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3  Ergebnisse

3.1 Probenentnahme aus dem Bioreaktor

Insgesamt wurden aus der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation sechs Proben entnommen (Polyurethanschaumstoffwürfel und Glasobjektträger). In diesem Zeitraum (08.01.1998 bis 25.10.2000) wurde die DCP-Konzentration im Zulauf des Reaktors variiert. Die Entnahmezeitpunkte sowie die gemessenen DCP-Konzentrationen im Reaktorzulauf sind in Tab. 3.1 zusammengefaßt. Probe S1 wurde aus der DCP-dechlorierenden Sedimentkultur entnommen, die als Inokulum des Reaktors verwendet wurde. Die Probe wurde unmittelbar vor der Beschickung des Bioreaktors genommen.

Tab. 3.1 Übersicht über die entnommenen Bioreaktorproben und korrespon-dierenden DCP-Konzentrationen. Von den Proben S2 - S6 wurden sowohl PU-Würfel als auch Glasobjektträger entnommen (Probe S1 nur PU-Würfel).

Zeitpunkt der
Probennahme

Probenbezeichnung

DCP-Konzentration
(Zulauf) [mg/L]

08.01.98

S1

0.05

17.03.98

S2

8.92

06.11.98

S3

68.00

15.03.99

S4

29.37

24.01.00

S5

22.45

25.10.00

S6

34.53

3.2 DNA-Extraktion aus den Bioreaktorproben

Die Gesamt-DNA der Proben S1 – S4 wurde durch eine Kombination aus Lysozym-, Proteinase K- sowie Frier/Tau-Behandlung extrahiert und anschließend durch eine Phenol/Chloroform-Behandlung aufgereinigt. Trotz dieses ersten Aufreinigungsschritts wies die wässrige DNA-Lösung aller vier Proben eine stark bräunliche Färbung auf, die auf die Anwesenheit von PCR-inhibierenden Huminsäuren schließen ließ. Die Konzentration verunreinigender Substanzen wurde durch den zweiten Aufreinigungsschritt, der Gelfiltration, deutlich verringert. Trotzdem zeigten die DNA-Extrakte im Agarosegel neben der dominierenden hochmolekularen DNA-Bande immer [Seite 42↓] noch eine Vielzahl an niedermolekularen Degradationsprodukten (Abb. 3.1), die erst durch einen dritten Aufreinigungsschritt, der präparativen Agarosegelelektrophorese, entfernt werden konnten.

Abb. 3.1 Agarosegelelektrophorese von extrahierter Bioreaktor-DNA (5 µL S2-DNA [A] mit 1.5 µL DNA-Marker II [B]). Die DNA des Gelbereichs zwischen den hellen Linien wurde für die 16S rDNA-Amplifikation eluiert.

3.3 Charakterisierung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch Analyse von 16S rDNA-Klonbibliotheken

3.3.1  Anlage der 16S rDNA-Klonbibliotheken

Nach etwa zweimonatiger Kultivierung der DCP-transformierenden Bioreaktormischkultur wurde Probe S2 entnommen, von der ausgehend eine breit angelegte Diversitätsanalyse der Population erfolgte (siehe 1.7). Aus dem DNA-Extrakt von S2 wurden 16S rDNA-Fragmente sowohl von Bakterien (etwa 1550 bp Länge) als auch von Archaea (etwa 1000 bzw. 1400 bp Länge) amplifiziert und in E. coli kloniert. Die Klonbibliothek bakterieller 16S rDNA wurde als Klonbibliothek A bezeichnet. Aus ihr leiten sich die “SHA-Klone” ab (für: Saale, Halle, Klonibliothek A). Mit den Archaea-Klonbibliotheken wurde analog verfahren (Primerpaar 10-30Fa/1390Ra: Klonbibliothek B, “SHB-Klone”; Primerpaar 357Fa/1390Ra: Klonbibliothek C, “SHC-Klone”). Probe S3 wurde dem Bioreaktor etwa 8 Monate nach Probe S2 entnommen. Aus dieser Probe wurde eine weitere bakterielle rDNA-Klonbibliothek angelegt (Klonbibliothek D, “SHD-Klone”).


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3.3.2  Zusammensetzung und phylogenetische Analyse der Klonbibliothek A

Die Klonbibliothek A wurde durch eine Kombination aus direktem Sequenzieren der 16S rDNA-Inserts zufällig ausgewählter Klone sowie Dot-Blot-Hybridisierung mittels spezifischer Polynukleotidsonden analysiert (von Wintzingerode et al., 1999). Die Hybridisierung mit Polynukleotidsonden diente dem Auffinden redundanter Klonsequenzen innerhalb der Klonbibliothek. Auf diese Weise konnte der Suchraum und damit der Sequenzier- bzw. Zeitaufwand der Klonanalyse erheblich verringert werden.

Zunächst wurde die Klonbibliothek A auf das Vorhandensein von vier 16S rDNA-Klonsequenzen geprüft, die bei der molekularen Diversitätsanalyse eines Trichlorbenzol (TCB)-transformierenden Bioreaktorkonsortiums gefunden worden waren (SJA-19, SJA-36, SJA-102 sowie SJA-186; von Wintzingerode et al., 1999). Zu diesem Zweck wurden 300 SHA-Klone (SHA-1 bis SHA-300) sukzessive mit von diesen Klonen amplifizierten Polynukleotidsonden hybridisiert. Von allen Sonden reagierte lediglich SJA-19 mit Klon SHA-67. Die anschließende 16S rDNA-Sequenzanalyse von SHA-67 ergab 99.2% Sequenzähnlichkeit zu Klon SJA-19 (Tab. 3.2).

Anschließend wurden die 16S rDNA-Inserts von zunächst 13 zufällig ausgewählten SHA-Klonen (gekennzeichnet mit " ∗ " in Tab. 3.2) sequenziert. Neun dieser Klone wiesen höchste 16S rDNA-Sequenzähnlichkeiten (≥ 93.2%) entweder zu WCHA-, WCHB-, WsCH- bzw. WFeA-Klonen (im Folgenden "Wurtsmith-Sequenzen" genannt; Dojka et al., 1998) oder zu SJA-Klonen auf (im Folgenden "Trichlorbenzol-Sequenzen" genannt; von Wintzingerode et al., 1999). Diese 16S rDNA-Sequenztypen konnten bislang ausschließlich in mit chlorierten Kohlenwasserstoffen belasteten Habitaten gefunden werden. Aus diesem Grunde wurden DIG-markierte 16S rDNA-Fragmente der neun SHA-Klonsequenzen generiert, um deren Verteilung innerhalb der Klone SHA-1 bis SHA-300 durch Dot-Blot-Hybridisierung zu ermitteln. Die 16S rDNA-Inserts aller positiven Klone wurden sequenziert (etwa 1000 bp). Da die Stringenz der Hybridisierungen mit 60°C vergleichsweise niedrig war, wurden teilweise auch Klone mit nur geringer Sequenzähnlichkeit zur jeweiligen Sondensequenz erfaßt. Im Anschluß an die Hybridisierungen erfolgten 16S rDNA-Sequenzierungen (etwa 1550 bp) weiterer 50 zufällig ausgewählter SHA-Klone, so daß nach Abschluß der Analyse von Klonbibliothek A die 16S rDNA-Sequenzen von insgesamt 125 SHA-Klonen vorlagen, die mit den Einträgen von 16S rDNA-Datenbanken verglichen wurden (Tab. 3.2).


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Tab. 3.2 16S rDNA-Sequenzen der SHA-Klone und deren ähnlichste 16S rDNA-Sequenzen in Datenbanken.


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Da bei Bakterien bzw. Archaea derselben Gattung eine 16S rDNA-Sequenzähnlichkeit von ≥ 97% zu Grunde gelegt wird (Stackebrandt und Goebel, 1994), konnten die 125 SHA-Klone gemäß dieses Kriteriums in 75 Klonfamilien zusammengefaßt werden, die jeweils nach einem repräsentativen Klon benannt wurden (Tab. 3.2). Der überwiegende Teil aller SHA-Klonfamilien (73.7%) umfaßte jeweils nur eine SHA-Klonsequenz. Klonfamilie SHA-21 war mit insgesamt 8 Klonen die größte Klonfamilie.

Gruppierung der SHA-Klonsequenzen innerhalb der bakteriellen Phyla

Die phylogenetische Analyse zeigte, daß der überwiegende Teil der SHA-Klonsequenzen 15 bekannten bakteriellen Phyla zugeordnet werden konnte (Abb. 3.2). Die zu den Grünen nicht-schwefelhaltigen Bakterien (GNS) gehörigen SHA-Klone waren am häufigsten vertreten (36 SHA-Klone in 17 Klonfamilien), gefolgt von den Klonen, die zu den grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt gehörten (30 SHA-Klone in 16 Klonfamilien). Zu den GNS gehörten auch die beiden größten gefundenen Klonfamilien, SHA-21 (8 Klone) sowie SHA-20 (6 Klone).

In zwei Fällen wurden SHA-Klonsequenzen gefunden, die offenbar neue Untergruppen bekannter bakterieller Phyla darstellten. Gruppe SHA-16 (Abb. 3.3) bestand aus vier SHA-Klonsequenzen (SHA-16, -98, -102 und –118), die phylogenetisch eng miteinander verwandt waren und auch bei Anwendung unterschiedlicher Berechnungsalgorithmen mit variierenden Datensätzen stets eine monophyletische Einheit bildeten. Alle vier Sequenzen zeigten maximale Ähnlichkeiten zwischen 83 und 85% zu den Gattungen Dehalobacterium, Thermoanaerobacter und Dethiosulfovibrio, so daß Gruppe SHA-16 als neue Untergruppe der Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt eingeordnet werden konnte. Eine ähnliche Situation lag bei Klon SHA-71 vor, der höchste Sequenzähnlichkeiten zu den Klonen PBR-10, PBS-III-30 sowie TAYNAYA25 aufwies (Abb. 3.3). Diese vier Klone, die in der Gruppe SHA-71 zusammengefaßt wurden, stellen einen monophyletischen Zweig innerhalb des Holophaga-Acidobacterium-Fibrobacter-Phylums dar. Bei Vertretern unterschiedlicher bakterieller Phlya wäre der Sequenzunterschied höher und würde mindestens 20 - 25% betragen (Hugenholtz et al., 1998b).

Bei insgesamt sieben gefundenen SHA-Sequenzen war die Zuordnung zu bekannten bakteriellen Phyla nicht möglich. Für sechs dieser sieben SHA-Klonsequenzen konnten anhand der phylogenetischen Analyse drei neue Phylum-Cluster definiert werden, Saale-1 bis Saale-3 (Abb. 3.3). Alle Saale-Gruppen enthalten mindestens zwei enger miteinander verwandte 16S rDNA-Sequenzen (> 90% Ähnlichkeit). Sie sind auch unter Anwendung unterschiedlicher Berechnungsalgorithmen mit variierenden 16S rDNA-Datensätzen streng monophyletisch und weisen mindestens 25% Sequenzunterschied zu den Vertretern der am nahesten verwandten bakteriellen Phyla auf. Unter Zugrundelegung [Seite 49↓] dieser Kriterien konnte Klonsequenz SHA-59 nicht sicher zugeordnet werden, da keine nähere Verwandtschaft zu 16S rDNA-Datenbankeinträgen bzw. zu anderen SHA-Klonsequenzen bestand.

Abb. 3.2 Verteilung der 75 SHA-Klonfamilien repräsentierenden SHA-Klone innerhalb der bakteriellen Phyla bzw. Phylum-Cluster. Der phylogenetische Baum wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenz von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) wurde als Bezugsgruppe gewählt. Die Summe der Astlängen kennzeichnet die phylogenetische Distanz zwischen den Vertretern der einzelnen bakteriellen Phyla. Die Größe der Fläche eines jeweiligen Astes korrespondiert mit der Anzahl der dargestellten SHA-Klonsequenzen.


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Abb. 3.3 Phylogenetische Einordnung von SHA-Klonsequenzen, die neuen bakteriellen Untergruppen bzw. Phylum-Clustern zugeordnet wurden (grau hinterlegt). Bakterielle Phyla werden durch einen Rahmen hervorgehoben. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenzen von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) und Methanosaeta concilii (X16932) wurden als Außengruppe gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungswahrscheinlichkeiten sind durch Prozentangaben dargestellt. Die Baumtopologie wurde durch eine PHYLIP-PARSIMONY-Analyse des gleichen Datensatzes verifiziert. Die Summe der horizontalen Astlängen kennzeichnet die phylogenetische Distanz zwischen den einzelnen 16S rDNA-Sequenzen.


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Ähnlichkeiten der SHA-Klone zu 16S rDNA-Datenbankeinträgen

Nur eine der ermittelten SHA-Sequenzen zeigte eine vollständige Übereinstimmung mit einer in 16S rDNA-Datenbanken hinterlegten Sequenz (Klon SHA-1 mit Klon DGGE band 8, Tab. 3.2). Da es sich jedoch bei der aus einem DGGE-Gel isolierten “DGGE band 8”-16S rDNA lediglich um ein 563 bp langes Nukleinsäure-Fragment handelt, kann nicht von einer Identität des gesamten 16S rRNA-Gens beider mikrobieller Spezies ausgegangen werden. Wird wiederum eine 16S rDNA-Sequenzähnlichkeit von 97 bis 100% innerhalb einer bakteriellen Gattung zugrunde gelegt (Stackebrandt und Göbel, 1994), repräsentieren etwa 23% der SHA-Klonfamilien bekannte kultivierte bzw. bislang nicht-kultivierte Bakteriengattungen. So konnten 16S rDNA-Sequenzen der Gattungen Clostridium, Rhizobium, Ultramicrobacterium, Syntrophobacter und Dehalobacter nachgewiesen werden. Bei zwei Klonfamilien (SHA-11, SHA-58) lagen Sequenzähnlichkeiten von 96.6% zu Vertretern der Gattungen Pseudomonas bzw. Acidaminobacter sowie 94.3% zur Gattung Syntrophus vor. Klon SHA-50 wies nahezu vollständige Sequenzübereinstimmung (99%) zum bakteriellen Isolat BKA-11 auf (Wind et al., 1999). Besonders hervorzuheben ist Klon SHA-67, der eine Sequenzähnlichkeit von 98.7% zu Dehalobacter restrictus Stamm TEA aufwies (Wild et al., 1996). Bakterien der Gattung Dehalobacter sind in der Lage, Tri- und Tetrachlorethen reduktiv zu dechlorieren.

Gruppierung der SHA-Klone mit Wurtsmith- und Trichlorbenzol-Klonsequenzen

Die vergleichende 16S rDNA-Analyse der Klonbibliothek A ergab, daß für rund die Hälfte aller SHA-Klone Wurtsmith- (Dojka et al., 1998) bzw. Trichlorbenzol-Sequenztypen (von Wintzingerode et al., 1999) die ähnlichsten Sequenzen darstellten (Sequenzähnlichkeiten zwischen 85.2 und 99.2%). Über ein Drittel aller SHA-Klone stand dabei in engerer phylogenetischer Verwandtschaft zu diesen bislang ausschließlich in anaeroben CKW-belasteten Habitaten nachgewiesenen 16S rDNA-Sequenzen. Wie aus Tab. 3.2 ersichtlich (grau hinterlegt), zeigten 22 SHA-Klonfamilien (35.2% aller SHA-Klone) über 92% Sequenzähnlichkeit zu den Wurtsmith- oder Trichlorbenzol-Sequenzen. Von diesen 22 SHA-Klonfamilien konnten 14 Klonfamilien in sechs bakterielle monophyletische 16S rDNA-Sequenzuntergruppen oder “Cluster” eingeordnet werden (Abb. 3.4). Diese Cluster (SHA-I bis SHA-VI) basierten auf DNA-Ähnlichkeitswerten von ≥ 92% zwischen allen jeweils dazugehörigen 16S rDNA-Sequenzen und beinhalteten mindestens drei Klone. Vier der sechs SHA-Cluster (SHA-I, -II, -III und -V) umfaßten auschließlich 16S rDNA-Sequenzen, die bislang nur in anaeroben mit chlorierten Kohlenwasserstoffen belasteten Habitaten nachgewiesen worden waren. Cluster SHA-IV sowie SHA-VI beinhalteten insgesamt drei 16S rDNA-Sequenzen, die auch in nicht mit CKW-kontaminierten anaeroben Biotopen gefunden worden waren (SHA-IV: Syntrophobotulus glycolicus (Friedrich et al., 1996); SHA-VI: Klon LD21 (Zwart et al., 1998), Cytophaga sp. Stamm [Seite 52↓] BD1-16 (Li et al., 1999)). Insgesamt jedoch ließen sich die SHA-Sequenzcluster I - VI phylogenetisch klar von den verfügbaren 16S rDNA-Sequenzen aus CKW-unbelasteten anaeroben Habitaten trennen, da ein Sequenzunterschied von mindestens 10.5% zu den nächst-verwandten Sequenzen vorlag. Im Falle der acht nicht zu den SHA-Clustern gehörenden SHA-Klonfamilien, die eng mit Wurtsmith- bzw. Trichlorbenzol-Sequenztypen verwandt sind (SHA-7, -18, -28, -53, -86, -89, -94, -124), lagen Sequenzunterschiede zu den 16S rDNA-Sequenzen anderer Habitate von mindestens 9.1% vor. Im dargestellten Dendogramm (Abb. 3.4) sind zwei 16S rDNA-Sequenzgruppen enthalten, die in marinen mit CKW belasteten anaeroben Lebensräumen nachgewiesen wurden (RFLP-Sequenzen, Pulliam-Holoman et al., 1998; ST-Sequenzen, Kengen et al., 1999). Auch von diesen 16S rDNA-Sequenztypen sind alle genannten SHA-Klonfamilien phylogenetisch deutlich entfernt. Eine Ausnahme stellen die zu den δ-Proteobakterien gehörenden Klone SHA-42, -51 und –79 dar. Diese Klone, die mit der Gattung Syntrophus phylogenetisch eng verwandt sind, weisen Sequenzähnlichkeiten von etwa 94% zu Klon RFLP40 auf.


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Abb. 3.4 Phylogenetische Einordnung von SHA-Klonsequenzen, die eng mit Wurtsmith- (WCHA-, WCHB-, WsCH- und WFeA-Klone; Doijka et al., 1998) und Trichlorbenzol-Klonsequenzen (SJA-Klone; von Wintzingerode et al., 1999) verwandt sind. Bakterielle Phyla sind durch Rahmen gekennzeichnet. Die spezifischen SHA-Sequenzcluster sind grau hervorgehoben. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenzen von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) und Methanosaeta concilii (X16932) wurden als Außengruppe gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungswahrscheinlichkeiten sind durch Prozentangaben dargestellt. Die Topologie wurde durch eine PHYLIP-PARSIMONY-Analyse des gleichen Datensatzes verifiziert. Die Summe der horizontalen Astlängen kennzeichnet die phylogenetische Distanz zu jeweils anderen 16S rDNA-Sequenzen.


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3.3.3  Zusammensetzung und phylogenetische Analyse der Klonbibliotheken B und C

Zunächst wurden die 16S rDNA-Inserts von jeweils zwei zufällig ausgewählten SHB- bzw. SHC-Klonen direkt sequenziert (etwa 1000 - 1400 bp). Die Klone SHB-143 sowie SHC-10 zeigten Sequenzähnlichkeiten von ≥ 98.7% zu Methanomethylovorans hollandica (Lomans et al., 1999), während die Klone SHB-23 und SHC-216 Sequenzähnlichkeiten von ≥ 99.3% zu Methanosaeta concilii aufwiesen (Abb. 3.5). Daraufhin wurde die Abundanz von 16S rDNA-Sequenzen beider methanogenen Archaea innerhalb der Klonbibliotheken B und C durch Dot-Blot-Hybridisierung mit spezifischen Oligonukleotidsonden ermittelt. Dazu wurde die Plasmid-DNA von jeweils 50 SHB- bzw. SHC-Klonen auf Nylonmembranen aufgebracht. Zunächst wurde die Anwesenheit rekombinanter Archaea-Klone durch Hybridisierung mit einer strangbindenden Archaea-spezifischen Oligonukleotidsonde (ARCH915) überprüft. Die Analyse ergab, daß alle Klone, mit Ausnahme von Klon SHC-42, archaeale 16S rDNA-Inserts besaßen. Zur Bestimmung der Zahl Methanosaeta-ähnlicher Klone wurde das Oligonukleotid MCONC verwendet, das spezifisch für Methanosaeta concili bzw. für die Klonsequenzen SHB-23 und SHC-216 ist (von Wintzingerode et al., 1999). Von jeweils 50 SHB- sowie 49 SHC-Klonen hybridisierten mit der Sonde MCONC unter stringenten Bedingungen (52°C) 19 SHB-Klone (38%) und 12 SHC-Klone (24.5%) (Abb. 3.6). Um die Verteilung der Methanomethylovorans-ähnlichen Klonsequenzen in den Klonbibliotheken A und B zu analysieren, wurde eine neue Oligonukleotidsonde entwickelt, die spezifisch für Methanomethylovorans hollandica sowie die Klone SHB-143 und SHC-10 war (MHOLL). Unter stringenten Bedingungen (55.5°C) führte die Hybridisierung der 50 SHB- bzw. 49 SHC-Klone mit dem Oligonukleotid MHOLL zu insgesamt 29 positiven SHB- (58%) und 36 positiven SHC-Klonen (73.5%) (Abb. 3.6).

Die Spezifität aller Hybridisierungsexperimente wurde durch die Verwendung geeigneter [Seite 55↓] Kontroll-DNA einschließlich bereits sequenzierter Klone sichergestellt. Die jeweilige Überprüfung der Insertsequenz einiger positiver SHB- bzw. SHC-Klone zeigte in allen Fällen komplette Übereinstimmung.

Ein Klon, SHC-40, reagierte nach Hybridisierung mit beiden Oligonukleotidsonden, MCONC bzw. MHOLL (Abb. 3.6). Zur Kontrolle wurde das 16S rDNA-Insert dieses Klons sequenziert und phylogenetisch analysiert. Die Sequenzauswertung ergab eine über 99 prozentige Sequenzähnlichkeit zu Methanomethylovorans hollandica der E. coli-Positionen 403 – 800 sowie zu Methanosaeta concilii der E. coli-Positionen 800 – 1401, so daß es sich bei Klon SHC-40 offenbar um eine 16S rDNA-Sequenzchimäre handelt (siehe 3.3.5).

Insgesamt drei SHB- bzw. SHC-Klone (SHB-200, SHC-88, SHC-268) reagierten weder mit der MCONC- noch mit der MHOLL-Oligonukleotidsonde (Abb. 3.6). Die 16S rDNA-Inserts dieser Klone wurden ebenfalls sequenziert. Die Klone SHB-200 sowie SHC-88 zeigten über 97% Sequenzähnlichkeit zu Klon WCHD3-07 (Abb. 3.5), der im Rahmen der 16S rDNA-Analyse des Wurtsmith-Standortes (Dojka et al., 1998) gefunden worden war. Klon SHC-268 wies dagegen 98% Sequenzähnlichkeit zu Methanocorpusculum labreanumauf (Zellner et al., 1989; Abb. 3.5).

Abb. 3.5 Phylogenetische Zuordnung der SHB- bzw. SHC-Klonsequenzen zu 16S rRNA-Datenbankeinträgen methanogener Archaea. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenz von E. coli wurde als Bezugssequenz gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungs-wahrscheinlichkeiten sind durch die Prozentangaben dargestellt. Die Baumtopologie wurde durch eine PHYLIP-PARSIMONY-Analyse des gleichen Datensatzes verifiziert. Die Astlänge kennzeichnet die phylogenetische Distanz zwischen den einzelnen 16S rDNA-Sequenzen.


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Abb. 3.6 Dot-Blot-Hybridisierung rekombinanter Klone der Genbibliotheken B und C mit den Oligonukleotidsonden MCONC und MHOLL. Die Nummern geben den jeweiligen SHB- bzw. SHC-Klon an. Klon SHC-42 enthielt kein archaeales 16S rDNA-Insert (schwarze Pfeile). Das Signal von Klon SHC-91 nach Hybridisierung mit MCONC stellte eine unspezifische Farbreaktion dar (weißer Pfeil).

3.3.4  Zusammensetzung und phylogenetische Analyse der Klonbibliothek D

Durch Anlage und Analyse von Klonbibliothek D sollte im wesentlichen untersucht werden, ob die zu den spezifischen SHA-Clustern I - VI gehörenden 16S rDNA-Sequenzen (siehe 3.3.2) auch noch nach einem längeren Zeitraum (8 Monate) in der Bioreaktorpopulation nachzuweisen waren. Zu diesem Zweck wurden 300 SHD-Klone durch Dot-Blot-Hybridisierung mit DIG-markierten Polynukleotidsonden durchgemustert. Die Polynukleotidsonden wurden von 16S rDNA-Sequenzen abgeleitet, die jeweils zu einem der spezifischen Cluster SHA-I bis SHA-VI gehörten (Cluster SHA-I: Klone SHA-22, SHA-207, SJA-162; Cluster SHA-II: Klone SHA-24, SHA-56, SHA-300, SJA-108; Cluster SHA-III: Klone SHA-3, SHA-21, SJA-15; Cluster SHA-IV: Klone SHA-67, SJA-19 sowie Dehalobacter restrictus; Cluster SHA-V: Klone SHA-33, SHA-61, SHA-219; Cluster SHA-VI: SHA-25, SHA-38, SHA-54). Die DIG-markierten Polynukleotidsonden eines jeweiligen[Seite 57↓] SHA-Clusters wurden zu gleichen Teilen vereint und die daraus resultierenden Sondengemische zur Dot-Blot-Hybridisierung der Klonbibliothek D eingesetzt. Im Anschluß daran erfolgte eine weitere Hybridisierung der SHD-Klone lediglich mit einer Dehalobacter restrictus-spezifischen Sonde.

Abb. 3.7 Dot-Blot-Hybridisierung von 300 SHD-Klonen mit der Dehalobacter restrictus-spezifischen Polynukleotidsonde. Die Nummern geben den jeweiligen SHD-Klon an. Zur Kontrolle wurde die 16S rDNA-Inserts der Klone SHD-2, -10, -11, -15, -17, -25, -49, -212 und -300 sequenziert (Tab. 3.3).

Nach diesen insgesamt sieben Dot-Blot-Hybridisierungen wurden die 16S rDNA-Inserts aller positiven SHD-Klone sequenziert (~1550 bp) und phylogenetisch analysiert. Bei den zwei Hybridisierungen, sowohl mit dem Cluster-IV-Sondengemisch als auch mit der Dehalobacter restrictus-spezifischen Sonde, reagierten jeweils 130 identische SHD-Klone (Abb. 3.7). Aufgrund dieser hohen Zahl wurden die 16S rDNA-Inserts von lediglich neun SHD-Klonen zur Kontrolle sequenziert. Sieben dieser neun Klone wiesen ≥ 99.5% Ähnlichkeit zur 16S rDNA von Dehalobacter restrictus Stamm TEA (Wild et al., 1996) auf (Klonfamilie SHD-11). Die verbliebenen zwei SHD-Klone waren mit der Gattung [Seite 58↓] Dehalobacter nur entfernt verwandt, ließen sich aber den grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt zuordnen (Klone SHD-2, SHD-17). Es konnte folglich davon ausgegangen werden, daß etwa 100 von 130 positiv hybridisierten SHD-Klonen Dehalobacter restrictus Stamm TEA-identische 16S rDNA-Inserts trugen.

Wie schon bei den SHA-Klonen (3.3.2) wurden diejenigen SHD-Klone, die untereinander eine Sequenzähnlichkeit von ≥ 97% aufwiesen (Stackebrandt und Goebel, 1994), in insgesamt 28 distinkte Klonfamilien zusammengefaßt (Tab. 3.3). Dabei konnten 12 der 28 SHD-Klonfamilien den spezifischen SHA-Sequenzclustern SHA-I bis SHA-V zugeordnet werden (Abb. 3.8; grau hinterlegt in Tab. 3.3). Diese 12 SHD-Klonfamilien wiesen mindestens 92% Ähnlichkeit zu allen anderen 16S rDNA-Sequenzen eines jeweiligen SHA-Clusters auf. Mit Ausnahme von Cluster SHA-VI konnten mit allen SHA-Clustern korrespondierende 16S rDNA-Sequenzen in Klonbibliothek D nachgewiesen werden. Die zu Cluster SHA-IV gehörenden SHD-Klone trugen ausschließlich zu Dehalobacter restrictus-identische 16S rDNA-Inserts. Sie waren mit einer Anzahl von etwa 100 die am häufigsten gefundenen rDNA-Sequenztypen innerhalb der Klonbibliothek D. Dies entsprach einem Drittel der insgesamt 300 untersuchten SHD-Klone.

Durch vergleichsweise niedrige Stringenzbedingungen bei der Hybridisierung wurde gewährleistet, daß alle mit einem SHA-Cluster korrespondierenden Klone innerhalb der 300 SHD-Klone nachgewiesen werden konnten. Auf diese Weise wurden jedoch auch Klone erfaßt, die zwar nicht mit einem der SHA-Cluster korrespondierten, jedoch innerhalb des entsprechenden bakteriellen Phylums gruppierten. Dadurch wurden zahlreiche Klone nachgewiesen, die vor allem zur Gruppe der GNS, jedoch nicht zu den entsprechenden Clustern SHA-II bzw. SHA-III gehörten (Tab. 3.3).

Da in der unter 3.4 dargestellten DGGE-Analyse der Bioreaktorkultur Dehalococcoides-ähnliche 16S rDNA-Sequenzen gefunden worden waren (Klone SHE-134 bis SHE-136), sollte Klonbibliothek D hinsichtlich des Vorkommens dieser Sequenzen untersucht werden. Dazu wurde die 16S rDNA des Klons SHE-134 unter Verwendung des Primerpaares F-968/R-1401 (ohne GC-Klammer) sowie Digoxygenin-markierten dNTPs reamplifiziert. Jedoch hybridisierte diese Dehalococcoides-spezifische Polynukleotidsonde mit keinem der 300 SHD-Klone aus Klonbibliothek D.


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Abb. 3.8 Phylogenetische Einordnung der SHD-Klonsequenzen, die innerhalb der spezifischen SHA-Cluster gruppieren (grau hervorgehoben). Bakterielle Phyla sind durch Rahmen gekennzeichnet. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenzen von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) und Methanosaeta concilii (X16932) wurden als Außengruppe gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungswahrscheinlichkeiten sind durch Prozentangaben dargestellt. Die Baumtopologie wurde durch eine PHYLIP-PARSIMONY-Analyse des gleichen Datensatzes verifiziert. Die Astlänge kennzeichnet die phylogenetische Distanz zwischen den einzelnen 16S rDNA-Sequenzen.


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Tab. 3.3 Phylogenetische Zuordnung der SHD-Klonfamilien.

3.3.5  Bestimmung chimärer 16S rDNA-Sequenzen

Bei der gleichzeitigen in-vitro-Amplifikation homologer DNA können Mischsequenzen entstehen, die aus mindestens zwei verschiedenen DNA-Fragmenten zusammengesetzt sind. Diese Amplifikations-Artefakte werden als Sequenzchimären bezeichnet. Bei der Analyse mikrobieller Lebensräume mittels vergleichender rDNA-Sequenzanalyse kann das Auftreten von Chimären zu einer Fehleinschätzung mikrobieller Diversität führen. Ob eine 16S rDNA-Sequenz eine Chimäre darstellt, kann durch einen getrennten Vergleich verschiedener Sequenzbereiche mit Datenbankeinträgen festgestellt werden (CHECK-CHIMERA; Larsen et al., 1993). Weisen Bereiche einer Sequenz jeweils unterschiedliche Ähnlichkeiten zu entsprechenden Datenbankeinträgen auf, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß es sich um ein PCR-Artefakt handelt.

Mit Hilfe des CHECK-CHIMERA-Programms konnten drei 16S rDNA-Sequenzen der Klonbibliotheken A und D zweifelsfrei als Chimären identifiziert werden (SHA-113, SHD-91, SHD-210). Mit Ausnahme einer Klonsequenz (SHC-40), die sich eindeutig als Chimäre aus Methanomethylovorans hollandica und Methanosaeta concilii herausstellte (siehe 3.3.3), war die Überprüfung der SHB- und SHC-Klone mit CHECK-CHIMERA nicht erforderlich.


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3.4  Charakterisierung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch DGGE

Um die Zusammensetzung der Bioreaktorpopulation über einen längeren Zeitraum (14 Monate) zu erfassen, wurde bakterielle 16S rDNA von vier Bioreaktorproben (S1 - S4, siehe Tab. 3.1) mittels Denaturierender Gradientengelelektrophorese (DGGE) untersucht.

Verwendet wurde PCR-amplifizierte 16S rDNA der vier Bioreaktorproben sowie das entsprechend amplifizierte 16S rDNA-Fragment von Dehalobacter restrictus als Kontrolle. Da Dehalobacter-identische Klonsequenzen in den Klonbibliotheken A und D gefunden worden waren, sollte eine Dehalobacter-16S rDNA-Bande der Identifizierung von rDNA-Banden amplifizierter Bioreaktorproben dienen.

3.4.1  Analyse des DGGE-Gels

Die etwa 435 bp langen 16S rDNA-Fragmente wurden in einem Polyacrylamidgel, das mit einen denaturierenden Gradienten aus Harnstoff und Formamid versehen war, in Abhängigkeit ihrer Schmelzeigenschaften aufgetrennt. Nach Silberfärbung des DGGE-Gels war eine hohe Bandenzahl erkennbar, die bei jeder Bioreaktorprobe mehr oder weniger unterschiedliche Muster aufwies (Abb. 3.9). Bei allen vier Reaktorproben lag die Anzahl eindeutig diskriminierbarer Banden (“band richness”, S) in der Größenordnung von 30 (S1: 35, S2: 30, S3: 28, S4: 30). In allen vier Fällen war jedoch auch ein mehr oder weniger starker unspezifischer Hintergrund zu erkennen. Im unteren Bereich des in Abb. 3.9 dargestellten DGGE-Gels waren einzelsträngige DNA-Fragmente für den Hintergrund verantwortlich. Diese wurden durch die Silberfärbung miterfaßt. Beim Vergleich der Probenprofile S1 – S4 fiel auf, daß die Bandenmuster von S3 und S4 nahezu identisch waren, während sich vor allem das Bandenmuster von S1 deutlich von denen anderer Proben unterschied. Um diesen Eindruck überprüfen zu können, wurden die Bandenmuster durch Ermittlung des sogenannten Sorenson-Index’, CS, miteinander verglichen. Ein CS-Wert von 1 beschreibt die Identität zweier Bandenmuster, ein Wert von 0 das Fehlen jeglicher Bandengleichheit. Die ermittelten Sorenson-Indizes der vier Bioreaktorproben sind in Tab. 3.4 dargestellt. Die Bandenmuster der Proben S3 und S4 zeigten die höchsten bzw. die von S1 und S3 die niedrigsten Werte.


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Abb. 3.9 Silber-gefärbtes DGGE-Gel nach Auftrennung amplifizierter 16S rDNA-Fragmente (E. coli-Positionen 968 - 1401) der vier Bioreaktorproben S1 - S4 sowievon Dehalobacter restrictus. Die Banden A und B sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die 16S rDNA der Banden A-S4 und B-S4 wurde aus dem Gel extrahiert, reamplifiziert und anschließend einer Sequenzanalyse unterzogen (siehe 3.4.2). Die Banden innerhalb des schwarzen Rahmens sind anhand ihrer Farbintensität quantifiziert worden (Abb. 3.10).

Tab. 3.4 Sorenson-Indizes (CS) der Proben S1 - S4 nach DGGE-Analyse.

Probe

S1

S2

S3

S4

S1

1

   

S2

0.55

1

  

S3

0.35

0.62

1

 

S4

0.37

0.63

0.90

1


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Abb. 3.10Schematische Darstellung des in Abb. 3.9 mit einem schwarzen Rahmen gekennzeichneten Gelbereichs. Die DGGE-Banden wurden identifiziert und anhand ihrer Farbintensität quantifiziert. Die grau hinterlegten Zahlenwerte (S1 - S4) geben die relative Intensität einer Bande in Bezug zur Gesamtintensität des Probenprofils an (relative Abundanz, rA). Die Graustufe entspricht der jeweiligen Bandenintensität (rA = 0-4: 25% grau; rA = 4.01-8: 50% grau; rA = 8.01-20: 75% grau; rA ≥ 20.01: schwarz). Die Buchstaben A und B kennzeichnen die Bandenprofile, deren 16S rDNA sequenziert wurde (siehe 3.4.2). Der Rf-Wert (relative Mobilität) beschreibt die im Gel zurückgelegte Distanz bezogen zur Startlinie.


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Neben der qualitativen Auswertung von Bandenmustern bietet die DGGE durch Messung der Farbintensität der Banden die Möglichkeit zur semi-quantitativen Analyse der aufgetrennten 16S rDNA. Die Farbintensität jeder DGGE-Bande wird dabei als Verhältnis zur Gesamt-Farbintensität des betreffenden Profils angegeben (relative Abundanz einer Bande, rA). Die rA-Werte der Mehrzahl aller 16S rDNA-Banden sind in Abb. 3.10 wiedergegeben. Hier wurden die Banden eines zentralen Gelausschnitts anhand ihrer Farbintensitäten bzw. Laufweiten (Rf-Werte) schematisch dargestellt. In 9 Fällen lassen sich Banden der gleichen Laufweite in allen vier Reaktorproben nachweisen. Anhand der rA-Werte können Ab- und Zunahme der korrespondierenden 16S rDNA verfolgt werden. Die höchsten rA-Werte wurden bei den Banden B-S3 sowie B-S4 ermittelt. Hier betrug rA etwa 40 und ist damit über 12 mal höher als der durchschnittliche rA-Wert aller anderen Banden (rAMittel = 3.3). Der Vergleich der Banden B-S2 und B-S3 zeigte darüber hinaus, daß die Bandenintensität in diesem Zeitraum um den Faktor 12 anstieg.

3.4.2  Analyse ausgewählter DGGE-Banden

Die Dehalobacter restrictus-Bande befand sich auf gleicher Höhe mit den Banden B-S3 und B-S4 (siehe Abb. 3.9). Auch bei Probe S2 war eine Bande an gleicher Position erkennbar. Um die Identität dieser Banden zu überprüfen, wurde die Bande B-S4 ausgeschnitten und sequenziert. In gleicher Weise wurde mit einer zweiten dominanten Bande (A-S4) verfahren. Die Untersuchung weiterer Banden gestaltete sich als schwierig, da ein kontaminationsfreies Ausschneiden durch die kurzen Abstände zwischen den einzelnen Banden nicht gewährleistet war.

Die 16S rDNA-Fragmente wurden aus dem Gel extrahiert, reamplifiziert und in E. coli kloniert. Diese aus der DGGE-Analyse resultierenden Klone wurden als SHE-Klone bezeichnet. Die Sequenzanalyse von sieben Klonen aus Bande B-S4 ergab in sechs Fällen (Klone SHE-146 bis SHE-151) eine Sequenzähnlichkeit von ≥ 99.8% zur 16S rDNA von Dehalobacter restrictus Stamm TEA (Wild et al., 1996) (Abb. 3.11). Klon SHE-145 war phylogenetisch über 18% von Dehalobacter restrictus entfernt, gruppierte aber innerhalb der Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt. SHE-145 wies die höchste 16S rDNA-Sequenzähnlichkeit (90.1%) zum Wurtsmith-Klon WCHB1-71 (Dojka et al., 1998) auf. Die 16S rDNA-Inserts der acht analysierten SHE-Klone (SHE-133 bis SHE-140) aus DGGE-Bande A-S4 waren deutlich heterogener und konnten vier unterschiedlichen bakteriellen Phyla zugeordnet werden (Abb. 3.11). Dabei wies die 16S rDNA von Klon SHE-137 eine Sequenzähnlichkeit von 93.2% zu Klon SHA-114 bzw. 92.0% zu Klon SIC.7255 auf und gehörte damit zu dem neu definierten bakteriellen Phylum Saale-3 (siehe 3.3.2). Vier der acht analysierten SHE-Klone gehörten zu den GNS und zeigten eine nahe phylogenetische Verwandtschaft zu Dehalococcoides ethenogenes (Maymó-Gatell et al., 1997) und zum Isolat CBDB1 (Adrian et al., 2000). Beide Mikroorganismen [Seite 66↓] dechlorieren chlororganische Verbindungen reduktiv. Die Klone SHE-134 bis SHE-136 zeigten über 97% 16S rDNA-Sequenzähnlichkeit zu diesen beiden halorespirierenden Organismen.

Abb. 3.11 Phylogenetische Verwandtschaft der DGGE-Klone (SHE-Klone) zu veröffentlichten 16S rDNA-Sequenzen. Mit [A] und [B] sind die entsprechenden DGGE-Bandenprofile angegeben (siehe Abb. 3.9 bzw. 3.10). Bakterielle Phyla sind durch schwarze Balken gekennzeichnet. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenz von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) wurde als Außengruppe gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungswahrscheinlichkeiten sind durch Prozentangaben dargestellt. Die Summe der horizontalen Astlängen repräsentiert die phylogenetische Distanz zwischen den einzelnen 16S rDNA-Sequenzen.


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3.5  Analyse der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch QE-PCR

Mit Hilfe der QE-PCR wurden 16S rDNA Konzentrationen in den vier Bioreaktorproben S1 bis S4 gemessen, um die relative Häufigkeit von Dehalobacter restrictus abschätzen zu können. Durch die Verwendung entsprechender Primerkombinationen wurde die 16S rDNA-Konzentration von Dehalobacter restrictus bestimmt und im Vergleich zur Gesamt- 16S rDNA-Konzentration ausgewertet. Während zur Messung der 16S rDNA-Konzentration der Bakterien auf etablierte Primer (TPU1 und RTU8) zurückgegriffen werden konnte, mußte zur Amplifizierung von Dehalobacter-16S rDNA ein neues Primerpaar entwickelt werden. Basierend auf den Sequenzdaten der Dehalobacter-identischen SHA- bzw. SHD-Klone sowie auf den entsprechenden in Datenbanken hinterlegten Sequenzen wurde das Primerpaar deb179f/deb1007r abgeleitet, mit dem ein etwa 800 bp langes 16S rDNA-Fragment amplifiziert wurde. Zur Überprüfung der Amplifizierungsspezifität wurde DNA von Clostridium symbiosum sowie Sulfospirillum barnesii als Negativkontrolle eingesetzt.

Die QE-PCR im LightCycler wurde im sog. „SYBR-Green I Format“ durchgeführt. Bei diesem Ansatz enthält der PCR-Reaktionsansatz den fluoreszierenden Farbstoff SYBR-Green I, der sich selektiv in doppelsträngige DNA einlagert. Der LightCycler mißt während der PCR-Reaktion die Zunahme des Amplifikationsprodukts durch den damit verbundenen Anstieg der Fluoreszenzemission von SYBR-Green I. Wird parallel zur DNA aus der zu untersuchenden Probe DNA aus einer Verdünnungsreihe amplifiziert, so kann aus den jeweiligen Reaktionskinetiken die Ausgangskonzentration der Proben-DNA ermittelt werden.

Zunächst wurden die PCR-Reaktionen unter Verwendung des DNA-Master SYBR-Green I Kits in einem herkömmlichen PCR-Gerät optimiert, um die Eignung sowohl des Kits als auch des neuen Primerpaares deb179f/deb1007r zur Amplifizierung bakterieller bzw. Dehalobacter-identischer 16S rDNA aus den Bioreaktorproben zu prüfen. Danach erfolgte die Übertragung des PCR-Protokolls auf den LightCycler. Da sich zum einen das Temperierprinzip (Heißlufttemperierung) und zum anderen die Reaktionsgefäße (transparente Kapillaren) des LightCyclers im Gegensatz zu herkömmlichen PCR-Verfahren unterscheiden, waren Änderungen im Reaktionsprotokoll erforderlich. Es zeigte sich, daß der Zusatz von Dimethylsulfoxid und zusätzlichem Magnesiumchlorid sowie eine Verringerung der Temperatursteigerungsrate eine erfolgreiche Amplifizierung bakterieller und Dehalobacter-identischer 16S rDNA ermöglichte.

In Abb. 3.12 sind die mit Hilfe des LightCyclers ermittelten Kinetiken der 16S rDNA-Amplifikationen aus den Bioreaktorproben S1 bis S4 bzw. aus den entsprechenden Verdünnungsreihen dargestellt. Aus den Kinetiken der definierten DNA-Verdünnungsreihen wurden spezifische Kalibriergeraden für jeweils eine der beiden [Seite 68↓] Primerkombinationen erstellt (Abb. 3.12). In beiden Fällen betrug der Regressionskoeffizient mehr als 0.98, so daß eine hinreichende Linearität der Kalibriergeraden gewährleistet war.

Abb. 3.12 Quantifizierung bakterieller (linker Teil) sowie Dehalobacter restrictus-ähnlicher (rechter Teil) 16S rDNA in den Proben S1 –S4 mittels QE-PCR im LightCycler. Im oberen Teil der Abbildung sind die Reaktionsverläufe (Fluoreszenzemissionen vs. Zahl der PCR-Zyklen) in halblogarithmischer Auftragung dargestellt. Die grüne Linie („Noise-Band“) grenzt verwertbare Meßpunkte von unspezifischer Hintergrundfluoreszenz ab. Aus den Kinetiken der Verdünnungsreihen wurden Kalibriergeraden erstellt, mit deren Hilfe die 16S rDNA-Konzentrationen der Proben ermittelt werden konnten. CP (Crossing Point) bezeichnet den Beginn der exponentiellen Amplifikation.


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Abb. 3.13 Elektrophoretische Auftrennung der im LightCycler erzeugten PCR-Produkte im Agarosegel (1%). Linkes Bild: Dehalobacter restrictus-spezifische Primer; rechtes Bild: Bacteria-spezifische Primer.

Tab. 3.5 Quantifizierung bakterieller und Dehalobacter restrictus-ähnlicher 16S rDNA mittels QE-PCR. In Probe S3 wurden die höchsten 16S rDNA-Konzentrationen gemessen (Dehalobacter- und Bacteria-spezifische Primer). Diese Werte repräsentieren jeweils 100%. Auf diese Weise können die Konzentrationsänderungen innerhalb der Proben miteinander verglichen werden.

Probe

16S rDNA-Konzentration

16S rDNA-Konzentration

 

D. restrictus -spezifische Primer

Bakterien-spezifische Primer

 

[ng/mL]

[%]

[ng/mL]

[%]

S1

nicht nachweisbar

-

0.14

1.34

S2

0.16

0.77

0.65

6.22

S3

20.80

100.00

10.45

100.00

S4

4.27

20.53

4.73

45.26


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Eine der Hauptfehlerquellen der Echtzeit-PCR im LightCycler liegt in der Entstehung von Primer-Dimeren. Diese zusammengelagerten Primermoleküle verfälschen die Messung der Fluoreszenzemissionen amplifizierter DNA und sind anhand der Reaktionskinetiken nicht eindeutig zu erkennen. Aus diesem Grunde wurden zur Kontrolle die im LightCycler amplifizierten PCR-Produkte einer Agarosegelelektrophorese unterzogen (Abb. 3.13). Die nach der Ethidiumbromidfärbung erhaltenen 16S rDNA-Banden bestätigten qualitativ die Ergebnisse des LightCyclers. Bakterielle 16S rDNA war aus allen 4 Reaktorproben amplifizierbar. Der Anteil Dehalobacter restrictus-ähnlicher 16S rDNA hingegen lag in Probe S1 unterhalb der Nachweisgrenze. Basierend auf den Werten der Kalibriergraden konnten die Konzentrationen bakterieller sowie Dehalobacter-identischer 16S rDNA berechnet werden (Tab. 3.5). Der Gehalt bakterieller 16S rDNA nahm von Probe S2 zu Probe S3 um den Faktor 16 zu. Im gleichen Zeitraum stieg die Konzentration der Dehalobacter restrictus-ähnlichen 16S rDNA 130-fach, d.h. um etwa eine Größenordnung (8-fach) stärker als die der gesamten Bakterien. Von Probe S3 zu S4 kam es zu einem leichten Rückgang des 16S rDNA-Gehalts. Die Dehalobacter restrictus-spezifische rDNA nahm dabei doppelt so stark ab, wie die bakterielle rDNA.

3.6 Nachweis von Bakterien und Archaea der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch FISH

Basierend auf der Analyse der Klonbibliotheken A – D wurden insgesamt neun Klone ausgewählt, die mit Hilfe der FISH in den Bioreaktorproben S1 – S6 nachgewiesen werden sollten (Tab. 3.6). Dazu mußten im rechnergestützten Verfahren fünf neue 16S rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden abgeleitet werden, deren Spezifität durch Vergleich mit über 20000 16S rRNA-Datenbankeinträgen überprüft wurde. Neben den Hybridisierungen mit gattungs- bzw. speziesspezifischen Sonden wurden auch Versuche mit den universellen Sonden EUB338Cy3 sowie ARCH915Cy3 durchgeführt. Alle verwendeten Oligonukleotidsonden waren mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin3 (Cy3) markiert, der bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 550 nm zu einem roten Farbeindruck führt (Emissionswellenlänge von 570 nm) (Moter und Göbel, 2000). Zusätzlich wurde das Probenmaterial parallel zur FISH mit DAPI gefärbt. Dieser Farbstoff interkaliert selektiv in DNA und läßt DNA-enthaltende Zellen bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge von 345 nm blau erscheinen (Emissionswellenlänge von 450 nm).


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Tab. 3.6 Zusammenfassung der für die FISH verwendeten Oligonukleotidsonden.

Oligonukleotid

Spezifität 1

Phylum / Phylum Cluster

a21Cy3

SHA-21

GNS

a24Cy3

SHA-24, SHA-56, Klon WCHB1-43

GNS

a25Cy3

SHA-25

Cytophaga-Bacteroides-Flexibacter

deb179Cy3

SHA-67, SHD-11, Klon SJA-19,
Dehalobacter restrictus

Grampositive Bakterien mit
niedrigem GC-Gehalt

MHOLLCy3

SHB-143, SHC-10
Methanomethylovorans hollandica
Methanomethylovorans victoriae

Euryarchaeota

MCONCCy3

SHB-23, SHC-216, Methanosaeta concilii,
Methanosaeta concilii-
ähnliche Klone bzw. Isolate2

Euryarchaeota

EUB338Cy3

Bacteria

-

ARCH915Cy3

Archaea

-

1Datenbankabgleich wurde im Januar 2001 durchgeführt.

2Diese Klone bzw. Isolate sind im Anhang in Tab. 6.1 zusammengefaßt

Aufgrund der Beschaffenheit des Probenmaterials gestaltete sich die Durchführung der FISH als schwierig. Im Falle der Objektträgerproben führte lediglich die FISH von Probe S2 zu auswertbaren Ergebnissen. Die Hybridisierung des Biofilms mit der Sonde ARCH915Cy3 zeigte eine Vielzahl von Zellen überwiegend gleicher charakteristischer Morphotypen (relativ große, oftmals in Paketen zusammengelagerte Kokken; Abb. 3.14). Eine solche Morphologie wurde auch für Methanomethylovorans hollandica beschrieben (Lomans et al., 1999).

Abb. 3.14 Mikroskopische Auswertung der FISH sowie der DAPI-Färbung von Probe S2 (Objektträger). Linkes Bild: Sonde ARCH915Cy3, rechtes Bild: DAPI.


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Parallel zur Hybridisierung mit ARCH915Cy3 reagierten die Zellen ebenfalls mit DAPI (Abb. 3.14). Die Hybridisierung des Biofilms mit der Sonde EUB338Cy3 war hingegen negativ. Die nachfolgenden Objektträgerproben (S3 - S6) bewuchsen mit zunehmender Kultivierungsdauer der Population immer dichter, so daß einzelne Zellen des Biofilms mikroskopisch nicht eindeutig diskrimierbar waren.

Bei den PU-Proben wurde zunächst versucht, die in Form eines dichten Biofilms wachsenden Mikroorganismen durch starkes Schütteln ("Vortexing") von der Kunststoffoberfläche abzulösen. Auf diese Weise entstanden jedoch nur kleinere „Biofilmflocken“, d.h. Aggregate aus einer Vielzahl von Mikroorganismen und der sie zusammenhaltenden Polysaccharidmatrix. Die FISH-Versuche mit diesen Biofilmflocken führten zu keinen befriedigenden Ergebnissen. Um den Biofilm der PU-Körper mit Hilfe der FISH untersuchen zu können, wurde in Anlehnung an die Arbeit von Zarda et al. (1997) ein Protokoll zur Vorbehandlung der Proben etabliert. Diese Vorbehandlung erlaubte ein Lösen der Mikroorganismen aus dem Biofilm bei hinreichendem Erhalt der Zellintegrität. Zunächst wurden die derart konditionierten Biofilmproben (S1 – S6) mit den universellen Sonden EUB338Cy3 sowie ARCH915Cy3 hybridisiert sowie mit DAPI gefärbt. Während mit der bakteriellen Sonde trotz Vorbehandlung keine eindeutigen Ergebnisse zu erzielen waren, konnten Archaea in allen Proben in großer Zahl gefunden werden. Wieder dominierten die bereits in der Probe S2 (Objektträger) nachgewiesenen Methanomethylovorans-ähnlichen Zellen (Abb. 3.15). Zusätzlich wurden positive Hybridisierungssignale von Archaea mit Methanosaeta concilii-charakteristischen Morphotypen gefunden (Abb. 3.15). Die DAPI-Färbung ließ neben den Methanomethylovorans- und den Methanosaeta-ähnlichen Zellen eine Vielzahl anderer Morphotypen erkennen, die jedoch vergleichsweise klein waren.

Abb. 3.15 Mikroskopische Auswertung der FISH von Probe S5 (PU-Partikel) mit der Sonde ARCH915Cy3. a: Methanomethylovorans-ähnlicher Morphotyp, b: Methanosaeta-ähnlicher Morphotyp.


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Nach den Hybridisierungen mit gruppenspezifischen Oligonukleotidsonden sollten einige der in den Klonbibliotheken A - C gefundenen Bakterien sowie Archaea durch Verwendung von gattungs- bzw. speziesspezifischen Oligonukleotiden in situ nachgewiesen werden. Trotz entsprechender Vorbehandlung der Bioreaktorproben sowie niedriger Stringenzbedingungen blieben alle Versuche, die in Tab. 3.6 aufgeführten bakteriellen Mikroorganismen mit Hilfe der FISH zu erfassen, erfolglos. Oftmals waren die erzielten Ergebnisse uneindeutig, d.h. es gab zwar ein Fluoreszenzsignal einer jeweiligen Sonde, jedoch kein korrespondierendes Signal der parallel durchgeführten DAPI-Färbung. Die im Falle der Dehalobacter-spezifischen Sonde deb179Cy3 vorhandene Positivkontrolle (Dehalobacter retrictus, DSM 9454) lieferte ein eindeutiges Ergebnis (Abb. 3.16), so daß deb179Cy3 zur FISH von Bakterien der Gattung Dehalobacter geeignet war. Bei den Sonden a21Cy3, a24Cy3 sowie a25Cy3 waren Positivkontrollen nicht verfügbar, da die korrespondierenden Bakterien bislang nicht kultiviert worden waren.

Abb. 3.16 Mikroskopische Auswertung der FISH von Dehalobacter restrictus mit der Sonde deb179Cy3.

Anders hingegen stellte sich die Situation im Falle der Oligonukleotidsonden MHOLLCy3 sowie MCONCCy3 dar. Die Hybridisierungen führten in allen Proben zu positiven Ergebnissen (Abb. 3.17). Die Spezifität der Versuche wurde durch das Mitführen geeigneter Negativ- und Positivkontrollen (siehe 2.5) sowie durch hohe Stringenzbedingungen (46°C, 60% Formamid) gewährleistet. Methanosaeta concilii war aufgrund der charakteristischen Zellform auch im Phasenkontrastbild leicht erkennbar (Abb. 3.18).


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Abb. 3.17 Mikroskopische Auswertung der FISH. Linkes Bild: Probe S3 (PU-Partikel), Sonde MHOLLCy3; rechtes Bild: Probe S6 (PU-Partikel), Sonde MCONCCy3.

Abb. 3.18 Mikroskopische Auswertung der Probe S6 (PU-Partikel) im Phasenkontrast.

Zum Ausschluß von Autofluoreszenz (zur Übersicht s. Moter und Göbel, 2000), wurden FISH-Protokolle ohne Zugabe von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotidsonden bzw. DAPI durchgeführt. Bei diesen Kontrollversuchen wiesen lediglich einige „Partikel“ Eigenfluoreszenz auf, die durch ihre Form und Gestalt eindeutig von Mikroorganismen abgegrenzt werden konnten.


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3.7  DCP-Dechlorierung der Bioreaktorpopulation nach Zugabe von Wasserstoff

Um den Einfluß von Wasserstoff auf die DCP-Transformation der Bioreaktorkultur zu untersuchen, wurden zwischen Tag 769 und 785 des Reaktorbetriebs (08.02. – 24.02.2000) täglich zur gleichen Zeit 200 mL gasförmiger Wasserstoff in den Zulauf des Reaktors gegeben. Daraufhin stieg die DCP-Transformationsrate innerhalb eines Zeitraums von zwei Tagen um etwa 45% (Abb. 3.19) Nach 16 Tagen wurde die Zufuhr von Wasserstoff beendet. Die DCP-Transformationsrate nahm als Folge wieder ihren ursprünglichen Wert an.

Abb. 3.19 Veränderung der mikrobiellen DCP-Transformation im Bioreaktor nach Zugabe von Wasserstoff. Die relativ stark fluktuierende Transformationsrate läßt sich auf die Art der Wasserstoffzugabe zurückführen (Einzeldosierungen).


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20.09.2004