Mikrobielle Diversität und Dynamik einer
1,2-Dichlorpropan dechlorierenden Mischkultur

D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Dipl.-Ing. (FH) Cord Schlötelburg
20. August 1969, Oldenburg

Präsident:
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan:
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. B. Ronacher

Gutachter:
1. Prof. Dr. T. Börner
2. Prof. Dr. Dr. U. B. Göbel
3. Prof. Dr. H. Görisch

Tag der mündlichen Prüfung: 7. Dezember 2001

Zusammenfassung

Die toxische sowie kanzerogene Verbindung 1,2-Dichlorpropan (DCP) ist weit verbreitet in Industrie und Landwirtschaft. Die Verbindung zeigt eine geringe chemische Reaktivität, ist nur mäßig wasserlöslich und unter aeroben Bedingungen weitestgehend beständig gegenüber mikrobiellen Abbauprozessen in der Umwelt. Als Folge reichert sich DCP in Grundwässern, Sedimenten und Böden an und gefährdet über die Nahrungskette die Gesundheit von Mensch und Tier. Um DCP effizient und ökonomisch zu unbedenklichen Verbindungen abzubauen, wurden mikrobielle Mischkulturen aus belasteten Sedimenten angereichert und in einen Wirbelschichtreaktor überführt. Dieses Verfahren ermöglichte eine kontinuierliche anaerobe Dechlorierung von DCP zu Propen.

Grundsätzlich stellen biologische Abbauverfahren, bei denen komplexe mikrobielle Mischpopulationen eingesetzt werden, einen vielversprechenden Weg zur Transformation chlororganischer Verbindungen dar. Jedoch liegen üblicherweise nur wenige Informationen über die Zusammensetzung der betreffenden Populationen vor, so daß eine Optimierung bzw. effiziente Steuerung des Prozesses erheblich erschwert wird. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der mikrobiellen Zusammensetzung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation. Aufgrund der bekannten Limitierungen klassisch-mikrobiologischer Nachweisverfahren wurde eine Kombination mehrerer molekulargenetischer Methoden eingesetzt, die auf der vergleichenden Sequenzanalyse ribosomaler RNA beruhten. Die Untersuchungen zeigten, daß die Bakterienpopulation des Reaktors außerordentlich divers zusammengesetzt war und im wesentlichen aus bislang nicht-kultivierten Arten bestand. Es dominierten "Grüne nicht-schwefelhaltige Bakterien" (green nonsulfur bacteria) sowie Grampositive Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt. Die Archaea hingegen waren fast ausschließlich durch zwei bekannte methanogene Spezies vertreten, Methanosaeta concilii sowie Methanomethylovorans hollandica. Der Vergleich der gewonnenen rDNA-Daten mit denen anderer Lebensräume ergab, daß Süßwasserhabitate, in denen chlororganische Verbindungen reduktiv umgesetzt werden, offenbar eine spezifische Populationsstruktur aufweisen. Es konnten spezifische 16S rDNA-Gruppen definiert werden (SHA-Cluster), die auch nach längerem Reaktorbetrieb noch nachgewiesen werden konnten. Darüber hinaus wurden Dehalobacter restrictus- sowie Dehalococcoides ethenogenes-ähnliche Bakterien in der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation gefunden. Beide Spezies sind in der Lage, chlororganische Verbindungen unter Verwendung von Wasserstoff als alleinigem Elektronendonor reduktiv zu dechlorieren. Es ist davon auszugehen, daß Dehalobacter und Dehalococcoides spp. aufgrund ihrer Physiologie an der reduktiven Umsetzung des DCPs beteiligt sind. Die Untersuchung der Population über einen längeren Zeitraum zeigte überdies, daß Bakterien der Gattung Dehalobacter überproportional angereichert und daraufhin zur dominierenden Spezies im Reaktor wurden. Dieser Befund läßt auf eine zentrale Rolle von Dehalobacter spp. bei der Transformation von DCP zu Propen schließen. Konsequenterweise führte die Zugabe von Wasserstoff zum Reaktor zur einer deutlichen Steigerung des DCP-Umsatzes. Dehalobacter und Dehalococcoides spp. sowie die anderen durch SHA-Cluster repräsentierten Bakterien stellen potentielle Indikatororganismen für die DCP-Transformation im Reaktor dar. Ein kontinuierliches Monitoring dieser Bakterien würde zu einer effizienteren Steuerung des Dechlorierungsprozesses und damit zu einer Optimierung des Verfahrens führen.

Eigene Schlagworte: 1,2-Dichlorpropan, reduktive Dechlorierung, 16S rRNA, Dehalobacter restrictus

Abstract

The toxic and carcinogenic compound 1,2-dichloropropane (DCP) is widely used in industry and agriculture. DCP shows a low chemical reactivity. It is only moderately soluble in aqueous systems and almost recalcitrant to microbial degradation under aerobic conditions. As a consequence DCP accumulates in groundwater, sediments and soil, thus endangering humans and animals via the food chain. To efficiently transform DCP to harmless organic compounds microbial mixed cultures have been enriched from sediments and were subsequently transferred into a fluidized bed bioreactor. This process allowed a continuous anaerobic dechlorination of DCP to propene.

Bioreactor processes using complex microbiota represent a promising technology for transformation of chlorinated compounds. However, the composition of the used population is usually unknown, hence hindering both optimization and control of the degradation process. Subject of this work was the analysis of the microbial diversity of the DCP-dechlorinating bioreactor population. Conventional culture-dependent microbiological methods are often limited if used for the analysis of complex communities. Therefore, a combination of different molecular methods based on comparative 16S rRNA analysis was applied. It was found that the bioreactor population was highly diverse and consisted mainly of as yet-uncultured bacteria. Members of the green nonsulfur bacteria and the gram-positive bacteria with low G+C content dominated the consortium. In contrast the archaea were represented by only two species, Methanosaeta concilii and Methanomethylovorans hollandica. The comparison of the rDNA data with those of other biotopes revealed that reductively dechlorinating freshwater habitats show a specific community structure. 16S rDNA-clusters were defined, which could still be detected after a longer operation time of the bioreactor. Furthermore, Dehalobacter restrictus- and Dehalococcoides ethenogenes-like bacteria were found in the DCP-dechlorinating bioreactor population. Both species are capable of reductive dechlorination using hydrogen as the sole electron source. Therefore, it could be assumed that these bacteria were also involved in the dechlorination of DCP. The investigation of the bioreactor population for a longer period of time revealed that Dehalobacter-like bacteria were significantly enriched and subsequently became the most frequently found bacterium within the bioreactor. This indicates a major role of Dehalobacter spp. within the transformation process of DCP to propene. Consequently, the addition of hydrogen to the bioreactor led to an increase of the DCP transformation rate. Dehalobacter und Dehalococcoides spp. as well as the bacteria represented by the specific SHA-clusters are possibly suitable as indicator organisms for the transformation of DCP within the bioreactor. A continuous monitoring of these bacteria would lead to a more efficient control and hence, to an optimization of the transformation process.

Keywords: 1,2-dichloropropane, reductive dechlorination, 16S rRNA, Dehalobacter restrictus

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20.09.2004