Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Tumorspezifisches Targeting der humanen Natürlichen Killerzellinie YT durch Gentransfer chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Diplom-Biochemiker Thomas Schirrmann
geb. am 23.04.1973 in Berlin

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Thomas Buckhout

Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfgang Uckert
2. Prof. Dr. Stefan Dübel
3. PD Gabriele Pecher

eingereicht:8.11.2004

Datum der Promotion:18.03.2005

Zusammenfassung

Die spezifische adoptive Immuntherapie ist ein hoffnungsvoller Ansatz zur Behandlung von Tumoren. Die aufwendige individuelle Bereitstellung primärer Effektor lymphozyten könnte durch den Einsatz etablierter tumorantigen spezifischer Effektor zellinien vermieden werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich ein Tumortargeting der humanen Natürlichen Killer-(NK)-Zellinie YT durch den Gentransfer chimärer Immun globulin-T-Zell rezeptoren (cIgTCRs) erreichen läßt. Die cIgTCR-Konstrukte wurden aus single-chain- Fv-Fragmenten (scFv), dem IgG1-Fc-Teil und der CD3 ζ-Signalkette erzeugt. Die scFv-Fragmente wurden aus den humanisierten Antikörpern BW431/26 und HuM195, die spezifisch für das karzinoembryonale Antigen (CEA) bzw. CD33 sind, konstruiert und zeigten als scFv-hFc-Fusions proteine eine spezifische Bindung an Tumorzellen. Die YT-Zellen wurden mit den cIgTCR-Gen konstrukten über Elektroporation transfiziert und über immunologische Verfahren angereichert. In-vitro -Studien ergaben eine spezifische Lyse von CEA ⁺ Kolon karzinom zellinien durch die scBW431/26-hFc ζ ⁺ YT-Zellen. Die Zytotoxizität korrelierte mit der Expression des cIgTCR-Antigens auf den Tumor zellen und wurde durch zirkulierendes CEA nicht gehemmt. Die scHuM195-hFc ⁺ YT-Zellen zeigten eine spezifische Lyse der CD33 ⁺ myeloischen Leukämie zellinie KG1. Die γ-Bestrahlung wurde zur Wachstums begrenzung der YT-Zellen eingesetzt. Die spezifische Zytotoxizität der scBW431/26-hFc ζ ⁺ YT-Zellen gegenüber CEA ⁺ Tumor zellen war einen Tag nach Bestrahlung unverändert. Die Koinjektion von CEA ⁺ Tumor zellen mit bestrahlten scBW431/26-hFc ζ ⁺ YT-Zellen führte zu einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums in NOD/SCID-Mäusen. Die cIgTCR ⁺ YT-Zellen zeigten in vitro eine geringe Sensibilität gegenüber allogenen Blut lymphozyten.

Die Ergebnisse zeigen, daß die Zytotoxizität der NK-Zellinie YT tumor antigen spezifisch durch cIgTCR-Gentransfer erweitert werden kann und ein Potential zur Behandlung von minimalen Tumor erkrankungen besteht.

Eigene Schlagworte: Gentransfer, Natürliche Killerzellen, chimäre Immunglobulin-T-Zell, rezeptoren, adoptive Immuntherapie, Tumortargeting

Abstract

The specific adoptive immunotherapy is a promising strategy for cancer treatment. The utilization of established tumor antigen specific effector cell lines could bypass the expendable individual preparation and often limited specificity of primary effector lymphocytes. This study investigated the tumor targeting of the human Natural Killer (NK) cell line YT by gene transfer of chimeric immunoglobulin T cell receptors (cIgTCRs). The cIgTCR constructs were generated of single chain antibody fragments (scFv), the IgG1 Fc part and the CD3 ζ chain. The scFv fragments were constructed of the humanized antibodies BW431/26 and HuM195 with specificity for the carcinoembryonic antigen (CEA) and CD33, respectively, and showed as scFv-Fc fusion proteins a specific binding to tumor cells. YT cells were transfected with the cIgTCR gene constructs by electroporation and enriched by immunological cell separation. In vitro studies revealed a specific lysis of CEA ⁺ colon carcinoma cell lines by scBW431/26-hFcζ ⁺ YT cells. The cytotoxicity correlated with the expression of the cIgTCR antigen on the tumor cells and was not inhibited in the presence of soluble CEA. The scHuM195-hFcζ ⁺ YT cells mediated a specific lysis of the CD33 ⁺ myeloic leukemia cell line KG1. The γ-irradiation was used to limit the growth of the YT cell line. The specific cytotoxicity of the scBW431/26-hFcζ ⁺ YT cells against CEA ⁺ tumor cells was unaltered one day after irradiation. The coinjection of CEA ⁺ tumor cells and irradiated scBW431/26-hFcζ ⁺ YT cells led to a significant growth inhibition in NOD/SCID mice. The cIgTCR ⁺ YT cells showed a low susceptibility to the cytotoxicity of allogeneic blood lymphocytes in vitro . The results demonstrated that the cytotoxicity of the human NK cell line YT can be specifically extended to tumor antigens by cIgTCR gene transfer. The employment of receptor gene modified YT cells could be a useful tool for the adoptive immunotherapy of minimal tumor diseases.

Keywords: Gene transfer, Natural Killer cells, chimeric immunoglobulin T cell receptors, adoptive immunotherapy, tumor targeting

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
• 1.1 Immuntherapie von Tumorerkrankungen
• 1.2 Adoptive zelluläre Immuntherapie
  • 1.2.1 Prinzip der adoptiven Immuntherapie
  • 1.2.2 Adoptive Immuntherapie mit autologen LAK-Zellen und TILs
  • 1.2.3 In-vitro-Sensitivierung von autologen T-Zellen
  • 1.2.4 Genmodifikation von Lymphozyten zur Verbesserung ihrer Erkennungs- und Effektoreigenschaften
  • 1.2.5 Adoptive Immuntherapie mit autologen NK-Zellen
  • 1.2.6 Probleme autologer Strategien einer adoptiven Immuntherapie
  • 1.2.7 Allogene Spenderlymphozyteninfusionen
  • 1.2.8 Adoptive Immuntherapie mit tumorspezifischen Effektorzellinien
• 1.3 Tumorassoziierte Antigene
  • 1.3.1 Einteilung der Tumorantigene
  • 1.3.2 Das karzinoembryonale Antigen (CEA)
  • 1.3.3 CD33, ein Marker akuter myeloischer Leukämien
• 1.4 Immunologische „Escape-Mechanismen“ von Tumoren
  • 1.4.1 Toleranzinduktion durch den Tumor
  • 1.4.2 Veränderte MHC-Expression auf Tumoren
  • 1.4.3 Tumorinduzierte Immunmodulation und -suppression
• 1.5 Natürliche Killerzellen
  • 1.5.1 Allgemeine Eigenschaften von NK-Zellen
  • 1.5.2 Erkennungsmechanismen der NK-Zellen
  • 1.5.3 NK-Zellrezeptoren
  • 1.5.4 Adhäsionsmoleküle
  • 1.5.5 Signaltransduktion
  • 1.5.6 Zytotoxische Mechanismen der NK-Zellen
  • 1.5.7 Eigenschaften der humanen NK-Zellinie YT
• 1.6 Rekombinante Antikörper für ein Immuntargeting
  • 1.6.1 Antikörper
  • 1.6.2 Erzeugung humaner Antikörper
  • 1.6.3 Konstruktion von single-chain-Antikörper-Fragmenten
  • 1.6.4 Displaytechnologien zur Isolation von Antikörperfragmenten
  • 1.6.5 Expression von scFv-Fragmenten
  • 1.6.6 Bispezifische Antikörper für ein Immuntargeting
• 1.7 Tumorspezifische Rezeptoren für ein Immuntargeting
  • 1.7.1 Voraussetzungen an ein rezeptorvermitteltes Targeting
  • 1.7.2 Rekombinante T-Zellrezeptoren für das Targeting von NK-Zellen
  • 1.7.3 Targeting von Lymphozyten mit rekombinanten TCR-Konstrukten
• 2 Zielsetzung
• 3 Material und Methoden
• 3.1 Allgemeine Geräte
• 3.2 Zellkultur
  • 3.2.1 Zellinien
  • 3.2.2 Einfrieren und Auftauen von Säugerzellen
  • 3.2.3 Isolation von humanen peripheren Blutlymphozyten
  • 3.2.4 Kalziumphosphattransfektion der 293T-Zellen
• 3.3 Antikörperfärbungen
  • 3.3.1 Durchflußzytometrische Analyse von Oberflächenmarkern
  • 3.3.2 Intrazelluläre FACS-Analyse
• 3.4 Allgemeine molekularbiologische Methoden
  • 3.4.1 Bakterienkultur
  • 3.4.2 Allgemeine Methoden bei der DNA-Klonierung
  • 3.4.3 Enzymreaktionen bei der DNA-Klonierung
  • 3.4.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
  • 3.4.5 Isolation der Gesamt-cDNA humaner Blutlymphozyten
  • 3.4.6 DNA-Sequenzierung
  • 3.4.7 Immunodotblot
  • 3.4.8 ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)
  • 3.4.9 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
  • 3.4.10 Westernblot
• 3.5 Konstruktion der single-chain-Fv-Fragmente
  • 3.5.1 Konstruktion der CEA-spezifischen scFv-Fragmente scBW431/26 und scBW431/26-Yol
  • 3.5.2 Konstruktion des phOx-spezifischen scFv-Fragments scPhOx
  • 3.5.3 Expression und Westernblot-Analyse der scFv-Fragmente in E. coli
  • 3.5.4 Reinigung und Bindungsanalyse der scFv-Fragmente
• 3.6 Konstruktion der scFv-hFc-Fusionsproteine
  • 3.6.1 Konstruktion des sekretorischen Signalpeptids
  • 3.6.2 Isolation des humanen IgG1-Fc-Teils
  • 3.6.3 Konstruktion der scFv-hFc-Proteine scBW431/26-hFc und scPhOx-hFc
  • 3.6.4 Konstruktion des scHuM195-hFc-Proteins
  • 3.6.5 Expression und Analyse der scFv-hFc-Proteine
• 3.7 Herstellung chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren
  • 3.7.1 Isolation der cDNA der humanen CD3 ζ-Kette
  • 3.7.2 Konstruktion der chimären Immunglobulin-T-Zellrezeptorkonstrukte
  • 3.7.3 Expression und Analyse der cIgTCR-Konstrukte in den 293T-Zellen
• 3.8 Antigenexpression auf Tumorzellen
  • 3.8.1 FACS-Analyse phOx-markierter Zellen mit dem scPhOx-hFc-Protein
  • 3.8.2 FACS-Analyse von Tumorzellinien mit dem scBW431/26-hFc-Protein
  • 3.8.3 FACS-Analyse von Leukämiezellinien mit dem scHuM195-hFc-Protein
• 3.9 Genmodifikation der humanen NK-Zellinie YT
  • 3.9.1 Gentransfer der cIgTCR-Konstrukte in die YT-Zellen
  • 3.9.2 Analyse der cIgTCR-Expression der transfizierten YT-Zellen
  • 3.9.3 Immunologische Anreicherung der cIgTCR⁺ YT-Zellen
• 3.10 Zytotoxizitätsstudien
  • 3.10.1  ⁵¹Cr-Freisetzungsassay
  • 3.10.2 Durchflußzytometrischer Zytotoxizitätsassay
  • 3.10.3 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen
  • 3.10.4 Zytotoxizität der scHuM195-hFcζ⁺ YT-Zellen
  • 3.10.5 Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen
  • 3.10.6 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen in Gegenwart von freiem CEA-Protein
  • 3.10.7 Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen in Gegenwart von gelöstem PhOx-BSA mit einzelnen und multiplen PhOx-Gruppen
  • 3.10.8 Wirkung von gelöstem PhOx-BSA mit einzelnen und multiplen PhOx-Gruppen auf die Antigenbindung des scPhOx-hFc-Proteins
• 3.11 Studien mit bestrahlten cIgTCR+ YT-Zellen
  • 3.11.1 Bestrahlung der YT-Zellen
  • 3.11.2 Bestimmung der lethalen Strahlendosis für die YT-Zellinie
  • 3.11.3 Zytotoxizität der bestrahlten scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen
• 3.12 Maustumormodell
  • 3.12.1 Etablierung des Maustumormodells
  • 3.12.2 Adoptiver Transfer bestrahlter scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen zur Behandlung minimaler CEA⁺ MC32A-Tumore
  • 3.12.3 Adoptiver Transfer von scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen zur Bekämpfung etablierter CEA⁺ MC32A-Tumore
  • 3.12.4 Statistik
• 3.13 Abstoßung der cIgTCR⁺ YT-Zellen durch allogene Lymphozyten
  • 3.13.1 Zytotoxizität allogener PBL und NK-Zellen gegenüber den cIgTCR⁺ YT-Zellen
  • 3.13.2 Zytotoxizität allogener PBL nach Kokultivierung mit bestrahlten cIgTCR⁺ YT-Zellen
• 4 Ergebnisse
• 4.1 Konstruktion chimärer Immunglobulin-T-Zellrezeptoren
  • 4.1.1 Konstruktion der CEA- und PhOx-spezifischen scFv-Fragmente
  • 4.1.2 Bakterielle Expression and Bindungsanalyse der scFv-Fragmente scBW431/26, BW431/26-Yol, scPhOx und PhOx-Yol
  • 4.1.3 Konstruktion von scFv-hFc-Fusionsproteinen aus den scFv-Fragmenten scBW431/26 und scPhOx
  • 4.1.4 Expression und Analyse der Bindungseigenschaften der scFv-hFc-Fusionsproteine scBW431/26-hFc und scPhOx-hFc
  • 4.1.5 Konstruktion und Expression des scFv-hFc-Fusionsproteins scHuM195-hFc
  • 4.1.6 Isolation der CD3 ζ-Kette
  • 4.1.7 Konstruktion der chimären Immunglobulin-T-Zellrezeptoren
• 4.2 Antigenexpression auf den Tumorzellinien
  • 4.2.1 Färbung PhOx-markierter Zellinien durch das scPhOx-hFc-Protein
  • 4.2.2 FACS-Analyse von Tumorzellinien mit dem scBW431/26-hFc-Protein
  • 4.2.3 FACS-Analyse von myeloischen Leukämiezellinien mit dem scHuM195-hFc-Protein
• 4.3 Gentransfer der cIgTCR-Konstrukte in die humane NK-Zellinie YT
  • 4.3.1 Elektroporation der YT-Zellen mit den cIgTCR-Genkonstrukten
  • 4.3.2 Immunologische Anreicherung der cIgTCR⁺ YT-Zellen
• 4.4 Zytotoxizitätsstudien mit den cIgTCR⁺ YT-Zellen
  • 4.4.1 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen
  • 4.4.2 Zytotoxizität der scHuM195-hFcζ⁺ YT-Zellen
  • 4.4.3 Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen
  • 4.4.4 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen in Gegenwart von gelöstem CEA-Protein
  • 4.4.5 Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen in Gegenwart von gelöstem PhOx-BSA-Protein mit einzelnen oder multiplen PhOx-Gruppen
  • 4.4.6 Bindungsinhibition des scPhOx-hFc-Proteins in Gegenwart von freiem PhOx-BSA mit einzelnen oder multiplen PhOx-Gruppen
• 4.5 Studien mit γ-bestrahlten scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen
  • 4.5.1 Wachstumsinhibition der YT-Zellen durch γ-Bestrahlung
  • 4.5.2 Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen nach γ-Bestrahlung
• 4.6 Maustumormodell
  • 4.6.1 Adoptiver Transfer bestrahlter scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen zur Behandlung minimaler CEA⁺ MC32A-Tumore in NOD/SCID-Mäusen
  • 4.6.2 Adoptiver Transfer bestrahlter scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen zur Bekämpfung etablierter CEA⁺ MC32A-Tumore
• 4.7 Sensibilität der cIgTCR⁺ YT-Zellen gegenüber allogenen Lymphozyten
  • 4.7.1 Abstoßung der cIgTCR⁺ YT-Zellen durch allogene PBL und NK-Zellen
  • 4.7.2 Stimulation allogener Lymphozyten durch die cIgTCR⁺ YT-Zellen
• 5 Diskussion
• 5.1 Tumorspezifische chimäre Immunglobulin-T-Zellrezeptoren für ein Targeting der NK-Zellinie YT
• 5.2 Antigenexpression auf den Tumorzellen
• 5.3 Genetische Modifikation der humanen NK-Zellinie YT
• 5.4 Zytotoxizität der genmodifizierten cIgTCR⁺ YT-Zellen
• 5.5 Studien mit bestrahlten scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen
• 5.6 Maustumormodell
• 5.7 Allogene Abstoßung der cIgTCR⁺ YT-Zellen
• 5.8 Potential der cIgTCR⁺ YT-Zellen für die klinische Anwendung
• Abkürzungsverzeichnis
• Anhang
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung
• Literaturverzeichnis

Tabellen

• Tabelle 1 - Humane inhibitorische NK-Zellrezeptoren
• Tabelle 2 - Humane aktivatorische NK-Zellrezeptoren
• Tabelle 3 - Andere Rezeptoren, Korezeptoren und kostimulatorische Moleküle der NK-Zellen
• Tabelle 4 - Adhäsionsmoleküle auf NK-Zellen
• Tabelle 5 - Linker-Sequenzen zur Konstruktion von scFv-Fragmenten
• Tabelle 6 - Targeting von Effektorzellen mit chimären Rezeptorgenen
• Tabelle 7 - Kalziumphosphattransfektionsansätze
• Tabelle 8 – Übersicht über die verwendeten Antikörper
• Tabelle 9 - PCR-Mix
• Tabelle 10 - Ablauf der Standard-PCR

Bilder

• Abbildung 1 - Die CEACAM-Familie Die Mitglieder der CEACAM-Familie besitzen homologe Proteindomänen und sind stark glykolysiert. Über die N-Domänen kann eine homotypische Aggregation der CEACAMs erfolgen. Einige CEACAMs verfügen über eine große Zahl von Spleißvarianten (modifiziert nachHammarstrom, 1999).
• Abbildung 2- Signaltransduktion in NK-ZellenDie aktivatorischen NK-Rezeptoren lösen über die PI3K und den MAPK-Signalweg die Aktivierung der ERK2-Kinase aus, die die Mobilisierung der zytotoxischen Granula bewirkt. Korezeptoren unterstützen diesen Signalweg. Inhibitorische NK-Rezeptoren inaktivieren über die Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-1 den Rac-1-Guanidin-Nukleotid-Austauschfaktor Vav-1 und hemmen den MAPK-Signalweg.
• Abbildung 3 - „Immunologische Synapse“ zwischen NK-Zelle und Zielzelle Die NK-Zellen binden über Adhäsionsmoleküle an die Zielzellen, die sich im Zentrum der Kontaktstelle ansammeln. Um dieses Zentrum formiert sich ein Ring aus inhibitorischen NK-Rezeptoren. Dort werden ebenfalls die aktivatorischen NK-Rezeptoren und Korezeptoren vermutet. Die gemeinsame Lokalisation inhibitorischer und aktivatorischer Rezeptoren sowie die enge Verbindung von NK- und Zielzelle ermöglicht eine optimale Erkennung, Signaltransduktion und Lyse der Zielzellen mit geringen Kolateralschäden. T-Zellen bilden ähnliche immunologische „Synapsen“ mit APCs und Zielzellen aus.
• Abbildung 4 - Molekularstruktur eines IgG1-Antikörpers Die Molekularstruktur des humanen IgG1 (modifiziert nachClark, 1997). Die VL- und VH-Domänen verfügen über 3 hypervariable Loops (CDRs, rot), die die Antigenbindung vermitteln. In der hinge-Region sind die schweren Immunglobulinketten über Disulfidbrücken verbunden. Die Bindungsorte für die Fc(γ)RIIIa-Kette der NK-Zellen und das Komplement C1q wurden angegeben (rechts – Van-der-Waals-Radien, links – Peptidrückgrat, V – variable Region, C – konstante Region, L – leichte Kette, H – schwere Kette).
• Abbildung 5 - V-Regionen der humanisierten Antikörper BW431/26 und HuM195 Die Aminosäuresequenzen der V-Regionen der humanisierten Antikörper BW431/26 (obere Sequenz) und HuM195 (untere Sequenz) wurden mit den Konsensusbereichen (fett) humaner Antikörper dargestellt. Die CDRs (<->) wurden gekennzeichnet. Bei der VH-Region wurden die CDR-Definitionen nach Kabat (Längenpolymorphismus der hypervariablen Bereiche,Kabat et al., 1987;Wu und Kabat, 1970), die Definition nach Chothia (Antigenbindungsstellen,Chothia und Lesk, 1987;Chothia et al., 1989) und die AbM-Definition (Oxford Molecular’s antibody modelling software AbM) angegeben. Andere CDR-Definitionen werden aus Kristallographiedaten nach dem Antigenkontakt (MacCallum et al., 1996) oder mit mathematischen Methoden (Honegger und Pluckthun, 2001) festgelegt (nicht gezeigt).
• Abbildung 6 - Struktur eines single-chain-Fv-FragmentsFv-Fragmente von Antikörpern können über einem flexiblen und löslichen Peptid-Linker zu scFv-Fragmenten verbunden werden.
• Abbildung 7 - Immunologisches Targeting von CTL CTL können über bispezifische Antikörper, die CD3 und ein Tumorantigen (TAA) binden, Tumorzellen erkennen und lysieren. Die effektive Wirkung der CTL erfordert die Kostimulation von CD28. NK-Zellen wurden mit CD16 x TAA- oder CD2 x TAA-bispezifischen Diabodies erfolgreich gegen Tumorzellen abgerichtet. Eine weitere Möglichkeit für ein Tumortargeting zytotoxischer Lymphozyten besteht in ihrer genetischen Modifikation mit tumorspezifischen Rezeptoren (Abschnitt 1.7).
• Abbildung 8 - Strategien zur Herstellung von cIgTCR-Konstrukten„T-Bodies“ werden aus den Antigenbindungsdomänen von Antikörpern und den Signalkomponenten des TCR-Komplexes konstruiert. Der Austausch der V-Regionen im TCR durch Antikörper-V-Regionen oder scFv-Fragmente erfordert die Expression von zwei Rezeptoruntereinheiten und die Assemblierung mit dem Signalkomplex des TCRs (unten links), so daß diese Strategie auf T-Zellen beschränkt ist. Einzelsträngige Rezeptorgenkonstrukte aus einem scFv-Fragment und einer Signalkette (unten rechts) können dagegen auch in anderen Immunzellen funktionell exprimiert werden. Häufig werden extrazelluläre „Spacer“-Domänen zwischen scFv-Fragment und Signalkette eingefügt.
• Abbildung 9 - Durchflußzytometrischer ZytotoxizitätsassayIn der Abbildung ist die Auswertung des durchflußzytometrischen Zytotoxizitätsassays dargestellt. Die PhOx-markierten Zielzellen (ALL-Zellinie Reh) wurden vor (a) und nach (b) der Markierung mit dem Farbstoff CFSE und nach 5 h Inkubation mit den scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen (E : T-Verhältnis = 20 : 1) (c) im FACS-Gerät gemessen. Durch die CFSE-Markierung (FL-1) konnten Effektor- und Zielzellen eindeutig in der FL1 unterschieden werden (c). Die toten Zellen wurden durch den Farbstoff PI (FL-3) angefärbt.
• Abbildung 10– Schemata der scFv-Konstrukte Die Schemata zeigen den Aufbau der scFv-Konstrukte scBW431/26 und scPhOx mit der Konfiguration VL / Linker-218 / VH (a) und BW431/26-Yol und PhOx-Yol mit der Konfiguration VH / Yol-Linker / VL (b) inklusive der wichtigsten Restriktionsschnittstellen. Die scFv-Fragmente wurden in den bakteriellen Expressionsvektor pOPE51 kloniert. Die Plasmidkarte von pOPE51 ist im Anhang 0 angegeben ( ^* nicht bei BW431/26-Yol).
• Abbildung 11 – Die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol wurden im Gegensatz zu scPhOx und PhOx-Yol nur in geringen Mengen periplasmatisch in E. coli exprimiert. Die Überstände der Bakterienkultur wurden 36 h nach Induktion der scFv-Expression geerntet. Die scFv-Proteine wurden über ihren (His)5-Tag mit Ni²⁺-NTA-Agarose aufgereinigt. Der Nachweis erfolgte mit dem Antikörper 9E10 gegen das c-myc-Epitop der scFv-Konstrukte.
• Abbildung 12 - Die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol zeigten im Gegensatz zu scPhOx und PhOx-Yol nach bakterieller Expression keine spezifische Bindung an ihr Antigen. Die scFv-Fragmente scBW431/26 und BW431/26-Yol wurden nach periplasmatischer Expression in E. coli und nach Reinigung über eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule auf ihre Bindung gegenüber CEA-Protein (a) mittels ELISA analysiert. Die scFv-Fragmente scPhOx und PhOx-Yol wurden auf ihre Bindung gegenüber PhOx-BSA untersucht (b). Als Negativkontrolle wurden Ansätze mit BSA-Protein als Antigen durchgeführt. Der Nachweis der scFv-Fragmente erfolgte mit dem Antikörper 9E10.
• Abbildung 13 – Die scFv-Proteine scBW431/26 und BW431/26-Yol zeigten im Gegensatz zu scPhOx und PhOx-Yol keine definierte Bande nach einer nichtreduzierenden SDS-PAGE. Nach Expression (1 mM IPTG, 4 h, 37°C) der scFv-Konstrukte scBW431/26 (Spur 1), BW431/26-Yol (Spur 2), scPhOx (Spur 3) und PhOx-Yol (Spur 4) wurden die Bakterienpellets mit reduzierendem (a) oder nichtreduzierendem SDS-Probenpuffer (b) vorbereitet und über ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die scFv-Proteine wurden im Westernblot mit dem Antikörper 9E10 nachgewiesen.
• Abbildung 15 – Signalpeptidsequenzen für die scFv-hFc- und cIgTCR-Konstrukte  Leader-A und Leader-C wurden aus dem Signalpeptid der humanen IgGκ-Kette abgeleitet. Sie unterschieden sich nur in der Klonierungsstelle für das scFv-Fragment. Der Leader-A erfordert aufgrund seiner ScaI-Schnittstelle die blunt-end-Klonierung der scFv-Fragmente. Der Leader-C läßt dagegen eine direkte Klonierung der scFv-Fragmente aus dem pOP51-Plasmid über die NcoI-Schnittstelle zu, erzeugt aber ein zusätzliches Methionin, das nach Abspaltung des Signalpeptides am N-Terminus der scFv-Fragmente erhalten bleibt.
• Abbildung 16 – Die scFv-hFc-Konstrukte konnten in den 293T-Zellen sekretorisch exprimiert werden.Im oberen Teil des Dotblots wurden jeweils 10 µL der Zellkulturüberstände von 293T-Zellen, die mit den scFv-hFc-Genkonstrukten scBW431/26-hFc (1, 2, 3), scPhOx-hFc (4, 5, 6) oder scHuM195-hFc (7, 8) transfiziert waren, als Duplikate aufgetragen. Als Negativ-kontrolle wurde Medium verwendet. Im unteren Teil des Dotblots wurden Duplikate eines humanen IgG-Proteinstandards aufgetragen.
• Abbildung 17 – Die scFv-hFc-Fusionsproteine scBW431/26-Fc und scPhOx-hFc zeigten eine spezifische Bindung an ihre Antigene. Die Kulturüberstände der 293T-Zellen, die mit den Genkonstrukten für die scFv-hFc-Proteine scBW431/26-hFc (a) oder scPhOx-hFc (b) transfiziert worden waren, wurden im ELISA auf die Bindung an CEA (a) bzw. PhOx-BSA (b) getestet. Ansätze mit BSA als Antigen wurden als Negativkontrolle parallel in allen Versuchen durchgeführt. Kulturüberstände mock-transfizierter 293T-Zellen wurden als Kontrolle angegeben. Die scFv-hFc-Klone, die den Leader-A als Signalpeptid enthielten, wurden mit Ax bezeichnet, Klone mit dem Leader-C wurden mit Cx bezeichnet.
• Abbildung 18 – Die Isolation der CD3 ζ-Signalkette erfolgte mit einer verschachteltenPCR.Die cDNA der humanen CD3 ζ-Kette (a) wurde aus der Gesamt-cDNA aktivierter PBL voramplifiziert (Spur 1 - 25 Zyklen, Spur 2 - 30 Zyklen). Der zur Spur 1 gehörende PCR-Ansatz wurde 1:10 verdünnt und zur Amplifikation der Transmembrandomäne und des zytoplasmatischen Teils der CD3 ζ-Kette (b) eingesetzt (Spur 3 - 16 Zyklen, Spur 4 - 21 Zyklen).
• Abbildung 19 – Aminosäuresequenz der humanen CD3 ζ-Kette Der für die cIgTCR-Konstrukte verwendete Anteil der CD3 ζ-Kette (AS 28 – 163, fett) umfaßte die Transmembrandomäne, inkl. der flankierenden positiv geladenen Aminosäuren und den gesamten zytoplasmatischen Anteil mit den drei ITAMs (a, b, c). Die ITAMs sind paarige Tyr-Phosphorylierungsmotive ( YxxL ) und rekrutieren je nach Phosphorylierungszustand zytoplasmatische Signal- und Adaptermoleküle, wie Syk und ZAP70. Unterschiede zur ursprünglich publizierten Sequenz (genbank) wurden angegeben. Die Q101-Isoform wurde nicht verwendet (siehe Text).
• Abbildung 20 – Schemata der scFv-hFc- und der cIgTCR-Genkonstrukte Die scFv-hFc-Fusionsproteine (a) wurden aus den scFv-Fragmenten scBW431/26, scHuM195 oder scPhOx (VL / Linker218 / VH) und dem Fc-Teil (hinge-CH2-CH3) des humanen IgG1 (hFc) konstruiert. Die cIgTCR-Konstrukte (b) wurden durch Fusion der scFv-hFc-Proteine mit der Transmembrandomäne (TM) und dem zytoplasmatischen Teil der humanen CD3 ζ-Kette konstruiert. Das Signalpeptid der humanen IgGκ-Kette (^* Leader A ^** Leader C) wurde sowohl für die sekretorische Expression der scFv-hFc-Proteine als auch für die Plasmamembranexpression der cIgTCRs benötigt. Die Plasmidkarten für pCMX und pCDNA3 sind im Anhang angegeben.
• Abbildung 21 – Die cIgTCR-Konstrukte wurden nach Transfektion auf Oberfläche der 293T-Zellen exprimiert. Die Expression der cIgTCR-Konstrukte scBW431/26-hFcζ und scPhOx-hFcζ wurde durch Transfektion von 293T-Zellen getestet. Die extrazelluläre Färbung der humanen Fc-„Spacer“-Domäne der cIgTCR-Konstrukte wurde mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-human-IgG-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragment (linke Spalte, gefüllt) durchgeführt. Als Kontrolle wurde die Färbung mit einem Ziege-anti-Maus-IgG-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragment angegeben (linke Spalte, hellgrau, leer). Der intrazelluläre Anteil der cIgTCR-Konstrukte wurde mit dem Antikörper 1D4, der spezifisch für die humane CD3 ζ-Signalkette ist, nachgewiesen (rechte Spalte, gefüllt). Färbungen mock-transfizierter 293T-Zellen wurden als Negativkontrollen angegeben (grau, leer).
• Abbildung 22 – Das scPhOx-hFc-Protein färbte spezifisch PhOx-markierte Zellen. Das scPhOx-hFc-Protein wurde zur Färbung von PhOx-markierten Zellen (gefüllt) und unbehandelten Zellen (leer) der ALL-Zellinie Reh eingesetzt.
• Abbildung 23 – Das scBW431/26-hFc-Protein und der Antikörper CEJ065 färbten spezifisch die CEA-transfizierte Zellinie MC32A.  Die Maus-Kolonkarzinomzellinie MC38 und die aus ihr abgeleiteten CEA-transfizierten MC32A-Klone 6 und 10 wurden mit dem scBW431/26-hFc-Protein (mit Leader A - linke Spalte; mit Leader C - mittlere Spalte) oder mit dem Antikörper CEJ065 (rechte Spalte) gefärbt (gefüllt). Als Negativkontrolle für das scBW431/26-hFc-Protein wurde das scPhOx-hFc-Protein mit entsprechenden Leader-Sequenzen (linke und mittlere Spalte: grau, leer) und das CD33-spezifische scHuM195-hFc-Protein (mittlere Spalte: hellgrau, leer) eingesetzt. Für den Antikörper CEJ065 wurde die Isotypenkontrolle angegeben (rechte Spalte: grau, leer).
• Abbildung 24 – Das scBW431/26-hFc-Protein zeigte gegenüber humanen Tumorzellinien eine andere Spezifität als der Antikörper CEJ065. Die Kolonkarzinomzellinien HT29, LoVo, LS174T, SW403, SW480, SW948, SW1222 und SW1417, die Pankreaskarzinomzellinien Capan2 und Panc89 wurden mit dem scBW431/26-hFc-Protein oder dem monoklonalen Antikörper CEJ065 gefärbt (gefüllt). Als Negativkontrollen wurden Färbungen mit dem scPhOx-hFc-Protein für das scBW431/26-hFc-Protein und Färbungen mit einem Isotypenantikörper für den Antikörper CEJ065 angegeben (grau, leer).
• Abbildung 25 – Das scHuM195-hFc-Protein färbte spezifisch myeloische Leukämiezellinien. Die myeloischen Leukämiezellinien KG1 und HL60 wurden mit dem scHuM195-hFc-Protein (linke Spalte) und dem CD33-spezifischen Antikörper WM54 (rechte Spalte) gefärbt (gefüllt). Außerdem wurden HL60-Zellen gefärbt, deren Differenzierung mit DMSO angeregt worden war. Als Negativkontrollen für das scHuM195-hFc-Protein wurden Färbungen mit dem scPhOx-hFc-Protein (linke Spalte: grau, leer) und dem scBW431/26-hFc-Protein (linke Spalte: hellgrau, leer) durchgeführt. Für den Antikörper WM54 wurde die Isotypenkontrolle (rechte Spalte: grau leer) angegeben.
• Abbildung 26 – Die HL60-Zellen regulierten nach Stimulation mit DMSO das Integrin CD11c hoch. HL60-Zellen wurden vor und nach einwöchiger DMSO-Stimulation mit einem CD11c-spezifischen Antikörper gefärbt (gefüllt). Die Isotypenkontrolle wurde angegeben (grau, leer).
• Abbildung 27 – Der Gentransfer der cIgTCR-Konstrukte in die YT-Zellen erfolgte durch Elektroporation, Selektion und immunologische Anreicherung. Die Abbildung zeigt die Expression des cIgTCR-Konstruktes scHuM195-hFcζ auf den YT-Zellen 48 h nach Elektroporation (a) und nach zweiwöchiger Selektion mit G418 (b). Außerdem wurde die erste immunologische Anreicherung der scHuM195-hFcζ⁺ YT-Zellen durch MACS^® (c) und die zweite Anreicherung mit einem Hochleistungs-FACS-Sorter (c) dargestellt. Die Färbungen vor (grau, leer) und nach (gefüllt) der Zellseparation wurden angegeben. Die FACS-Analysen wurden mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-human-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragment durchgeführt.
• Abbildung 28 – Über 90% der cIgTCR-transfizierten YT-Zellen exprimierten nach zweifacher immunologischer Anreicherung ihr cIgTCR-Konstrukt auf der Oberfläche. Nach zweifacher immunologischer Anreicherung wurden die cIgTCR-Konstrukte scPhOx-hFcζ, scBW431/26-hFcζ und scHuM195-hFcζ auf den cIgTCR-transfizierten YT-Zellen durch Färbung mit einem FITC-konjugierten Ziege-anti-human-Fc(γ)-F(ab’)2-Fragment untersucht (gefüllt). Als Negativkontrolle wurde die Färbung mock-transfizierter YT-Zellen angegeben (leer).
• Abbildung 29– Die Expression der CD3 ζ-Kette war in den cIgTCR+ YT-Zellen erhöht. Die CD3 ζ-Kette wurde durch intrazelluläre Färbung von mock-transfizierten YT-Zellen, scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen und scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen mit dem Antikörper 1D4 analysiert (gefüllt). Die mock-Kontrolle zeigt die endogene Expression der ζ-Kette der YT-Zellen. Die Isotypenkontrollen wurden angegeben (leer).
• Abbildung 30 – Die scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen vermittelten eine spezifische und effiziente Lyse der CEA-transfizierten Zellinie MC32A. Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen (■) wurde mittels 6 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassays gegenüber der Maus-Kolonkarzinomzellinie MC38 (c) und den aus ihr abgeleiteten CEA-transfizierten MC32A-Zellklonen, Klon 6 (a) und Klon 10 (b), untersucht. Bei den Kontrollansätzen wurden mock-transfizierte YT-Zellen (○), PhOx-spezifische scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen (Δ) und CD33-spezifische scHuM195-hFcζ⁺ YT-Zellen (◊) als Effektorzellen eingesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben.
• Abbildung 31 – Die scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen lysierten spezifisch humane Kolonkarzinomzellinien, die durch das scBW431/26-hFc-Protein gefärbt werden konnten. Die scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen (■) wurden mit 6 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassays auf ihre Zytotoxizität gegenüber den humanen Kolonkarzinomzellinien LoVo (a), LS174T (b), SW948 (c) und SW1222 (d) untersucht. Mock-transfizierte YT-Zellen (○) und scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen (Δ) wurden als Kontrolleffektorzellen in parallel durchgeführten Ansätzen eingesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben.
• Abbildung 32 - Die scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen zeigten keine Zytotoxizität gegenüber humanen Tumorzellinien, die nicht mit dem scBW431/26-hFc-Protein gefärbt werden konnten. Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen (■) wurden in 6 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassays gegenüber den humanen Kolonkarzinomzellinien SW403 (a), SW480 (b), SW1417 (c), HT29 (d) und der humanen Pankreaskarzinomzellinien Capan2^* (f) und Panc89 (g) untersucht. Mock-transfizierte YT-Zellen (○) und scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen (Δ) wurden in parallelen Ansätzen als Kontrolleffektorzellen eingesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben (^*nur 4 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassay).
• Abbildung 33 – Die scHuM195-hFcζ⁺ YT-Zellen vermittelten eine spezifische, aber geringe Zytotoxizität gegenüber CD33⁺ Leukämiezellinien. Die scHuM195-hFcζ⁺ YT-Zellen (■) wurden in 6 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassays auf ihre Zytotoxizität gegenüber den CD33⁺ Leukämiezellinien KG1 (a) und HL60 (b) untersucht. Außerdem wurden HL60-Zellen getestet, deren Differenzierung mit DMSO stimuliert worden war (c). Parallel wurden Ansätze mitgeführt, in denen mock-transfizierte YT-Zellen (○) oder scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen (Δ) als Effektorzellen eingesetzt wurden. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben.
• Abbildung 34 – Die scPhOx-hFcζ+ YT-Zellen lysierten spezifisch PhOx-markierte Zellen. Die scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen wurden mit einem durchflußzytometrischen Zytotoxizitätsassay gegenüber PhOx-markierten (■) und unbehandelten (□) Zellen der ALL-Zellinie Reh auf ihre Zytotoxizität untersucht. Zum Vergleich wurden die CEA-spezifischen scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen gegenüber PhOx-gelabelten Reh-Zellen (○) getestet. Die Targetzellyse wurde mit den Standardabweichungen angegeben.
• Abbildung 35 – Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen wurde nicht durch gelöstes CEA-Protein gehemmt. Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen wurde in Gegenwart von 0,1 µg/mL (◊), 1 µg/mL (Δ) und 10 µg/mL (○) gelöstem CEA-Protein im Medium gegenüber der CEA⁺ Zellinie MC32A in einem 6 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassay untersucht. Bei der Kontrolle (breite Linie, ■) wurde dem Medium kein CEA-Protein zugesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den Standard-abweichungen angegeben.
• Abbildung 36 – Gelöstes Antigen mit multiplen PhOx-Gruppen hemmte die Zytotoxizität der scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen bei geringeren Konzentrationen als Antigen mit einzelnen PhOx-Gruppen. Die Zytotoxizität scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen wurde gegenüber PhOx-markierten Zellen der ALL-Zellinie Reh in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen an freiem PhOx-BSA mit einzelnen PhOx-Gruppen (grau) und multiplen PhOx-Gruppen (schwarz) untersucht. Im Diagramm wurde die Lyse (E : T = 10 : 1) im Verhältnis zur Kontrolle (= 100%), bei der kein gelöstes Antigen dem Medium hinzugefügt wurde (weiß), angegeben. Außerdem wurde ein Ansatz mit unbehandeltem 100 µg/mL BSA-Protein (schraffiert) durchgeführt.
• Abbildung 37 – Die Antigenbindung des scPhOx-hFc-Proteins wurde durch gelöstes Antigen mit multiplen PhOx-Gruppen bei erheblich geringeren Konzentrationen gehemmt als durch Antigen mit einzelnen PhOx-Gruppen. Die ELISA-Platten wurden mit (PhOx)2-BSA (Quadrate) oder (PhOx)20-BSA (Kreise) beschichtet („Coating“). Die Antigenbindung des scPhOx-hFc-Proteins (= extrazellulärer Anteil des cIgTCR-Konstruktes scPhOx-hFcζ) wurde in Gegenwart von gelöstem (PhOx)20-BSA (leer) und (PhOx)2-BSA (gefüllt) gehemmt. Zur Berechnung der Molarität wurde für das Antigen unabhängig von der Zahl der PhOx-Gruppen ein Molekulargewicht von 65 kDa angenommen.
• Abbildung 38 – Das Wachstum der YT-Zellen wurde nach γ-Bestrahlung mit 2000 rad vollständig und irreversibel gehemmt. Die YT-Zellen wurden mit unterschiedlichen Dosen γ-Strahlung behandelt und anschließend in Kultur genommen. Die Zellzahl wurde mehrere Tage bestimmt und im Verhältnis zur Ausgangszellzahl aufgetragen. Die eingesetzten Strahlungsdosen sind in der Abbildung angegeben.
• Abbildung 39 – Einen Tag nach γ-Bestrahlung der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen blieb deren CEA-spezifische Zytotoxizität erhalten. Einen Tag nach γ-Bestrahlung wurde die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen gegenüber der CEA-transfizierten Zellinie MC32A durch 4 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassays untersucht. Um eine unspezifische Aktivierung durch die Bestrahlung auszuschließen, wurden auch die CEA^- MC38-Zellen als Target untersucht. Die Strahlungsdosen und die Targetzellinien sind in der Abbildung angegeben.
• Abbildung 40 – Die Expression des cIgTCR-Konstruktes auf den scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen blieb einen Tag nach γ-Bestrahlung unverändert. Die Expression des cIgTCR-Konstruktes auf den scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen wurde einen Tag nach deren γ-Bestrahlung durch FACS-Analyse untersucht. Als Kontrollen sind die Färbungen von unbestrahlten scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen und mock-transfizierten YT-Zellen dargestellt. Die Strahlungsdosen für die scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen sind in der Abbildung angegeben.
• Abbildung 41 – Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen war schon drei Tage nach Bestrahlung gegenüber der CEA⁺ Zellinie MC32A deutlich reduziert. Die Zytotoxizität der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen wurde drei Tage (a) und fünf Tage (b) nach deren γ-Bestrahlung gegenüber der CEA⁺ Zellinie MC32A in 4 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassays untersucht. Die Strahlungsdosen für die γ-Bestrahlung der scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen sind angegeben.
• Abbildung 42 – Die Koinjektion von CEA⁺ MC32A-Tumorzellen und bestrahlten scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen führte zur Hemmung des Tumorwachstums in NOD/SCID-Mäusen. Am Tag 0 wurden sechs NOD/SCID-Mäusen je Gruppe 10⁶ CEA⁺ MC32A-Tumorzellen (Klon 6) zusammen mit 10⁷γ-bestrahlten CEA-spezifischen scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen, 10⁷γ-bestrahlten PhOx-spezifischen scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen oder PBS (siehe Legende) subkutan injiziert. Die kumulativen Überlebensraten wurden angegeben. Die Mäuse wurden getötet, wenn der MC32A-Tumor ein Volumen von 1 cm³ überschritt und als tot klassifiziert.
• Abbildung 43 – Die intratumorale Injektion bestrahlter scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen hatte keinen signifikanten Effekt auf das Wachstum etablierter CEA⁺ MC32A-Tumore in NOD/SCID-Mäusen. Am Tag 0 wurden jeweils sechs NOD/SCID-Mäusen pro Gruppe 10⁶ CEA⁺ MC32A-Zellen subkutan injiziert. Am Tag 19 und 26 wurden je 10⁷γ-bestrahlte scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen intratumoral in die MC32A-Tumore injiziert. Der Kontrollgruppe wurden 10⁷γbestrahlte scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen intratumoral injiziert. Mäuse mit einem MC32A-Tumor > 1 cm³ Volumen wurden als tot klassifiziert.
• Abbildung 44 – Allogene PBL und NK-Zellen zeigten nur eine geringe Zytotoxizität gegenüber den mock- oder cIgTCR-transfizierten YT-Zellen. Die Zytotoxizität frisch isolierter humaner PBL (a) und NK-Zellen (b) eines allogenen Spenders wurden als Effektorzellen gegenüber scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen (♦), scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen (▲) scHuM195-hFcζ⁺ YT-Zellen (■) und mock-transfizierten YT-Zellen (○) in 4 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassays untersucht. Die Targetzellyse wurde mit den Standardabweichungen angegeben.
• Abbildung 45 – Die Kokultivierung allogener PBL mit bestrahlten mock- oder cIgTCR-transfizierten YT-Zellen führte zu keiner Zunahme ihrer Zytotoxizität. Allogene PBL wurden eine Woche mit bestrahlten mock-transfizierten YT-Zellen (a), scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen (b) oder scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen (c) stimuliert. Die stimulierten PBL wurden als Effektorzellen gegenüber mock-transfizierten YT-Zellen (○), scBW431/26-hFcζ⁺ YT-Zellen (♦) oder scPhOx-hFcζ⁺ YT-Zellen (▲) in 4 h-⁵¹Cr-Freisetzungsassays eingesetzt. Die Targetzellyse wurde mit den zugehörigen Standardabweichungen angegeben.
• Abbildung 46 – Restriktionskarten für die Ausgangsplasmide Das Plasmid pOPE51-PhOx-Yol wurde für die Konstruktion der scFv-Fragmente und ihre periplasmatische Expression in E. coli verwendet. Das Plasmid pCMX-sFRFG4-hFc war Quelle für den humanen IgG1-Fc-Teil und wurde zur Konstruktion und Expression der scFv-hFc-Proteine eingesetzt. Das Blueskript-Plasmid (mit der CD8α-hinge-Region) kam bei der Isolierung der humanen CD3 ζ-Kette zum Einsatz. Das Expressionsplasmid pCDNA3 diente zur Klonierung und Expression der cIgTCR-Konstrukte.