil) und die Thymidinkinase (Wirkstoff: Ganciclovir) bewirken sogar ein „Bystander-Killing“ (Degreve et al., 1999;Mesnil und Yamasaki, 2000;Nishihara et al., 1998), das eine zusätzliche Antitumorwirkung erzielen könnte. Suizidgenstrategien zeigten unbefriedigende Ergebnisse bei allogenen Donorlymphozyten, um die durch sie ausgelöste GvHD zu verhindern (Bordignon et al., 1999). Dementsprechend ist mit Suizidgenstrategien keine sichere klinische Anwendung der cIgTCR+ YT-Zellen möglich.

Kombination von konventioneller Tumortherapien mit der adoptiven Immun-therapie

↓141

Die Ergebnisse dieser Arbeit und anderer Publikation belegen, daß die adoptive Immuntherapie nicht als Primärtherapie zur Behandlung größerer Tumore eingesetzt werden kann. Dagegen gibt es gute Gründe für die Kombination konventioneller Tumortherapien (Operation, Strahlen- und Chemotherapie) mit der adoptiven Immuntherapie, da beide Therapieformen voneinander profitieren. Mit den konventionellen Tumortherapien können große Tumorvolumina erheblich reduziert werden, wozu gegenwärtig kein adoptiver Immuntherapieansatz in der Lage ist. Im Gegensatz dazu könnten adoptiv transferierte tumorspezifische Lymphozyten kleinste verbliebene Tumorherde aufspüren und vernichten, die die konventionelle Tumortherapie überstanden haben. Bei diesen minimalen Resterkrankungen (minimal residual diseases) handelt es sich häufig um wenige Tumorzellen, aus denen jedoch schnell ein Tumorrezidiv hervorgehen kann.

Synergistische Effekte von Chemotherapie und dem adoptiven Transfer von LAK-Zellen (+ IL-2) wurden gezeigt (Kawata et al., 1990;Kawata et al., 1995). Die chirurgische Entfernung der Primärtumormasse subkutan implantierter humaner Tumore in Mäusen führte zu einer verbesserten Antitumorwirkung adoptiv transferierter bestrahlter Zellen der zytotoxischen T-Zellinie TALL-104 (Cesano et al., 1998). Die Chemotherapie mit Adriamycin ergab in Kombination mit dem adoptiven Transfer von TALL-104-Zellen eine bessere Prognose (Cesano et al., 1997). Der Einsatz von Cyclophosphamit verringerte die tumorinduzierte Suppression von T-Zellen (Awwad und North, 1988;North, 1982). Die Transfektion des Multi-Drug-Resistance-Gens (mdr1, P-Glykoprotein) in die YT-Zellinie bewirkte eine stärkere Resistenz gegen R-Verapamil. Die zytotoxischen Mechanismen der mdr1-transfizierten YT-Zellen wurden dadurch kaum beeinflußt (N'Cho et al., 1999), so daß mdr1 + YT-Zellen sogar während einer Chemotherapie eingesetzt werden könnten.

Einfluß cIgTCR + YT-Zellen auf die Tumorimmunität des Patienten

↓142

Das Immunsystem des Tumorpatienten kann nicht nur als potentieller Inhibitor der adoptiv transferierten cIgTCR+ YT-Zellen sondern auch synergistisch wirken. Eine NK-Zellantwort geht bei viralen Infektionen einer T-Zellanwort voraus. Aktivierte NK-Zellen stimulieren über die Sekretion von IFN-γ die Th1-Antwort und damit die Bildung antigenspezifischer CTL. Tumorspezifische CTL gelten als die wichtigste „Waffe“ des Immunsystems im Kampf gegen Tumorzellen. Die humane NK-Zellinie YT zeigt einen aktivierten Phänotyp (Yamabe et al., 1997) und sekretiert IFNγ (Chuang et al., 2001;Johnson et al., 2000). Die Wirkung der YT-Zellen auf das Immunsystems eines Patienten bedarf noch einer eingehenden Untersuchung.

Vorbereitung der cIgTCR + YT-Zellen für klinische Studien

Für den klinischen Einsatz genmodifizierter YT-Zellen müssen standardisierte Chargen unter klinischen GMP-Bedingungen (good manufacturing practise) hergestellt werden. Ausgangspunkt ist die Etablierung eines Zellstammes aus der YT-Zellinie, der auf Viren, Mykoplasmen und andere Mikroorganismen getestet sein muß. Aus diesem standardisierten und gut charakterisierten Zellstamm muß der Gentransfer der cIgTCR-Konstrukte erfolgen. Die Stabilität der genetischen Modifikation und der Eigenschaften der YT-Zellen muß beim Herstellungsprozeß gewährleistet werden, um definierte Chargen der cIgTCR+ YT-Zellen erzeugen zu können. Ein Schwerpunkt ist das Einfrieren der cIgTCR+ YT-Zellen zur Lagerung und das Auftauen ohne größeren Funktionsverlust vor der Anwendung. Die Expansion und Herstellung von standardisierten Chargen unter klinischen GMP-Bedingungen wurde für die humanen zytotoxischen Zellinien TALL-104 (Visonneau et al., 2000) und NK92 (Tam et al., 2003) beschrieben.

↓143

Schlußfolgerungen

Die humane NK-Zellinie YT verfügt über nützliche Eigenschaften für den Einsatz bei einer adoptiven Immuntherapie. Sie läßt sich in vitro ohne Zugabe von IL-2 in beliebigen Mengen expandieren und verfügt trotzdem über potente zytotoxische Effektoreigenschaften. Außerdem können YT-Zellen mit Plasmiden durch Elektroporation genetisch modifiziert werden.

Die Zytotoxizität der YT-Zellinie läßt sich durch den Gentransfer tumorspezifischer cIgTCR-Konstrukte auf andere Tumorarten erweitern. Die cIgTCR+ YT-Zellen lysieren spezifisch rezeptorantigenexprimierende Tumorzellen. Sie können für eine sichere klinische Anwendung durch γ-Bestrahlung in ihrem Wachstum begrenzt werden, ohne daß ihre Spezifität und zytotoxischen Eigenschaften verändert werden. Der zeitliche Umfang ihrer Wirkung wird aber durch die Bestrahlung eingeschränkt. Der adoptive Transfer bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen führt zu einer signifikanten Hemmung des Wachstums minimaler CEA+ MC32A-Tumore. Im Gegensatz dazu wird das Wachstum etablierter größerer Tumore durch die intratumorale Injektion bestrahlter scBW431/26-hFcζ+ YT-Zellen kaum beeinflußt. Deshalb könnte der adoptive Transfer tumorspezifischer cIgTCR+ YT-Zellen zur Therapie minimaler Resterkrankungen nach konventionellen Tumortherapien zu einer verbesserten Prognose für den Patienten führen.

↓144

Im Zusammenhang mit der Chemotaxis und den Effektoreigenschaften besitzen die YT-Zellen noch große Reserven, so daß das Wirkungspotential der YT-Zellen in Zukunft verbessert werden könnte. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob sich tumorspezifische genmodifizierte Effektorzellen auf Basis der YT-Zellinie herstellen lassen, die für die gezielte adoptive Immuntherapie von Tumorerkrankungen eingesetzt werden können.


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28.10.2005