Material und Methoden

↓36

In den Versuchsjahren 1995 - 1997 wurden insgesamt 10 Silierversuche unter Praxis- und Laborbedingungen sowie begleitende Untersuchungen durchgeführt. In der Praxis wurde mit Hilfe verschiedener Ballenpressen vor allem der Einfluß der Lagerungsdichte auf das Schimmelpilzwachstum untersucht. In Verbindung mit einer gestaffelten Folienlagenzahl wurden unterschiedliche Bedingungen für Lagerungsdichte und äußere Luftabschlußgüte eingestellt und geprüft. Die geprüften Bedingungen wurden in bezug auf andere Silier- und Wickelverfahren als übertragbar angesehen. Im Labor wurden Einflußfaktoren wie der Anwelkgrad untersucht, die bei Silierversuchen in der Praxis nur mit hohem Kostenaufwand variiert werden können.

Zur physikalischen Definition der Gasdurchlässigkeit der in den Praxis- und Laborsilierversuchen angewandten Varianten der Folienlagenzahl wurden radiometrische Langzeitmessungen durchgeführt. Für die Beurteilung der aeroben Stabilität der Silagen wurde eine Meßanordnung zur Erfassung des Temperaturverlaufes erarbeitet und diese Methode mit einem Verfahren zur Messung des Sauerstoffverbrauches verglichen. Zum Toxinbildungsvermögen von in Grassilagen natürlich vorkommenden Penicillium roqueforti - Stämmen wurden mikrobiologische Versuche durchgeführt. Für die chemische Analyse von Ergosterin wurde eine eigene Methode entwickelt. Eine vorhandene Methode zur Bestimmung des Mykotoxins Roquefortin C wurde modifiziert.

3.1  Praxissilierversuche

↓37

Die Praxissilierversuche P 1 bis P 5 wurden auf einer ca. 16 ha großen Grünfutterfläche im Golmer Luch bei Potsdam durchgeführt, die vom ortsansässigen Landwirtschaftsbetrieb vor allem für die Heuwerbung genutzt wird. Der in einem Niedermoorgebiet liegende und auch im Sommer relativ feuchte Standort erlaubt jährlich bis zu 3 Aufwüchse. Düngungsmaßnahmen werden wegen Ausgleichszahlungen nicht durchgeführt. Der Standort war wegen Vernässung jedes Jahr erst ab Anfang Juni mit Siliertechnik befahrbar. Um beim jahreszeitlichen Siliertermin von Extremen auszugehen, wurde der jährlich 1. Silierversuch Mitte / Ende Juni und der 2. Silierversuch Ende September / Anfang Oktober durchgeführt. Im Jahr 1995 fand technisch bedingt nur ein Silierversuch statt.

Ausgangsmaterial:

Als Siliergut wurde das Mähgut des 1. und des 3. Aufwuchses verwendet. Der jeweils 2. Aufwuchs diente dem Landwirtschaftsbetrieb für die Heuwerbung. Wesentliche Angaben zu Ernte, Pflanzenbestand und Parameter des Siliergutes sind in Tab. 1 dargestellt.

↓38

Die Aufwüchse bestanden überwiegend aus einem Gemisch von etwa 60 % Gräsern (u.a. Wiesenlieschgras, Ausdauerndes Weidelgras, Knaulgras, Wiesenfuchsschwanz) und 40 % Klee und Kräutern (u.a. Rot- und Weißklee, Löwenzahn, Brennesseln, Distel- und Wickenarten). Der Futterwert der Aufwüchse wird durch den ortsansässigen Landwirtschaftsbetrieb als befriedigend und insbesondere für die Nutzung in der Mutterkuhhaltung als ausreichend eingeschätzt.

Das Grünfutter wurde mit einem Rotationsmähwerk mit Nachzerkleinerer (KRONE) gemäht und innerhalb der Versuchsserie zeitlich verschieden lang angewelkt. Sowohl bei den 1. Aufwüchsen als auch bei den 3. Aufwüchsen wurde mindestens einmal 24 h (Welkgrad W 1) und einmal 48 h (W 2) angewelkt. Dies diente der Gewinnung unterschiedlicher Welkgrade in Abhängigkeit vom jahreszeitlichen Siliertermin. In Versuch P 1 wurde 72 h angewelkt und ein relativ hoher Welkgrad (W 3) erzeugt. Während des Welkens wurde das Grünfutter 2x am Tag gewendet und über Nacht sowie vor dem Einsilieren in Schwade gelegt. Die Schwade wurden bei der Einsilierung von den Ballenpressen direkt aufgenommen. Bei allen Arbeitsgängen wurde aufgrund von Bodenunebenheiten und Maulwurfshügeln ein mehr oder minder starker Erdeintrag in das Siliergut beobachtet.

↓39

Tab. 1: Ernte, Pflanzenbestand, Siliergutparameter und Varianten bei den Praxissilierversuchen

Ernte und Pflanzenbestand /

Parameter des Siliergutes /

Versuchsvarianten / n

1. AW 1995

1. AW 1996

3. AW 1996

1. AW 1997

3. AW 1997

P 1

P 2

P 3

P 4

P 5

Erntetermin: Dekade/ Monat

2. / Juni

2. / Juni

1. / Oktober

3. / Juni

3. / Sept.

Schnittzeitpunkt

mittelspät

mittelspät

spät

spät

spät

Bestandeshöhe (cm)

60-70

60-70

40-50

70-80

50-60

Vegetationsstadium

Beginn / Mitte Blüte

Beginn / Mitte Blüte

über 6 Wo. nach 1. AW

Ende Blüte

über 6 Wo. nach 1. AW

Trockenmassegehalt (g/kg)

636,8

472,2

321,5

374,3

538,0

Rohasche (g/kg T)

73,8

107,7

118,7

74,0

127,1

Rohprotein (g/kg T)

119,7

146,7

146,9

106,2

129,7

Rohfaser (g/kg T)

271,4

267,0

259,0

297,4

241,9

WLKH (g/kg T)

140,9

135,0

64,6

73,2

119,9

Pufferkapazität (g MS/kg T)

52,2

49,2

55,1

33,6

41,3

WLKH/PK

VK

2,7

85

2,7

69

1,2

42

2,2

55

2,9

77

Nitrat (g/kg T)

0,10

n.n.

0,41

n.n.

n.n.

Ergosterin (mg/kg T)

10,7

24,1

54,0

21,0

36,0

PK-Z (KBElg /g FM)

6,23

6,57

7,34

6,85

7,18

MSB-Z (KBElg /g FM)

3,87

4,41

3,43

3,00

3,15

Anwelkgrad (Anwelkdauer)

W 3 (72 h)

W 2 (48 h)

W 1 (24 h)

W 1 (24 h)

W 2 (48 h)

Preß- bzw. Lagerungsdichte

C / R

C / R

C / R

C / R / RS1)

C / R / RS1)

Anzahl der Folienlagen

2 / 4 / 6

2 / 4 / 6 / 8

22) / 4 / 6 / 8

2 / 4 / 6 / 8

2 / 4 / 6 / 8

Lagerungsdauer in Monaten

4

2 / 6

2 / 6

2 / 3 / 4 / 5

2 / 32) / 4

Ballen je Versuch / Variante

12 / 2

32 / 2

23 / 1-2

60 / 1-2

38 / 1-2

1) - kürzere Häcksellänge; 2) - Wegen geringen Futterertrages wurden in dieser Variante keine „R“-Silageballen hergestellt.

Einsilierung:

Abhängig vom Grünfutterertrag wurden bei den Versuchen je Variante 1-2 Silageballen hergestellt. Die Varianten und die Anzahl der je Versuch hergestellten Silageballen sind in Tab. 1 angegeben. Mit unterschiedlichen Pressen-Bauarten wurde das Ballen-Silierverfahren in Kombination mit dem Einzelballen-Wickelverfahren angewandt. Zur Erzeugung einer unterschiedlichen Lagerungsdichte bei den Silageballen (Dichte-Varianten bzw. Ballentypen C und R) wurden eine hochverdichtende Compactrollenpresse (Abb. 3: Technologiestudie CRP 1000, LELY-WELGER / KRONE) und eine praxisübliche Rundballenpresse mit konstantem Preßkammervolumen (RP 200, LELY-WELGER) eingesetzt. Beide Pressen verfügten über eine Vorschneideinrichtung. Die hergestellten Ballen wiesen in der Länge etwa gleiche Abmessungen auf (ca. 1,2 m). Im Durchmesser waren technisch bedingt Unterschiede zwischen Compactrollen (ca. 1,0 m) und Rundballen (ca. 1,2 m) feststellbar.

↓40

In den Versuchen P 4 und P 5 (1997) stand zusätzlich eine zweite Rundballenpresse (RP 220, LELY-WELGER) zur Verfügung. Beide Rundballenpressen waren im wesentlichen bauartgleich, die zweite Rundballenpresse verfügte aber über eine verbesserte Vorschneideinrichtung. Der Messerblock dieser Vorschneideinrichtung war mit der etwa zehnfachen Anzahl Schneidmesser wie der Messerblock der ersten Rundballenpresse ausgerüstet. Durch die intensivere Zerkleinerung des Siliergutes wurde im Vergleich zu den Ballentypen R und C in den erzeugten Silageballen (RS) eine andere Häcksellängenverteilung erzeugt. Die konkrete Häcksellängenverteilung (P 4 und P 5) ist in Tab. A 2 dargestellt. Der wesentlichste Unterschied bestand hinsichtlich der Masseanteile im

Abb. 3: Grassilagebereitung mit einer hochverdichtenden Compactrollenpresse

Häcksellängen-Bereich ≤ 100 mm. Während bei den Ballentypen R und C in dieser Größenfraktion nur jeweils ca. 15 % der Masseanteile vorlagen, waren es bei dem Ballentyp RS fast 50 %. Bei der Ballenherstellung mit den Pressen wurde grundsätzlich vom jeweiligen Stand der Technik ausgegangen und im Interesse hoher Verdichtung die kleinsten erreichbaren Häcksellängen angestrebt. Bei den praxisüblich hergestellten Rundballen (R) wurde überwiegend eine T-Dichte im Bereich von 170-200 kg T/m³ in den Silagen erreicht. Von den mit verbesserter Vorschneideinrichtung erzeugten Rundballen (RS) waren weit mehr als die Hälfte der Silagen etwa 10-15 % höher verdichtet. Die erreichte T-Dichte lag bei 50 % dieser Rundballen (RS) über 210 kg T/m³. Bei den Compactrollen (C) wurde in etwa 75 % der Silagen eine T-Dichte von mehr als 290 kg T/m³ erreicht. Die in den Ballensilagen erzeugte T-Dichte wird zusammenfassend im Anhang in Tab. A 1 dargestellt.

↓41

Alle Silageballen wurden bei jedem Versuch am selben Tag gepreßt und binnen 1-3 Stunden nach Herstellung in unmittelbarer Nähe des vorgesehenen Lagerplatzes mit Hilfe eines Folienwickelgerätes (FG 6, LELY-WELGER) eingewickelt. In den Versuchen wurde stets die Preßballenstretchfolie AGRI-STRETCH: weiß / 500 mm breit / 0,025 mm stark (UNTERLAND) verwendet. Das Wickeln erfolgte mit ca. 55 % Vorstreckung und 50 % Überlappung. Die verschiedenen Stufen der äußeren Luftabschlußgüte wurden durch das Umwickeln mit 2-8 Folienlagen erzeugt. Die Lagerung der Si-lagen erfolgte im Freien. Hierbei wurde ein Vogelschutznetz verwendet. Die Lagerungsdauer wurde außer bei Versuch P 1 gestaffelt. Zu den vorgesehenen Auslagerungsterminen wurden die Silagen versuchstechnisch bedingt nicht an einem Tag sondern innerhalb von 3–5 Tagen ausgelagert.

Bestimmung von Gärverlust und Lagerungsdichte:

Am Siliertag wurde jeder Silageballen vor dem Einwickeln auf Durchmesser und Länge hin vermessen. Nach dem Einwickeln wurden die Ballen durch einen Mobilkran mit Hilfe von Schwerlast-Hebebändern einzeln angehoben und mit einer geeichten, digitalen Anhängewaage (TRACTEL) gewogen. Am Tag der Auslagerung wurde vor dem Entfernen der Folie ebenfalls eine Wägung durchgeführt. Unter Berücksichtigung des Foliengewichtes wurde der jeweilige Gärverlust der Silageballen als Gewichtsverlust ermittelt. Eine Korrektur auf gelöstes Kohlendioxid wurde wegen der relativ groben Genauigkeit der Waage von ± 0,5 kg nicht durchgeführt.

↓42

Die jeweilige Lagerungsdichte der Ballen wurde als Trockenmasse-Lagerungsdichte aus dem Gewicht (ohne Folie) und den Abmessungen am Tag der Einsilierung sowie dem Trockenmassegehalt im Ausgangsmaterial berechnet. Bei ausgewählten Silageballen wurde die Lagerungsdichte auch nach einer radiometrischen Methode ermittelt [GLÄSER und FUCHS, 1993; FÜRLL et al., 1996].

Probenahme bei Ausgangsmaterial und Ballensilagen:

Für die Probenahme vom Ausgangsmaterial wurde unmittelbar vor der Einsilierung in diagonaler Richtung quer über den Schlag von jedem Siliergut-Schwad eine Probe von ca. 300 g FM genommen. Die Proben wurden zu einer Mischprobe zusammengefaßt und homogenisiert, insgesamt 3-4 kg. Diese Probenahme wurde bis zum Versuchsabschluß im Intervall von 1,5 h wiederholt. Alle Mischproben wurden einzeln weiter aufgearbeitet.

↓43

Zur Beprobung der Silagen (Abb. 4) wurde jeder Ballen nach Entfernen der Folie visuell begutachtet und anschließend mit einem Ballenschneidmesser (BUSATIS) in Längsrichtung von oben nach unten etwa 10-15 cm tief eingeschnitten. Die Randschicht (etwa 5-10 cm stark) wurde nach außen geklappt und ausgebreitet abgelegt. Nach der Sinnenprüfung wurde diese Silageschicht und die beiden Enden des walzenförmigen Ballens für die Gewinnung einer repräsentativen „Rand“-Probe gleichmäßig beprobt. Anschließend wurde der restliche Ballen vollständig durchgeschnitten, auseinander geklappt und der Kernbereich (etwa 35-40 cm vom Ballenrand entfernt) nach der Sinnenprüfung für eine repräsentative „Kern“-Probe gleichmäßig beprobt. Der Übergangsbereich zwischen den Probenahmezonen „Rand“ und „Kern“ wurde als Pufferzone angesehen und nicht beprobt. Bei der Probenahme wurde die Verschimmelung der Silagen sensorisch beurteilt (muffiger Geruch, visuell sichtbarer Schimmelbefall). Die Einschätzung des prozentualen Anteils verschimmelter an der insgesamt vorhandenen Silage wurde dabei auf die gesamte Probenahmezone des jeweiligen Silageballens bezogen. Die gleichmäßige Beprobung bedingte, daß bei Vorhandensein von Schimmel in den Probenahmezonen auch anteilig verschimmelte Silage in die jeweilige Sammelprobe gelangte. Bei den einzelnen Sammelproben wurde nach der Probenahme keine Klassifizierung hinsichtlich Schimmelbefall mehr vorgenommen. Beide Sammelproben eines Ballens (jeweils ca. 4,5 kg FM) wurden getrennt durch Mischen homogenisiert und einzeln weiter bearbeitet. Das für die chemische Analytik bestimmte Probenmaterial wurde bis zur Verarbeitung bei –18°C in Plastikbeuteln gelagert. Die mikrobielle Analytik und die Beurteilung der aeroben Stabilität der Silagen wurde unmittelbar im Anschluß an die Probenahme mit frischem Probenmaterial durchgeführt.

Abb. 4: Auslagerung der Silageballen mit einem Ballenschneidmesser

In den Ausgangsmaterialien wurden Trockenmassegehalt, Rohnährstoffe (Rohasche-, Rohprotein-, Rohfasergehalt), Parameter der Vergärbarkeit (Gehalt an wasserlöslichen Kohlenhydraten, Pufferkapazität), Nitrat- und Ergosteringehalt sowie mikrobieller Status (Keimzahl von Pilzen, Milchsäurebakterien und Listerien) analysiert. Die Silagen wurden sensorisch beurteilt und neben der Analyse auf Trockenmassegehalt, Rohnährstoffe und mikrobiellen Status vor allem bezüglich Konservierungserfolg (pH-Wert, Gehalt an Milchsäure und flüchtigen Fettsäuren, Alkohol- und Ammoniakgehalt), Dauer der aeroben Stabilität sowie Gehalt an Roquefortin C und Ergosterin hin untersucht.

3.2 Laborsilierversuche

↓44

Die Laborsilierversuche L 1 bis L 5 wurden im Institut für Agrartechnik Bornim e.V. durchgeführt. Der jährlich 1. Silierversuch wurde Ende Juli und der 2. Silierversuch Mitte / Ende September durchgeführt. Im Jahr 1995 fand technisch bedingt nur ein Silierversuch statt. In den Versuchen wurden mehrere Stufen des Anwelkgrades geprüft. Hierbei sollten Praxisbedingungen durch Schadbelastungen des Siliergutes und Witterungseinflüsse durch kontrollierte Luftdruckschwankungen in Laborsilos simuliert werden. Die Wirksamkeit von Silierzusätzen sowie qualitative Veränderungen bei Luftzutritt von der Oberfläche aus wurden in Versuch L 1 mit Faßsilos untersucht. Um den Einfluß von Anwelkgrad und Folienlagenzahl auf das Pilzwachstum unter definierten Bedingungen zu prüfen, wurde für die Versuche L 2 bis L 5 eine Silieranlage mit Laborsilos errichtet.

Silieranlage:

Für die Silieranlage wurden insgesamt 30 zylindrische Laborsilos aus Plexiglas (Wandung: 10 mm) mit einem Volumen von jeweils 5 l angefertigt. Der Aufbau eines Laborsilos ist in Abb. 5 dargestellt.

↓45

Abb. 5: Schematische Darstellung eines zylindrischen Laborsilos für die Versuche L 2 bis L 5

In den ringförmigen Spezialdeckel wurden je nach Variante der äußeren Luftabschlußgüte 2 bis 8 übereinandergelegte Folien eingelegt und am Außenrand mit einem Spannring gasdicht verschlossen. Es wurde stets dieselbe Stretchfolie wie in den Praxissilierversuchen verwendet. Durch geringe Innendruckschwankungen in den Laborsilos bzw. die Verstärkung der natürlichen Luftdruckschwankungen sollten Witterungseinflüsse (Wind / atmosphärische Luftdruckschwankungen) auf den Gasaustausch durch die Folienabdeckung bei der Silagelagerung im Freien simuliert werden. Hierzu wurde jedes Laborsilo mit Hilfe eines Schlauchanschlusses im Silodeckel über einen Poly-ethylenschlauch (10 mm Ø, 15 cm Länge) an ein Zweiweg-Magnetventil angeschlossen. An den Magnetventilen wurde über ein kontrolliertes Vakuumsystem (BÜCHI) ein geringer Unterdruck von konstant -20 mbar Druckdifferenz zum jeweils vorliegenden atmosphärischen Luftdruck angelegt. Die Differenz von -20 mbar entsprach den täglichen atmosphärischen Luftdruckschwankungen, die bei den Messungen zur Gasdurchlässigkeit von Stretchfolie beobachtet wurden (siehe Kap. 3.3.1). Die Magnetventile wurden mit Hilfe einer automatischen Steuerung kurzzeitig (10 s) und zeitlich gestaffelt (12x/Tag) geöffnet. In den Silos wurde dabei zwischen Futteroberfläche und Folienmembran Gas abgesaugt und der im Vakuumsystem herrschende Unterdruck eingestellt. Der induzierte Unterdruck im Silo sollte sich infolge Luftdiffusion durch die Folienlagen von selbst wieder ausgleichen, wenn kein Gas abgesaugt wurde. Der atmosphärische Luftdruck wurde parallel zu den Versuchen fortlaufend gemessen und aufgezeichnet.

Ausgangsmaterial:

↓46

Als Ausgangsmaterial wurde das Mähgut des 2. und 3. Aufwuchses verwendet. Der jeweils 1. Aufwuchs wurde versuchstechnisch bedingt nicht einsiliert. Wesentliche Angaben zu Ernte, Pflanzenbestand und Siliergutparametern sind in Tab. 2 ersichtlich. Die in Tab. 2 bei jedem Versuch jeweils 2 - 3 Angaben zu den einzelnen Siliergutparametern stehen für die einzelnen Stufen des Welkgrades (von oben nach unten: z.B. W 0 → W 1 → W 2). Das Siliergut für die Versuche L 1 bis L 3 wurde auf dem auch für die Praxissilierversuche genutzten Standort gewonnen. Das Grünfutter wurde mit einem Mäh- und Häckselwerk (KEMPER) gemäht und auf eine theoretische Häcksellänge von 30 mm geschnitten. In den Versuchen L 2 und L 3 wurde bei natürlich vorhandenen Boden-unebenheiten und Maulwurfshügeln eine Schnitthöhe von 40-60 mm gewählt. Hierdurch sollte der in den Praxissilierversuchen beobachtete Erdeintrag in das Siliergut nachvollzogen bzw. praxisübliche Schadbelastungen simuliert werden. Das Siliergut für die Versuche L 4 und L 5 wurde auf der Versuchsfläche für ökologischen Landbau der Versuchsstation Blumberg der Landwirtschaftlich-Gärtnerischen Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin gewonnen. Das Grünfutter, ein Kleegrasgemisch mit 50-60 % Kleeanteil (u.a. Ausdauerndes Weidelgras, Knaulgras, Rot- und Weißklee), wurde mit einem Anbau-Mähbalken gemäht und danach mit einem stationären Probenhäcksler auf eine theoretische Häcksellänge von 10 mm geschnitten.

Das Grünfutter wurde bei allen Versuchen homogenisiert und regengeschützt ausgebreitet. Die Variante mit dem Welkgrad W 0 (frisch bzw. nicht angewelkt) wurde sofort einsiliert. Für die Erzeugung der unterschiedlichen Welkgrade W 1 und W 2 wurde das Siliergut 24 h bzw. 48 h angewelkt.

Tab. 2: Ernte, Pflanzenbestand und Siliergutparameter bei den Laborsilierversuchen

Ernte und Pflanzenbestand / Anwelkgrad /
Parameter des Siliergutes

2. AW 1995

2. AW 1996

3. AW 1996

2. AW 1997

3. AW 1997

L 1

L 2

L 3

L 4

L 5

Erntetermin: Dekade/ Monat

3. / Juli

3. / Juli

3. / Sept.

3. / Juli

2. / Sept.

Schnittzeitpunkt

mittelspät

mittel

spät

mittel

spät

Bestandeshöhe (cm)

50-60

50-60

40-50

70-80

50-60

Vegetationsstadium

4-6 Wochen nach 1. AW

4-6 Wochen nach 1. AW

über 6 Wo. nach 1. AW

4-6 Wochen nach 1. AW

über 6 Wo. nach 1. AW

Anwelkgrad (Anwelkdauer)

W 0 ( 0 h) W 1 (24 h)

W 1 (24 h) W 2 (48 h)

W 0 ( 0 h) W 1 (24 h) W 2 (48 h)

W 0 ( 0 h) W 1 (24 h) W 2 (48 h)

W 0 ( 0 h) W 1 (24 h) W 2 (48 h)

Trockenmassegehalt (g/kg)

W 0: 186,0 W 1: 294,0

W 1: 298,5 W 2: 382,0

W 0: 309,5 W 1: 386,2 W 2: 503,3

W 0: 238,2 W 1: 309,5 W 2: 358,3

W 0: 366,4 W 1: 527,7 W 2: 606,2

Rohasche (g/kg T)

W 0: 70,8 W 1: 78,9

W 1: 143,9 W 2: 151,5

W 0: 184,0 W 1: 177,0 W 2: 173,0

W 0: 96,7 W 1: 93,6 W 2: 97,9

W 0: 108,1 W 1: 108,9 W 2: 108,9

Rohprotein (g/kg T)

W 0: 126,0 W 1: 124,0

W 1: 212,7 W 2: 212,0

W 0: 241,3 W 1: 238,1 W 2: 235,6

W 0: 198,4 W 1: 186,6 W 2: 184,2

W 0: 183,1 W 1: 188,6 W 2: 182,3

Rohfaser (g/kg T)

W 0: 277,2 W 1: 260,3

W 1: 224,0 W 2: 231,4

W 0: 218,2 W 1: 229,4 W 2: 221,8

W 0: 246,2 W 1: 246,8 W 2: 238,7

W 0: 204,6 W 1: 207,7 W 2: 203,4

WLKH (g/kg T)

W 0: 62,3 W 1: 79,9

W 1: 27,2 W 2: 20,1

W 0: 29,1 W 1: 19,8 W 2: 42,0

W 0: 33,5 W 1: 26,2 W 2: 30,0

W 0: 34,1 W 1: 22,0 W 2: 19,4

Pufferkapazität (g MS/kg T)

W 0: 44,4 W 1: 45,9

W 1: 74,4 W 2: 71,0

W 0: 73,2 W 1: 75,2 W 2: 74,0

W 0: 80,9 W 1: 85,9 W 2: 89,8

W 0: 81,9 W 1: 81,1 W 2: 85,7

WLKH/PK
– Quotient

Vergär-
barkeits-
koeffizient

1,4 1,7

30 43

0,4 0,3

33 40

0,4 0,3 0,6

34 41 55

0,4 0,3 0,3

27 33 38

0,4 0,3 0,2

40 55 61

Nitrat (g/kg T)

W 0: 1,10 W 1: 0,64

W 1: 0,27 W 2: 0,33

W 0: 0,40 W 1: 0,38 W 2: 0,65

W 0: 0,16 W 1: 0,21 W 2: 0,22

W 0: 0,29 W 1: 0,24 W 2: 0,18

Ergosterin (mg/kg T)

W 0: 13,0 W 1: 8,1

W 1: 55,3 W 2: 108,3

W 0: 22,1 W 1: 63,0 W 2: 116,1

W 0: 12,9 W 1: 17,6 W 2: 15,7

W 0: 32,4 W 1: 50,6 W 2: 54,2

PK-Z (KBElg /g FM)

W 0: 6,15 W 1: 6,95

W 1: 7,40 W 2: 8,32

W 0: 6,51 W 1: 7,45 W 2: 8,73

W 0: 7,08 W 1: 7,53 W 2: 7,20

W 0: 7,30 W 1: 7,00 W 2: 7,61

MSB-Z (KBElg /g FM)

W 0: 7,08 W 1: 7,60

W 1: 8,15 W 2: 8,08

W 0: 4,15 W 1: 6,64 W 2: 7,00

W 0: 8,30 W 1: 8,58 W 2: 8,38

W 0: 6,15 W 1: 6,20 W 2: 7,00

(L 1: Faßsilos, L 2 bis L 5: Laborsilos)

↓47

Einsilierung:

In die Faß- bzw. Laborsilos wurden jeweils konstante FM-Mengen einsiliert. Infolge der verschiedenen Anwelkgrade des Siliergutes wurde dadurch in den Silagen eine unterschiedliche T-Dichte (unterschiedliches Porenvolumen) erzeugt. Die Versuchsvarianten sind in Tab. 3 dargestellt.

Im Versuch L 1 wurden jeweils 60 kg FM in jedes Faßsilo (100l-Plastikfässer) eingelagert und durch Feststampfen verdichtet. In den Varianten mit Silierzusätzen wurde der jeweilige Zusatz unmittelbar vorher in das gesamte zu silierende Material eingemischt. Die Aufwandmenge bei Propionsäure (BASF) betrug 5 kg/t FM. Bei dem Milchsäurebakterienzusatz (Stamm 8+14, ATB) wurde eine gleichmäßige theoretische Impfdichte von je 100000 KBE/g FM angestrebt. Der Milchsäurebakterienzusatz stand technisch bedingt nur für das frisch einsilierte Grünfutter (W 0) zur Verfügung. Die Faßsilos wurden durch je 6 Folienlagen bzw. den Original-Plastikdeckel mit Hilfe eines Spannringes verschlossen und genau drei Monate regengeschützt im Freien stehend gelagert.

↓48

In den Versuchen L 2 bis L 5 wurden in die Plexiglas-Laborsilos jeweils 2 kg FM eingelagert und durch festdrücken verdichtet. In der oberen Welkstufe von Versuch L 5 wurden wegen schwerer Verdichtbarkeit des Siliergutes nur je 1,5 kg FM in die Laborsilos eingelagert. Die verschiedenen Stufen der äußeren Luftabschlußgüte wurden durch unterschiedliche Folienlagenzahlen im Silodeckel hergestellt, wobei jeder Anwelkgrad mit jeder Folienlagenzahl kombiniert wurde. Im Versuch L 3 wurden für die Varianten mit natürlichen Luftdruckschwankungen technisch bedingt 2 l-Labor-silos (WECK®) verwendet. In jedes 2 l-Laborsilo wurden je 0,8 kg FM einsiliert. Als weitere Stufe des Luftabschlusses wurde hier eine Variante mit Deckelverschluß angelegt. In den Versuchen L 4 und L 5 wurden zur Simulation von Schadbelastungen unmittelbar vor der Einsilierung in das Aus-

Tab. 3: Varianten der Laborsilierversuche (L 1: Faßsilos, L 2 bis L 5: Laborsilos)

Versuchsvarianten

2. AW 1995

2. AW 1996

3. AW 1996

2. AW 1997

3. AW 1997

L 1

L 2

L 3

L 4

L 5

Anwelkgrad

W 0 / W 1

W 1 / W 2

W 0 / W 1 / W 2

W 0 / W 1 / W 2

W 0 / W 1 / W 25)

Anzahl der Folienlagen

6 / D1),2)

2 / 6

2 / 5 / 8 / D1),3)

2 / 5 / 8

2 / 4 / 6 / 8

Lagerungsdauer in Monaten

3

1

1

1

1

Silierzusatz

ohne / PS / MSB4)

ohne

ohne

ohne

ohne

Simulierung von Schad-
belastungen

ohne

Erdeintrag

Erdeintrag

ohne / mit Beimpfung

ohne / mit Beimpfung

Luftdruckschwankungen

natürlich

verstärkt / natürlich

verstärkt / natürlich

verstärkt

verstärkt

Siloanzahl je Variante

2

3-4

3

1-2

1-2

1)– mit Deckelverschluß; 2)– kein Silierzusatz; 3)– nur natürliche Luftdruckschwankungen; 4)– nur bei Anwelkgrad W 0 geprüft; 5) – versuchstechnisch bedingt geringere Silierguteinwaage (1,5 kg FM) bzw. FM-Dichte in den Laborsilos dieser Welkstufe

↓49

gangsmaterial der entsprechenden Varianten Schimmelpilzsporen eingebracht. Hierfür wurde das Siliergut einzeln für jedes beimpfte Laborsilo mit einer Penicillium roqueforti - Sporensuspension inokuliert (Angaben zur Herstellung in Kap. 3.3.2). Hierbei wurde in jedem beimpften Laborsilo eine gleichmäßige theoretische Impfdichte von etwa 10000 Schimmelpilz-KBE/g FM (5000 KBE/g FM Penicillium roqueforti DSM 11484 + 5000 KBE/g FM Penicillium roqueforti DSM 11485) angestrebt.

Die Laborsilos wurden abgedunkelt bei 25°C gelagert. Die Lagerungsdauer betrug in den Silierversuchen L 2 bis L 5 jeweils genau einen Monat.

Bestimmung von Gärverlust und Lagerungsdichte:

↓50

Unter Berücksichtigung des Gewichtes der einzelnen Faß- und Laborsilos wurde der jeweilige Gärverlust der Silagen als Gewichtsverlust zwischen Silierguteinwaage und Silageauswaage ermittelt. Eine Korrektur auf gelöstes Kohlendioxid wurde wegen der allgemein sehr geringen Differenzen von 1-4 % Gärverlust nicht durchgeführt. Die Lagerungsdichte der Silagen wurde als Trocken-masse-Lagerungsdichte aus der Silierguteinwaage und dem Trockenmassegehalt im jeweiligen Ausgangsmaterial unter Berücksichtigung des Volumens der Faß- bzw. Laborsilos berechnet.

Probenahme bei Ausgangsmaterial und Silagen:

Für die Probenahme vom Ausgangsmaterial wurde unmittelbar vor der Einsilierung der einzelnen Varianten des Anwelkgrades vom frischen (W 0) bzw. gewelkten (W 1 und W 2) Siliergut eine repräsentative Probe von jeweils ca. 2 kg FM genommen, homogenisiert und aufgearbeitet.

↓51

Für die Beprobung der Silagen im Versuch L 1 wurde von jedem Faßsilo die optisch verschimmelte (obere) Schicht abgenommen und als Randschicht betrachtet. Die optisch unverschimmelte (untere) Schicht wurde als Kernschicht angesehen. Die einzelnen Schichten wurden einheitlich beprobt und die Proben durch Mischen homogenisiert. Die „Rand“- und „Kern“-Probe (je ca. 2 kg FM) wurden getrennt weiter bearbeitet. In den Varianten mit Deckelverschluß wurde optisch generell kein Schimmelbefall festgestellt, weshalb eine Unterteilung in Rand und Kern nicht vorgenommen wurde. In den Versuchen L 2 bis L 5 mit Laborsilos wurde jedes Silo vollständig entleert. Der Inhalt der Silos einer Variante wurde miteinander vermischt und eine Probe von je ca. 3,5 kg FM genommen.

Die Verschimmelung der Silagen wurde sensorisch beurteilt. Die prozentuale Einschätzung des Anteils verschimmelter Silage wurde auf den gesamten Inhalt eines Silos bezogen. Bei den einzelnen Proben wurde hinterher keine Klassifizierung hinsichtlich Schimmelbefall mehr vorgenommen. Das für die chemische Analytik bestimmte Probenmaterial wurde bis zur Verarbeitung bei -18°C in Plastikbeuteln gelagert. Die mikrobielle Analytik und die Beurteilung der aeroben Stabilität der Silagen wurde unmittelbar im Anschluß an die Probenahme mit frischem Probenmaterial durchgeführt. Ebenso wie in den Praxissilierversuchen wurden in den Ausgangsmaterialien Trockenmassegehalt, Rohnährstoffe, Parameter der Vergärbarkeit, Nitrat- und Ergosteringehalt sowie mikrobieller Status analysiert. Die Silagen wurden sensorisch beurteilt und neben der Analyse auf Trockenmassegehalt, Rohnährstoffe und mikrobiellen Status vor allem bezüglich Konservierungserfolg, Dauer der aeroben Stabilität sowie Gehalt an Roquefortin C und Ergosterin hin untersucht.

3.3 Begleitende Untersuchungen

3.3.1  Gasdurchlässigkeit der verwendeten Silierstretchfolie

Die Versuche wurden im Institut für Agrartechnik Bornim e.V. bei Einhaltung der geltenden Sicherheitsvorschriften für Arbeiten mit radioaktiven Stoffen und im Beisein des zuständigen Kernstrahlungsbeauftragten durchgeführt. Die Gasdurchlässigkeit der in den Praxis- und Laborsilierversuchen verwendeten Preßballen-Silierstretchfolie wurde bei 18-20°C Raumtemperatur nach einer radiometrischen Methode ermittelt [RETTIG und KLICH, 1986; GLÄSER und FUCHS, 1993].

↓52

Der für die Messungen verwendete Kernstrahlungsmeßplatz wurde mit folgenden Spezialgeräten aufgebaut: Linearverstärker-Analysator VA-V-100 (RFT), Halogenzählrohr VA-Z-118 mit Zählrohrsonde 72013 (RFT), 10 MHz-Impulszähler VA-G-120 mit Ergebnisdrucker VA-G-24 A (RFT).

Als Tracer wurde das chemisch inerte, radioaktive Edelgasnuklid 85Krypton verwendet. Der Moleküldurchmesser von Krypton ist mit 32x10-8 mm in derselben Größenordnung wie der von Kohlendioxid (32x10-8 mm), Sauerstoff (O2) (29x10-8 mm) und Stickstoff (N2) (31x10-8 mm).

Versuchsdurchführung:

↓53

In den ringförmigen Deckelrand eines zylindrischen Stahlbehälters (10 mm stark) wurden 8 Fo-lienlagen übereinander eingelegt und am Außenrand durch einen Spannring gasdicht verschlossen (Abb. 4). Der Detektor (Halogenzählrohr mit Zählrohrsonde) wurde durch eine Seitenwandbohrung in den Behälter eingelassen und die Bohrung gasdicht mit Epoxydharz vergossen. Mit einer Injek-tionsspritze wurden 2x je 10 ml 85Krypton (ca. 70 kBq) über einen gasdicht verschließbaren Stutzen zugeführt. Nach jeder Injektion wurde mit der Spritze ein dreimaliges „Nachpumpen“ durchgeführt, um den Tracer gleichmäßig zu verteilen. Die Konzentrationsänderung von 85Krypton wurde kontinuierlich im Abstand von 2,0 Stunden über die Änderung der Impulszählrate erfaßt. Die eingesetzte Aktivität je Versuch betrug ca. 150 kBq mit einer Ausgangszählrate von ca. 8000 Impulse/min.

Abb. 6: Stahlbehälter zur radiometrischen Messung der Gasdurchlässigkeit von Stretchfolie

Die Versuchsdauer je Variante der Folienlagenzahl (1 F - 8 F) betrug abhängig vom Gasaustausch 3-4 Wochen. Danach wurde eine Folienlage entfernt und der nächste Versuch durchgeführt. Zur Prüfung der Dichtheit des Behälters und als Kontrolle wurde vor und nach den Versuchen mit Folie die Gasdurchlässigkeit einer in den Deckel eingelegten 5 mm starken Stahlplatte gemessen. Die Konstanz der Meßanordnung wurde durch Kalibrierung mit einer 137Cäsium-Prüfquelle kontrolliert.

↓54

Die Gasdurchlässigkeit bei der jeweiligen Folienlagenzahl wurde nach folgender Formel berechnet:

D = physikalischer Gasaustausch bzw. Gasdurchlässigkeit (l/m² in 24 h)

↓55

c = Konzentration des Tracers: c0 – zu Beginn der Messung; ct – am Ende der Messung

t = Zeiteinheit von Beginn bis Ende einer Messung

V = Gasvolumen (Innenvolumen des Behälters = 10,01 l)

↓56

A = Fläche (Folienfläche bzw. Gasaustauschfläche des Behälters = 0,057 m²)

Parallel zu den Messungen im Isotopenlabor wurde der atmosphärische Luftdruck fortlaufend gemessen. Hierbei traten tägliche Schwankungen bis zu 25 mbar auf. Zur Überprüfung wurden die gemessenen Luftdruckwerte mit den amtlichen Luftdruckdaten des betreffenden Versuchszeitraumes verglichen. Diese wurden vom Deutschen Wetterdienst Potsdam zur Verfügung gestellt.

3.3.2 Toxinbildungsvermögen von Penicillium roqueforti - Isolaten

↓57

In den Praxissilierversuchen P 2 und P 3 (1996) und den Laborsilierversuchen L 2 und L 3 (1996) wurden von visuell verschimmelten Silagen Penicillium roqueforti - Stämme isoliert und kultiviert. Die Pilzisolate wurden in der Bayerischen Landesanstalt für Tierzucht Grub auf ihr Roquefortin C - Bildungsvermögen hin untersucht. Die Untersuchungen dienten insbesondere der Selektion von zwei geeigneten Stammkulturen für die Herstellung der in den Laborsilierversuchen L 4 und L 5 (1997) benötigten Penicillium roqueforti - Inokulate.

Die beiden ausgewählten Penicillium roqueforti - Isolate wurden zur Überprüfung und Bestätigung an die „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH“ (DSMZ) geschickt.

Nährmedien:

↓58

Für die Isolierung von Penicillium roqueforti - Stämmen wurde ein in der Literatur beschriebenes Selektiv-Nährmedium verwendet [ENGEL und TEUBER, 1978]: Es wurden 19,2 g Czapek-Dox-Agar (MERCK 5460) in 400 ml Reinstwasser gelöst. Das sterilisierte Nährmedium wurde nach dem Abkühlen auf ca. 45-50°C mit 2 ml sterilfiltrierter (0,20 µm) Essigsäure (99-100%ig) versetzt, in Petrischalen gegossen und bis zum Verbrauch bei 4°C gelagert (höchstens 7-10 Tage).

Zum Abschwemmen von Penicillium roqueforti - Isolaten wurde ein spezielles Flüssigmedium hergestellt. Hierzu wurden 800 mg Yeastextrakt-Agar (DIFCO 5577) und 1,6 g Saccharose in 400 ml Reinstwasser gelöst. Das sterilisierte Flüssigmedium wurde nach dem Abkühlen bis zum Verbrauch ebenfalls bei 4°C gelagert (höchstens 7-10 Tage). Alle weiteren Nährmedien wurden nach Herstellerangaben bzw. Standardvorschriften hergestellt.

Isolierung und Kultivierung von Penicillium roqueforti-Stämmen:

↓59

Von visuell verschimmelten Frischproben wurde Silage entnommen, auf 2-3 cm Häcksellänge zerkleinert und gleichmäßig auf einen Selektiv-Nährboden gelegt. Die Nährböden wurden 10 Tage bei Raumtemperatur aerob inkubiert (abgedunkelt). Neben Penicillium roqueforti kann zumindest Penicillium glabrum ebenfalls auf dem Selektiv-Nährmedium wachsen [SPICHER und WESTENHOFF, 1985]. Bei Wachstum charakteristischer Penicillium-Kolonien wurden diese deshalb auf ihre mikroskopischen Merkmale (Hyphen, Fruchtkörper, Konidien) hin untersucht. Bei Verdacht auf Penicillium roqueforti wurden Sporen oder Mycelstücke dieser Kolonien auf Nährböden (Malzextrakt-Agar / MERCK 1.05398) überimpft. Diese Nährböden wurden 7 Tage bei Raumtemperatur aerob inkubiert (abgedunkelt) und die Kolonien anhand morphologischer (Farbe, Form, Durchmesser) und mikroskopischer (Form von Hyphen, Fruchtkörper und Konidien; Konidiengröße) Merkmale identifiziert [SAMSON et al., 1995]. Bei Vorliegen charakteristischer Merkmale von Penicillium roqueforti wurde die Kolonie zur Stammkonservierung auf Schrägagar (Malzextrakt-Agar) überimpft und 10 Tage bei Raumtemperatur aerob inkubiert (abgedunkelt). Anschließend wurde die Schrägkultur mit sterilem Paraffinöl überschichtet und bei 4°C als Stammkonserve bis zur weiteren Verwendung gelagert.

Untersuchung des Roquefortin C - Bildungsvermögens der Penicillium roqueforti - Isolate:

Von jedem Penicillium roqueforti - Isolat (Stammkonserve) wurden Konidien auf je 3 Nährböden (Malzextrakt-Agar / MERCK 1.05398) überimpft und 10 Tage bei Raumtemperatur aerob inkubiert (abgedunkelt). Für die Herstellung einer Sporensuspension wurde jede Petrischale mit 10 ml Flüssigmedium überschichtet, die Konidien mit einem Drigalski-Spatel abgeschabt und in einen sterilen Erlenmeyerkolben überführt. Die gewonnene Suspensionsmenge je Isolat betrug etwa 20 ml.

↓60

Von frischer Grassilage, bei der kein Roquefortin C nachgewiesen werden konnte, wurden jeweils 100 g in einen 1000 ml Weithalskolben eingewogen und autoklaviert. Je 7,5 ml der Sporensuspension eines Penicillium roqueforti - Isolates wurden in 2 Weithalskolben mit Grassilagemedium pipet-tiert und der Kolben mit einem Pilzstopfen aerob verschlossen. Die beimpfte Grassilage wurde bei Raumtemperatur aerob inkubiert (abgedunkelt). Nach 14 Tagen wurde die Inkubation und damit eventuell einhergehende Toxinbildung durch Einfrosten abgebrochen. Die Silagen wurden in den Weithalskolben belassen, bei -18°C gelagert und auf ihren Roquefortin C-Gehalt hin analysiert.

Herstellung der Penicillium roqueforti–Inokulate für die Laborsilierversuche L 4 und L 5 (1997):

Von den beiden ausgewählten Penicillium roqueforti-Isolaten wurden Konidien auf jeweils 2 Nährböden (Malzextrakt-Agar / MERCK 1.05398) überimpft und 10 Tage bei Raumtemperatur aerob inkubiert (abgedunkelt). Jede Petrischale wurde mit 10 ml Flüssigmedium überschichtet, die Konidien mit einem Drigalski-Spatel abgeschabt und in einen sterilen Erlenmeyerkolben überführt. Mit der Sporensuspension von einem Isolat wurde je eine mit Nährmedium (Malzextrakt-Agar) ausgegossene Zellkulturflasche (900 ml) beimpft. Die Nährböden wurden 35 Tage bei Raumtemperatur aerob inkubiert (abgedunkelt). Der in beiden Flaschen gewachsene Pilzrasen wurde mit jeweils 200 ml Flüssigmedium und sterilen Glasperlen überschichtet und durch kreisförmiges Schwenken der Flasche abgeschwemmt. Die Sporensuspension wurde in einen sterilen Erlenmeyerkolben überführt. Die gewonnene Menge betrug etwa 150 ml je Isolat. Die Anzahl an Penicillium roqueforti - Sporen wurde in der Thomakammer (0,1 mm Tiefe) und durch Keimzahlbestimmung festgestellt. Bis zur Verarbeitung in den Silierversuchen wurden die Inokulate bei 4°C gelagert, meist 1-3 Tage.

3.3.3 Methodenvergleich zur Beurteilung der aeroben Stabilität

↓61

Nach der Auslagerung wurde zur Beurteilung der aeroben Stabilität in den Grassilagen der Temperaturanstieg unter wärmeisolierten Bedingungen erfaßt. Parallel zur Messung des Temperaturanstiegs wurde bei ausgewählten Versuchsreihen der Sauerstoffverbrauch der ausgelagerten Silagen bestimmt. Beide angewandten Methoden erlauben eine kontinuierliche Datenerfassung. Sie unterscheiden sich jedoch in der Handhabung und den Investitionskosten. Mit dem Vergleich sollte untersucht werden, inwieweit die Methoden bei der Einschätzung der aeroben Stabilität der untersuchten Silagen in ihrer Aussage miteinander übereinstimmen bzw. voneinander abweichen.

Der Methodenvergleich wurde im Institut für Agrartechnik Bornim e.V. durchgeführt. Von jeder Frischprobe der Silagen wurden für die Messung des Temperaturanstiegs je 2x 100 g T und bei Messung des Sauerstoffverbrauchs nochmals 2x 50 g T in abgedeckten Fotoschalen bei Raumtemperatur bis zur Verarbeitung (höchstens 2-4 h) gelagert. Die notwendige Frischmasse-Einwaage wurde auf der Grundlage des T-Gehaltes im Ausgangsmaterial ermittelt.

Messung des Temperaturanstiegs (AE-T):

↓62

Der Versuchsaufbau ist in Abb. 7 schematisch dargestellt. Je 100 g T einer Silageprobe wurde zu-sammen mit je einer Tinytalk® II Datalogger-Thermistorsonde (ORION GR.) in zwei 1,5 l-Laborsilos (WECK®) gefüllt. In der Wandung jedes Silos befand sich etwa 2 cm über dem Boden ein Bohrloch (5 mm Ø). Jedes Laborsilo wurde mit handelsüblichen Wärmedämmplatten (5 cm stark) gegen die unmittelbare Umgebung sowie die anderen Silos wärmeisoliert und bis 7 Tage nach der Silageaus-lagerung bei 25°C Raumtemperatur gelagert. Das Abfließen von gebildetem Kohlendioxid aus der Silageprobe und der Gasaustausch mit der Umgebungsluft wurde durch Deckelöffnung (10 mm Ø) und Bohrloch im Silo sowie kleine Aussparungskanäle (5 mm Ø) in der Wärmedämmung gewährleistet. Von den Sonden wurde im Intervall von 2,4 h die Temperatur im Silo kontinuierlich gemessen und gespeichert. Der Intervall war frei wählbar von 1-16200 s. Im Versuchsraum wurde durch zwei Sonden ebenfalls die Temperatur erfaßt. Die gespeicherten Daten des Temperaturanstiegs wurden nach Abschluß der Messungen über eine Interfaceleitung von den Sonden in einen Standard-Personalcomputer übertragen und mit der Systemsoftware OTML (ORION GR.) ausgewertet.

Messung des Sauerstoffverbrauchs (AE-S):

Der Sauerstoffverbrauch der ausgelagerten Silagen wurde mit Hilfe eines automatisch arbeitenden BSB5-Meßgerätesystems (digi®, JOHANNA OTTO GmbH) gemessen. Jede der in diesem Gerätesystem vorhandenen Meßeinheiten ist ein in sich geschlossenes System und besteht aus 500 ml Probengefäß, Sauerstofferzeuger und Präzisionsmanometer, die in einem Klimaschrank temperiert werden. Durch den mikrobiellen Stoffwechsel in der Probe wird Sauerstoff zu Kohlendioxid veratmet. Das Kohlendioxid wird im Probengefäß an einen Absorber gebunden. Der entstandene Unterdruck induziert im Sauerstofferzeuger die elektrolytische Erzeugung von reinem Sauerstoff, was quantitativ (mg O2/l) und kontinuierlich erfaßt wird.

↓63

Für die Messungen wurden von den Silagen jeweils 50 g T in zwei 500 ml BSB5-Probengefäße ge-füllt. Die Probengefäße wurden im Klimaschrank bei 25°C gelagert. Der Verbrauch von Sauerstoff wurde im Intervall von 2,0 h über den Zeitraum von 7 Tagen erfaßt und automatisch berechnet.

Abb. 7: Schema der Messung des Temperaturanstiegs zur Beurteilung der aeroben Stabilität

3.4 Verwendete Analysenmethoden

3.4.1  Chemische Analytik

Trockenmasse:

↓64

Für die Ermittlung des Gehaltes an Trockenmasse im Ausgangsmaterial und den Silagen wurden je 4x ca. 400 g FM (bei Silagen aus Laborversuchen 4x ca. 200 g FM) eingewogen. Die Trockenmassebestimmung erfolgte durch Vortrocknung des Materials bei 60°C mit anschließender Endtrocknung für 9 h bei 105°C ohne Probenteilung zwischen den Trocknungsschritten. Bei Silagen wurde nachfolgend zur Erfassung von Trockenmasseverlusten während dieses Trocknungsverfahrens eine Korrektur nach folgender Gleichung vorgenommen [WEISSBACH und BERG, 1977]:

Tk = korrigierter T-Gehalt

↓65

Tn = nicht korrigierter T-Gehalt (nach Trocknung im Trockenschrank ermittelt)

FFS = Summe der Gehalte an flüchtigen Fettsäuren (C2 – C6) (hier: Essig- /Propion- /Buttersäure)

AL = Summe der Gehalte an einwertigen Alkoholen (C2 – C4) (hier: Ethanol / Propanol)

↓66

NH3 = Gehalt an Ammoniak

MS = Gehalt an Milchsäure

Rohnährstoffe, Wasserlösliche Kohlenhydrate, Pufferkapazität, Nitrat:

↓67

Für die chemische Analytik wurde das bei -18°C gelagerte Probenmaterial wie folgt aufgearbeitet:

Zur Bestimmung von Parametern aus luftgetrocknetem Probenmaterial wurden 2x ca. 500 g FM (bei Silagen aus Laborversuchen 2x ca. 300 g FM) bei 60°C für 24 h getrocknet, auf 1 mm Siebdurchgang feingemahlen und in verschlossenen Weithalsflaschen (braun) bei 10-12°C aufbewahrt.

Der Rohasche- und Rohproteingehalt im Ausgangsmaterial und den Silagen wurde im Institut für Agrartechnik Bornim e.V. nach Standardmethoden ermittelt [VDLUFA, 1993]. Der Rohfasergehalt der Ausgangsmaterialien wurde in der Bayerischen Landesanstalt für Tierzucht Grub mit einem Fibertec System bestimmt. In den Silagen wurde im Institut für Agrartechnik Bornim e.V. technisch bedingt anstelle des Rohfasergehaltes der Rohcellulosegehalt ermittelt [NEHRING, 1969].

↓68

Im Ausgangsmaterial wurden der Nitratgehalt nach der Xylenol- und die wasserlöslichen Kohlenhydrate nach der Anthron-Methode bestimmt [VON LENGERKEN und ZIMMERMANN, 1991]. Die Pufferkapazität wurde durch Titration mit Milchsäure (0,2 N) ermittelt. Als Pufferkapazität wird dabei der Bedarf an Milchsäure (g MS/kg T) zur Ansäuerung von Grünfutter auf pH 4,0 bezeichnet.

pH-Wert, Milchsäure und flüchtige Fettsäuren, Ammoniak, Alkohole:

Für die Bestimmung des pH-Wertes und der Gehalte an Gärsäuren, Alkoholen und Ammoniak wur-den 100 g FM mit 1 l Reinstwasser und 1 ml Toluol als Stabilisator versetzt und zur Kaltwasserextraktion 14-16 h bei 4°C stehen gelassen. Der Silageextrakt wurde über ein Faltenfilter grob filtriert.

↓69

Der pH-Wert wurde im grob filtrierten Silageextrakt elektrometrisch mit Hilfe eines pH-Meters und einer Einstabmeßelektrode bestimmt. Für die chromatographischen Messungen in der Bayerischen Landesanstalt für Tierzucht Grub wurden Probengebergläschen befüllt. Hierzu wurde ein Aliquot des grob filtrierten Silageextraktes (50 ml) bei 3000 n/min für 5 min zentrifugiert und über ein Minisart-Einmalfilter (0,45 µm) fein filtriert. Die fein filtrierten Silageextrakte wurden bis zur Verarbeitung bei -18°C gelagert. Die Quantifizierung von Milch-, Essig-, Propion- und n-Buttersäure erfolgte über Ionenausschluß-Chromatographie an einer HPIEC AS1 Säule (250 x 9 mm) mit gekoppelter Vorsäulenkartusche und Leitfähigkeitsdetektion mit Anionen-Mikromembransuppression. Isomere und höhere Homologe der Buttersäure wurden nicht bestimmt. Die Quantifizierung von Ammoniak erfolgte über Ionenaustausch-Chromatographie als Ammonium-Ion (NH4 +-Ion) an einer Kationenaustauschsäule CS 12 (250 x 4 mm) mit Vorsäule und Leitfähigkeitsdetektion mit Kationen-Mikro-membransuppression. Die Bestimmung der Gehalte an Ethanol und Propanol erfolgte über Gas-Chromatographie an einer Kapillarsäule FFAP (25 x 0,32 mm) mit Flammen-Ionisationsdetektion. Die Konzentration von Gärsäuren, Ammoniak, Ethanol und Propanol in den Silageproben wurde anhand von Eichreihen mit externen Standards berechnet. Die Ethanol- und Propanolkonzentrationen wurden als Alkoholgehalt addiert. Beispiel-Chromatogramme (Standardsubstanzen, Silagen) aus der Ionen-Chromatographie sind im Anhang in Abb. A 1 bis A 4 dargestellt.

3.4.2 Mikrobiologische Analytik

Die mikrobielle Analytik erfolgte überwiegend im Institut für Agrartechnik Bornim e.V. innerhalb von 4-6 h nach der Probenahme aus frischem, bei 4°C in sterilen Gefäßen gelagertem Probenmaterial.

↓70

Pilzkeimzahl:

Für die Pilzkeimzahl wurden von der Frischprobe 40 g Silage in einen Stomacher-Beutel eingewogen, mit 360 ml ¼-starker, steriler Ringerlösung suspendiert und 2 min im Stomacher extrahiert. Aus dem Extrakt (Verdünnungsstufe 10-1) wurde in dezimalen Abständen eine Verdünnungsreihe (10-2 - 10-9) erstellt. Das Herstellen der Anzuchtplatten erfolgte im Oberflächenkultur-Spatelverfah-ren. Von jeder Verdünnungsstufe wurden je 100 µl Extrakt auf einen Nährboden (Sabouraud-2% Glucose-Agar / MERCK 7315 / + 0,1 g/l Chloramphenicol) pipettiert und mit einem Drigalski-Spatel gleichmäßig verstrichen. Die Nährböden wurden 3-5 Tage bei Raumtemperatur aerob inkubiert. Danach wurde die Anzahl der Kolonien gezählt und die KBE/g FM ermittelt.

Milchsäurebakterienzahl:

↓71

Für die Milchsäurebakterienzahl wurde analog eine Verdünnungsreihe hergestellt bzw. es wurde dieselbe Verdünnungsreihe verwendet. Das Ausplattieren erfolgte im Oberflächenkultur-Droplating-verfahren. Von jeder Verdünnungsstufe wurden 3 Tropfen mit jeweils 50 µl Extrakt räumlich versetzt auf einen Nährboden (MRS-Agar / MERCK 1.10660 / + 0,04 % Sorbinsäure) pipettiert. Die Nährböden wurden 2 Tage bei 30°C im Brutschrank aerob inkubiert. Danach wurde die Anzahl der Kolonien gezählt und die KBE/g FM ermittelt.

Listerienzahl:

In den Praxissilierversuchen P 2 bis P 5 wurden von Herrn Jens Hoffmann (INW) zusätzlich die Listerienzahlen ermittelt. Die angewandte Nachweismethode basiert auf § 35 LMBG [N.N., 1991].

3.4.3 Eigene Entwicklung und Modifikation von chemischen Methoden

↓72

Alle Arbeiten zur Ergosterin- und Roquefortinanalytik wurden in der Bayerischen Landesanstalt für Tierzucht Grub durchgeführt. Sicherheitsvorschriften wurden beachtet [TAUCHMANN et al., 1972].

3.4.3.1  Bestimmung von Ergosterin

Zur Bestimmung von Ergosterin in Grünfutter und Grassilagen wurde folgende Methode entwickelt:

Herstellung von Standard-Lösungen:

↓73

100 mg Ergosterin-Standard (SIGMA) wurde auf einer Analysenwaage in einen 200 ml Meßkolben eingewogen, mit Ethanol bis zur Marke aufgefüllt und mittels Ultraschallbad vollständig aufgelöst. Die theoretische Konzentration der Ergosterin-Stammlösung (Lösung 1) betrug danach 500 µg/ml. Zur genauen Konzentrationsbestimmung wurden 20 ml der Lösung 1 genau 1 : 5 mit Ethanol verdünnt (Lösung 2). Mit einem UV / VIS-Spektralphotometer wurde unter Verwendung von Quarzküvetten die Extinktion bei 282 nm gemessen.

Die Berechnung der Ergosterin-Konzentration von Lösung 2 erfolgte nach der folgenden Formel (Lambert-Beer’sche Gleichung):

↓74

c = Ergosterin-Konzentration der Lösung 2 (µg/ml)

ΔE = Extinktion

MG = Molekulargewicht (396,67 g/mol)

↓75

ε = molarer Extinktionskoeffizient (11900 l x mol-1 x cm-1 bei 282 nm in Ethanol)

d = Schichtdicke der Quarzküvette (1 cm)

1000 = Umrechnungsfaktor (g/l → µg/ml)

↓76

Die exakte Konzentration C von Lösung 1 war entsprechend C = c x 5. Für die HPLC-Kalibrierung wurden danach jeweils 0,25 / 0,50 / 1,25 / 2,50 / 5,00 / 7,50 und 10,00 ml der Lösung 1 in 50 ml Meßkolben pipettiert und im Stickstoffstrom bei 40°C im Wasserbad bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand in den Meßkolben wurde mit HPLC-Laufmittel bis zur Marke aufgefüllt und mit Hilfe eines Ultraschallbades vollständig aufgelöst. Von diesen Kalibrier-Standardlösungen wurden jeweils 20 µl in die HPLC eingespritzt und eine Eichgerade ermittelt. Die Standardlösungen wurden ebenso wie die Lösung 1 bei 4°C gelagert. Die Lösung 1 wurde vor jeder Meßreihe bzw. jeden Monat neu hergestellt und photometrisch gemessen. Die Standardlösungen wurden jede Woche neu hergestellt.

Extraktion des Probenmaterials:

10 g der luftgetrockneten und feingemahlenen Futtermittelprobe wurden in einen 250 ml Schliff-rundkolben eingewogen. Nach Zugabe von 75 ml methanolischer Kaliumhydroxid-Lösung (2,4 M) (135 g Kaliumhydroxid-Plätzchen wurden in einen 1000 ml Meßkolben eingewogen und vollständig in Methanol aufgelöst) und 50 ml Ethanol wurde die Probe im Reihenwasserbad unter Rückfluß 30 min bei 80°C gekocht. Die Rundkolben wurden nach dem Kochen bis zum Abkühlen auf Raumtemperatur mit einem Plast- oder Glasstopfen verschlossen. Während des Kochens und Abkühlens wurden Tefloneinsätze im Schliff verwendet. Die abgekühlte Probenlösung wurde über ein Faltenfilter in ein Becherglas filtriert. Ein geringer Probenrückstand konnte im Rundkolben verbleiben.

↓77

In einem Meßzylinder wurde ein Aliquot des Filtrats (50 ml) abgemessen und quantitativ in einen 500 ml Scheidetrichter überführt; der Meßzylinder wurde 2x mit je 50 ml Reinstwasser nachgespült. Die vereinten Phasen (50 ml Probenaliquot und 100 ml Reinstwasser) wurden unter leichtem Schütteln des Scheidetrichters mit 8 ml Salzsäure (25%ig) neutralisiert. Anschließend wurde die leicht alkalische Lösung mit 50 ml n-Hexan ca. 30 Sekunden ausgeschüttelt, wobei vor allem zu Beginn der Scheidetrichter zwischendurch entlüftet wurde. Das Abmessen des n-Hexan erfolgte generell in dem Meßzylinder, der schon für das jeweilige Probenaliquot verwendet wurde. Nach der Phasentrennung (ca. 5-10 min) wurde die untere leicht alkalische Phase in ein neues Becherglas abgelassen und die obere, ergosterinhaltige n-Hexan-Phase über Natriumsulfat-Decahydrat (etwa 2 Spatellöffel im Faltenfilter) in einen 250 ml Schliffrundkolben abfiltriert.

Die alkalische Phase wurde wieder in den Scheidetrichter überführt und das verwendete Becherglas mit 40 ml n-Hexan nachgespült. Mit diesen 40 ml n-Hexan wurde danach die alkalische Phase noch einmal ca. 20 Sekunden ausgeschüttelt. Nach der Phasentrennung wurde die untere Phase abgelassen und die obere n-Hexan-Phase wiederum in den Schliffrundkolben abfiltriert (siehe oben). Das Faltenfilter mit Natriumsulfat-Decahydrat wurde mit 10 ml n-Hexan nachgewaschen. Die vereinten n-Hexan-Filtrate wurden am Vakuum-Rotationsverdampfer bei 40°C Badtemperatur auf ca. 1 ml eingeengt. Der Schliffrundkolben mit dem Probenextrakt wurde mit einem Stopfen verschlossen und bis zur HPLC-Bestimmung bei 4°C gelagert, meist 1-3 Tage. Der Ergosteringehalt der Probenextrakte blieb während dieser Zeit nahezu konstant.

Kurz vor der HPLC-Bestimmung wurde der Probenextrakt im Stickstoffstrom bei 40°C im Wasserbad bis zur Trockene eingeengt und der Rückstand in 4 ml HPLC-Laufmittel (n-Hexan / 2-Propanol, 98 : 2, v / v) mit Hilfe eines Ultraschallbades vollständig aufgelöst. Der Probenextrakt wurde in 2 Eppendorf-Reaktionsgefäße (2 ml) überführt und 2 min in einer Mikroliter-Zentrifuge bei 15000 n/min zentrifugiert. Von der überstehenden Lösung wurden jeweils 1,5 ml in 2 Probengeber-gläschen überführt und in der HPLC gemessen. Das am Vakuum-Rotationsverdampfer abrotierte n-Hexan wurde getrennt gesammelt, rückdestilliert und wiederverwendet.

↓78

Bestimmung von Ergosterin mittels HPLC (spezielle Geräte / Trennbedingungen):

Pumpe L6200, UV-Detektor L4000, MERCK HITACHI; Autosampler Typ 231 BIO GILSON mit Dilutor 401, ABIMED; Chromatographiedatensystem GynkoSoft V5.50, SOFTRON.

HPLC-Säule:

LiChrosorb Si 60, 5 µm, 250 x 4,6 mm, MERCK;

Eluent:

n-Hexan / 2-Propanol (98 : 2, v / v);

Flußrate:

1,5 ml/min;

Detektion:

UV 282nm.

↓79

Die HPLC wurde im isokratischen Trennlauf und bei Raumtemperatur durchgeführt. Zur Ergosterin-Identifizierung wurden die Retentionszeiten und Peakformen der Substanzen in den Probenextrakten mit denen der Ergosterin-Standardlösung verglichen. Die Retentionszeit für Ergosterin lag bei ca. 8,1 min. Die Berechnung des Ergosteringehaltes im Probenextrakt erfolgte anhand der Eichgeraden, wobei die Fläche des Ergosterin-Peaksignals ausgewertet wurde. Von den Probenextrakten wurden jeweils 20 µl eingespritzt. Bei Konzentrationen oberhalb des Eichbereiches wurden die Messungen mit entsprechender Verdünnung wiederholt. Die Erfassungsgrenze der gesamten Methode zum Nachweis von Ergosterin in Grassilagen lag bei 0,5 mg ERG/kg T. Der Ergosteringehalt der Futtermittelproben wurde auf deren Trockenmassegehalt bezogen.

Die beschriebene Methode wurde neben Grünfutter und Grassilagen auch bei Futtermitteln wie Getreideganzpflanzen- und Maissilagen sowie Getreide angewendet. Beispiel-Chromatogramme (Standardsubstanz, Grünfutter, Silagen, Getreide) sind im Anhang in Abb. A 5 bis A 9 dargestellt.

↓80

Bestimmung der Wiederfindungsrate in verschiedenen Futtermitteln:

Bei fünf verschiedenen Futtermittelproben wurde der Ergosteringehalt ohne und mit Addition von 10 mg Ergosterin-Standard /kg Trockenmasse ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tab. 4 und die entsprechenden Chromatogramme einer Futtermittelprobe in Abb. A 10 und A 11 dargestellt.

↓81

Tab. 4: Wiederfindungsrate von Ergosterin in verschiedenen Futtermitteln

Futtermittel

Ergosterin (gemessen)

σ1)

Ergosterin (berechnet)

Ergosterin (gemessen)

σ1)

Wiederfindung

mg/kg T

(n=6)

mg/kg T

mg/kg T

(n=6)

%

Istwert ohne Addition:

Sollwert bei Addition:

Istwert bei Addition:

Formel für die Berechnung:

oA

oA + 10 mg ERG/kg T

mA

mA / (oA+10) x 100

Grassilage

251,96

1,79

261,96

276,76

2,15

105,65

Grassilage

158,51

1,41

168,51

176,11

2,21

104,51

Weizen-GPS2)

55,04

1,82

65,04

61,34

2,14

94,30

Maissilage

33,17

1,04

43,17

39,58

0,45

91,68

Weizen

7,49

0,09

17,49

15,21

0,37

86,94

1) – Standardabweichung; 2)GPS - Ganzpflanzensilage

3.4.3.2 Bestimmung von Roquefortin C

Zur Bestimmung von Roquefortin C in Grassilagen wurde eine von ARMBRUSTER beschriebene Methode modifiziert [ARMBRUSTER, 1994]:

↓82

Herstellung von Standard-Lösungen:

5 mg Roquefortin C-Standard (SIGMA) wurde in einen 10 ml Meßkolben überführt, mit Methanol bis zur Marke aufgefüllt und mittels Ultraschallbad vollständig aufgelöst. Die theoretische Konzentration der Roquefortin-Stammlösung (Lösung 1) betrug danach 500 µg/ml. Zur genauen Konzentrationsbestimmung wurde 1 ml der Lösung 1 genau 1 : 10 mit Methanol verdünnt (Lösung 2). Mit einem UV / VIS-Spektralphotometer wurde unter Verwendung von Quarzküvetten die Extinktion bei 325 nm gemessen.

Die Berechnung der Roquefortin-Konzentration von Lösung 2 erfolgte nach der folgenden Formel (Lambert-Beer’sche Gleichung):

↓83

c = Roquefortin-Konzentration der Lösung 2 (µg/ml)

ΔE = Extinktion

↓84

MG = Molekulargewicht (389,18 g/mol)

ε = molarer Extinktionskoeffizient (26300 l x mol-1 x cm-1 bei 325 nm in Methanol)

d = Schichtdicke der Quarzküvette (1 cm)

↓85

1000 = Umrechnungsfaktor (g/l → µg/ml)

Die exakte Konzentration C von Lösung 1 war entsprechend C = c x 10. Für die HPLC-Kalibrierung wurden danach von der Lösung 1 je 50 µl in einen 200ml und einen 20 ml, je 250 µl in einen 20 ml und einen 10 ml sowie je 500 µl in einen 10 ml und einen 5 ml Meßkolben pipettiert und im Stickstoffstrom bei 40°C im Wasserbad bis zur Trockene eingedampft. Der Rückstand in den Meßkolben wurde mit HPLC-Laufmittel bis zur Marke aufgefüllt und mit Hilfe eines Ultraschallbades vollständig aufgelöst. Von diesen Kalibrier-Standardlösungen wurden jeweils 20 µl in die HPLC eingespritzt und eine Eichgerade ermittelt. Die Standardlösungen wurden bei -18°C aufbewahrt und alle 2 Wochen neu hergestellt. Die Lösung 1 wurde bis zum endgültigen Verbrauch bei -18°C gelagert.

Extraktion des Probenmaterials:

↓86

5 g der luftgetrockneten und gemahlenen Futtermittelprobe wurden in eine 200 ml Weithalsflasche (handelsübliche Säuglingsflasche) eingewogen, mit 50 ml Natriumhydrogencarbonat–Lösung (3%ig) vermischt und der pH-Wert der Aufschlämmung durch Zugabe von Natriumhydroxid-Lösung (1N) (40 g Natriumhydroxid-Plätzchen wurden in einen 1000 ml Meßkolben eingewogen und vollständig in Reinstwasser aufgelöst) auf pH 12 eingestellt. Nach sofortiger Zugabe von 100 ml Ethyl-acetat und Verschluß mit einem Silikonstopfen erfolgte eine 30–minütige Extraktion bei 180 n/min auf einem Laborschüttler. Anschließend wurde die obere Ethylacetat-Phase bei 3000 n/min für 10 min zentrifugiert, ein Aliquot (40 ml) der Ethylacetat-Phase quantitativ in einen 500 ml Scheidetrichter überführt und mit 40 ml Salzsäure (0,01N) ca. 30 Sekunden ausgeschüttelt.

Nach der Phasentrennung (ca. 5-10 min) wurde die untere Salzsäure-Phase in einem zweiten 500 ml Scheidetrichter aufgefangen und das Ausschütteln mit nochmals 40 ml Salzsäure (0,01N) wiederholt. Die beiden Salzsäure–Phasen wurden in dem zweiten Scheidetrichter vereint, durch Zugabe von 40 ml Natriumhydrogencarbonat–Lösung (3%ig) neutralisiert und mit 50 ml Natriumhydroxid-Lösung (1N) stark alkalisiert. Diese alkalische Phase wurde sofort mit 50 ml Ethylacetat ca. 30 Sekunden ausgeschüttelt. Nach der Phasentrennung (ca. 5-10 min) wurde die obere Ethyl-acetat-Phase mit einer Pipette abgehoben und in einen 100 ml Schliffrundkolben überführt.

Das Ausschütteln wurde noch zweimal mit 30 ml bzw. 10 ml Ethylacetat wiederholt. Die vereinten Ethylacetat-Phasen wurden am Vakuum-Rotationsverdampfer bei 40°C Badtemperatur bis zur Trockene eingeengt. Der Schliffrundkolben mit dem Probenextrakt - Rückstand wurde mit einem Stopfen verschlossen und bis zur HPLC-Analyse bei -18°C gelagert, meist 3-5 Tage. Der Gehalt an Roquefortin in den Rückständen blieb während dieser Zeit nahezu konstant.

↓87

Kurz vor der HPLC-Bestimmung wurde der Probenextrakt - Rückstand in 2 ml HPLC-Laufmittel (Methanol / Reinstwasser, 70 : 30, + 5,75 g/l Ammoniumdihydrogenphosphat) mit Hilfe eines Ultraschallbades vollständig aufgelöst, in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (2 ml) überführt und 2 min in einer Mikroliter-Zentrifuge bei 15000 n/min zentrifugiert. Von der überstehenden Lösung wurden jeweils ca. 0,8 ml in 2 Probengebergläschen überführt und in der HPLC gemessen.

Das am Vakuum-Rotationsverdampfer abrotierte Ethylacetat wurde getrennt gesammelt, destilliert und wiederverwendet. Um eine durch das alkalische Milieu bedingte Instabilität von Roquefortin C während der Extraktion zu vermeiden, wurden maximal 3 Proben gleichzeitig extrahiert.

Bei der Untersuchung des Toxinbildungsvermögens der isolierten Pilzkulturen (Kap. 3.3.2) wurde versuchstechnisch bedingt der gesamte Versuchsansatz einer Kultur als Probe angesehen und extrahiert. Die Veränderungen gegenüber der oben beschriebenen Extraktion sind:

↓88

Die eingefrorene Frischprobe (100 g beimpfte Silage in einem 1000 ml Weithalskolben) wurde 16 h bei 4°C aufgetaut, mit 250 ml Natriumhydrogencarbonat–Lösung (3%ig) vermischt und der pH-Wert der Aufschlämmung durch Zugabe von Natriumhydroxid-Lösung (1N) (ca. 100 ml) auf pH 12 eingestellt. Nach sofortiger Zugabe von 250 ml Ethylacetat erfolgte eine 30-minütige Extraktion bei 180 n/min auf einem Laborschüttler. Anschließend wurde die obere Ethylacetat-Phase bei 3000 n/min für 10 min zentrifugiert, ein Aliquot (100 ml) der Ethylacetat-Phase quantitativ in einen 500 ml Scheidetrichter überführt und mit 40 ml Salzsäure (0,01N) ca. 30 Sekunden ausgeschüttelt. Alle weiteren Aufarbeitungsschritte erfolgten analog der oben beschriebenen Extraktion.

Bestimmung von Roquefortin C mittels HPLC (spezielle Geräte / Trennbedingungen):

Pumpe L6200, UV-Detektor L4000, MERCK HITACHI; Autosampler Typ 231 BIO GILSON mit Dilutor 401, ABIMED; Chromatographiedatensystem GynkoSoft V5.50, SOFTRON.

↓89

HPLC-Säule:

LiChrospher 100 RP 18, 5 µm, 250 x 4 mm, MERCK;

Vorsäule:

LiChrospher 100 RP 18, 5 µm, 25 x 4 mm, MERCK;

Eluent:

Methanol / Reinstwasser (70 : 30) + 5,75 g/l Ammoniumdihydrogenphosphat;

Flußrate:

1,0 ml/min;

Detektion:

UV 328 nm.

Die HPLC wurde im isokratischen Trennlauf und bei Raumtemperatur durchgeführt. Zur Roquefortin-Identifizierung wurden die Retentionszeiten und Peakformen der Substanzen in den Probenextrakten mit denen der Roquefortin-Standardlösung verglichen. Die Retentionszeit für Roquefortin C lag bei ca. 7,9 min. Die Berechnung des Gehaltes an Roquefortin im Probenextrakt erfolgte anhand der Eichgeraden, wobei die Fläche des Roquefortin-Peaksignals ausgewertet wurde. Von den Probenextrakten wurden jeweils 20 µl eingespritzt. Bei Konzentrationen oberhalb des Eichbereiches wurden die Messungen mit entsprechender Verdünnung wiederholt. Die Erfassungsgrenze der gesamten Methode zum Nachweis von Roquefortin C in Grassilagen lag bei 0,05 mg ROF/kg T. Der Roquefortin C-Gehalt der Futtermittelproben wurde auf deren Trockenmassegehalt bezogen. Beispiel-Chromatogramme (Standardsubstanz, Silagen mit und ohne Roquefortin C-Gehalt) sind in Abb. A 12 bis A 14 dargestellt.

Bestimmung der Wiederfindungsrate:

↓90

Bei einer Grassilageprobe wurde der Roquefortin C-Gehalt ohne und mit Addition von 3 unterschiedlichen Mengen Roquefortin C ermittelt (0,13 / 3,20 / 50,00 mg Roquefortin C-Standardsub-stanz/kg Trockenmasse). Die Ergebnisse sind in Tab. 5 und entsprechende Chromatogramme in Abb. A 15 und A 16 dargestellt.

Tab. 5: Wiederfindungsrate von Roquefortin C in Grassilage

Roquefortin C-Addition

Roquefortin (gemessen)

σ1)

Roquefortin (berechnet)

Roquefortin (gemessen)

σ1)

Wiederfindung

mg/kg T

mg/kg T

(n = 6)

mg/kg T

mg/kg T

(n = 6)

%

Istwert ohne Addition:

Sollwert bei Addition:

Istwert bei Addition:

Formel für die Berechnung:

Spike (Sp)

oA

oA + Spike

mA

mA / (oA+Sp) x 100

0,13

0,00

0,00

0,13

0,10

0,01

78,85

3,20

0,00

0,00

3,20

2,86

0,08

89,38

50,00

0,00

0,00

50,00

42,54

0,79

85,07

1) – Standardabweichung


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11.10.2006