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4  Diskussion

4.1 Mikrobielle Diversität der DCP-dechlorierenden Population

4.1.1  Methodischer Ansatz

In natürlichen Lebensräumen werden Mikroorganismen überwiegend in Form komplexer Populationen gefunden, die sich aus einer Vielzahl unterschiedlicher Arten zusammensetzen. Die mikrobielle Diversität solcher Populationen wird dabei wesentlich durch die jeweils vorherrschenden Umweltbedingungen, die Gesamtheit des genetischen Pools sowie die ökologische Rolle der beteiligten Mikroorganismen charakterisiert. Innerhalb dieser Lebensräume unterliegen die Mikroorganismen den chemisch-physikalischen Veränderungen der sie umgebenden Umwelt sowie den Einflüssen durch physiologische und metabolische Prozesse der gesamten Mikroflora. Die oftmals unzureichende Kenntnis dieser natürlichen Interaktionen in mikrobiellen Lebensgemeinschaften erschweren die in-vitro-Kultivierung bzw. -Isolierung der beteiligten Mikroorganismen, da die notwendigen physiologischen Rahmenbedingungen nicht simuliert werden können. Aus diesem Grunde ist bisher ein nur relativ kleiner Teil der in der Umwelt vorkommenden Bakterien und Archaea als in-vitro-Reinkultur verfügbar (etwa 1 – 5%; Hunter-Cevera et al., 1998). Da für die Bestimmung der mikrobiellen Diversität eines komplexen Lebensraums herkömmliche Kultur- und Identifizierungsverfahren allein offenbar nicht ausreichen, muß stattdessen ein experimentelles Vorgehen gewählt werden, das die Gesamtheit aller Mikroorganismen, d.h. kultivierte wie auch bislang nicht-kultivierte, zu erfassen vermag. Die Verwendung molekulargenetischer Techniken, wie die in-vitro-Amplifikation, Klonierung oder Sequenzierung von Nukleinsäurefragmenten, ermöglicht eine solche kulturunabhängige Charakterisierung komplex zusammengesetzter mikrobieller Populationen. Seit den grundlegenden Arbeiten von Carl Woese und Mitarbeitern (zur Übersicht s. Woese, 1987) werden vor allem ribosomale Ribonukleinsäuren bzw. deren kodierenden Gene als molekulare Marker zur Typisierung oder phylogenetischen Klassifizierung von Mikroorganismen eingesetzt. Aufgrund ihrer Schlüsselposition in der Proteinsynthese sind diese Moleküle ubiquitär verbreitet und besitzen eine weitgehend konservierte Struktur. In der Primärstruktur wechseln sich stark konservierte Bereiche, die bei der überwiegenden Zahl der Mikroorganismen identisch sind, mit weniger stark bis kaum konservierten Bereichen ab. Letztere variable Bereiche weisen meist ausreichende Sequenzunterschiede zur Diskriminierung einzelner mikrobieller Spezies auf. Oligonukleotidprimer, die gegen stark konservierte Bereiche der rRNA-Gene gerichtet sind, erlauben die PCR-Amplifikation und anschließende Klonierung der rDNA nahezu aller Bakterien und Archaea. Da die universelle Amplifikation mikrobieller rDNA auch die [Seite 77↓] Analyse von Mikroorganismen ermöglicht, die nicht als in-vitro-Reinkultur vorliegen, hat dieser methodische Ansatz zu grundlegend neuen Erkenntnissen bei der Beschreibung mikrobieller Diversität in komplexen Ökosystemen geführt (Göbel, 1995). Untersuchungen in einer Vielzahl unterschiedlichster mikrobieller Lebensräume, wie etwa Böden (Weber et al., 2001), heißen Quellen (Hugenholtz et al., 1998a), Belebtschlamm (Schuppler et al., 1995), Seesediment (Hastings et al., 1998) usw., zeigten, daß die mikrobielle Diversität solcher Habitate weitaus höher ist, als bislang angenommen. Darüber hinaus wurde deutlich, daß sich die Mehrzahl mikrobieller Lebensgemeinschaften nahezu vollständig aus bisher unbekannten, nicht-kultivierten Bakterien bzw. Archaea zusammensetzen. Zahlreiche dieser lediglich anhand ihrer rDNA-Sequenz charakterisierten Mikroorganismen sind phylogenetisch mit bereits bekannten Mikroorganismen verwandt und lassen sich bestehenden Taxa zuordnen. Nicht selten jedoch repräsentieren rDNA-Sequenzen bislang unkultivierte Mikroorganismen neuer Taxa für die bisher keine oder nur wenige kultivierte Vertreter beschrieben wurden (Hugenholtz et al., 1998b).

Zu Beginn dieser Arbeit lagen keine Daten zur mikrobiellen Diversität CKW-transformierender mikrobieller Populationen in der Literatur vor. Daher wurde die DCP-dechlorierende Bioreaktorpopulation zunächst durch Anlage und Analyse von 16S rDNA-Klonbibliotheken charakterisiert. Dieser methodische Ansatz ermöglicht eine hohe Auflösung sowie das Auffinden bislang unbekannter Mikroorganismen. Von dieser Herangehensweise unterscheidet sich der sogenannte „top-to-bottom-approach“ (Amann et al., 1995). Hier werden gruppenspezifische 16S rRNA-gerichtete Oligonukleotidsonden, die mikrobielle Taxa unterschiedlicher Hierarchien erfassen, in der FISH eingesetzt. Dieser Ansatz ermöglicht zwar eine deutlich schnellere Analyse mikrobieller Populationen, setzt allerdings einen zum jeweiligen Zeitpunkt vorhandenen 16S rRNA-Datensatz als Grundlage zur Entwicklung neuer Sonden voraus. Auch eine simultane Verwendung von Sonden mit gestaffelter Spezifität (z.B. Gattungs- und Speziesspezifität) gestattet folglich nur den Nachweis bekannter rRNA-Sequenzen und kann höchstens durch das Ausbleiben eines Doppelnachweises einen indirekten Hinweis auf die Anwesenheit bislang unbekannter Mikroorganismen geben. Demgegenüber ermöglicht die Verwendung hochkonservierter PCR-Amplifikationsprimer die Erfassung nahezu aller mikrobiellen 16S rDNA-Sequenzen, die durch nachfolgende Klonierung und Sequenzierung eindeutig phylogenetisch klassifiziert werden können. Aus diesem Grunde ist ein „top-to-bottom-approach“ zur Charakterisierung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation nur als Ergänzung, nicht aber als alleiniges Konzept der Diversitätsanalyse zu betrachten.


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4.1.2  Einfluß experimenteller Faktoren auf die PCR-vermittelte Diversitätsanalyse

Bei der Anwendung molekulargenetischer Methoden zur kulturunabhängigen Diversitätsanalyse von Mischpopulationen können, wie bei jedem anderen methodischen Ansatz auch, einige Fehlerquellen zu einer Verfälschung des Ergebnisses führen (zur Übersicht s. von Wintzingerode et al., 1997). Zunächst stellt die Probennahme bzw. der Probentransport von der Entnahmestelle zum Ort der Weiterverarbeitung eine potentielle Fehlerquelle dar. So zeigte der Vergleich von Diversitätsanalysen mehrerer Tiefseesedimentproben, daß unterschiedliche Lagerungen des Probenmaterials (Variation von Temperatur, Zeit und Luftsauerstoffkontakt) vor der Weiterverarbeitung zu einer signifikanten Veränderung der bakteriellen Zusammensetzung führte (Rochelle et al., 1994). Aus diesem Grunde wurden die Proben aus dem DCP-dechlorierenden Bioreaktor unmittelbar nach Entnahme entweder direkt in kaltem Ethanol/PBS (mit sowie ohne Formalinzusatz) fixiert oder in einen zuvor mit Eis (-20°C) und Kälteakkus (-80°C) präparierten Thermotransportbehälter überführt.

Unabhängig von den verwendeten Methoden zur Charakterisierung der DCP-dechlorierenden Population stellten die im Wirbelschichtreaktor befindlichen Aufwuchskörper der Mikroorganismen (PU-Würfel) ein spezielles Problem hinsichtlich der Probennahme dar. In einem Zweiphasensystem (flüssig-gasförmig) kann unter normalen Betriebsbedingungen eines Reaktors von einer vollständigen Durchmischung der Dispersion ausgegangen werden. Demzufolge sind auch die in der Dispersion suspendierten Mikroorganismen homogen verteilt, so daß eine Probennahme hinreichenden Volumens aus dem vollständig durchmischten Reaktorinhalt einen repräsentativen Querschnitt der mikrobiellen Flora gewährleisten würde. Beim verwendeten Dreiphasensystem hingegen (flüssig-gasförmig-fest) befand sich der Großteil aller Mikroorganismen in Form von Biofilmen an der Oberfläche der PU-Körper und ein nur relativ kleiner Teil in der flüssigen Phase. Die Entnahme eines PU-Körpers zur mikrobiellen Analyse setzte folglich die Annahme voraus, daß die einzelnen Aufwuchsflächen innerhalb der Bioreaktorkultur gleich bewachsen waren und auf diese Weise einen repräsentativen Querschnitt der im Reaktor befindlichen Mikroorganismen ermöglichten.

Für alle PCR-vermittelten Analysemethoden ribosomaler rRNA-Gene stellt das Aufbrechen der Zellen sowie die anschließende Extraktion der DNA aus dem Probenmaterial einen weiteren kritischen Schritt dar. So kann eine insuffiziente Zellysis im Rahmen der Probenaufarbeitung dazu führen, daß ein nur unvollständiges rDNA-Spektrum für die anschließende PCR-Amplifikation zugänglich wird. Auf der anderen Seite resultieren harsche Methoden des Zellaufbruchs, wie sie etwa bei grampositiven oder säurefesten Bakterien erforderlich sind, in fragmentierter DNA der gramnegativen Bakterien. Solche Nukleinsäurefragmente tragen zur Enstehung von PCR-Artefakten bei und werden speziell [Seite 79↓] für die Entstehung von Sequenzchimären verantwortlich gemacht (Liesack et al., 1991) (s. auch 3.3.5). Folglich muß eine möglichst vollständige Lysis aller beteiligten Zellen und eine schonende Behandlung der Nukleinsäuren angestrebt werden. Die sich anschließende Extraktion der DNA kann vor allem durch im Probenmaterial vorhandene biotische sowie abiotische Komponenten, z.B. anorganische Kleinstpartikel oder organische Substanzen, beeinträchtigt werden. Zur Präparation hochmolekularer DNA aus der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation wurde daher eine Kombination aus mehreren Lysis- und Extraktionsschritten gewählt (modifiziert nach Tsai und Olson, 1991). Diese Verfahrensweise hatte sich bei vergleichbaren Arbeiten innerhalb der Arbeitsgruppe bewährt (von Wintzingerode et al., 1999; Abd El Haleem et al., 2000) und sollte zudem der Vergleichbarkeit der gewonnenen Ergebnisse dienen.

Auch die Amplifikation der 16S rDNA aus der präparierten Proben-DNA unterliegt zahlreichen Einflüssen, die zu einer fehlerhaften Bestimmung mikrobieller Diversität führen können. So wurden beispielsweise die rDNA-Amplifikationen der Bioreaktorproben S1 bis S4 durch koextrahierte Substanzen (z.B. Huminsäuren) inhibiert, die erst durch einen zusätzlichen Gelfiltrationsschritt beseitigt werden konnten. Ein weiteres PCR-Phänomen sind Sequenzchimären, die bereits im oberen Teil dieses Abschnitts Erwähnung fanden. Diese PCR-Artefakte können sowohl durch Amplifikation fragmentierter DNA als auch durch unvollständige Strangsynthesen während der PCR-Elongation gebildet werden und sind aus der rDNA zweier Mikroorganismen zusammengesetzt. Ein weiterer Fehler bei jeder Amplifikation gemischter, für homologe Gene kodierender DNA ist die Bildung von Heteroduplex-Molekülen (Qiu et al., 2001), bei der es zur Zusammenlagerung zweier nicht-komplementärer DNA-Stränge kommt. Wird eine rDNA-Heteroduplex kloniert bzw. transformiert, entstehen zwei homoduplexe rDNA-Moleküle, die infolge der Plasmidvermehrung voneinander getrennt und weitergegeben werden. Auch durch fehlerhafte Replikation eingeführte Mutationen können zu einer Verfälschung der Diversitätsanalyse beitragen. Deletionsmutanten treten auf, wenn das zu amplifizierende Molekül, wie etwa das rRNA-Gen, über eine ausgeprägte Sekundärstruktur verfügt. Punktmutationen werden durch Basenfehlinkorporationen der verwendeten DNA-Polymerasen verursacht.

In einem kürzlich erschienenen Aufsatz wurde eine systematische Untersuchung des Einflusses von PCR-Bedingungen auf die Entstehung von PCR-Artefakten vorgestellt (Qiu et al., 2001). Anhand ihrer experimentellen Daten schlußfolgerten die Autoren, daß möglichst wenige Amplifikationszyklen, eine möglichst lange Elongationsphase sowie die Verwendung von AmpliTaq DNA-Polymerase die Formation der wenigsten PCR-Artefakte zur Folge hat. Diesen Kriterien wurde im Rahmen dieser Untersuchung Rechnung gertragen. Einen Hinweis auf die Entstehung relativ weniger PCR-Artefakte lieferte die Überprüfung des rDNA-Datensatzes auf chimäre Sequenzen. So wurden mit Hilfe des CHECK-CHIMERA-Programms bei insgesamt 170 sequenzierten SHA-, SHB-, SHC- bzw. [Seite 80↓] SHD-Klonen nur vier Klone als Sequenzchimären identifiziert (etwa 2%). In vergleichbaren Untersuchungen komplexer Habitate wurden Sequenzchimären zwischen 2 und 9% nachgewiesen (Choi et al., 1994; Godon et al., 1997; von Wintzingerode et al., 1999). Neben den sinnvoll gewählten PCR-Bedingungen wirkte sich vermutlich auch die Verwendung hochmolekularer Ausgangs-DNA zur Amplifikation mikrobieller 16S rDNA positiv auf das Ausbleiben von Sequenzchimären aus. Allerdings ist die Identifizierung einer Chimäre mit CHECK-CHIMERA dann als unsicher zu betrachten, wenn nur geringe Sequenzähnlichkeiten zu den vorhandenen 16S rDNA-Datenbankeinträgen vorliegen (Hugenholtz et al., 1998a). Da dies bei einem Großteil der ermittelten SHA- sowie SHD-Klonsequenzen der Fall war, wurden zusätzlich alle SHA- sowie SHD-Klonsequenzen in Partialsequenzen zerlegt und die daraus erzeugten phylogenetischen Stammbäume miteinander verglichen. Jedoch wiesen alle Dendogramme eine übereinstimmende Baumtopologie auf, so daß die durch Anwendung von CHECK-CHIMERA erhaltenen Ergebnisse bestätigt werden konnten.

Auch eine bevorzugte PCR-Amplifizierung einzelner rDNA-Moleküle kann zu einer Verzerrung von Diversitätsanalysen führen. Als Ursachen werden die Genomgröße und Anzahl der rRNA-Genkopien (Farrelly et al., 1995), die Wahl der Amplifikationsprimer (Rainey et al., 1994; Suzuki und Giovannoni, 1996; Hansen et al., 1998), der GC-Gehalt der rDNA (Reysenbach et al., 1992) sowie die Konzentration der Ausgangs-DNA (Chandler et al., 1997) diskutiert. Auch eine bevorzugte Klonierung bestimmter rDNA-Moleküle wurde beschrieben (Rainey et al., 1994). Allerdings wurde dieses Phänomen im Rahmen einer anderen rDNA-Diversitätsstudie nicht beobachtet (von Wintzingerode et al., 1999).

4.1.3  Bakterielle Diversität der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation

Zur Untersuchung der bakteriellen Diversität der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation wurde die 16S rDNA-Zusammensetzung (Klonbibliothek A) von Reaktorprobe S2 ermittelt, die etwa zwei Monate nach Beginn des Bioreaktorbetriebs entnommen worden war. Zu diesem Zeitpunkt lag eine stabil dechlorierende Population im Bioreaktor vor. Wie bei vielen vergleichbaren Diversitätsstudien anderer Habitate wies die DCP-dechlorierende Population eine außerordentlich komplexe bakterielle 16S rDNA-Zusammensetzung auf. Die Interpretation dieser Sequenzdaten, d.h. die Zuordnung der rDNA-Sequenzen zu bakteriellen Spezies bzw. zu bakteriellen Gruppen, wurde dadurch erschwert, daß der gewonnene rDNA-Datensatz nahezu keine identischen, jedoch eine Vielzahl sehr ähnlicher Sequenzen beinhaltete. Solche 16S rDNA-Sequenzen werden in der phylogenetischen Analyse nicht eindeutig aufgelöst und führen in Dendogrammen zu charakteristischen „Sequenzbüschen“. Für dieses in molekularen Diversitätsanalysen häufig auftretende Phänomen (z.B. Borneman et al., 1996; Choi et al., 1994; Field et al., 1997; Stackebrandt et al., 1993; von Wintzingerode et al., 2000) sind rDNA-[Seite 81↓] Mikroheterogenitäten verantwortlich, die in den meisten Fällen individuelle, aber sehr nah verwandte Spezies repräsentieren. rDNA-Mikroheterogenitäten können allerdings auch durch das Vorkommen multipler 16S rDNA-Operons innerhalb einer Spezies (Mylvaganam und Dennis, 1992; Nübel et al., 1996; Rainey et al., 1996) oder aber durch PCR-Fehler verursacht werden (Speksnijder et al., 2001). Solche Effekte täuschen unter Umständen eine erhöhte mikrobielle Diversität vor.

Weitere Inkonsistenzen in der Interpretation von 16S rDNA-Sequenzdaten aus komplexen Populationen werden durch das inadequate prokaryotische Spezieskonzept verursacht (Ferris et al., 1996). Die Klassifizierung von Bakterien erfolgt gegenwärtig nach unterschiedlichen taxonomischen, phylogenetischen und biologischen Konzepten und ist, obwohl häufig als „polyphasisches Konzept“ angewandt, in vielen Fällen uneindeutig (Rosselló-Mora und Amann, 2001; Schloter et al., 2000). Für Fragestellungen innerhalb der mikrobiellen bzw. molekularen Ökologie wird darüber hinaus ein ökologisches Spezieskonzept vorgeschlagen, daß die Evolution von Mikroorganismen im wesentlichen als Folge der ökologischen Rahmenbedingungen begreift und in diesem Sinne einen sogenannten „Ökotyp“ als Gruppe mikrobieller Spezies mit gemeinsamer Ökologie fordert (Ferris et al., 1996). Unterschiedliche Ökotypen können über nahezu identische ribosomale RNA verfügen. Vor dem Hintergrund dieser Überlegungen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, sehr nah verwandte rDNA-Sequenzen in Gruppen (oder Klonfamilien) zusammenzufassen, die auf einer Sequenzähnlichkeit von mehr als 97% beruhen (Speksnijder et al., 2001). Diese Vorgehensweise ermöglicht eine einheitlichere Analyse des rDNA-Datensatzes und erleichtert zudem den Vergleich mit den Ergebnissen anderer klonaler Studien.

Der Vergleich der bei der Analyse von Klonbibliothek A gefundenen 16S rDNA-Sequenzen mit den in Datenbanken befindlichen Einträgen zeigte, daß die Zusammensetzung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation außerordentlich divers war. Wie bei zahlreichen molekularen Diversitätsunteruchungen anderer Habitate, wurden in der DCP-dechlorierenden Reaktorpopulation überwiegend Sequenzen bislang nicht-kultivierter Spezies gefunden. Dieser Befund bestätigte die Wahl kulturunabhängiger Methoden zur Charakterisierung der DCP-dechlorierenden Mischkultur.

Die nachfolgende phylogenetische Analyse des rDNA-Datensatzes ermöglichte die Einordnung der Klonfamilien innerhalb der Bacteria. Dazu wurden die SHA-Klonsequenzen durch Anwendung unterschiedlicher Berechnungsalgorithmen mit den in 16S rDNA-Datenbanken hinterlegten Sequenzen sowie untereinander verglichen. Die Ergebnisse der phylogenetischen Berechnungen wurden in Form von Bäumen, entweder als Dendogramme oder Radialbäume, dargestellt. Im Gegensatz zur reinen binären Ähnlichkeitsmatrix, die etwa im Rahmen eines primären Datenbankabgleichs erstellt wird, basieren die phylogenetischen Berechnungsalgorithmen auf Modellen, die evolutionäre Veränderungen eines molekularen Markers simulieren. Das resultierende [Seite 82↓] Verzweigungsmuster eines Baumes, die Baumtopologie, repräsentiert die evolutionäre Entwicklung einer Sequenz, während die Summe der Astlängen ein Maß für die jeweilige phylogenetische Distanz darstellt. Üblicherweise kommen drei Berechnungsmethoden zur Erstellung phylogenetischer Stammbäume zur Anwendung, die sogenannten „Distance Matrix“-, „Maximum Parsimony“- sowie „Maximum Likelyhood“-Analysen. Jede dieser Methoden basiert auf unterschiedlichen evolutionären Modellen mit charakteristischen Annahmen bzw. Vereinfachungen und verfügt über spezifische Vor- und Nachteile (z. Übersicht siehe Ludwig et al., 1998). Da das Ergebnis einer phylogenetischen Analyse von einer Vielzahl unterschiedlicher Faktoren abhängt (Art des molekularen Markers, Berechnungsmethoden, Qualität des Sequenzalignments, Länge der Sequenzen, Sequenzierungsqualität, Anzahl der Datenbankeinträge etc.), existiert keine absolute Baumtopologie. Als Konsequenz sollten die Ergebnisse durch Verwendung mehrerer unterschiedlicher Ansätze reproduziert werden (Ludwig et al., 1997). Um diesen Anforderungen Genüge zu leisten, wurden die phylogenetischen Analysen der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation mittels zweier Berechnungsmethoden durchgeführt. In allen Fällen konnten die Ergebnisse, die unter Anwendung der „Neighbor-Joining-Methode“ (ein „Distance Matrix“-Verfahren) erhalten worden waren, durch die „Phylip-Parsimony-Analyse“ bestätigt werden. Auf die Durchführung einer „Maximum-Likelyhood-Analyse“ zur zusätzlichen Überprüfung der erhaltenen phylogenetischen Verzweigungsmuster wurde verzichtet, da der Rechenaufwand die Kapazität üblicher Mikrocomputersysteme überstiegen hätte.

Einer der wichtigsten Einflußfaktoren auf die Qualität einer phylogenetische Analyse ist die Länge der verwendeten Sequenzen. Da zum einen der Informationsgehalt eines Markermoleküls natürlicherweise begrenzt ist und zum anderen unterschiedliche Teile der Primärstruktur Informationen über unterschiedliche phylogenetische Ebenen beinhalten, sollten grundsätzlich nur Vollsequenzen bei der Erstellung phylogenetischer Stammbäume Verwendung finden (Ludwig und Schleifer, 1994). Dies gilt vor allem für molekulare Diversitätsanalysen bislang unbekannter Habitate, in denen ein Großteil der gefundenen Sequenzen nur geringe Ähnlichkeiten zu den vorhandenen Datenbankeinträgen aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden aus diesem Grunde nahezu alle 16S rDNA-Inserts der SHA-Klone vollständig sequenziert. Diejenigen SHA-Klone, deren 16S rDNA-Inserts als Partialsequenzen vorlagen, umfaßten mindestens 1000 Basenpaare. Trotzdem mußten z.T. sehr kurze Partialsequenzen (z.B. Klon DGGE band 8) aufgrund ihrer hohen Ähnlichkeiten zu den SHA-Klonen bei der phylogenetischen Analyse berücksichtigt werden. Neben der limitierten phylogenetischen Aussagekraft kurzer Partialsequenzen führen diese bei gleichzeitiger Analyse mit deutlich längeren Sequenzen zu instabilen Stammbaumtopologien (Ludwig et al., 1998). Grundsätzlich kann dieses Problem durch Angleich der Sequenzlängen umgangen werden. Jedoch wurden die SHA-Klonsequenzen nicht verkürzt, da dies einen nicht zu rechtfertigenden [Seite 83↓] Verlust phylogenetisch relevanter Sequenzinformation bedeutet hätte.

Die oben diskutierten Aspekte einer sorgfältigen Sequenzanalyse spielen dann eine wesentliche Rolle, wenn neue bakterielle Phylum-Cluster ausschließlich anhand von Sequenzdaten identifiziert werden. Ein aus reinen 16S rRNA-Daten abgeleitetes bakterielles Phylum-Cluster wird als eine Gruppe aus mindestens zwei Sequenzen angesehen, die in der phylogenetischen Analyse reproduzierbar monophyletisch erscheint und eine deutliche Distanz zu allen anderen bakteriellen Phyla bzw. Phylum-Clustern aufweist (Hugenholtz et al., 1998b). Die typische phylogenetische Distanz zwischen Bakterien unterschiedlicher Phyla beträgt dabei 20 – 25%. Im Rahmen der in dieser Arbeit vorgestellten Diversitätsanalyse wurden zwei neue bakterielle Untergruppen der Grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt (Gruppe SHA-16) sowie des Holophaga-Acidobakterium-Fibrobacter-Phylums (Gruppe SHA-71) gefunden. Darüber hinaus wurden drei neue Phylum-Cluster definiert, Saale-1 bis Saale-3. Mit Ausnahme von Gruppe SHA-17, die sich ausschließlich aus SHA-Klonen zusammensetzt, beinhalten Gruppe SHA-16 bzw. Phylum-Cluster Saale-1 bis Saale-3 auch aus anderen Habitaten stammende Klonsequenzen. Dieser Befund bestätigte sowohl die betreffenden SHA-Klonsequenzen als auch diejenigen der anderen Biotope in ihrer Funktion als Ökotypen repräsentierende Markermoleküle, da bei Einzelsequenzen ohne phylogenetisch näher verwandten rDNA-Datenbankeintrag (>92%) das Vorliegen eines PCR-Artefakts nicht mit Gewißheit ausgeschlossen werden kann (z.B. Klon SHA-59). Die hier neu eingeführten bakteriellen Gruppen sowie Phylum-Cluster erweitern damit die verfügbaren Daten zur mikrobiellen Diversität sowie die Informationen zur Verteilung der betreffenden Mikroorganismen in der Umwelt.

Der Vergleich der SHA-Klonsequenzen mit den Einträgen der 16S rRNA-Datenbanken wies in vielen Fällen hohe Ähnlichkeitswerte zu rDNA-Sequenztypen auf, die im Rahmen zweier anderer molekularer Diversitätsstudien gefunden worden waren. In der ersten dieser beiden vergleichenden 16S rRNA-Analysen wurde ein Aquifer eines Militärflughafengeländes (Wurtsmith Airforce Base) untersucht, in den eine Vielzahl unterschiedlichster Kohlenwasserstoffe sowie chlorierter Lösemittel, u.a. Chlor- und Dichlorethan, über einen Zeitraum von ca. 30 Jahren in großen Mengen eingebracht wurden (Dojka et al., 1998). Innerhalb des Aquifers herrschten anaerobe Bedingungen mit nitrat-, eisen-/sulfat-, bzw. sulfatreduzierenden Bereichen sowie einer methanogenen Zone, die beprobt und anschließend einer vergleichenden 16S rRNA-Analyse unterzogen wurden (WCHA-, WCHB-, WCHD-, WsCH- und WFeA- oder "Wurtsmith-Klone"). Der überwiegende Teil der Wurtsmith-Klone (etwa 70%) ließ sich bekannten bakteriellen Phyla zuordnen, darunter hauptsächlich die GNS, die Grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt sowie die Proteobakterien. Etwa 20% der Wurtsmith-Klone waren mit vier Phylum-Clustern assoziiert, die ursprünglich anhand von 16S rDNA-Sequenzen aus einer heißen Quelle (Yellowstone Nationalpark, USA) identifiziert worden waren [Seite 84↓] (Hugenholtz et al., 1998a). Die restlichen 10% der Wurtsmith-Sequenzen wurden in sechs neu eingeführte Phylum-Cluster eingeordnet (WS1 – WS6; Dojka et al., 1998; Dojka et al., 2000).

In der zweiten 16S rRNA-Studie wurde die mikrobielle Diversität eines anaeroben Trichlorbenzol (TCB)-dechlorierenden Bioreaktorkonsortiums untersucht (von Wintzingerode et al., 1999). Wie im Falle der DCP-dechlorierenden Population wurde die TCB-dechlorierende Mischkultur aus Saalesediment angereichert, jedoch lag die Probenentnahmestelle etwa 200 km flußaufwärts von Halle in der Nähe von Jena. Eine große Zahl der bei der Diversitätsanalyse der TCB-transformierenden Mischkultur gefundenen Klonsequenzen (SJA-Sequenzen für „Saale, Jena, Klonbibliothek A“ oder "Trichlorbenzol-Klone") gehörten zu den GNS, den Proteobakterien, dem Phylum-Cluster OP10 (Hugenholtz et al., 1998a) sowie den Spirochäten und wiesen hohe Ähnlichkeiten zu den auf dem kontaminierten Militärflughafengelände gefundenen Wurtsmith-Klonsequenzen auf.

Wie im DCP-dechlorierenden Bioreaktor wurden sowohl in dem mit CKW kontaminierten Flughafengelände als auch in dem TCB-transformierenden Bioreaktor chlorierte organische Verbindungen unter anaeroben Bedingungen umgesetzt. Folglich kann von einer reduktiven mikrobiellen Dechlorierung der umgesetzten chlorierten Verbindungen ausgegangen werden (Löffler et al., 1999). Die auffälligen Ähnlichkeiten zwischen den Klonsequenzen beider reduktiv dechlorierenden Habitate, dem Wurtsmith-Standort und der TCB-dechlorierenden Mischkultur, konnten anhand der Diversitätsanalyse der DCP-dechlorierenden Population erweitert werden. Etwa 32% aller gefundenen SHA-Klone zeigten mehr als 92% Sequenzähnlichkeit zu Wurtsmith bzw. Trichlorbenzol-Klonsequenzen. Es konnten sechs bakterielle Sequenzcluster, SHA-I bis SHA-VI, definiert werden, die fast ausschließlich in reduktiv dechlorierenden Lebensräumen gefundene 16S rDNA-Sequenzen umfaßten. Zwei der SHA-Cluster (SHA-II und SHA-III) beinhalteten Sequenzen, die zu den GNS gehörten. Obwohl das GNS-Phylum vor etwa 15 Jahren erstmalig eingeführt wurde (Woese, 1987), existieren bis zum heutigen Zeitpunkt kaum entsprechende Isolate. Das Wissen über diese bakterielle Gruppe ist daher vergleichsweise gering. GNS-Bakterien treten in allen drei reduktiv dechlorierenden Habitaten in relativ großer Zahl und Variation auf. Das gleiche gilt für die u.a. durch Cluster SHA-IV und SHA-V repräsentierten Grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt, die im Gegensatz zu den GNS-Bakterien ein Phylum mit einer Vielzahl kultivierter Vertreter darstellen. So wurden in der DCP- sowie in der TCB-dechlorierenden Mischkultur die Klonfamilien SHA-67 bzw. SJA-19 gefunden, die über 97% Sequenzähnlichkeit zu Dehalobacter restrictus PER-K23 (Holliger et al., 1998) bzw. Dehalobacter restrictus Stamm TEA (Wild et al., 1996) aufwiesen. Beide Spezies sind in der Lage, Tri- und Tetrachlorethen reduktiv zu dechlorieren.


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Neben den Untersuchungen der oben genannten Habitate, bei denen es sich um Süßwasserhabitate handelt, wurden noch zwei weitere 16S rRNA-Diversitätsanalysen von marinen Lebensräumen durchgeführt, in denen chlororganische Verbindungen reduktiv umgesetzt wurden. So führte die vergleichende 16S rRNA-Analyse einer anaeroben Sedimentanreicherungskultur, die polychlorierte Biphenyle (PCB) umsetzte, zu insgesamt 16 dominanten Sequenztypen (RFLP-Klone; Pulliam-Holoman et al., 1998). Das Sediment wurde ursprünglich einem Hafenbecken in Baltimore (USA) entnommen. Mit Ausnahme eines Klons zeigte keiner der dominanten RFLP-Klone signifikante phylogenetische Verwandtschaft zu Wurtsmith-, Trichlorbenzol- oder SHA-Klonsequenzen. Ein ähnliches Bild ergab sich bei der Diversitätsanalyse einer Tetrachlorethen-transformierenden mikrobiellen Mischkultur, die aus Sediment eines Rotterdamer Hafenbeckens (Niederlande) angereichert worden war (Kengen et al., 1999). Hier wurden zwei dominante Sequenztypen (ST-Klone) identifiziert, die beide zu den Grampositiven Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt gehörten und Sequenzähnlichkeiten von je 90% zu Dehalobacter restrictus (Klon ST10) bzw. 86% zum Genus Desulfotomaculum (Klon ST12) aufwiesen. Diese Sequenzähnlichkeiten sind allerdings in einer Größenordnung, die keine nähere Verwandtschaft der ST-Klone zu den genannten Gattungen repräsentiert. Wie die RFLP-Klone sind auch die ST-Klone phylogenetisch von den Wurtsmith-, Trichlorbenzol- und SHA-Klonen deutlich entfernt. Daraus folgt, daß die mikrobielle Zusammensetzung reduktiv dechlorierender Salzwasserhabitate offenbar von derjenigen reduktiv dechlorierender Süßwasserhabitate deutlich abweicht. Die durch den Vergleich dreier Diversitätsanalysen gefundenen Sequenzübereinstimmungen innerhalb reduktiv dechlorierender Süßwasserhabitate lassen hingegen eine spezifische Populationsstruktur in diesen Lebensräumen vermuten, in denen von grundsätzlich vergleichbaren physiologischen Rahmenbedingungen ausgegangen werden kann. Da ferner die Wurtsmith-Sequenzen im Gegensatz zu den Trichlorbenzol- bzw. SHA-Sequenzen auf dem nordamerikanischen Kontinent gefunden wurden, scheint eine spezifische mikrobielle Zusammensetzung vorzuliegen, die sich auch in deutlich voneinander getrennten geografischen Räumen herausgebildet hat.

Wie bereits im Abschnitt 4.1.2 diskutiert, unterliegen PCR-basierte 16S rRNA-Analysen einer Reihe von Fehlermöglichkeiten. Die Vergleichbarkeit von 16S rDNA-Klonbibliotheken, die unter unterschiedlichen experimentellen Bedingungen sowie aus Probenmaterial unterschiedlicher Habitate angelegt wurden, ist folglich eingeschränkt (Head et al., 1998). Daher wurden die experimentellen Bedingungen der hier verglichenen 16S rRNA-Diversitätsstudien, d.h. die beprobten Habitate, kontaminierenden Verbindungen, Zellaufschlußmethoden, Klonierungssysteme und PCR-Primer, zur genaueren Analyse in Tab. 4.1 miteinander verglichen.


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Tab. 4.1 Experimentelle Bedingungen der miteinander verglichenen 16S rDNA-Klonbibliotheken.

Habitat

Chlorierte

Verbindung

Zellysis

Klonierungs-verfahren

Bakterielle PCR-Primer

Referenz

Flußsediment, Bioreaktor

Dichlorpropan

enzymatisch, frieren/tauen, Detergenz

TA-Klonierung

27f – 1522r

diese Arbeit

Flußsediment,
Bioreaktor

Trichlorbenzol

enzymatisch, frieren/tauen, Detergenz

TA-Klonierung, LIC-Klonierung

27f – 1522r

von Wintzingerode
et al. (1999)

Aquifer,
Boden

Kohlenwasser-stoffe/chlorierte
Verbindungen

Bead-Beater, enzymatisch, Detergenz

TA-Klonierung

27f – 1492r, 533f – 1492r,

Dojka et al. (1998)

marines Sediment

Tetrachlorbi-phenyl

Bead-Beater, Detergenz

TA-Klonierung

519f – 1406r

Pulliam Holoman
et al. (1998)

marines Sediment

Tetrachlorethen

Guanidinthio-cyanat, Bead- Beater

TA-Klonierung

8f – 1512r

Kengen et al. (1999)

Bei den 16S rDNA-Diversitätsanalysen der drei reduktiv dechlorierenden Süßwasserhabitate fanden unterschiedliche Probenmaterialien sowie voneinander abweichende Zellysis- bzw. PCR-Protokolle Verwendung. Trotzdem konnten in diesen Lebensräumen deutliche Übereinstimmungen der bakteriellen Zusammensetzung gefunden werden. Im Gegensatz dazu führten gleiche Zellysismethoden und PCR-Bedingungen in den Diversitätsanalysen des marinen PCB-dechlorierenden Habitats (Pulliam Holoman et al., 1998) und des kontaminierten Aquifers (Dojka et al., 1998) zu keinen nennenswerten Ähnlichkeiten zwischen den gefundenen 16S rDNA-Sequenzen. Es kann folglich davon ausgegangen werden, daß die experimentellen Bedingungen der hier miteinander verglichenen molekularen Diversitätsanalysen keine wesentlichen Auswirkungen auf die Ergebnisse hatten.

4.1.4  Archaeale Diversität der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation

Zur Untersuchung der archaealen Diversität der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation wurde die 16S rDNA-Zusammensetzung von Reaktorprobe S2 ermittelt (Klonbibliotheken B und C). Im Gegensatz zur bakteriellen Zusammensetzung, die ebenfalls ausgehend von Probe S2 untersucht wurde (siehe 4.1.3), war die Diversität der Archaea in der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation gering. Anhand der 16S rDNA wurden im wesentlichen zwei dominierende methanogene Spezies nachgewiesen, Methanosaeta concilii sowie Methanomethylovorans hollandica. Methanosaeta concilii-[Seite 87↓] ähnliche Spezies wurden bereits häufig in molekularen Diversitätsanalysen unterschiedlicher anaerober Habitate gefunden, darunter auch eine Vielzahl von Bioreaktorpopulationen (Leclerc et al., 2001; Schmidt und Ahring, 1999). Archaea dieser Spezies dominierten auch die mikrobiellen Populationen der bereits unter 4.1.3 erwähnten reduktiv dechlorierenden Süßwasserhabitate (Dojka et al., 1998; von Wintzingerode et al., 1999). Bei Methanomethylovorans hollandica hingegen handelt es sich um eine erst vor kurzem aus Süßwassersediment (Nijmegen, Niederlande) erstmalig isolierte methanogene Spezies, die in der Lage ist, Dimethylsulfid als alleinige Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen (Lomans et al., 1999). Von der Gattung Methanomethylovorans wurde kürzlich noch eine zweite Spezies, Methanomethylovorans victoriae Stamm TM (AJ276437) isoliert, die aus dem Viktoriasee in Tansania stammt.

Neben den zwei dominierenden Methanosaeta- und Methanomethylovorans-ähnlichen 16S rDNA-Sequenztypen wurden u.a. zwei Klonsequenzen gefunden, die hohe Ähnlichkeiten zu Klon WCHD3-07 aufwiesen. Dieser Klon wurde bislang ausschließlich in dem mit chlorierten Lösemitteln kontaminierten Wurtsmith-Flughafengelände nachgewiesen (Dojka et al., 1998). Die Dominanz von Methanosaeta concilii sowie die hohen Ähnlichkeiten von SHB- bzw. SHC-Klonen zu bislang ausschließlich am Wurtsmith-Standort gefundenen Klonsequenzen unterstreichen die bereits anhand der bakteriellen Diversität ermittelte spezifische Populationsstruktur reduktiv dechlorierender Süßwaserhabitate.

4.2 Veränderung der DCP-dechlorierenden Population im Bioreaktor

Durch die Analyse der Klonbibliotheken A, B und C wurde die Diversität der Bakterien sowie der Archaea in der DCP-dechlorierenden Bioreaktorkultur erfaßt. Es ergaben sich wesentliche Übereinstimmungen zu anderen reduktiv dechlorierenden Süßwasserhabitaten, so daß von einer spezifischen Populationsstruktur dieser Lebenräume ausgegangen werden kann. Darüber hinaus wurden neue bakterielle Sequenzcluster bzw. Einzelsequenzen identifiziert. Der zum Cluster SHA-IV gehörende Klon SHA-67 wies über 97% Sequenzähnlichkeit zum dehalorespirierenden Bakterium Dehalobacter restrictus auf.

Alle bisherigen Untersuchungen basierten auf der Probe S2 und stellten folglich eine Momentaufnahme der mikrobiellen Populationszusammensetzung unmittelbar nach Ende der Anfahrphase des Bioreaktors dar. Im Anschluß daran wurde das Verfahren durch Variation der Verweilzeit, der Substratzusammensetzung sowie der DCP-Konzentration optimiert (Hauck, 2000). In diesem etwa 14 Monate umfassenden Zeitraum wurde das zugeführte DCP durch die Bioreaktorpopulation mit Transformationsraten zwischen 60%[Seite 88↓] und 98% kontinuierlich dechloriert. Es stellte sich die Frage, ob sich die DCP-transformierende Population im Zuge der längeren Reaktorbetriebsdauer veränderte. Daher wurde Probe S2 zusammen mit weiteren fünf zu anderen Zeitpunkten entnommenen Reaktorproben (S1, S3 – S6, siehe Tab. 3.1) durch eine Kombination unterschiedlicher molekularer Methoden untersucht (DGGE, 16S rDNA-Klonbibliothek, QE-PCR und FISH). Die Auswahl der Methoden diente sowohl der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse als auch dem Ausgleich spezifischer Nachteile eines einzelnen Ansatzes (Muyzer, 1999).

4.2.1  Untersuchung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation mittels DGGE

Die DGGE wurde 1993 von Muyzer und Mitarbeitern (Muyzer et al., 1993) erstmals bei Fragestellungen der mikrobiellen Ökologie angewandt. Als molekulare Fingerprinting-Methode wird sie häufig zur orientierenden Analyse von Diversität und Dynamik mikrobieller Lebensräume eingesetzt (zur Übersicht s. Muyzer und Smalla, 1998; Muyzer, 1999). In der DGGE beruht die spezifische Trennung von Nukleinsäure-Fragmenten auf der Eigenschaft doppelsträngiger DNA-Moleküle, in Abhängigkeit ihrer Basenzusammen-setzung unterschiedliche Schmelzverhalten zu zeigen. Das allmähliche Aufschmelzen einer DNA führt zu einer Konformationsänderung des Moleküls, die ein verändertes elektrophoretisches Laufverhalten in einer Gelmatrix zur Folge hat. Partiell denaturierte DNA bewegt sich im Elektrophoresegel langsamer als nicht-denaturierte DNA. Da ein DGGE-Gel mit einem Gradienten eines oder mehrerer denaturierender Agenzien versehen ist, kommt es folglich zu einer Auftrennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Basenzusammensetzung in Abhängigkeit ihres jeweiligen Schmelzverhaltens. Die durch die PCR-Amplifikation eingebrachte “GC-Klammer” eines zu trennenden DNA-Fragments verhindert dabei die vollständige Denaturierung des Moleküls. Auf diese Weise entstehen Proben-spezifische Bandenprofile, die miteinander verglichen werden können. In der mikrobiellen Ökologie erlaubt dieser methodische Ansatz eine vergleichsweise schnelle Erfassung der 16S rDNA-Zusammensetzung einer komplexen mikrobiellen Population.

Insgesamt vier Proben der DCP-dechlorierenden Reaktorkultur (S1 – S4) wurden mit Hilfe der DGGE untersucht. Die erhaltenen Bandenmuster zeigten, daß sich die Bioreaktorkultur innerhalb eines Zeitraums von etwa 10 Monaten (S1 – S3) signifikant verändert hatte. Vor allem während der Reaktoranfahrphase (S1 – S2) fand ein deutlicher Wandel der bakteriellen Zusammensetzung statt, während nach Ablauf von etwa 10 Monaten (S3 – S4) eine vergleichsweise stabile Phase zu verzeichnen war. Das erhaltene Gesamtprofil verdeutlicht den kontinuierlichen Adaptionsprozeß der bakteriellen Population im Reaktor, der in einem stabilen DCP-umsetzenden Konsortium mündet.

In allen vier Proben waren jeweils etwa 30 16S rDNA-Banden zu unterscheiden. Im Idealfall entspricht eine rDNA-Bande einem mikrobiellen Ökotyp. Da die Analyse der DCP-[Seite 89↓] dechlorierenden Population durch vergleichende 16S rDNA-Analyse zu mindestens 75 durch einzelne Klonfamilien repräsentierte Ökotypen geführt hatte (Probe S2), ist davon auszugehen, daß die bakterielle Diversität innerhalb der vier untersuchten Reaktorproben (S1 – S4) durch die DGGE-Profile unterschätzt wurde. Diese Diskrepanz zwischen den Ergebnissen beider methodischen Ansätze verdeutlicht spezifische Limitierungen der DGGE-Analyse. So ist das Auflösungsvermögen von rDNA-Fragmenten sehr komplex zusammengesetzter mikrobieller Lebensgemeinschaften in der DGGE begrenzt (Muyzer und Smalla, 1998). Im Rahmen einer Studie zur Diversität von bakteriellem Plankton in Flußmündungen kommen die Autoren zu dem Schluß, daß lediglich abundante Ökotypen, die mehr als 1% der Gesamtpopulation ausmachen, durch die DGGE erfaßt werden (Murray et al., 1996). Da der überwiegende Teil der SHA-Sequenzen nur ein- oder zweimal innerhalb der Klonbibliothek A gefunden worden war, ist davon auszugehen, daß viele dieser Sequenzen nicht von der DGGE erfaßt wurden. Darüber hinaus zeigten eine Vielzahl der SHA-Klonsequenzen (vor allem GNS-Sequenzen) untereinander nur relativ geringe Sequenzunterschiede, so daß die betreffenden rDNA-Fragmente möglicherweise nicht von der DGGE aufgelöst werden konnten. Die in der Literatur publizierten Ergebnisse zum Auflösungsvermögen einzelner rDNA-Fragmente durch die DGGE sind widersprüchlich. So zeigten Arbeiten zur 16S rRNA-Mikroheterogenität von Paenibacillus polymyxa, daß rDNA-Fragmente, die sich in ihrer Sequenz um nur ein Basenpaar unterschieden, durch die DGGE aufgetrennt werden konnten (Nübel et al., 1996). Auf der anderen Seite wird von 16S rDNA-Fragmenten unterschiedlicher methanoxidierender Bakterien berichtet, die trotz signifikanter Sequenzunterschiede nicht durch die DGGE getrennt wurden (Vallaeys et al., 1997). Offenbar spielen Primär- und Sekundärstruktur der amplifizierten rDNA-Fragmente sowie die experimentellen DGGE-Bedingungen eine wichtige Rolle. Neben einem begrenzten Auflösungsvermögen der DGGE kann auch die Ko-Migration von rDNA-Fragmenten das qualitative Ergebnis einer DGGE verfälschen. Dieses Phänomen führt zu heterogen zusammengesetzten rDNA-Banden, so daß die tatsächliche mikrobielle Diversität somit unterschätzt wird.

Ein wesentlicher Vorteil der DGGE besteht in der Möglichkeit zur semi-quantitativen Analyse der erhaltenen Bandenprofile bzw. Einzelbanden (Nübel et al., 1996). Anhand der kalkulierten rA-Werte (relative Abundanz) kann die Präsenz bakterieller Ökotypen in den untersuchten Proben verfolgt werden. Da jedoch eine DGGE-Bande in Folge von Ko-Migration oder Operon-Mikroheterogenitäten ungleichmäßig zusammengesetzt sein kann (Muyzer und Smalla, 1998), sollte eine nachfolgende Klonierung und Sequenzierung der korrespondierenden rDNA-Fragmente erfolgen, um die betreffende Bande eindeutig zu identifizieren. Die DGGE-Analyse der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation ergab infolge der hohen bakteriellen Diversität ein komplexes Bandenprofil. Das kontaminationsfreie Ausschneiden einzelner Banden war technisch schwierig. In zwei Fällen konnten jedoch dominante Banden, die innerhalb des DGGE-Profils eine [Seite 90↓] exponierte Position aufwiesen, aus dem Gel ausgeschnitten und sequenziert werden (Banden A-S4 und B-S4). Bande A-S4 wies eine sehr heterogene Zusammensetzung auf. Nur drei Klonsequenzen waren identisch und zeigten hohe Sequenzähnlichkeiten zu Dehalococcoides ethenogenes (Maymó-Gatell, 1997) und Isolat CBDB1 (Adrian et al., 2000). Beide bakteriellen Spezies sind in der Lage chlororganische Verbindungen durch Halorespiration vollständig reduktiv zu dechlorieren. Dehalococcoides-ähnliche Bakterien wurden kürzlich an mehreren mit Chlororganika belasteten Standorten in den USA und in den Niederlanden gefunden (Löffler et al., 2000). Das Auftreten von Dehalococcoides-ähnlichen Spezies in der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation und demzufolge auch im Sediment der Saale ist ein weiteres Indiz für die offenbar weite Verbreitung dieses Bakteriums in unterschiedlichen geografischen Regionen. Ein weiterer interessanter Befund der Analyse von Bande A-S4 war die Identifikation des rDNA-Fragments von Klon SHE-137. Die betreffende Sequenz gehört zum Phylum-Cluster Saale-3 und unterstützt damit die Existenz dieser neu identifizierten bakteriellen Hauptgruppe.

Im Gegensatz zu Bande A-S4 war Bande B-S4 nahezu homogen aus Dehalobacter restrictus-ähnlichen 16S rDNA-Fragmenten zusammengesetzt und wurde in drei Reaktorproben (S2 - S4) nachgewiesen. Daher konnten in diesem Fall Rückschlüsse bzgl. der Abundanz dieses halorespirierenden Bakteriums in der DCP-transformierenden Population gezogen werden. Anhand der ermittelten rA-Werte von Probe S2 und Probe S3 läßt sich eine signifikante Anreicherung Dehalobacter restrictus-ähnlicher Bakterien im Reaktor ableiten. Dieser Befund wird durch den mitgeführten Marker (amplifizierte Dehalobacter restrictus-rDNA), der eine identische Gelmigration aufweist, bestätigt. Auch unter Berücksichtigung der experimentellen Störfaktoren jeder PCR-vermittelten Diversitäts-analyse (z.B. Probenaufarbeitung, PCR-Artefakte, rRNA-Operonmikro-heterogenitäten; siehe 4.1.2) erscheint die quantitative Interpretation der DGGE-Banden B-S2 bis B-S4 aufgrund der überaus deutlichen Dominanz der Dehalobacter restrictus-ähnlichen 16S rDNA-Fragmente plausibel.

4.2.2  Untersuchung der mikrobiellen Diversität der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation anhand von Klonbibliothek D

Ausgehend von der Reaktorprobe S3 wurde eine weitere 16S rDNA-Klonbibliothek angelegt und durchgemustert (Klonbibliothek D, SHD-Klone). Basierend auf den Ergebnissen der Klonbibliothek A sowie der DGGE-Analyse wurde der Fokus beim Durchmustern von Klonbibliothek D auf die sechs SHA-Sequenzcluster (SHA-I bis SHA-VI) gelegt. Zusätzlich wurden im Zuge der Hybridisierungsexperimente Dehalobacter restrictus- bzw. Dehalococcoides ethenogenes-ähnliche 16S rDNA-Sequenzen explizit in Klonbibliothek D gesucht. Die von der DGGE-Analyse abgeleitete Anreicherung Dehalobacter restrictus-ähnlicher Bakterien bis hin zur dominierenden Spezies innerhalb[Seite 91↓] der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation konnte anhand der SHD-Klonzusammensetzung bestätigt werden. Während in Klonbibliothek A lediglich ein einzelner Dehalobacter-ähnlicher Klon gefunden worden war (Klon SHA-67), umfaßte Klonbibliothek D etwa 100 Klone mit höchster Sequenzähnlichkeit zu Dehalobacter restrictus Stamm TEA (Wild et al., 1996). Im Gegensatz dazu konnten keine Dehalococcoides ethenogenes-ähnlichen SHD-Klone nachgewiesen werden. Beide Stämme, Dehalococcoides ethenogenes sowie Isolat CBDB1, weisen in ihrem 16S rRNA-Gen die Primerbindungsstelle der verwendeten universellen Primer TPU1 und RTU8 auf und hätten demzufolge PCR-amplifiziert werden können. Der Versuch, Dehalococcoides ethenogenes durch PCR-Amplifikation mit spezifischen Primern in den Reaktorproben nachzuweisen, schlug fehl (Daten nicht gezeigt). Demzufolge repräsentierten die Dehalococcoides-ähnlichen DGGE-Sequenzen möglicherweise Ökotypen, die Sequenzvariationen in den Bindungsbereichen der verwendeten spezifischen Primer aufweisen. Das Nicht-Vorhandensein Dehalococcoides-ähnlicher rDNA-Sequenzen in Klonbibliothek D kann allerdings auch durch ein geringes Vorkommen des betreffenden Ökotyps in der Reaktorpopulation begründet sein.

Neben Dehalobacter restrictus-ähnlichen Spezies sind auch andere Bakterien in der Reaktormischkultur häufig vertreten. Wie schon in Klonbibliothek A waren auch in Klonbibliothek D GNS-Ökotypen in großer Variation und Zahl anzutreffen. Es wurden mehrere 16S rDNA-Sequenzen gefunden, die zu den spezifischen GNS-Clustern SHA-II und SHA-III gehörten. Mit Ausnahme von Cluster SHA-VI konnten auch im Falle der anderen SHA-Sequenzcluster verwandte Sequenzen innerhalb der Klonbibliothek D gefunden werden. Die durch diese Sequenzen repräsentierten Ökotypen wurden folglich auch über einen längeren Zeitraum nicht durch andere Organismen verdrängt oder vollständig ausgewaschen. Neben Dehalobacter restrictus-ähnlichen Spezies besitzen demzufolge auch diese bislang nicht-kultivierten Mikroorganismen das Potential, als Marker- oder Indikatororganismen zur Überwachung und Optimierung des Bioreaktor-prozesses zu fungieren.

4.2.3  Quantifizierung Dehalobacter restrictus-ähnlicher 16S rDNA in der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation

Um die Anreicherung Dehalobacter restrictus-ähnlicher bakterieller Spezies in der Reaktormischkultur bestätigen zu können, wurde der Gehalt entsprechender 16S rDNA mittels quantitativer PCR bestimmt. Bislang wurden hauptsächlich drei quantitative PCR-Methoden angewandt, die Verdünnungs-PCR (Pillai et al., 1991; Sykes et al., 1992), die kinetische PCR (Alard et al., 1993; Higuchi et al., 1992) sowie die kompetetive PCR (Felske et al., 1998a; Yu et al., 1999). Alle drei Methoden haben den entscheidenden Nachteil, auf einer Endpunktmessung der amplifizierten Nukleinsäure zu beruhen. Dies kann zu einer deutlichen Verfälschung der ermittelten Nukleinsäure-[Seite 92↓] Ausgangskonzentration führen (Grüntzig et al., 2001). Ein solcher Fehler tritt bei der kürzlich eingeführten QE-PCR (Heid et al., 1996) nicht auf, da die Bildung des Amplifikationsprodukts während der Reaktion kontinuierlich gemessen wird. Die QE-PCR gilt als sensitive, reproduzierbare und effiziente Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren (Lyons et al., 2000) und wurde in der mikrobiellen Ökologie bereits erfolgreich zur Quantifizierung von 16S rDNA in verschiedenen komplex zusammengesetzten Populationen angewandt, so z.B. in marinem Plankton (Becker et al., 2000; Suzuki et al., 2000) und in Bodenproben (Hermansson und Lindgren, 2001). In allen vorgenannten Studien wurde die sogenannte TaqMan-Technologie verwendet (Livak et al., 1995).

In der vorliegenden Arbeit wurde bakterielle Gesamt- sowie Dehalobacter restrictus-ähnliche 16S rDNA mit dem sogenannten „LightCycler“ quantifiziert (Fa. Roche, Mannheim). Dieses Gerät wurde bereits zum quantitativen Nachweis ribosomaler DNA im Rahmen medizinisch-mikrobiologischer Untersuchungen eingesetzt, so z.B. zur Quantifizierung von Chlamydia trachomatis (Mathews et al., 1999), Collinsella aerofaciens (Kageyama et al., 2000) oder Leptospira biflexa (Woo et al., 1999). Die technische Konfiguration des LightCyclers erlaubt es, Fluoreszenzemissionen, die mit Zunahme der PCR-Produktkonzentration ansteigen, während des Ablaufs einer PCR-Reaktion zu messen. Dazu muß die PCR in einem geeigneten „Format“ ablaufen, d.h. dem Reaktionsansatz müssen Substanzen hinzugefügt werden, die sowohl quantitativ mit dem PCR-Produkt reagieren, als auch Fluoreszenzenergie emittieren. Zum Nachweis von 16S rDNA in den Bioreaktorproben wurde der Farbstoff „SYBR-Green I“ verwendet. SYBR-Green I lagert sich selektiv in doppelsträngige DNA ein und emittiert Fluoreszenzenergie bei einer Anregungswellenlänge von 530 nm. Mit größer werdender PCR-Produktkonzentration steigen demzufolge die vom SYBR-Green I erzeugten Fluoreszenzemissionen, so daß die Kinetik der PCR-Reaktion ermittelt werden kann. Aus der Reaktionskinetik werden der sog. „Crossing Point“ (Beginn der exponentiellen PCR-Produktzunahme) sowie die Steigung im „linearen Bereich“ bestimmt und zur Berechnung der DNA-Ausgangskonzentration verwendet. Beim „linearen Bereich“ handelt es sich um die Anfangsphase der exponentiellen PCR-Produktzunahme, die in logarithmierter Darstellung einen linearen Verlauf aufweist (Reaktionskinetik 1. Ordnung).

Zur Amplifikation Dehalobacter restrictus-ähnlicher 16S rDNA aus den Bioreaktorproben wurden die neu abgeleiteten Primer deb179f sowie deb1007r eingesetzt. Sie basierten auf einem Datensatz von über 20 Dehalobacter restrictus-ähnlichen 16S rDNA-Sequenzen, die in der ARB-Datenbank hinterlegt waren. Simultan zur Dehalobacter-rDNA wurde bakterielle rDNA als Biomassemarker im LightCycler PCR-amplifiziert. Auf diese Weise war eine relative Quantifizierung Dehalobacter-ähnlicher Bakterien in bezug zur gesamten bakteriellen Population möglich. Dieser experimentelle Ansatz erlaubte den weitestgehenden Ausschluß von Meßwertverfälschungen, die durch variierende Proben-[Seite 93↓] bzw. Nukleinsäurepräparationen der vier untersuchten Bioreaktorproben hätten hervorgerufen werden können. Bestimmte Variablen wie etwa der GC-Gehalt oder die Zahl der rRNA-Operons sind jedoch nicht präzise erfaßbar.

Die gemessenen 16S rDNA-Konzentrationen in den Bioreaktorproben bestätigten die signifikante Anreicherung Dehalobacter restrictus-ähnlicher Bakterien im Bioreaktor. Die Anreicherung (8-fach) lag in der gleichen Größenordnung wie bei den DGGE-Daten (12-fach). Allerdings waren die ermittelten rDNA-Konzentrationen der gesamten Bakterien niedriger als die der Dehalobacter-ähnlichen. Diese Diskrepanz läßt sich durch unterschiedliche Amplifizierungseffizienzen der verwendeten Primerpaare erklären, da das vom Primerpaar TPU1/RTU8 amplifizierte rDNA-Fragment nahezu doppelt so lang ist (etwa 1550 bp), wie das vom Primerpaar deb179f/deb1007r. Darüber hinaus führt die im LightCycler verwendete Kapillartechnik bei längeren Amplikons zu einer stärkeren Abnahme der Produktausbeute. Aus diesem Grund wurden lediglich Konzentrationsänderungen miteinander verglichen, um die Anreicherung Dehalobacter-ähnlicher Bakterien im Bioreaktor erfassen zu können.

4.2.4  Untersuchung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch FISH

Im Gegensatz zu den anderen im Rahmen dieser Arbeit angewandten molekularen Methoden ist die FISH ein PCR-unabhängiges Verfahren zum Nachweis mikrobieller 16S rRNA in fixiertem mikrobiellen Probenmaterial. Demnach unterliegt die FISH nicht den spezifischen Fehlermöglichkeiten PCR-vermittelter Methoden (siehe 4.1.2) und ermöglicht eine direkte Quantifizierung von Mikroorganismen in komplexen Populationen unter Erhalt ihrer Zellintegrität (Moter und Göbel, 2000). In der mikrobiellen Ökologie wird die FISH bei Untersuchungen unterschiedlichster Habitate eingesetzt (zur Übersicht s. Amann und Ludwig, 2000). Beim Nachweis von Mikroorganismen der DCP-dechlorierenden Population durch FISH stellte allerdings die Art des Probenmaterials ein erhebliches technisches Problem dar. Ohne die vergleichsweise drastische Vorbehandlung des auf den PU-Körpern befindlichen mikrobiellen Biofilms, wie z.B. durch die Kombination aus Zerkleinern, Schütteln (Vortexing), Ultraschall und Natriumpyrophosphatzugabe, war eine FISH der Zellen nicht möglich. Eine ähnliche Probenvorbehandlung wurde beispielsweise zur Aufarbeitung von Mikroorganismen aus Bodenproben gewählt, in denen eine vergleichbare an Feststoffpartikeln gebundene Biomasse vorlag (Zarda et al., 1997).

Bei der mikroskopischen Quantifizierung von Mikroorganismen mittels FISH werden sowohl die positiv hybridisierten als auch die DAPI-markierten Zellen eines definierten Ausschnitts ausgezählt und ins Verhältnis zueinander gesetzt (Amann et al., 1995). Diese Vorgehensweise setzt zum einen eine repräsentative Probennahme und zum anderen eine direkte Weiterverarbeitung der Proben voraus. Die Mikroorganismen der DCP-[Seite 94↓] dechlorierenden Bioreaktorpopulation lagen zum überwiegenden Teil als an PU-Würfeln gebundene Biofilme und nicht in suspendierter Form vor, so daß eine repräsentative Beprobung des Reaktors nur eingeschränkt möglich war. Zudem konnte aufgrund des dichten Biofilms keine direkte FISH des Probenmaterials erfolgen. Es war darüber hinaus davon auszugehen, daß die zur Hybridisierung notwendige Vorbehandlung mit Natriumpyrophosphat und Ultraschall zu einer Schädigung einzelner Mikroorganismen und damit zu einer Verfälschung des mikroskopischen Auszählens führen würde. Folglich wurde auf eine quantitative Auswertung der FISH verzichtet. Vielmehr sollte die FISH als qualitative Plausibilitätskontrolle in Ergänzung zu den PCR-vermittelten Verfahren dienen.

Der Nachweis von Bakterien in der Bioreaktorpopulation mittels FISH führte zu keinem Erfolg. Dies widersprach den Ergebnissen aller anderen im Rahmen dieser Arbeit angewandten Methoden. Mit Hilfe der DAPI-Färbung waren zwar eine Vielzahl unterschiedlicher Morphotypen mikroskopisch erkennbar, aber der überwiegende Teil dieser "Partikel" erschien vergleichsweise klein. Ähnliche Beobachtungen wurden bereits in FISH-Untersuchungen an Bakterioplankton unterschiedlicher Süßwasserproben beschrieben (Glöckner et al., 1999). Die Autoren vermuteten, es handele sich um virale Partikel, die in aquatischen Systemen eine beträchtliche Abundanz aufweisen (Heldal und Bratbak, 1991).

Für falsch-negative Hybridisierungsergebnisse der FISH kommen eine Reihe unterschiedlicher Ursachen in Betracht. So wird etwa durch eine geringe zelluläre 16S rRNA-Konzentration ein möglicherweise zu niedriges Fluoreszenzsignal erzeugt (Moter und Göbel, 2000). Geringe Ribosomenzahlen sind ein Hinweis auf geringe physiologische Aktivität der betreffenden Bakterien und können Ausdruck mikrobieller Überlebenstrategien zu Zeiten ungünstiger physiologischer Rahmenbedingungen sein (Kolter et al., 1993; Roszak et al., 1987). Da aber im Falle der Bakterien und insbesondere der Dehalobacter restrictus-ähnlichen Bakterien eine deutliche Anreicherung in der DCP-dechlorierenden Population nachgewiesen werden konnte (siehe 3.4), war von der physiologischen Aktivität vieler Zellen auszugehen. Weitere Ursachen für falsch-negative Hybridisierungsergebnisse liegen in der Art der Zellwand eines Bakteriums sowie in der Sekundärstruktur der 16S rRNA begründet (Moter und Göbel, 2000). Beispielsweise kann der ausgeprägte Mureinsacculus grampositver Bakterien die Penetration der Sonde durch die Zellwand behindern (Felske et al., 1998b). Durch Verwendung etablierter Oligonukleotidonden (EUB338Cy3) und entsprechender Kontrollen (Dehalobacter restrictus) konnten solche Einflußfaktoren jedoch weitestgehend ausgeschlossen werden. Eine Ausnahme stellten die Hybridisierungen mit den Sonden a21Cy3, a24Cy3 und a25Cy3 dar, weil in diesen Fällen weder etablierte Sonden noch Positivkontrollen verfügbar waren.


[Seite 95↓]

Der Grund für die negativen Ergebnisse der FISH-Untersuchungen bei Verwendung bakterienspezifischer Oligonukleotidsonden war vermutlich die vergleichsweise harsche Vorbehandlung des fixierten Probenmaterials, die in einer Schädigung bakterieller Zellen resultierte. Die in der DCP-dechlorierenden Population präsenten Archaea waren von dieser Probenvorbehandlung offenbar weit weniger betroffen, da in allen Proben Methanomethylovorans hollandica sowie Methanosaeta concilii mittels FISH nachgewiesen werden konnten. Somit bestätigten die Ergebnisse der FISH die der Klonbibliotheken B und C. Die fast ausschließliche Besiedelung eines in den Reaktor eingebrachten Objektträgers (Probe S2) mit Methanomethylovorans hollandica stellte einen Hinweis auf die Dominanz dieser Art innerhalb der DCP-dechlorierenden Reaktorpopulation dar.

4.3 Rückschlüsse auf den Metabolismus der DCP-dechlorierenden Bioreaktorkultur

Phylogenetische Untersuchungen lassen in begrenztem Umfang Rückschlüsse auf physiologische Prozesse innerhalb einer Population zu (Dojka et al., 1998). So wurden in der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation zwei deutlich dominierende methanogene Spezies gefunden, Methanomethylovorans hollandica und Methanosaeta concilii. Methanomethylovorans hollandica ist obligat methylotroph und verwertet als Substrat ausschließlich Methanol, Methylamine, Methanthiol sowie Dimethylsulfid (Lomans et al., 1999). Daher war anzunehmen, daß Methanomethylovorans hollandica einen Teil des kontinuierlich zugeführten Methanols direkt für die Methanogenese verwendet. Im Gegensatz dazu ist bei Methanosaeta concilii bislang nur eine acetoklastische Methanogenese bekannt, die das Vorhandensein von Acetat in der Kultur voraussetzt (Whitman et al., 1992). Acetat kann durch Umsetzung von Alkoholen (z.B. Methanol) durch die strikt anaeroben acetogenen Bakterien gebildet werden (Schlegel, 1995). Bei dieser Reaktion entsteht neben Kohlendioxid auch Wasserstoff, dessen Vorhandensein für zahlreiche metabolische Prozesse (z.B. Methanogenese, Halorespiration, Sulfatreduktion) von zentraler Bedeutung ist. Zahlreiche acetogene Bakterien findet man beispielsweise innerhalb der Gattung Clostridium (Diekert, 1992). In der DCP-dechlorierenden Population wurden mehrere Clostridium-ähnliche Klone gefunden, so z.B. Klon SHA-123, der das Bakterium Clostridium lituseburense repräsentiert. Clostridium lituseburense bildet neben einer Reihe anderer organischer Säuren hauptsächlich Acetat durch proteo- wie auch saccharolytische Spaltung bei geringer Wasserstoffproduktion (Cato et al., 1986).


[Seite 96↓]

In vielen Fällen sind die wasserstoffproduzierenden acetogenen Bakterien mit den wasserstoffkonsumierenden methanogenen Archaea eng vergesellschaftet. Diese Syntrophie geht mit einem "Inter-Spezies-Wasserstoff-Transfer" einher, bei dem der Wasserstoff zwischen den beteiligten Mikroorganismen direkt, d.h. ohne Freisetzung ins Medium, übertragen wird. Dadurch wird eine niedrige Wasserstoffkonzentration im Medium erzeugt, die aus thermodynamischen Gesichtspunkten für eine ausreichend exergone Oxidation organischer Substanzen notwendig ist (Valentine et al., 1999). In Klonbibliothek A wurden 16S rDNA-Sequenzen der Gattungen Syntrophus und Syntrophobacter gefunden. Syntrophus und Syntrophobacter beziehen Energie durch anaerobe Oxidation diverser organischer Säuren zu Acetat und Wasserstoff in Syntrophie mit methanogenen Archaea (Wallrabenstein et al., 1995; Harmsen et al., 1998). Im Falle von Syntrophus gentianea und Methanosaeta concilii wurde in einer Mischkultur zusammen mit Methanospirillum hungatei oder Desulfovibrio desulfuricans eine syntrophe Wechselwirkung nachgewiesen (Schink, 1997). Die Anwesenheit von Methanosaeta concilii führte zu einer deutlich höheren Benzoatabbaurate durch Syntrophus gentianea, während das vermehrt gebildete Acetat stöchiometrisch umgesetzt wurde. Es ist demzufolge wahrscheinlich, daß die in der DCP-dechlorierenden Population vorkommenden Spezies der Gattungen Syntrophus sowie Syntrophobacter in syntropher Wechselwirkung mit den methanogenen Archaea Wasserstoff sowie Acetat produzieren. Das in Klonbibliothek A nachgewiesene Bakterium Acidaminobacter hydrogenoformans ist ebenfalls in der Lage, syntroph mit einem wasserstoff-konsumierenden Mikroorganismus zu existieren (Meijer et al., 1999). Es setzt unterschiedliche Kohlenhydrate, Alkohole sowie organische Säuren um. Interessanterweise wurde Acidaminobacter hydrogenoformans auch in mehreren anaeroben Sedimentanreicherungskulturen gefunden, die Tetrachlorethen, cis-Dichlorethen und Vinylchlorid reduktiv dechlorieren (Löffler et al., 2000).

Der in der DCP-dechlorierenden Mischkultur erzeugte Wasserstoff wird nicht ausschließlich zur Bildung von Methan und Kohlendioxid durch methanogene Archaea verwertet. Wasserstoff stellt auch bei der reduktiven Umsetzung von DCP die wichtigste Elektronenquelle dar. In der hier untersuchten Bioreaktorpopulation wurde die reduktive Dechlorierung von DCP zu Propen als Kombination aus sequentieller Dechlorierung und Dehydrodehalogenierung identifiziert (Hauck und Hegemann, 1999). Dieser Befund deutete auf mehrere anaerobe DCP-umsetzende mikrobielle Ökotypen im Reaktor hin.

Im Rahmen der molekularen Diversitätsanalyse wurde Dehalobacter restrictus im Bioreaktor gefunden. Dieses Bakterium ist in der Lage, Tetra- bzw. Trichlorethen durch sequentielle Dechlorierung zu cis-1,2-Dichlorethen zu transformieren (Wild et al., 1996). Neben Dehalobacter vermögen u.a. Bakterien der Gattung Dehalococcoides Energie durch Halorespiration zu beziehen (Adrian et al., 2000; Maymó-Gatell, 1997). Sequenzen dieser Organismengruppe wurden ebenfalls in der Bioreaktorkultur gefunden. Im [Seite 97↓] Gegensatz zu Dehalobacter ist Dehalococcoides in der Lage, eine Vielzahl aliphatischer wie aromatischer chlorierter Substrate vollständig umzusetzen. Die Bakterien beider Gattungen sind hinsichtlich ihres Stoffwechsels sehr spezialisiert, da sie die zum Zellwachstum notwendige Energie ausschließlich durch Chloratmung beziehen (El Fantroussi et al., 1998). Folglich ist davon auszugehen, daß Dehalobacter- bzw. Dehalococcoides-ähnliche Bakterien auch an der reduktiven Dechlorierung des DCPs im Bioreaktor beteiligt sind. Da Dehalobacter restrictus überproportional angereichert und darüber hinaus zur dominierenden bakteriellen Spezies innerhalb des Reaktors wurde, wird eine Schlüsselrolle dieser Spezies innerhalb der reduktiven DCP-Dechlorierung angenommen. Diese Hypothese wird durch den Nachweis von Dehalogenasegenen in der DCP-dechlorierenden Reaktorpopulation gestützt (von Wintzingerode et al., 2001). Reduktive Dehalogenasen stehen im Mittelpunkt der bei der Halorespiration stattfindenden enzymatischen Prozesse (Smidt et al., 2000). In der DCP-dechlorierenden Reaktorkultur wurden Dehalogenasegene gefunden, die Ähnlichkeiten zu Dehalobacter restrictus-Dehalogenasegenen aufwiesen (CprA-ähnliche Dehalogenase-gene, von Wintzingerode et al., 2001). CprA-Dehalogenasegene wurden ursprünglich in Desulfitobakterium dehalogenans nachgewiesen. Dieses Bakterium vermag sowohl chlorierte Phenole als auch Tetrachlorethen reduktiv zu dechlorieren (Gerritse et al., 1996).

Anhand bisher bekannten physiologischen (Hauck, 2000) sowie phylogenetischen Daten läßt sich ein vereinfachtes Modell der wesentlichen Kohlenstoff- und Energieflüsse in der anaeroben DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation aufstellen (Abb. 4.1). Das Modell verdeutlicht nocheinmal die zentrale Rolle des mikrobiell produzierten Wasserstoffs und die daraus resultierende Konkurrenzsituation wasserstoffverwertender Mikroorganismen. Eine externe Zufuhr von Wasserstoff zur Reaktorpopulation führte auch konsequenterweise zu einer schnell einsetzenden, deutlichen Steigerung der DCP-Transformation. Dieses Ergebnis stellte einen weiteren Hinweis für eine direkte Beteiligung von Dehalobacter und Dehalococcoides spp. an der Transformation des DCPs dar. Da die reduktiv dechlorierenden Mikroorganismen eine höhere Affinität zu Wasserstoff besitzen, als beispielsweise Methanogene oder Sulfatreduzierer, können sie sich bei geringen H2-Konzentrationen gegenüber den anderen Organismengruppen in der Mischkultur durchsetzen (Löffler et al., 1999). Allerdings ist eine Konkurrenz zwischen halorespirierenden und sulfatreduzierenden Bakterien in der Reaktorkultur unwahrscheinlich, da im verwendeten Mineralsalzmedium kein Sulfat enthalten war. Allerdings wurden Klonsequenzen gefunden, die nahezu identisch zum sulfatreduzierenden Isolat BKA11 (Wind et al., 1999) waren und demzufolge eine Sulfatreduktion in der Population vermuten ließen.


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Abb. 4.1 Modell für den Kohlenstoff- und Energiefluß in der anaeroben DCP-dechlorierenden Bioreaktorkultur (modifiziert nach Maymó-Gatell et al., 1995). Verstärkte Pfeile symbolisieren bevorzugte Umsatzwege.

Möglicherweise wurden die notwendigen Sulfate durch Verunreinigungen der verwendeten Salze in den Reaktor eingetragen. Darüber hinaus spielen auch die Verbindungen eine Rolle, die nach dem Absterben von Mikroorganismen in das Medium freigesetzt werden. Vermutlich waren derartige Verbindungen die Ursache für die hohe bakterielle Diversität in der Reaktorkultur, die trotz nur zwei kontinuierlich zugeführter Substrate über einen langen Zeitraum bestehen blieb. Es kann somit als sicher angenommen werden, daß auch das Stoffwechselgeschehen in der Reaktorpopulation außerordentlich komplex ist und daß eine Vielzahl gleichgerichteter Umsätze simultan ablaufen (z.B. metabolische und kometabolische Dechlorierung). Da sich der überwiegende Teil der im Reaktor nachgewiesenen Mikroorganismen aus bislang nicht-kultivierten Bakterien zusammensetzt, können für diese Organismen keine sinnvollen Schlußfolgerungen hinsichtlich ihrer Physiologie gezogen werden.

4.4 Schlußfolgerungen

In der vorliegenden Arbeit wurde die Zusammensetzung einer DCP-umsetzenden mikrobiellen Mischpopulation mit molekulargenetischen Methoden untersucht. Die Mikroorganismen dechlorierten in einem anaeroben kontinuierlichen Wirbelschichtreaktor DCP vollständig zu Propen. Anhand der Analyse von 16S rDNA-Klonbibliotheken konnte gezeigt werden, daß die DCP-dechlorierende Reaktorpopulation über den gesamten Untersuchungszeitraum eine hohe mikrobielle Diversität aufwies. Da kurzfristige Schwankungen, wie etwa ein vorübergehendes Ansteigen des Redoxpotentials, keine [Seite 99↓] nachhaltigen Störungen des Abbaus nach sich zogen, führte die physiologische Vielfältigkeit der Population offenbar zu einem störunanfälligen Reaktorverfahren, das eine konstante sowie effektive Dechlorierung des zugeführten DCPs ermöglichte.

Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß mikrobielle Lebensräume, in denen chlorierte Verbindungen unter anaeroben Verhältnissen reduktiv umgesetzt werden, eine spezifische Populationszusammensetzung aufweisen. Anhand der phylogenetischen Analyse wurden rDNA-Sequenzcluster definiert (SHA-I bis SHA-V), die spezifisch für reduktiv dechlorierende Süßwasserhabitate sind. Die in den SHA-Clustern zusammengefaßten Mikroorganismen stellen somit mögliche Indikatoren für die reduktive Dechlorierung dar. Der quantitative molekulargenetische Nachweis solcher Indikatororganismen ermöglicht ein kontinuierliches mikrobielles Prozeßmonitoring, mit dem die Kultur während des Auftretens kritischer Ereignisse (z.B. Anfahrphase des Reaktors, Schwankungen in der Abwasserzusammensetzung) überwacht werden kann (Brockman, 1995; Power et al., 1998; Stapleton et al., 1998). Auf diese Weise wäre eine effizientere Steuerung des Bioreaktors möglich, die wiederum zur einer erhöhten Standfestigkeit führen würde.

Cluster SHA-IV wird im wesentlichen durch das halorespirierende Bakterium Dehalobacter restrictus repräsentiert und eignet sich somit als Indikator für reduktive Dechlorierung. Dies konnte durch eine Kombination unterschiedlicher molekularer Methoden wie DGGE, 16S rDNA-Klonbibliotheksanalyse und QE-PCR gezeigt werden. Dehalobacter restrictus wurde im Gegensatz zu anderen Bakterienarten überproportional angereichert. Aufgrund der speziellen Physiologie von Dehalobacter spp. ist von einer direkten Beteiligung dieses Bakteriums an der reduktiven DCP-Umsetzung auszugehen. Neben Dehalobacter restrictus wurden auch Bakterien der Gattung Dehalococcoides im Bioreaktor nachgewiesen. Diese Mikroorganismen transformieren chlorierte Verbindungen ebenfalls durch Halorespiration und sind vermutlich an der reduktiven Umsetzung des DCPs beteiligt. Die physiologischen Eigenschaften von Dehalobacter und Dehalococcoides spp. ließen die Schlußfolgerung zu, daß die Verfügbarkeit von Wasserstoff von wesentlicher Bedeutung für die DCP-Transformation im Reaktor ist. Tatsächlich führte die Zugabe von Wasserstoff zum Bioreaktor zu einer Erhöhung der DCP-Transformationsrate. Demzufolge stellt diese Form der Biostimulation eine Möglichkeit dar, anaerobe Bioreaktorverfahren zur Transformation chlororganischer Verbindungen zu optimieren.


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20.09.2004