4  Ergebnisse

Für die Identifizierung von Tumorsuppressor- bzw. Onkogenen, die für die Entstehung der chronisch lymphatischen Leukämie relevant sein könnten, wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit zwei differentielle cDNA-Banken etabliert. Zur Erstellung einer cDNA-Genbank wurde die subtraktive suppressive Hybridisierung (SSH) als Methode eingesetzt, wobei gleiche cDNA-Sequenzen in den zu vergleichenden Populationen subtrahiert und differentielle Transkripte angereichert wurden. Die SSH startete mit der Aufarbeitung der Blutprobe, Selektion der B-Zellen, und Isolation von RNA aus den Zellen. Daraufhin erfolgte die Umschreibung in cDNA, subtraktive Hybridisierung der zu vergleichenden Proben und Amplifizierung der subtrahierten Transkripte. Die Proben wurden kloniert und mittels DotBlot und RT-PCR getestet.

Die Methode beinhaltete mehrere Kontrollschritte, die eine ständige Überprüfung der geleisteten Arbeit ermöglichten und somit einen erfolgreichen methodischen Ablauf garantierten. Aus Übersichtsgründen wurden exemplarisch Bilder von der Erstellung einer Genbank aufgeführt, in der gepoolte Proben von CLL-Patienten und gesunden Kontrollgruppen voneinander subtrahiert wurden. Als Ausgangsmaterial der Kontrollgruppen wurden sogenannte „Buffy coats“, d.h. mit Leukozyten angereicherte Restprodukte von gesunden Blutspendern, aufgearbeitet und mit Blut von CLL-Patienten verglichen. Als Kontrollgruppe musste das Blut von Blutspendern verwendet werden, da von anderen Normalspendern nicht ausreichend viele B-Lymphozyten isolierbar waren.

Für die Etablierung der differentiellen cDNA-Banken sowie für die nachfolgende Überprüfung der Differentialität der entdeckten Gene mit Hilfe semiquantitativer RT-PCR wurden CD19-positive B-Zellen von Normalspendern (n=10) sowie aus dem peripheren Blut von B-CLL-Patienten (n=11) mittels anti-CD19-gekoppelten Dynabeads isoliert. Nach der Positivselektion wurde die Reinheit der isolierten B-[Seite 44↓]Zellpopulationen über die Co-Expression von CD5 und CD19 bzw. CD20 mit Hilfe des FACScans bestimmt (Abb. 4.1, Tabelle 4.1), welche zwischen 96-98% lag. Darüber hinaus wurde die Ausbeute an gereinigten Zellen lichtmikroskopisch bestimmt.

Tab. 4.1: Liste der isolierten B-Zellen von CLL-Patienten und Kontrollen (Normalspendern).

Es werden Patienteninitialen, Alter, Stadium der Erkrankung nach Binet, Geschlecht, Blutentnahmetag, Zellzahl der isolierten B-Zellen und die Reinheit nach FACscan-Auswertung dargestellt.
* = Die isolierten Zellen dieser Patienten wurden gepoolt und für die exemplarische Darstellung der Etablierung der Genbank eingesetzt (250 ng pro Patient wurden eingesetzt).
*’ = Die isolierten B-Zellen dieser Kontrollen wurden gepoolt und für die exemplarische Darstellung der Etablierung der Genbank eingesetzt (250 ng pro Patient wurden eingesetzt).
† = Diese Patienten waren im Jahr 2000 bereits verstorben

	Abb. 4.1: FACscan Auswertung vor und nach Positivselekion (PS) bei Pat. Wö.
	Die Zellen wurden mit Antikörpern gegen CD5 und CD19 markiert. Beide Oberflächenmarker sind charakteristisch für B-Zellen. Die Auswertung nach Positivselektion zeigt eine Population, die zu >97% positiv für CD19 und CD5 ist. Sie stellt eine maligne B -Zell Population dar.

Die Untersuchung der differentiellen Exprimierung auf mRNA-Ebene erforderte die Isolierung von RNA aus den B-Zellen und die Umschreibung zu cDNA. Hierfür wurde der Rneasy-Kit der Firma Qiagen angewendet.

Um die Qualität der gereinigten Gesamt-RNA-Fraktionen zu überprüfen, wurden die Proben gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die in Abb. 4.2 erkennbaren Banden der 28S und 18S ribosomalen RNA wiesen daraufhin, daß die RNA intakt und nicht degradiert war.

	Abb. 4.2: Isolierung von Total-RNA.
	RNeasy-Mini-Kit, Vergleich von Patienten und gesunden Kontrollgruppen. Die Banden stellen die ribosomale RNA dar. (1,2%-Formaldehyd-Agarose-Gel).

.

Um im Verlauf der SSH sichere Aussagen über die Differentialität der exprimierten Gene machen zu können, mußte die Konzentration an RNA in den zu vergleichenden Proben gleich sein.

Die Quantität der isolierten RNA wurde photometrisch bestimmt und einheitlich auf 500 ng/µl eingestellt.

Da im Rahmen dieser Doktorarbeit das Ausgangsmaterial für die RNA-Isolierung auf 20 ml Blut je CLL-Patient limitiert war, wurde für die cDNA-Synthese die SMART-Technologie eingesetzt, bei der die RNA zunächst in einzelstängige cDNA umgeschrieben wird, um dann in der anschließenden SMART-PCR vervielfältigt zu werden. Hier kam der SMART PCR cDNA-Synthesis-Kit der Firma Clontech zur Anwendung.

	Abb. 4.3: Amplifikation von cDNA (LD PCR)
	Nach Auswahl der optimalen Zykluszahl wurde die SMART PCR für die Normalspender-Pool- und die Kontroll- Pool -Proben nach 21 Zyklen und bei der CLL-Pool-Probe nach 20 Zyklen gestoppt. Es wurden jeweils 5μl Probe aufgetragen. Als Kontrolle für die erfolgreiche Durchführung der SMART-PCR-Synthese wurde humane Placenta-Gesamt-RNA mitgeführt. (2% EtBr-Agarose-Gel).

Zunächst wurde eine Kontroll-PCR durchgeführt und die Zyklenzahl bestimmt, bei der die resultierende cDNA nach gelelektrophoretischer Auftrennung einen Schmier
bis maximal 10 000 bp ergab. Da humane mRNA einen Molekulargewicht von etwa
100-10 000 bp aufweist, sollten cDNA´s die größer waren als der angegebene
Bereich, PCR-Artefakte repräsentieren.

Nach der Bestimmung der optimalen Zyklenzahl wurde die SMART-PCR für jede Probe individuell beendet, so daß sowohl der Größenbereich als auch die Konzentration der amplifizierten cDNA´s übereinstimmten (Abb. 4.3).

Nach der cDNA-Synthese folgte der Verdau der Proben mit Rsa-I. Dieser Schritt war notwendig für die anschließende Adaptor-Ligation. Rsa-I schneidet eine spezifische vier Basenpaare lange Sequenz. Die enstandenen Schnittstellen stellen die Bindungsstellen für die Adaptoren dar.

Bei einem erfolgreichen Verdau entstanden Fragmente zwischen 0,1-2 kB. Da die cDNA vor dem Verdau 0,5-10 kB groß war, enthielten die Proben nach dem Verdau kleinere Fragmente.

	Abb. 4.4: Verdau der cDNA Proben mit Rsa-I.
	Proben gesunder Proben wurden mit kranken Proben vor und nach Verdau miteinander verglichen. (1,2 %-EtBr-Agarose-Gel)

In Abbildung 4.4 lässt sich erkennen, dass die Proben nach dem Verdau einen Schmier mit kleineren Fragmentgrößen aufwiesen. Die cDNA-Proben vor dem Verdau wiesen im Agarose-Gel größere Fragmente auf.
Der deutliche Verkleinerung der cDNAs nach gelelektrophoretischer Auftrennung weist auf eine erfolgreiche Restriktion hin.

Mit Hilfe der 1. und 2. (nested) suppressiven PCR wurden die im Verlauf der SSH angereicherten differentiellen Transkripte exponentiell amplifiziert.

	Abb. 4.5: Amplifikation von differentiellen Transkripten mittels suppressiver PCR.
	Subtrahierte Proben wurden gegen unsubtrahierten Proben aufgetragen. Als Kontrollen wurden eine Negativkontrolle (NK), eine cDNA Kontrolle und jeweils eine subtrahierte und unsubtrahierte Proben mitgeführt. (2%-EtBr-Agarose-Gel).

In Abb. 4.5 wurden subtrahierte Proben gegen unsubtrahierte Proben aufgetragen. Das Bandenmuster in subtrahierten und unsubtrahierten Proben war unterschiedlich. Die unsubtrahierten Proben zeigen einen Schmier, der auf viele verschiedene Fragmente schließen ließ.

Es ist zu erkennen, dass in den subtrahierten Proben stärkere Fragmente gleicher Größe amplifiziert wurden als in den unsubtrahierten Proben.
Es konnte dadurch vermutet werden, dass diese Banden die Anreicherung von differentiellen Transkripten darstellten, da sich gleichende Sequenzen subtrahiert wurden und nur die differentiellen Transkripte amplifiziert worden waren.

Gene, die bekanntermaßen etwa gleichstark in den verglichenen Zellen exprimiert werden, können zwischen subtrahierter Probe und unsubtrahierter Kontrolle verglichen werden. Ein gängiges Kontroll-Gen stellt GAPDH dar. GAPDH repräsentiert ein zentrales Enzym des Citratsäurezyklus und wird in normalen wie in malignen B-Zellen abundant exprimiert (Referenz: Ambion, PCR-Kit).

Dieses GAPDH-Transkript ist in vitro bei erfolgreicher Subtraktion in den subtrahierten Proben in geringerer Anzahl enthalten. Mit dieser Methode ließ sich der Erfolg der Subtraktion bestimmen.

	Abb. 4.6: Kontrolle der Subtraktionseffizienz mittels einer PCR.
	Es wurden unsubtrahierte Proben mit subtrahierten Proben verglichen. Es wurden aus beiden Proben je 20 μl nach Zyklus 18, 23, 28, 33 entnommen und aufgetragen (2%-EtBr-Agarose-Gel).

In Abb. 4.6 ist die Intensität der PCR-Produkte in Abhängigkeit der Zyklenzahl bei den subtrahierten cDNA-Proben schwächer als bei den nicht-subtrahierten cDNA-Proben ausgeprägt. Aufgrund dieser Daten ist davon auszugehen, dass in den generierten subtrahierten Normalspender- bzw. CLL-cDNA-Proben differentiell expremierte Gene angereichert wurden.

Nach der Ligation der PCR-Produkte in den pTAdv-Vektor wurden E.coli-Bakterien transformiert und kloniert. Der pTAdv-Vektor enthielt ein LacZ-Gen, das nach Expression das Substrat CSPD umsetzen kann. Dieses Produkt resultierte in einer Blaufärbung. Das jeweilige PCR-Produkt wurde in die Sequenz des LacZ-Gens inseriert, dadurch war bei erfolgreicher Ligation eine Expression dieses Gens und die damit einhergehende Substratumsetzung und Blaufärbung nicht möglich, gebildete E.coli-Kolonien erschienen weiß. Diese weißen Kolonien enthielten Klone, welche durch eine PCR überprüft wurden.

Für die PCR wurde ein M.13-Primerpaar eingesetzt. Diese M.13 Sequenzen flankierten auf dem Vektor das jeweilige ligierte PCR-Produkt.

	Abb. 4.7: PCR zur Amplifikation und zum Nachweis der erfolgreichen Ligation und Transformation der subtrahierten PCR-Produkte.
	Nachdem die weißen Kolonien gepickt worden waren, wurde für diese Kolonie-PCR ein M.13 Primerpaar eingesetzt und die PCR Produkte nach 35 Zyklen auf ein Gel aufgetragen (2%-EtBr-Agarose-Gel).

Abb. 4.7 zeigt die erfolgreiche Ligation und Transformation, da fast alle gepickten Kolonien Klone enthielten, die als PCR-Produkt in der Kolonie-PCR zu detektieren waren.

Der „Dot-Blot“ stellte die erste Testmethode in der SSH dar. Die differentiellen PCR- Produkte wurden auf eine Membran gepunktet und mit einer DIG-markierten Sonde hybridisiert. Diese Sonde wurde hergestellt, indem bei der Replikation der cDNA Digoxigenin-UTPs eingebaut wurden. Diese Dig-UTPs waren von bestimmten Chemilumniszenz-markierten Antikörpern als Antigen erkennbar. Die Sonde band komplementär an die Kolonie-PCR-Produkte und erzeugte durch den Farbstoff ein Signal.

Da jeweils eine Sonde von CLL-cDNA und eine von cDNA gesunder Kontrollmenschen hergestellt wurde, gab die Schwärze des Spots Auskunft über die [Seite 52↓]Expressionsstärke des jeweiligen Genes in den zu untersuchenden Gruppen. Nach Auswertung der beiden Blots mittels densitometrischer Software konnten diejenigen Klone identifiziert werden, die sich als stark differentiell mit dieser Methode erwiesen.

	Abb. 4.8 und 4.9: Dot-Blot.
	Nylonmembran mit aufgetragenen subtrahierten PCR-Produkten gesunder Kontrollen. Hybridisierung mit CLL- DIG Sonde. Die Eich-Kontrollen stammten aus einer vorher hergestellten Eichreihe (links Normalspender/subtrahiert + Kontroll-DIG; rechts Normalspender/subtrahiert + CLL-DIG).

Die Auswertung der „Dot-Blots“ ergab sowohl differentielle, als auch nicht-differentielle Signale. Exemplarisch wurden die „Dot-Blots“ der subtrahierten Kontroll-Genbank aufgeführt, beim ersten mit subtrahierter Kontroll-cDNA hybridisiert (Abb. 4.8) und beim zweiten mit subtrahierter CLL-cDNA (Abb. 4.9). Vergleicht man die Spots, fällt auf, dass bei unterschiedlicher Sonde auch unterschiedliche Intensitäten der Blots auftraten. Der rot markierte Spot z.B. zeigt bei der Kontroll-Sonde ein stärkeres Signal als mit der CLL-Sonde. Es wurde erkennbar, dass hier ein PCR-Produkt vorlag, welches im Vergleich zu gesunden Kontrollgruppen bei Patienten mit CLL vermindert exprimiert wurde.

Es wurden 69 Proben, die im „Dot-Blot“ differentiell erschienen, gepickt. Diese Proben wurden von Frau Dr. M. Wedde sequenziert und in einem BLAST Programm überprüft. Viele Sequenzen stellten Teile von Immunglobulinen dar oder waren nicht bekannt. Von den 69 Proben erschienen 11 durch ihre Funktion interessant, so dass sie weiter untersucht wurden.

Da eine korrekte Aussage über die reale Differentialität der Gentranskripte nur durch eine quantitative Methode getroffen werden konnte, wurden die im „Dot-Blot“ als differentiell erkannten Sequenzen mit einer semiquantitativen PCR überprüft.

Zyklusabhängig wurden die erste Detektion einer klaren Bande und die Stärken der Banden in den zu vergleichenden Gruppen untersucht.

Das Erscheinen einer Bande bei einer geringen Zykluszahl und die stärkere Expression einer Bande im Vergleich zur anderen Gruppe bestätigte die Anreicherung von differentiellen PCR-Produkten. Der Vergleich der Banden zwischen CLL-Patienten und Kontrollgruppe führte zu quantitative Unterschieden in der Expression der untersuchten Transkripte.

Die PCR für jedes zu untersuchende Gen wurde mit 9 an CLL erkrankten Patienten und 5 gesunden Kontrollen durchgeführt. Nach Zyklus 21, 24, 27, 30 und 33 wurden jeweils gleiche Probenmengen entnommen, und mittels einer Gelelektrophorese ausgewertet.

	Abb. 4.10: Semiquantitative PCR mit einem für die zu untersuchende Sequenz hergestellten Primerpaar (interne Nummer: 1438).
	Es sind CLL-Patienten (n=9) aufgeführt. Es wurden gleiche Mengen an Probe bei Zyklus 21, 24, 27, 30 und 33 abgenommen und auf das Gel aufgetragen (2%-EtBr-Agarose-Gel).

	Abb. 4.11: Semiquantitative PCR mit einem für die zu untersuchende Sequenz hergestellten Primerpaar. (interne Nummer 1438).
	Es sind 5 gesunde Kontrollen (Buffy coats) aufgeführt. Es wurden gleiche Mengen an Probe bei Zyklus 21, 24, 27, 30 und 33 abgenommen und auf das Gel aufgetragen (2%-EtBr-Agarose-Gel).

In Abbildung 4.10 sind zyklusabhängige Amplifikationen für eine bestimmte Sequenz dargestellt, in Abbildung 4.11 die der gesunden Kontrollgruppe. Sind bei niedrigen [Seite 55↓]Zykluszahlen schon Banden erkennbar und sind die Banden stark ausgeprägt, ist das ein Zeichen für eine hohe Expression des Genes in diesem Kollektiv.

In der erfolgten PCR waren die Banden der Kontrollgruppe stärker ausgeprägt.

Von den 9 untersuchten Sequenzen waren zwei differentiell.

	Abb. 4.12: Semiquantitative PCR mit einem für die zu untersuchende Sequenz hergestellten Primerpaar (interne Nummer 1438).

	Das untere Bild zeigt die den drei aufgeführten Patienten entsprechende Aktin-PCR. Es wurden gleiche Mengen an Probe bei Zyklus 21, 24, 27, 30 und 33 abgenommen und auf das Gel aufgetragen. (2%-EtBr-Agarose-Gel).

In Abb. 4.12 wurde die RT-PCR mit dem bei Abbildung 3.8 aufgeführten Primer Paar und der entsprechenden Aktin-PCR verglichen. Aktin wurde als Referenzgen zum Abgleichen der Ergebnisse herangezogen, da es bekanntermaßen etwa gleichstark in den verglichenen Zellen exprimiert wird. In dieser Abbildung wurden beispielhaft für drei Patienten das Gel der Aktin-PCR aufgeführt.

Die Aktin-Banden der einzelnen Patienten waren untereinander in gleicher Stärke zu erkennen.

Die Expression von 11 Genen wurde mittels semiquantitativer PCR untersucht und zusätzlich der Oberflächenmarker CD5 als Marker mitgeführt. Folgende Tabelle führt die Ergebnisse der BLAST-Suche und die Auswertungen der semiquantitativen PCR auf. Bei den Vergleichen zwischen Normalspendern und CLL-Patienten bedeutet ein p-Wert von <0,05 einen signifikanten Unterschied, das zu untersuchende Gen gilt somit als differentiell.

Tabelle 4.2 (S. 57 - S. 59):

Aufgeführt wurden die Genbanken J/S (Patient J./subtrahiert) und Kontrolle/S (Kontrollgruppe/subtrahiert). Die Werte der Genbank J/S entstammten der suppressiven subtrahierten Hybridisierung eines Patienten im Binet Stadium C mit dem Blut gesunder Kontrollmenschen (Normal-Spenderblut). Dieses Spenderblut diente als Ausgangsmaterial für die Erstellung der Genbank Kontrolle/S mit der Methode der SSH. In diesem Fall wurde das gesunde Spenderblut von dem Material des Patienten J. subtrahiert.

„Dot-Blot“-Unterschied der Hybridisierungs-Signale:

Die subtrahierte Richtung beim Screening der Werte mittels „Dot-Blot“ stimmte mit der RT-PCR überein.

^{Patient J.} - _Kontrolle = Kontroll-Material wurde in der SSH vom Patient J. subtrahiert.

Kontrolle vs. Binet = siehe Auswertung, Seite 41, Fläche x Dichte (Area x Mean) Werte der Banden wurden

ausgewertet und nach einem signifikaten Unterschied untersucht (p-Wert).

[Seiten 57 - 60↓]

[Seite 61↓]

Im folgenden wird auf die Gene eingegangen, die einen signifikanten Unterschied zwischen CLL-Patienten und der Kontrollgruppe (Normalspender) aufwiesen. Das Gen CD5 wurde als Überprüfung der Genbank mitgeführt; es gilt als phänotypisches Charakteristikum von B-CLL Zellen und sollte bei CLL-Patienten stärker exprimiert werden als bei Normalspendern.

	Abb. 4.13: CD5 Expression im Vergleich Kontrolle vs. CLL

	Abb. 4.14: CD5 Expression im Vergleich Kontrolle vs. CLL-Binet Stadien

	Abb. 4.15: Box-Diagramm, Mann-Whitney Test CD5 Expression Kontrolle vs. CLL

In obenstehender Tabelle wurde die Expression von CD5 bei Normalspendern mit denen der CLL Patienten in verschiedenen Binet-Stadien aufgeführt. Mit den Werten der semiquantitativen PCR wurde ein Mann-Whitney Test durchgeführt, der die Wahrscheinlichkeit (p-Wert) für die Differentialität des Genes lieferte. Der p-Wert betrug 0,015. Daraus ließ sich folgern, dass CD5-cDNA in B-CLL-Zellen signifikant stärker exprimiert wurde..

CD20 ist ein funktionell wichtiges Oberflächenmolekül auf B-Zellen. In einem Therapieansatz gegen die B-CLL mit Rituximab werden Antikörper gegen CD20 eingesetzt. Dabei wird die Apoptose der Zellen induziert.

In den folgenden Abbildungen wurde die Expression von cDNA für CD20 bei Normalspendern und CLL-Patienten aufgeführt.

	Abb. 4.16: CD20 Expression Kontrolle vs. CLL-Patienten. Pat. G wurde wegen fehlender Werte nicht dargestellt.

	Abb. 4.17: CD20 Expression im Vergleich Kontrolle vs. CLL-Patienten in den verschiedenen Binet-Stadien.

	Abb. 4.18: Mann-Whitney Test der CD20 Expression Kontrolle vs. CLL-Patienten, Box-Diagramm.

Der p-Wert der Expression von CD20 bei Normalspendern vs. CLL-Patienten betrug 0,02. Nach diesem Ergebnis wurde CD20 in CLL-Patienten signifikant schwächer exprimiert als in der gesunden Kontrollgruppe.

Im folgenden wird näher auf die Expression der cDNA fürIκBα (Mad-3) eingegangen. Die Expression der umgeschriebenen Transkripte war in der BLAST-Suche zu 80% homolog mit dem genannten Gen.

Es wurden wiederum die Expression in der Kontrollgruppe mit der in CLL-Patienten verglichen, in der ersten Tabelle (Abb. 4.19) individuell, in der zweiten (Abb. 4.20) nach Binet-Stadium unterteilt, und in der dritten Abbildung (Abb. 4.21) als Mann-Whitney Test mit Box-Diagramm. Die in Abb. 4.19 und 4.20 angegeben Fallzahlen weichen in dieser Auswertung ab, da die RT-PCR wiederholt wurde, und im folgenden die Ergebnisse von zwei weiteren Patienten und 5 weiteren Normalspendern mit aufgelistet wurden.

Abb. 4.19

Expression des IκBα (Mad-3) Gens, Kontrolle vs. CLL.

Buffy n=10

CLL Patienten n=11

	Abb. 4.19: IκBα Expression Kontrollen vs. CLL-Patienten

	Abb. 4.20: Expression des IκBα (Mad-3) Gens im Verleich Kontrolle vs. CLL-Binet Stadien

	Abb. 4.21: Mann-Whitney Test für die Expression des Mad-3 Gens Kontrolle vs. CLL, Box Diagramm.

Der p-Wert betrug 0,009. Das Mad-3 Gen war in der Kontrollgruppe stärker exprimiert als in CLL-Zellen.

Von 11 untersuchten Genen waren drei Gene differentiell, CD5, CD20 und das IκB/Mad-3 Gen. CD 5 wurde nicht aus den Kolonie-PCRs gepickt, sondern als Überprüfung mitgeführt. Die als differentiell nachgewiesenen Gene waren CD20 und IκB/Mad-3.

Andere Gene, wie z.B. das VDUP1-Gen (interne Nummer 1427) zeigten differentielle Tendenzen, vor allem bei dem Vergleich der Expression zwischen Kontrollgruppe und CLL-Binet-C Patienten. Bei dieser Auswertung betrug der p-Wert 0,02.

In folgender Tabelle sind alle p-Werte für die untersuchten Gene aufgeführt.

	Abb. 4.22: p-Werte Kontrolle vs. CLL
	(p-Wert <0,05 = Differentalität des Gens; signifikanter Unterschied in der Expression zw. Kontrollgruppe und Patienten).

Die in Abb. 4.22 farbig markierten Gene wurden in dieser Arbeit differentiell nachgewiesen. Auf den folgenden Seiten werden mögliche Funktionen dieser Gene in der Pathophysiologie der B-CLL diskutiert.