1  Einleitung

• 1.1 Chlorierte Kohlenwasserstoffe

• 1.2 1,2-Dichlorpropan (DCP)

  • 1.2.1  Eigenschaften von DCP

  • 1.2.2  Herkunft und Verwendung von DCP

  • 1.2.3  Vorkommen von DCP in der Umwelt

• 1.3 Mikrobielle Transformation von 1,2-Dichlorpropan

  • 1.3.1  Aerobe mikrobielle DCP-Transformation

  • 1.3.2  Anaerobe mikrobielle DCP-Transformation

• 1.4 Technische Verfahren mikrobieller Dechlorierung

• 1.5 Molekulare Analyse mikrobieller Diversität

• 1.6 Ziel der Arbeit

• 1.7  Analyseschema

2  Material und Methoden

• 2.1 Chemikalien

• 2.2  Puffer, Nährmedien und sonstige Lösungen

• 2.3 Biochemikalien und Kits

• 2.4 Oligonukleotide

• 2.5 Kontrollstämme

• 2.6  Entnahme von Flußsedimentproben, Kultivierung der mikrobiellen Sedimentpopulation und Probenentnahme aus dem Bioreaktor

• 2.7 Präparation der DNA aus den Bioreaktorproben

• 2.8 Analyse der Bioreaktorproben anhand von 16S rDNA-Klonbibliotheken

  • 2.8.1  PCR-Amplifikation der 16S rDNA aus den Bioreaktorproben

  • 2.8.2  Agarosegelelektrophorese der 16S rDNA-Amplifikate

  • 2.8.3  Klonierung der 16S rDNA aus den Bioreaktorproben

  • 2.8.4  Plasmidpräparation

  • 2.8.5  Analyse der 16S rDNA-Klonbibliotheken durch Sequenzierung

  • 2.8.6  Phylogenetische Analyse der 16S rDNA Sequenzen

  • 2.8.7  Analyse der bakteriellen 16S rDNA-Klonbibliotheken durch Dot-Blot- Hybridisierung mit Polynukleotidsonden

  • 2.8.8  Analyse der Archaea-16S rDNA-Klonbibliotheken durch Dot-Blot- Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden

• 2.9  Analyse der Bioreaktorproben mittels Denaturierender Gradientengelelektrophorese (DGGE)

  • 2.9.1  Amplifikation und Trennung der 16S rDNA aus den Bioreaktorproben

  • 2.9.2  Analyse der 16S rDNA-Fragmente ausgewählter DGGE-Banden

• 2.10 Analyse der Bioreaktorproben mittels quantitativer Echtzeit-PCR

• 2.11  Analyse der Bioreaktorproben durch Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH)

  • 2.11.1  Fixierung und Vorbehandlung des Zellmaterials

  • 2.11.2  Hybridisierung der Mikroorganismen mit spezifischen Fluoreszenz-farbstoff-markierten Oligonukleotiden und Färbung mit DAPI

  • 2.11.3  Mikroskopischer Nachweis

3  Ergebnisse

• 3.1 Probenentnahme aus dem Bioreaktor

• 3.2 DNA-Extraktion aus den Bioreaktorproben

• 3.3 Charakterisierung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch Analyse von 16S rDNA-Klonbibliotheken

  • 3.3.1  Anlage der 16S rDNA-Klonbibliotheken

  • 3.3.2  Zusammensetzung und phylogenetische Analyse der Klonbibliothek A

  • 3.3.3  Zusammensetzung und phylogenetische Analyse der Klonbibliotheken B und C

  • 3.3.4  Zusammensetzung und phylogenetische Analyse der Klonbibliothek D

  • 3.3.5  Bestimmung chimärer 16S rDNA-Sequenzen

• 3.4  Charakterisierung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch DGGE

  • 3.4.1  Analyse des DGGE-Gels

  • 3.4.2  Analyse ausgewählter DGGE-Banden

• 3.5  Analyse der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch QE-PCR

• 3.6 Nachweis von Bakterien und Archaea der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch FISH

• 3.7  DCP-Dechlorierung der Bioreaktorpopulation nach Zugabe von Wasserstoff

4  Diskussion

• 4.1 Mikrobielle Diversität der DCP-dechlorierenden Population

  • 4.1.1  Methodischer Ansatz

  • 4.1.2  Einfluß experimenteller Faktoren auf die PCR-vermittelte Diversitätsanalyse

  • 4.1.3  Bakterielle Diversität der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation

  • 4.1.4  Archaeale Diversität der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation

• 4.2 Veränderung der DCP-dechlorierenden Population im Bioreaktor

  • 4.2.1  Untersuchung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation mittels DGGE

  • 4.2.2  Untersuchung der mikrobiellen Diversität der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation anhand von Klonbibliothek D

  • 4.2.3  Quantifizierung Dehalobacter restrictus-ähnlicher 16S rDNA in der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation

  • 4.2.4  Untersuchung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation durch FISH

• 4.3 Rückschlüsse auf den Metabolismus der DCP-dechlorierenden Bioreaktorkultur

• 4.4 Schlußfolgerungen

6 Anhang

Publikationsliste

Tab. 1.1 Chemische und physikalische Eigenschaften von DCP (BUA, 1995).

Tab. 1.2 Beispiele für bakterielle Isolate mit der Fähigkeit zur respiratorischen Dechlorierung.

Tab. 2.1 Zusammenstellung der verwendeten Chemikalien und Hersteller.

Tab. 2.2 Zusammenstellung der verwendeten Puffer, Nährmedien sowie sonstigen Lösungen.

Tab. 2.3 Verwendete Biochemikalien bzw. Kits sowie deren Hersteller.

Tab. 2.4 Verwendete Primer und Oligonukleotidsonden.

Tab. 2.5 Verwendete Kontrollstämme.

Tab. 2.6 PCR-Protokoll für Bacteria-spezifische 16S rDNA-Amplifikation.

Tab. 2.7 PCR-Protokoll für Archaea-spezifische 16S rDNA-Amplifikation.

Tab. 2.8 PCR-Protokoll für universelle (M13) 16S rDNA-Amplifikation.

Tab. 2.9 Amplifikationsprotokoll der 16S rDNA-Sequenzierreaktionen.

Tab. 2.10 PCR-Protokoll zur Herstellung DIG-markierter 16S rDNA-Polynukleotidsonden.

Tab. 2.11 PCR-Protokoll für die DGGE.

Tab. 2.12 Amplifikationsprotokoll der QE-PCR.

Tab. 3.1 Übersicht über die entnommenen Bioreaktorproben und korrespon-dierenden DCP-Konzentrationen. Von den Proben S2 - S6 wurden sowohl PU-Würfel als auch Glasobjektträger entnommen (Probe S1 nur PU-Würfel).

Tab. 3.2 16S rDNA-Sequenzen der SHA-Klone und deren ähnlichste 16S rDNA-Sequenzen in Datenbanken.

Tab. 3.3 Phylogenetische Zuordnung der SHD-Klonfamilien.

Tab. 3.4 Sorenson-Indizes (CS) der Proben S1 - S4 nach DGGE-Analyse.

Tab. 3.5 Quantifizierung bakterieller und Dehalobacter restrictus-ähnlicher 16S rDNA mittels QE-PCR. In Probe S3 wurden die höchsten 16S rDNA-Konzentrationen gemessen (Dehalobacter- und Bacteria-spezifische Primer). Diese Werte repräsentieren jeweils 100%. Auf diese Weise können die Konzentrationsänderungen innerhalb der Proben miteinander verglichen werden.

Tab. 3.6 Zusammenfassung der für die FISH verwendeten Oligonukleotidsonden.

Tab. 4.1 Experimentelle Bedingungen der miteinander verglichenen 16S rDNA-Klonbibliotheken.

Tab. 6.1 Methanaeta concilii-ähnliche Klone und Isolate.

Abb. 1.1 Verbleib des bei der Produktion von Propylenoxid und Epichlorhydrin anfallenden DCPs in Deutschland (BUA, 1995).

Abb. 1.2 Mechanismen der reduktiven Dechlorierung. i) Sequentielle Dechlorierung von PCE(Diekert, 1995), ii) Dehydrodehalogenierung von Lindan (Fetzner, 1998), iii) Dihaloelimination von Hexachlorethan (Criddle et al., 1986).

Abb. 1.3 Übersicht über die bei anaeroben oder fakultativ anaeroben Mikroorganismen beobachteten Strategien zur Dechlorierung chloraliphatischer und chloraromatischer Verbindungen.

Abb. 1.4 Sekundärstruktur der 16S rRNA von E. coli (Garrett und Grisham, 1995).

Abb. 1.5 Auf vergleichender 16S rDNA-Analyse basierender phylogenetischer Baum der bislang bekannten bakteriellen Phyla (schwarz) bzw. Phylum-Cluster (weiß) (Hugenholtz et al., 1998b).

Abb. 1.6 Schematische Darstellung der methodischen Vorgehensweise zur molekularen Analyse der DCP transformierenden Bioreaktorkultur.

Abb. 2.1 Probenentnahmestelle an der Saale in der Nähe von Halle. Die Pfeile kennzeichnen den entsprechenden Flußabschnitt. Die hellgraue Fläche symbolisiert das Betriebsgelände des naheliegenden chemischen Industriestandorts (Buna-Werke).

Abb. 2.2Schematische Darstellung des zur Kultivierung der DCP-transformierenden Mischkultur verwendeten Wirbelschichtreaktors.

Abb. 3.1 Agarosegelelektrophorese von extrahierter Bioreaktor-DNA (5 µL S2-DNA [A] mit 1.5 µL DNA-Marker II [B]). Die DNA des Gelbereichs zwischen den hellen Linien wurde für die 16S rDNA-Amplifikation eluiert.

Abb. 3.2 Verteilung der 75 SHA-Klonfamilien repräsentierenden SHA-Klone innerhalb der bakteriellen Phyla bzw. Phylum-Cluster. Der phylogenetische Baum wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenz von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) wurde als Bezugsgruppe gewählt. Die Summe der Astlängen kennzeichnet die phylogenetische Distanz zwischen den Vertretern der einzelnen bakteriellen Phyla. Die Größe der Fläche eines jeweiligen Astes korrespondiert mit der Anzahl der dargestellten SHA-Klonsequenzen.

Abb. 3.3 Phylogenetische Einordnung von SHA-Klonsequenzen, die neuen bakteriellen Untergruppen bzw. Phylum-Clustern zugeordnet wurden (grau hinterlegt). Bakterielle Phyla werden durch einen Rahmen hervorgehoben. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenzen von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) und Methanosaeta concilii (X16932) wurden als Außengruppe gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungswahrscheinlichkeiten sind durch Prozentangaben dargestellt. Die Baumtopologie wurde durch eine PHYLIP-PARSIMONY-Analyse des gleichen Datensatzes verifiziert. Die Summe der horizontalen Astlängen kennzeichnet die phylogenetische Distanz zwischen den einzelnen 16S rDNA-Sequenzen.

Abb. 3.4 Phylogenetische Einordnung von SHA-Klonsequenzen, die eng mit Wurtsmith- (WCHA-, WCHB-, WsCH- und WFeA-Klone; Doijka et al., 1998) und Trichlorbenzol-Klonsequenzen (SJA-Klone; von Wintzingerode et al., 1999) verwandt sind. Bakterielle Phyla sind durch Rahmen gekennzeichnet. Die spezifischen SHA-Sequenzcluster sind grau hervorgehoben. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenzen von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) und Methanosaeta concilii (X16932) wurden als Außengruppe gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungswahrscheinlichkeiten sind durch Prozentangaben dargestellt. Die Topologie wurde durch eine PHYLIP-PARSIMONY-Analyse des gleichen Datensatzes verifiziert. Die Summe der horizontalen Astlängen kennzeichnet die phylogenetische Distanz zu jeweils anderen 16S rDNA-Sequenzen.

Abb. 3.5 Phylogenetische Zuordnung der SHB- bzw. SHC-Klonsequenzen zu 16S rRNA-Datenbankeinträgen methanogener Archaea. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenz von E. coli wurde als Bezugssequenz gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungs-wahrscheinlichkeiten sind durch die Prozentangaben dargestellt. Die Baumtopologie wurde durch eine PHYLIP-PARSIMONY-Analyse des gleichen Datensatzes verifiziert. Die Astlänge kennzeichnet die phylogenetische Distanz zwischen den einzelnen 16S rDNA-Sequenzen.

Abb. 3.6 Dot-Blot-Hybridisierung rekombinanter Klone der Genbibliotheken B und C mit den Oligonukleotidsonden MCONC und MHOLL. Die Nummern geben den jeweiligen SHB- bzw. SHC-Klon an. Klon SHC-42 enthielt kein archaeales 16S rDNA-Insert (schwarze Pfeile). Das Signal von Klon SHC-91 nach Hybridisierung mit MCONC stellte eine unspezifische Farbreaktion dar (weißer Pfeil).

Abb. 3.7 Dot-Blot-Hybridisierung von 300 SHD-Klonen mit der Dehalobacter restrictus-spezifischen Polynukleotidsonde. Die Nummern geben den jeweiligen SHD-Klon an. Zur Kontrolle wurde die 16S rDNA-Inserts der Klone SHD-2, -10, -11, -15, -17, -25, -49, -212 und -300 sequenziert (Tab. 3.3).

Abb. 3.8 Phylogenetische Einordnung der SHD-Klonsequenzen, die innerhalb der spezifischen SHA-Cluster gruppieren (grau hervorgehoben). Bakterielle Phyla sind durch Rahmen gekennzeichnet. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenzen von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) und Methanosaeta concilii (X16932) wurden als Außengruppe gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungswahrscheinlichkeiten sind durch Prozentangaben dargestellt. Die Baumtopologie wurde durch eine PHYLIP-PARSIMONY-Analyse des gleichen Datensatzes verifiziert. Die Astlänge kennzeichnet die phylogenetische Distanz zwischen den einzelnen 16S rDNA-Sequenzen.

Abb. 3.9 Silber-gefärbtes DGGE-Gel nach Auftrennung amplifizierter 16S rDNA-Fragmente (E. coli-Positionen 968 - 1401) der vier Bioreaktorproben S1 - S4 sowievon Dehalobacter restrictus. Die Banden A und B sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die 16S rDNA der Banden A-S4 und B-S4 wurde aus dem Gel extrahiert, reamplifiziert und anschließend einer Sequenzanalyse unterzogen (siehe 3.4.2). Die Banden innerhalb des schwarzen Rahmens sind anhand ihrer Farbintensität quantifiziert worden (Abb. 3.10).

Abb. 3.10Schematische Darstellung des in Abb. 3.9 mit einem schwarzen Rahmen gekennzeichneten Gelbereichs. Die DGGE-Banden wurden identifiziert und anhand ihrer Farbintensität quantifiziert. Die grau hinterlegten Zahlenwerte (S1 - S4) geben die relative Intensität einer Bande in Bezug zur Gesamtintensität des Probenprofils an (relative Abundanz, rA). Die Graustufe entspricht der jeweiligen Bandenintensität (rA = 0-4: 25% grau; rA = 4.01-8: 50% grau; rA = 8.01-20: 75% grau; rA ≥ 20.01: schwarz). Die Buchstaben A und B kennzeichnen die Bandenprofile, deren 16S rDNA sequenziert wurde (siehe 3.4.2). Der Rf-Wert (relative Mobilität) beschreibt die im Gel zurückgelegte Distanz bezogen zur Startlinie.

Abb. 3.11 Phylogenetische Verwandtschaft der DGGE-Klone (SHE-Klone) zu veröffentlichten 16S rDNA-Sequenzen. Mit [A] und [B] sind die entsprechenden DGGE-Bandenprofile angegeben (siehe Abb. 3.9 bzw. 3.10). Bakterielle Phyla sind durch schwarze Balken gekennzeichnet. Das Dendogramm wurde mit Hilfe der Neighbor-Joining-Methode konstruiert. Die 16S rDNA-Sequenz von Methanomethylovorans hollandica (AF120163) wurde als Außengruppe gewählt. Die Zuverlässigkeit des Verzweigungsmusters wurde durch eine Bootstrapanalyse mit 1000-facher Replikation geprüft. Die Verzweigungswahrscheinlichkeiten sind durch Prozentangaben dargestellt. Die Summe der horizontalen Astlängen repräsentiert die phylogenetische Distanz zwischen den einzelnen 16S rDNA-Sequenzen.

Abb. 3.12 Quantifizierung bakterieller (linker Teil) sowie Dehalobacter restrictus-ähnlicher (rechter Teil) 16S rDNA in den Proben S1 –S4 mittels QE-PCR im LightCycler. Im oberen Teil der Abbildung sind die Reaktionsverläufe (Fluoreszenzemissionen vs. Zahl der PCR-Zyklen) in halblogarithmischer Auftragung dargestellt. Die grüne Linie („Noise-Band“) grenzt verwertbare Meßpunkte von unspezifischer Hintergrundfluoreszenz ab. Aus den Kinetiken der Verdünnungsreihen wurden Kalibriergeraden erstellt, mit deren Hilfe die 16S rDNA-Konzentrationen der Proben ermittelt werden konnten. CP (Crossing Point) bezeichnet den Beginn der exponentiellen Amplifikation.

Abb. 3.13 Elektrophoretische Auftrennung der im LightCycler erzeugten PCR-Produkte im Agarosegel (1%). Linkes Bild: Dehalobacter restrictus-spezifische Primer; rechtes Bild: Bacteria-spezifische Primer.

Abb. 3.14 Mikroskopische Auswertung der FISH sowie der DAPI-Färbung von Probe S2 (Objektträger). Linkes Bild: Sonde ARCH915Cy3, rechtes Bild: DAPI.

Abb. 3.15 Mikroskopische Auswertung der FISH von Probe S5 (PU-Partikel) mit der Sonde ARCH915Cy3. a: Methanomethylovorans-ähnlicher Morphotyp, b: Methanosaeta-ähnlicher Morphotyp.

Abb. 3.16 Mikroskopische Auswertung der FISH von Dehalobacter restrictus mit der Sonde deb179Cy3.

Abb. 3.17 Mikroskopische Auswertung der FISH. Linkes Bild: Probe S3 (PU-Partikel), Sonde MHOLLCy3; rechtes Bild: Probe S6 (PU-Partikel), Sonde MCONCCy3.

Abb. 3.18 Mikroskopische Auswertung der Probe S6 (PU-Partikel) im Phasenkontrast.

Abb. 3.19 Veränderung der mikrobiellen DCP-Transformation im Bioreaktor nach Zugabe von Wasserstoff. Die relativ stark fluktuierende Transformationsrate läßt sich auf die Art der Wasserstoffzugabe zurückführen (Einzeldosierungen).

Abb. 4.1 Modell für den Kohlenstoff- und Energiefluß in der anaeroben DCP-dechlorierenden Bioreaktorkultur (modifiziert nach Maymó-Gatell et al., 1995). Verstärkte Pfeile symbolisieren bevorzugte Umsatzwege.