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1  Einleitung

1.1 Chlorierte Kohlenwasserstoffe

Chlor ist eines der am weitestverbreiteten chemischen Elemente in der Natur. In unterirdischen Lagern und in den Weltmeeren ist Chlor in Form von Stein- bzw. Meersalzen in ungeheuer großen Mengen vorhanden. Das außerordentlich reaktionsfähige Chlor reagiert bereits bei niedrigen Temperaturen mit den relativ reaktionsträgen petrochemischen Grundstoffen. Für die daraus entstehenden Chlorkohlenwasserstoffe (CKW) und Chloraromaten liegt die Energie zur Trennung der Bindung zwischen Chlor- und Kohlenstoffatom in einer Größenordnung, die einen leichten Austausch gegen andere Elemente oder Gruppen erlaubt. Demzufolge spielen chlorierte Kohlenwasserstoffe als End- sowie Zwischenprodukte chemischer Synthesen eine herausragende Rolle in der chemischen Industrie und haben eine Vielzahl unterschiedlichster Anwendungen (zur Übersicht s. Starnick, 1999).

Aufgrund ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften verfügen chlorierte organische Verbindungen über ein erhebliches öko- wie auch humantoxikologisches Potential. Vor allem schlecht wasserlösliche Verbindungen, wie polychlorierte Biphenyle (PCB) oder Dichlordiphenyltrichlorethan (DDT), akkumulieren in der Umwelt und gefährden den Menschen über die Nahrungskette. In den vergangenen Jahren wurde die Verwendung und Produktion zahlreicher chlorierter Substanzen daher eingestellt oder eingeschränkt. Dazu gehören u.a. eine Vielzahl chlorierter Lösemittel, Fluorchlorkohlenwasserstoffe (FCKW) und CKW-haltige Pflanzenschutzmittel, wie z.B. DCP-haltige Substanzen zur Bodenbegasung.

1.2 1,2-Dichlorpropan (DCP)

1.2.1  Eigenschaften von DCP

DCP (C3H6Cl2) ist eine farblose, brennbare und nach Chloroform riechende Flüssigkeit, die stabil bei Raumtemperatur, jedoch leicht flüchtig und entzündlich ist (BUA, 1995). Die wesentlichen chemischen und physikalischen Daten sind in Tab. 1.1 zusammengefaßt. DCP weist eine geringe bis mittlere Bodensorption auf (KOC (DCP): 288 – 414; BUA, 1995). Es ist im Boden mobil und kann daher schnell zur wassergesättigten Zone vordringen. DCP wird der Wassergefährdungsklasse 3 zugeordnet und ist somit als stark wassergefährdend eingestuft.


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DCP wird über die Atemwege bzw. den Magen-Darmtrakt resorbiert. Bei der resorptiven Vergiftung von Menschen durch DCP sind als Folgen hauptsächlich Leber- und Nierenfunktionsstörungen, hämolytische Anämie, Herzmuskelschwäche sowie Schock bekannt.

Tab. 1.1 Chemische und physikalische Eigenschaften von DCP (BUA, 1995).

Eigenschaft

Wert

Dampfdruck (25°C)

66.6 hPa

Dichte (25°C)

1.16 g/cm³

Molekulargewicht

113 g/mol

Siedepunkt

96.6°C

Wasserlöslichkeit (20°C)

2.8 g/L

Die orale Aufnahme größerer Mengen DCP (ca. 50 mL/70 kg Körpergewicht) kann tödlich verlaufen. Die maximale Arbeitsplatzkonzentration (MAK) von DCP beträgt 350 mg/m³. Von der MAK-Komission wurde DCP als Stoff mit begründetem Verdacht auf krebserregendes Potential eingestuft. In Tierversuchen wurde die Ausbildung von Leberkrebs bei Mäusen sowie Brustkrebs bei weiblichen Ratten beobachtet (ATSDR, 1989). Darüber hinaus erwies sich DCP in vitro als mutagen und chromosomenschädigend.

1.2.2  Herkunft und Verwendung von DCP

Bislang ist keine natürliche Quelle von DCP beschrieben worden. Es fällt hauptsächlich als Nebenprodukt bei der industriellen Produktion von Propylenoxid und Epichlorhydrin durch das Chlorhydrinverfahren an (BUA, 1995). Propylenoxid wird überwiegend (65-70%) zur Herstellung von Propylenglykolen verwendet, einer Vorstufe von Polyurethanen (Kahlich et al., 1993). Epichlorhydrin findet Verwendung bei der Herstellung von Epoxidharzen sowie bei der technischen Synthese von Glycerin (Sienel et al., 1987).

In den in Deutschland bestehenden Industrieanlagen zur Produktion von Propylenoxid und Epichlorhydrin fielen im Jahr 1991 77662 t DCP an (BUA, 1995). Abb. 1.1 schlüsselt die weitere Verwendung des DCPs auf. Über die Hälfte des produzierten DCPs wird zur Herstellung von Perchlorethylen und Tetrachlormethan weiterverarbeitet. Die verbleibende Menge wird etwa zu gleichen Teilen direkt entsorgt, d.h. verbrannt bzw. deponiert oder exportiert sowie andersweitig verwertet (BUA, 1995).


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Abb. 1.1 Verbleib des bei der Produktion von Propylenoxid und Epichlorhydrin anfallenden DCPs in Deutschland (BUA, 1995).

Hauptsächlich fand DCP als Bestandteil von Pflanzenschutzmitteln Verwendung. Gemische aus DCP und 1,3-Dichlorpropen (Produktnamen: D-D-Vidden, Di-Trapex) wurden als Bodenbegasungsmittel zur Bekämpfung von Nematoden eingesetzt und waren in Europa und den USA weit verbreitet. In diesen Schädlingsbekämpfungsmitteln war bis 1984 ein Anteil von bis zu 25% DCP als aktive Komponente enthalten (Merriman et al., 1991). Die Verwendung dieser Substanzen führte zu einer Akkumulation von DCP in Grundwässern und Böden vorwiegend ländlicher Gebiete, so daß der DCP-Gehalt in Pflanzenschutzmitteln als Konsequenz auf maximal 0.5% gesenkt worden ist (Produktnamen: Vidden D, Telone). Der 0.5-prozentige DCP-Anteil entstand prozeßbedingt als Nebenprodukt bei der Synthese von 1,3-Dichlorpropen. Seit 1994 ist die Anwendung von DCP-enthaltenden Pflanzenschutzmitteln generell untersagt (BUA, 1995).

Heute findet DCP eine vielseitige Anwendung in Forschung und Industrie. Es wird als Lösemittel für Öl, Fette, Kautschuk und Harz sowie als Fleckenentferner für Textilien, als Scheuermittelbestandteil, Metallreiniger sowie Galvanisierungsmittel eingesetzt (IARC, 1986; ATSDR, 1989; Langer, 1986). Darüber hinaus wird DCP bei der Herstellung von Bautenschutzmitteln und Dachpappen eingesetzt, da es Bitumen, Asphalt sowie Teer zu lösen vermag (Langer, 1986). Auch als Flammschutz- und Imprägnierungsmittel sowie als sog. Scavenger in Antiklopfmitteln kommt DCP in der Industrie zum Einsatz.

1.2.3  Vorkommen von DCP in der Umwelt

Das bei der Produktion von Propylenoxid bzw. Epichlorhydrin anfallende DCP sowie die langjährige Verwendung von DCP-enthaltenden Schädlingsbekämpfungsmitteln führte zu einer erheblichen Belastung der Umwelt. Im Rahmen einer größeren Studie wurden Grundwässer über 200 landwirtschaftlicher Gebiete in Deutschland zur Ermittlung der Konzentration von DCP beprobt. Die Messungen ergaben DCP-Konzentrationen zwischen 0.05 und 5.1 µg/L. Von der europäischen Union wurde als Richtwert für die Konzentration [Seite 4↓] von DCP in Trinkwasser ein Wert von maximal 1 µg/L festgelegt (Rippen, 1994). Die Berliner Liste legt eine Pestizidkonzentration im Grundwasser von 1 µg/L als sogenannten „Eingreifwert“ fest (Berliner Liste, 1996).

Im Gegensatz zu Deutschland wurden in den Niederlanden noch deutlich höhere Belastungen der Umwelt durch DCP festgestellt. Messungen im Gebiet um Drenthe ergaben DCP-Konzentrationen von 0.05 – 165 µg/L in einer Vielzahl unterschiedlicher Grundwasserproben. In einem zur Trinkwassergewinnung verwendeten Grundwasser am gleichen Standort fanden sich Konzentrationen von bis zu 9.3 µg/L DCP. Die hohe Belastung des genannten Bereichs wurde auf eine intensive Verwendung der Schädlingsbekämpfungsmittel D-D-Vidden bzw. Di-Trapex in den Jahren um 1968 zurückgeführt (Leistra und Boesten, 1989). Auch an weiteren Standorten in den Niederlanden sind erhebliche Grundwasserschadensfälle durch einen hohen DCP-Eintrag zu verzeichnen (bis zu 200 µg/L; Beitz et al., 1994).

Die Verwendung DCP-haltiger Bodenbegasungsmittel in der Vergangenheit hat auch auf dem nordamerikanischen Kontinent hohe Grundwasserbelastungen verursacht. Dies bestätigte eine Studie, in der eine Vielzahl unterschiedlicher Grundwässer ländlicher sowie städtischer Areale der USA hinsichtlich des DCP-Gehalts analysiert worden waren (Squillace et al., 1999). Die Messungen ergaben Werte von 0.2 bis 10 µg/L DCP in ländlichen Regionen, während die Proben aus städtischen Gebieten lediglich Werte zwischen 0.2 und 1 µg/L DCP aufwiesen. Andere Autoren aus den USA berichten von Grundwasserproben aus Kalifornien, in denen Belastungen von 1200 µg/L gemessen wurden (Holden, 1986). Obwohl in den 80er Jahren der DCP-Anteil in Schädlingsbekämpfungsmitteln drastisch reduziert wurde, ergaben Messungen in kanadischen Grundwässern in den Jahren 1991 bis 1994 konstante Konzentrationen von durchschnittlich 2.2 µg/L. Das ebenfalls untersuchte 1,2-Dichlorpropen konnte dagegen nur über kurze Zeit in den Proben gefunden werden (Grove et al., 1998). Diese Messungen verdeutlichen, daß DCP eine überaus hohe Verweilzeit in der Umwelt aufweist und somit eine stetige Belastung für die Umwelt darstellt.

In Deutschland lassen sich die bekannten aktuellen Schadensfälle, die mit einer Kontamination durch DCP einhergehen, nicht auf eine extensive Verwendung DCP-haltiger Schädlingsbekämpfungsmittel in der Vergangenheit zurückführen. Vielmehr stellen ohnehin stark mit Chemikalien belastete Standorte, wie die Gelände von Chemiewerken und Mülldeponien, eine stetige Quelle des Eintrags gefährdender Substanzen in die Biosphäre dar. In Sondermülldeponien entstehen hochbelastete Sickerwässer, in denen DCP-Konzentrationen zwischen 320 und 4000 µg/mL nachgewiesen wurden (Brack et al., 1998). Auf dem Gelände eines Chemieunternehmens in Berlin wurden im Grundwasser DCP-Konzentrationen zwischen 34 und 1200 µg/L ermittelt (Meierling, 1998). Die Produktion von Propylenoxid in der ehemaligen DDR [Seite 5↓] führte zu einem umfangreichen Schadensfall in der Nähe von Schönebeck. Das als Nebenprodukt anfallende DCP wurde in einer Salzkaverne zwischengelagert und führte zu einer Kontamination des salzgesättigten Solewassers (BUA, 1995). In der zu dekontaminierenden Sole (50000 m³) sind neben einer Vielzahl anderer Chlororganika 128 mg/L DCP enthalten.

1.3 Mikrobielle Transformation von 1,2-Dichlorpropan

Chlorierte organische Verbindungen anthropogenen Ursprungs gelten unter natürlichen Bedingungen als schwer abbaubar. Die Abbaubarkeit wird sowohl von der Anzahl als auch der Position der Chlorsubstituenten beeinflußt. Die hohe Elektronegativität des Chloratoms erschwert die Oxidation des Kohlenstoffgerüsts durch Sauerstoff. Diese Tatsache wirkt sich insbesondere auf CKW mit mehr als einem Chlorsubstituenten aus. Grundsätzlich werden hochchlorierte Verbindungen leichter anaerob bzw. niedrig chlorierte Verbindungen leichter aerob transformiert. Zweifach chlorierte Verbindungen stellen einen Grenzfall dar, so daß im Falle des DCPs sowohl die aerobe als auch die anaerobe Umsetzung möglich ist.

1.3.1  Aerobe mikrobielle DCP-Transformation

Neben einer nur geringen Zahl chlorierter Aliphaten, die von aeroben Mikroorganismen als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle genutzt werden können (Fetzner und Lingens, 1994), werden die meisten dieser Verbindungen kometabolisch in Gegenwart von Monooxygenasen umgesetzt. Solche Abbauprozesse durch methanotrophe und nitrifizierende Bakterien wurden auch für DCP beschrieben. Im Falle der beiden nitrifizierenden Mikroorganismen Nitrosomonas europaea sowie Nitrosolobus multiformis wird die Umsetzung von DCP mit Hilfe einer Ammonium-Monooxygenase katalysiert (Rasche et al., 1990). Die Nitrifikation wird durch halogenierte Verbindungen gehemmt. Das methanotrophe Bakterium Methylosinus trichosporium OB3 ist ebenfalls in der Lage, DCP kometabolisch umzusetzen (Oldenhuis et al., 1989). Hier ist die lösliche Form des Enzyms Methan-Monooxygenase, die sich nur bei Kupfer-Limitierung ausbildet, für die Transformation von DCP verantwortlich.

Neben der kometabolischen Umsetzung von DCP durch die obengenannten Mikroorganismen, wurde auch ein Bakterium, Pseudomonas fluorescens PFL12, beschrieben, das offenbar in der Lage ist, unter aeroben Bedingungen DCP als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen (Vandenbergh und Kunka, 1988). Allerdings konnten in diesem Falle die Abbauprodukte der DCP-Transformation nicht nachgewiesen werden, so daß der Befund als nicht sicher zu werten ist.


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1.3.2  Anaerobe mikrobielle DCP-Transformation

Unter anaeroben Bedingungen werden chlororganische Verbindungen im allgemeinen durch reduktive Dechlorierung transformiert. Bei dieser Form der anaeroben Dechlorierung werden die Chlorsubstituenten abgespalten und Elektronen auf das Kohlenstoffgerüst übertragen, so daß entweder niedriger chlorierte oder vollständig dechlorierte Verbindungen entstehen. Die drei wesentlichen Mechanismen der reduktiven Dechlorierung sind in Abb. 1.2 veranschaulicht.

Abb. 1.2 Mechanismen der reduktiven Dechlorierung. i) Sequentielle Dechlorierung von PCE(Diekert, 1995), ii) Dehydrodehalogenierung von Lindan (Fetzner, 1998), iii) Dihaloelimination von Hexachlorethan (Criddle et al., 1986).

Bei der sequentiellen reduktiven Dechlorierung werden die Chlorsubstituenten aus Alkylchloriden durch Wasserstoff ersetzt (Bouwer und Wright, 1988; Mohn und Tiedje, 1992). Dieser Abbauweg wurde für eine Vielzahl chlorierter Verbindungen, u.a. für Tetra- (PCE) und Trichlorethen (TCE), beschrieben (Holliger und Schraa, 1994; Diekert, 1995). Die Dehydrodehalogenierung ist bei der anaeroben Dechlorierung von Lindan (Hexachlorcyclohexan) beobachtet worden (Fetzner, 1998). Hier wird HCl aus dem chlororganischen Substrat unter Bildung einer Kohlenstoffdoppelbindung abgespalten. Im Falle der Dihaloelimination (auch: vicinale Reduktion), die beispielsweise bei der Umsetzung von Hexachlorethan zu Tetrachlorethan nachgewiesen wurde (Criddle et al., 1986), werden zwei Chlorsubstituenten von benachbarten Kohlenstoffatomen einer [Seite 7↓] chloraliphatischen Verbindung abgespalten. Auch hier ensteht im Anschluß eine Kohlenstoffdoppelbindung. Eine seltenere nicht-respiratorische Form der reduktiven Dechlorierung ist durch die Abspaltung der Chlorsubstituenten chlorierter C2- und C3-Karbonsäuren durch einige schwefelfreie Purpurbakterien gekennzeichnet (McGrath und Harfoot, 1997). Die dabei entstehenden dechlorierten Karbonsäuren werden von den Mikroorganismen phototroph assimiliert.

Eine Ausnahme stellen die beiden homoacetogenen Bakterien Dehalobacterium formicoaceticum Stamm DMC (Mägli et al., 1996) sowie Acetobacterium dehalogenans Stamm MC (Traunecker et al., 1991) dar. Sie sind in der Lage, Chlormethan bzw. Dichlormethan im Zuge einer Alkyltransferreaktion zu dechlorieren, bei der die Alkylgruppe des chlorierten Methans auf Kohlendioxid übertragen wird. Hierbei handelt es sich um eine anaerobe, jedoch nicht-reduktive Dechlorierung.

Ähnlich zur aeroben Dechlorierung kann die reduktive Dechlorierung entweder metabolisch oder kometabolisch ablaufen (Abb. 1.3). Bei der letzten Reaktion handelt es sich um eine exergone Transformation, die von diversen fakultativ oder obligat anaeroben Mikroorganismen durch verschiedene Enzymsysteme katalysiert werden kann. Dieser exergone Umsatz führt zu keinem direkten Nutzen für den betreffenden Mikroorganismus (Holliger und Schraa, 1994). Kometabolische reduktive Dechlorierungsreaktionen wurden bei methanogenen, acetogenen, sulfat- und eisenreduzierenden Mikroorganismen beim Umsatz halogenierter Aliphate beobachtet und sind als initialer Schritt in der anaeroben Degradation chlororganischer Verbindungen zu betrachten (Fetzner, 1998). Solche Reaktionen stellen im allgemeinen das Ergebnis einer Syntrophie dar, d.h. einer engen Interaktion zwischen unterschiedlichen Mikrorganismen, die aufeinander angewiesen sind (Sharak-Genthner et al., 1990; Häggblom et al., 1996).

Im Gegensatz zur kometabolischen reduktiven Dechlorierung hat die metabolische reduktive Dechlorierung einen direkten Nutzen für den betreffenden Mikroorganismus. In diesem Fall dient der chlorierte Kohlenwasserstoff als Elektronenakzeptor und wird im Verlauf der Reaktion reduziert. Bei diesem Prozeß der „Chloratmung“, die auch als respiratorische Dechlorierung bezeichnet wird, kommt es zur ATP-Synthese, also zum direkten Energiegewinn durch Elektronentransportphosphorylierung (Diekert, 1995). Eine Voraussetzung für die Energiegewinnung ist das Vorliegen einer exergonen Reaktion, d.h. das Redoxpaar RClx/RClx-1 muß ein positives Redoxpotential aufweisen (Holliger und Schumacher, 1994). Als Elektronendonor spielt Wasserstoff eine zentrale Rolle.


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Abb. 1.3 Übersicht über die bei anaeroben oder fakultativ anaeroben Mikroorganismen beobachteten Strategien zur Dechlorierung chloraliphatischer und chloraromatischer Verbindungen.

Die Mikroorganismen, die chlororganische Verbindungen durch respiratorische Dechlorierung umzusetzen vermögen, sind u.a. dadurch charakterisiert, daß sie die Energiegewinnung durch reduktive Dechlorierung an Zellwachstum koppeln können (Löffler et al., 1999). Da solche Bakterien in natürlichen Habitaten zumeist in metabiotischer Wechselwirkung mit einer komplexen mikrobiellen Flora vorkommen, ist die Isolierung solcher Mikroorganismen erheblich erschwert. Demzufolge ist die Anzahl bislang bekannter chlororespirierender Mikroorgansimen relativ gering (Tab. 1.2). Hinzu kommt, daß viele chlororganische Verbindungen toxisch und nur gering wasserlöslich sind.

Bislang wurde noch kein Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur vollständigen DCP-Transformation isoliert. Die oben genannten aerob DCP-transformierenden Bakterien sind lediglich in der Lage, eine unvollständige Dechlorierung zu vollziehen. Ein vollständiger Abbau von DCP zu Propen konnte bislang nur mit anaeroben aus Süßwassersedimenten angereicherten mikrobiellen Mischpopulationen erreicht werden (Löffler et al., 1997; Hauck und Hegemann, 1999). In diesen Anreicherungskulturen wurden Kombinationen aus sequentieller Dechlorierung und Dihaloelimination (Löffler et al., 1997) sowie aus sequentieller Dechlorierung und Dehydrodehalogenierung (Hauck und Hegemann, 1999) als DCP-Abbauwege nachgewiesen. Dies deutete auf ein Vorhandensein mehrerer DCP-umsetzender anaerober mikrobieller Spezies in den jeweiligen Mischkulturen hin.


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Tab. 1.2 Beispiele für bakterielle Isolate mit der Fähigkeit zur respiratorischen Dechlorierung.

Isolat

Elektronenakzeptor

Referenz

Desulfomonile tiedjei

CBT, PCE, PCP

Shelton und Tiedje, 1984

Desulfitobacterium dehalogenans

CP, PCE

Gerritse et al., 1996

Desulfitobacterium hafniense

CP

Christiansen und Ahring, 1996

Desulfitobacterium chlororespirans

CP

Sanford et al., 1996

Desulfitobacterium frappieri

PCP

Bouchard et al., 1996

Dehalospirillum multivorans

PCE, TCE

Neumann et al., 1994

Dehalobacter restrictus

PCE, TCE

Holliger et al., 1998

Dehalobacter sp. TEA

PCE, TCE

Wild et al., 1996

Dehalococcoides ethenogenes

PCE, TCE, DCE, VC

Maymó-Gatell et al., 1997

Isolat CBDB1

CB

Adrian et al., 2000

1.4 Technische Verfahren mikrobieller Dechlorierung

Zur mikrobiellen Dechlorierung chlororganischer Verbindungen in einem größeren Maßstab werden die abbauenden Mikroorganismen zumeist in Bioreaktoren, wie z.B. Festbett-, Wirbelschicht- oder Schlaufenreaktoren, kultiviert (Schlötelburg et al., 1999). In vielen Fällen liegt die Biomasse in immobilisierter Form vor, d.h. die Zellen werden an feste Trägermaterialen wie Aktivkohle, Sand, porösem Glas oder Ionenaustauscherharzen durch Adhäsion gebunden. Die Verwendung immobilisierter Mikroorganismen ermöglicht hohe Biomassedichten der transformierenden Organismen durch relativ große Aufwuchsflächen. Ein weiterer Vorteil besteht in der Entkopplung der Biomasse-aufenthaltszeit von der hydraulischen Verweilzeit. Dies ermöglicht auch langsam wachsenden Organismen sich im Bioreaktor zu etablieren (Hamilton, 1987).

In den meisten Fällen werden undefinierte anaerobe Mischkulturen zur Dechlorierung chlororganischer Verbindungen in Bioreaktoren eingesetzt (z.B. Hauck und Hegemann, 1999; Stuart et al., 1998; Tartakovsky et al., 2000; Zou et al., 1999). Die Mitglieder dieser Konsortien bilden komplexe Biofilme auf den verwendeten Trägermaterialien aus und sind gegenüber Störungen des Abbauprozesses außerordentlich widerstandsfähig. So sind Biofilme mikrobieller Mischpopulationen gegenüber schwankenden Schadstoffkonzentrationen oder unregelmäßigen Abwasseranfallzeiten weitaus weniger anfällig als suspendierte Mikroorganismen (Hempel und Krull, 1996). Darüber hinaus sind mikrobielle Mischkulturen für eine Dechlorierung kontaminierter Abwässer besser geeignet als entsprechende Reinkulturen, da letztere nach einer längeren Betriebszeit des Bioreaktors durch autochthone Mikroorganismen verdrängt werden können (Massol-Deyá [Seite 10↓] et al., 1997; Jones et al., 1998). Der Einsatz von dechlorierenden Reinkulturen würde zudem aufwendigere Maßnahmen zum Erhalt der Prozeßsterilität erfordern und somit zu einer Kostensteigerung führen.

Obwohl die Verwendung mikrobieller Mischpopulationen zur Dechlorierung kontaminierter Abwässer in Bioreaktoren zu einer hohen Prozeßstabilität führt, kann es dennoch durch drastische Veränderungen der Betriebsparameter zur Störungen kommen. In solchen Fällen muß dem Geschehen durch eine geeignete Bioprozeßsteuerung entgegengewirkt werden. Da jedoch im überwiegenden Fall nur unzureichende Informationen zur mikrobiellen Zusammensetzung bzw. zum komplexen Stoffwechselgeschehen der verwendeten Mischkultur vorliegen, ist eine effiziente Steuerung des Reaktors erheblich erschwert. Diese Problematik kommt auch bei der generellen Optimierung des Abbauprozesses im Bioreaktor zum Tragen.

In der Literatur sind zwei anaerobe mikrobielle Konsortien beschrieben, die DCP reduktiv zu dechlorieren vermögen (Löffler et al., 1997; Hauck und Hegemann, 1999; siehe auch 1.3.2). Eine kontinuierliche Kultivierung in einem Bioreaktor wurde bislang nur mit der zweitgenannten Kultur durchgeführt. Die mikrobiologische Analyse dieser Bioreaktorkultur ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit.

1.5 Molekulare Analyse mikrobieller Diversität

Prokaryoten kommen in vielfältiger Form in nahezu allen Lebensräumen der Erde vor. Über einen Zeitraum von ca. 3.5 Milliarden Jahren haben sie sich an unterschiedlichste Umweltbedingungen, etwa durch die Entwicklung spezieller Stoffwechselwege oder genetischer Regulationsmechanismen, optimal angepaßt. Dieser langandauernde evolutionäre Prozeß führte zu einer außerordentlich hohen Diversität und Komplexizität vieler mikrobieller Lebensgemeinschaften, deren Analyse Gegenstand umfangreicher Forschungsaktivitäten ist (zur Übersicht s. Hunter-Cevera, 1998; Bull et al., 2000).

Die Untersuchung komplexer mikrobieller Populationen stellt methodisch in vielerlei Hinsicht eine anspruchsvolle Aufgabe dar. Mikrobiologische Methoden, die ausschließlich auf herkömmlichen Kultur- und Identifizierungsverfahren beruhen, d.h. der Isolierung von Mikroorganismen aus einer Population mit anschließendem Nachweis physiologischer Eigenschaften mittels biologischer oder chemischer Testverfahren, haben sich in diesem Zusammenhang als nicht hinreichend erwiesen. Eine derartige Herangehensweise ermöglicht zwar eine weitreichende phäno- sowie genotypische Charakterisierung bzw. Identifizierung einzelner mikrobieller Spezies, führt jedoch in den meisten Fällen zu einer deutlichen Unterschätzung der tatsächlichen Diversität einer Population. So wurde anhand von DNA/DNA-Hybridisierungsexperimenten an Bodenproben eines norwegischen [Seite 11↓] Buchenwaldes die Anwesenheit von etwa 4000 genomisch vollständig differierenden Mikroorganismen ermittelt. Diese Zahl überstieg die der korrespondierenden Isolate um den Faktor 200 (Torsvik et al., 1990a; Torsvik et al., 1990b). Eine solche Diskrepanz kann auch beim Vergleich zwischen Direkt- und Lebendzellzahlbestimmungen einer mikrobiellen Population beobachtet werden. Ferner sind schon seit längerer Zeit zahlreiche Mikroorganismen bekannt, die zwar mikroskopisch dargestellt werden können, deren Isolierung aber bisher nicht gelang (Amann et al., 1995). Die Ursache für diese offensichtliche Schwäche kulturabhängiger mikrobiologischer Methoden ist u.a. darin zu sehen, daß der Großteil der beteiligten Mikroorganismen eines komplexen Lebensraums als Reaktion auf die vorherrschenden Umwelteinflüsse in sich stetig ändernde physiologische Zustände übergeht (Hattori et al., 1997). Darüber hinaus wird der physiologische Status eines Mikroorganismus‘ innerhalb einer Lebensgemeinschaft durch die Interaktion mit anderen Mikroorganismen maßgeblich beeinflußt. Diese Faktoren erschweren konsequenterweise die Isolierung der beteiligten Spezies auf künstlichen Nährmedien beträchtlich.

Eine andere Möglichkeit zur Analyse mikrobieller Diversität besteht in der Anwendung molekularer Nachweis- und Klassifizierungsmethoden. In diesem Fall werden Mikroorganismen anhand spezifischer Markermoleküle, wie z.B. ssRNA, lsRNA, Gyrasen, Elongationsfaktoren, ATPasen etc. identifiziert (Ludwig et al., 1998). Durch die vergleichende Analyse dieser Moleküle ist eine phylogenetische Einordnung der korrespondierenden Spezies möglich. Die ribosomale RNA spielt unter den phylogenetischen Markern eine herausragende Rolle. Aufgrund ihrer ubiquitären Verbreitung, ihrer funktionellen Konstanz und ihrer Unterteilung in Sequenzdomänen mit variierenden Substitutionsraten stellt sie einen molekularen „Zeitmesser“ dar (Woese, 1987) (Abb. 1.4). Die in den vergangenen 10 – 15 Jahren durchgeführten Arbeiten zur vergleichenden rRNA-Analyse haben eine molekulare Systematik aller Lebewesen entstehen lassen. Demnach werden alle Organismen in die drei Hauptentwicklungslinien (Domänen) Bacteria, Archaea (die letzteren bilden zusammen die Prokaryoten) und Eucarya eingeteilt. Basierend auf der molekularen 16S rRNA-Systematik wurden die Bacteria 1987 durch 11 Phyla1 charakterisiert (z.B. Proteobakterien, Spirochäten oder Cyanobakterien) (Woese, 1987). Etwa 10 Jahre später wurden bereits 36 Phyla beschrieben, von denen 13 noch ohne dazugehöriges Isolat waren (Phylum-Cluster; Abb. 1.5) (Hugenholtz et al., 1998b). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt beträgt die Zahl der in Datenbanken hinterlegten 16S rRNA-Sequenzen etwa 22000 (Amann und Ludwig, 2000). Diese rasante Entwicklung der vergleichenden 16S rRNA-Analyse hat dazu geführt, daß die entsprechenden Sequenzinformationen mittlerweile einen wesentlichen Bestandteil [Seite 12↓] innerhalb eines polyphasischen Konzeptes der prokaryotischen Taxonomie darstellen. Bei diesem Spezieskonzept werden die gesamten verfügbaren phäno- sowie genotypischen Daten zur Erstellung einer generellen prokaryotischen Klassifizierung berücksichtigt (Rosselló-Mora und Amann, 2001; Schloter et al., 2000; Vandamme et al., 1996).

Abb. 1.4 Sekundärstruktur der 16S rRNA von E. coli (Garrett und Grisham, 1995).

Der Nachweis der 16S rRNA bzw. 16S rDNA bei Prokaryoten hat im Gegensatz zu herkömmlichen mikrobiologischen Identifizierungsverfahren den entscheidenden Vorteil, daß auch nicht-kultivierte Organismen eines Lebensraums erfaßt werden können. Dies hatte erhebliche Konsequenzen für die Erforschung komplex zusammengesetzter mikrobieller Habitate und führte zur Definition der sog. „molekularen Ökologie“ (Akkermans et al., 1994), die sich von der „mikrobiellen Ökologie“ durch ihr methodisches Spektrum abhebt (Hunter-Cevera, 1998). Die Einführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Entwicklung zahlreicher 16S rDNA-Amplifizierungs- und Sequenzierprimer sowie der Einsatz leistungsfähiger Methoden zur automatischen DNA-Sequenzierung (Weisburg et al., 1991; Ludwig et al., 1998) machte 16S rRNA bzw. 16S rDNA-gerichtete Methoden zu mikrobiologischen Standardtechniken.


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Abb. 1.5 Auf vergleichender 16S rDNA-Analyse basierender phylogenetischer Baum der bislang bekannten bakteriellen Phyla (schwarz) bzw. Phylum-Cluster (weiß) (Hugenholtz et al., 1998b).

Ausgangspunkt aller in vitro-Amplifikationsverfahren zur Analyse ribosomaler RNA ist die aus einer entprechenden Probe präparierte genomische DNA. Aus ihr können die 16S rRNA-kodierenden Gene direkt amplifiziert und anschließend kloniert werden. Die durch das Sequenzieren des rDNA-Inserts eines rekombinanten Klons gewonnene 16S rDNA-Sequenz wird mit anderen, bereits in Datenbanken hinterlegten 16S rDNA-Sequenzen durch Anwendung unterschiedlicher Algorithmen zur Ähnlichkeitsberechnung verglichen und phylogenetisch analysiert (zur Übersicht s. Ludwig et al., 1998). Diese Vorgehensweise ermöglicht eine hohe Auflösung bei der Analyse komplexer mikrobieller Populationen. Allerdings ist das Durchmustern von 16S rDNA-Klonbibliotheken durch direktes Sequenzieren der rDNA-Inserts vergleichsweise arbeits- und zeitintensiv. Aus diesem Grunde wurden methodische Ergänzungen eingeführt, die durch das Auffinden [Seite 14↓] redundanter Klone eine Beschleunigung der Analyse herbeiführen. Dazu gehören etwa die Hybridisierung mit gruppen-spezifischen rDNA-Oligonukleotidsonden (Liesack und Stackebrandt, 1992), die Verwendung spezifischer rDNA-Polynukleotidsonden (von Wintzingerode et al., 1999) oder die Analyse rekombinanter Klone mittels Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) (Weidner et al., 1996) bzw. Terminalem-Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (TRFLP) (Liu et al., 1997).

Im Gegensatz zu den oben genannten Methoden ist bei der Denaturierenden Gradienten Gelelektrophorese (DGGE; Muyzer et al., 1993) kein Klonierungsschritt erforderlich. Bei diesem Verfahren wird die aus genomischer DNA amplifizierte 16S rDNA in einem Polyacrylamidgel in Abhängigkeit ihres GC-Gehalts elektrophoretisch aufgetrennt. Die DGGE erlaubt damit eine schnelle, aber relativ grobe Erfassung mikrobieller Diversität und eignet sich hervorragend zur Untersuchung von Populationsveränderungen über einen längeren Zeitraum. Die Einführung der DGGE in der molekularen Ökologie hatte die verstärkte Anwendung und Adaption weiterer molekularer „Fingerprint“-Methoden zur Folge wie etwa der TGGE (Temperatur Gradienten Gelelektrophorese; Muyzer und Smalla, 1998), des Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP) (Lee et al., 1996), der Amplifizierten-Ribosomalen-DNA-Restriktionsanalyse (ARDRA) (Massol-Deya et al., 1995) oder der Zufalls-Amplifizierten-Polymorphen-DNA (RAPD) (Xia et al., 1995). Ein wesentlicher Vorteil von DGGE, TGGE, SSCP sowie ARDRA besteht im Gegensatz zur RAPD darin, daß die 16S rDNA aus Gelbanden extrahiert und nach entsprechender Sequenzierung phylogenetisch analysiert werden kann. Die molekularen „Fingerprint“-Methoden sind relativ schnell und erlauben die Analyse vieler Proben in kurzer Zeit. Jedoch erreichen sie im Allgemeinen eine nur begrenzte Auflösung und erfassen lediglich die abundanten Mikroorganismen einer Population.

Neben der rein qualitativen Analyse mikrobieller Diversität ist eine molekulare Quantifizierung von Mikroorganismen zur Untersuchung von Populationsveränderungen von großer Wichtigkeit. DGGE sowie TGGE bieten die Möglichkeit der semi-quantitativen Abschätzung der aufgetrennten 16S rDNA und damit der korrespondierenden Organismen (Muyzer und Smalla, 1998). Eine genauere Methode stellt die quantitative PCR dar (z.B. Felske et al., 1998a). Bei diesem methodischen Ansatz kann durch die PCR-Amplifikation auf die Ausgangskonzentration eines jeweiligen 16S rDNA bzw. 16S rRNA-Templates rückgeschlossen und somit eine Quantifizierung der betreffenden Organismen vorgenommen werden.

Im Gegensatz zu den PCR-vermittelten Methoden ist die 16S rRNA-gerichtete In-Situ-Hybridisierung ein Verfahren zum direkten Nachweis von Mikroorganismen in fixiertem Probenmaterial unter Verwendung spezifischer Oligonukleotidsonden (DeLong et al., 1989). Die am häufigsten angewandte Methode ist die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH). Hier werden die Oligonukleotidsonden mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt, [Seite 15↓] der einen mikroskopischen Nachweis hybridisierter Zellen nach entsprechender Fluoreszenz-Anregung ermöglicht (zur Übersicht s. Moter und Göbel, 2000). Diese Methode erlaubt das mikroskopische „Auszählen“ hybridisierter Zellen und damit eine direkte Quantifizierung innerhalb der Probe (z.B. Cottrell und Kirchman, 2000; Manz et al., 1999; Ravenschlag et al., 2001).

So wie die herkömmlichen Kultur- und Identifizierungsverfahren unterliegen auch die molekularen PCR-vermittelten Nachweismethoden von Mikroorganismen spezifischen Limitierungen und Fehlermöglichkeiten (zur Übersicht s. von Wintzingerode et al., 1997). Beispielsweise können PCR-Artefakte, wie etwa Sequenz-Chimären, unvollständige DNA-Präparationen aus dem Probenmaterial oder DNA-Kontaminationen zu einer Verfälschung einer molekularen Populationsanalyse führen. Jedoch haben die vielen 16S rRNA-gerichteten Untersuchungen zur Diversität mikrobieller Populationen unterschiedlichster Lebensräume übereinstimmend gezeigt, daß die natürliche Diversität der beteiligten Mikroorganismen bislang signifikant unterschätzt worden ist (zur Übersicht s. Hugenholtz et al., 1998b). Durch die phylogenetische Charakterisierung auch nicht-kultivierter Organismen ermöglicht die vergleichende 16S rRNA-Analyse die Erstellung eines Grundgerüstes, an dem sich weitere molekulare, aber auch kulturabhängige Verfahren orientieren können. Nur durch eine Kombination und konsequente Weiterentwicklung der klassischen mikrobiologischen sowie der molekularen Verfahren kann die außerordentlich komplexe mikrobielle Vielfalt der Biosphäre sinnvoll erforscht werden.

1.6 Ziel der Arbeit

DCP fällt hauptsächlich als Nebenprodukt chemischer Synthesen an und gilt als toxische Substanz mit krebserregendem Potential. Da DCP unter aeroben Bedingungen nur sehr schwer abbaubar ist, reichert es sich in Böden, Sedimenten und Grundwässern an und stellt somit eine ernstzunehmende Umweltkontaminante dar. Innerhalb des Sonderforschungsbereiches 193 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) wurde an der Technischen Universität Berlin (Institut für Siedlungswasserwirtschaft, Arbeitsgruppe Prof. Hegemann) ein kontinuierliches Verfahren zur anaeroben Transformation von DCP in einem Wirbelschichtreaktor etabliert. Die Umsetzung des DCPs im Reaktor erfolgte durch eine anaerobe mikrobiellen Mischpopulation, die aus Flußsediment der Saale (bei Halle) angereichert worden war.


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Ziel der vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der mikrobiellen Diversität der anaeroben DCP-transformierenden Bioreaktorpopulation. Dazu sollte zunächst durch Anlage und Analyse von 16S rDNA-Klonbibliotheken ein möglichst repräsentativer Querschnitt der prokaryotischen Diversität der Bioreaktorkultur gewonnen werden. Für diese Untersuchungen wurde der Bioreaktor nach Beendigung der Anfahrphase beprobt. Die durch die Analyse der Klonbibliotheken gewonnenen 16S rDNA-Sequenzen sollten durch Abgleich mit 16S rDNA-Datenbanken identifiziert bzw. eingeordnet werden. Im Anschluß sollte die phylogenetische Klassifizierung der in der Bioreaktorkultur vorkommenden Bakterien und Archaea erfolgen. Basierend auf den Sequenzinformationen sollten dann spezifische Oligonukleotidsonden und PCR-Primer für weitere molekulare Untersuchungen abgeleitet werden.

Es stellte einen wichtigen Aspekt der Untersuchungen dar, nicht nur eine Momentaufnahme der mikrobiellen Flora der Bioreaktorkultur zu erhalten, sondern eine mögliche Veränderung der Population in Abhängigkeit der Betriebsdauer des Reaktors bzw. der sich ändernden Prozeßparameter zu erfassen. Es sollten Mikroorganismen oder Mikroorganismengruppen gefunden werden, die als Indikatoren für den Verlauf der DCP-Transformation im Bioreaktor fungieren könnten. Darüber hinaus sollten anhand der nachgewiesenen Mikroorganismen auch Rückschlüsse zur Physiologie der DCP-Transformation im Bioreaktor gezogen werden.

Um dieses Ziel zu erreichen, mußten unterschiedliche molekulare Methoden sinnvoll kombiniert werden, die neben der rein qualitativen Deskription mikrobieller Spezies auch deren Quantifizierung innerhalb der Population ermöglichen. Die Proben der DCP-transformierenden Bioreaktorpopulation sollten mit einer Kombination aus 16S rDNA-Klonbibliotheken, Denaturierender Gradienten Gelelektrophorese (DGGE), Quantitativer Echtzeit-PCR (QE-PCR) und Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) analysiert werden. Ziel dieses mehrdimensionalen Ansatzes war es, ein möglichst genaues Bild der DCP-umsetzenden Bioreaktorpopulation zu erstellen, das zum einen als Basis für weiterführende Untersuchungen zur mikrobiellen Transformation von chlororganischen Verbindungen und zum anderen der direkten Optimierung des Bioreaktorverfahrens dienen sollte.


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1.7  Analyseschema

Abb. 1.6 Schematische Darstellung der methodischen Vorgehensweise zur molekularen Analyse der DCP transformierenden Bioreaktorkultur.


Fußnoten und Endnoten

1 Ein 16Sr RNA-basiertes Phylum stellt eine reproduzierbar monophyletische Gruppe aus mindestens zwei 16S
rRNA-Sequenzen dar, die keine signifikante Ähnlichkeit zu einem anderen Phylum aufweist (Woese, 1987).



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20.09.2004