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1  Einführung

Der Brustkrebs stellt eine der häufigsten Todesursachen bei Frauen in der heutigen Zeit dar. Im Allgemeinen wird er chirurgisch reseziert oder es wird eine radikale Mastektomie zur Tumorentfernung vorgenommen. In Abhängigkeit von Risikofaktoren wird in vielen Fällen weiterhin mit einer adjuvanten postoperativen Chemotherapie behandelt. Diese Therapie findet jedoch nicht in allen Fällen ein zufriedenstellendes Ansprechen. Einige Tumoren sind von Beginn an resistent gegen die angewendeten Zytostatika, während andere nach einem anfänglichen Ansprechen der Therapie im späteren Verlauf eine Resistenz entwickeln. Man nennt dieses Phänomen die Multidrug Resistenz. Dem humanen Y-Box-Protein YB-1 wird bei der Regulierung und Entwicklung der Multidrug Resistenz eine Rolle zugeschrieben. In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob die YB-1 Expression im Mammakarzinom Aussagen über den klinischen Verlauf der Erkrankung erlaubt. Dafür wird in der Einführung ein Überblick über die Familie der Y-Box-Proteine, deren Aufbau, Gemeinsamkeiten und Funktionen, und über das Phänomen der Multiplen Medikamentenresistenz mit seinen verschiedenen Phänotypen und Regulations-mechanismen gegeben.

1.1 Y-Box-Proteine

Y-Box-Proteine stellen eine Gruppe von Proteinen mit gemeinsamem Strukturmotiv dar. Es handelt sich dabei um eine Nukleinsäure-bindende Domäne, die während der Evolution von Prokaryonten sehr gut erhalten geblieben ist, und die man sowohl in Bakterien, Pflanzen und Tieren finden kann. Es wurde beobachtet, dass die in Bakterien gefundenen Y-Box-Proteine durch Kälteschock induzierbar sind. Die Kälteschock-Antwort erfolgt, wenn man exponentiell wachsende Zellen abrupt von 37°C auf 10°C abkühlt. Die Zellen reagieren mit einer über 100fach gesteigerten Synthese ihrer Y-Box-Proteine (z.B. CS7.4 von E. coli) bei gleichzeitig stark reduzierter allgemeiner Transkription und Translation. Aufgrund dieser Eigenschaft gab man den Y-Box-Proteinen von Bakterien auch den Namen der Kälteschock-Proteine (cold shock proteins).

Die ersten Mitglieder der Y-Box-Proteinfamilie wurden in eukaryonten Zellen gefunden und zeigten in vitro eine Bindung an ein doppelsträngiges Transkriptions-Regulations-Element, welches als Y-Box bekannt war. Daher bekam die Familie den Namen Y-Box-Proteine. Inzwischen wurde gezeigt, dass Y-Box-Proteine ebenfalls an Einzelstrang-DNA und RNA binden können. Diese Beobachtungen führten zu einer Reihe von Aufgaben und Funktionen, die dieser Familie zugeschrieben werden. Mitglieder der Y-Box-Proteinfamilie können als Transkriptionsaktivatoren und -repressoren, Chromatin-Modifikations-Proteine, DNA-Reparatur-Proteine, selektive Translationsrepressoren und RNA-Verpackungs-Proteine wirken.

Vergleicht man die Struktur verschiedener Y-Box-Proteine, so kann man feststellen, dass sich ein bestimmter Teil überall finden lässt, die Kälteschock-Domäne. Bakterien besitzen nur diese eine Kälteschock-Domäne. In eukaryontischen Y-Box-Proteinen sind zusätzliche Domänen zu finden. Ein ungewöhnliches Y-Box-Protein von Säugetieren, das unr, besteht zum Beispiel aus fünf aufeinander folgenden Kälteschock-Domänen. Es stellt damit das Protein mit der am höchsten konservierten Anzahl an Kälteschock-Domänen dar. Die am häufigsten beschriebene eukaryontische Form von Y-Box-Proteinen besteht aus einer einzigen Kälteschock-Domäne, die mit einer Serie von typischerweise vier sich abwechselnden basischen und sauren Regionen gekoppelt ist. Zu den so aufgebauten Y-Box-Proteinen zählen das humane YB-1, das MSY1 der Maus und die beiden Xenopus-Proteine FRGY1 und FRGY2. Das humane NSEP1 (nuclease-sensitive element protein) und das RBYa von Ratten weisen eine andere Anordnung der geladenen Regionen auf. Das Y-Box-Protein der Pflanzen, das GRP2, besteht aus einer Kälteschock-Domäne, die mit einer Glycin-reichen Domäne verbunden ist.

1.1.1 Struktur der prokaryontischen Y-Box-Proteine

Kälte-Schock-Domänen sind verantwortlich für die spezifische Bindung eines cis-Elements, welches Y-Box genannt wird, an die DNA (Schnuchel et al., 1993). Die Kälte-Schock-Proteine von Escherichia coli (CspA bzw. CS7.4) und Bacillus subtilis (CspB) zeigen eine 43 %ige Übereinstimmung ihrer Sequenz mit der Nukleinsäure–bindenden Domäne von eukaryontischen Y-Box-Faktoren. Es wurde mittels NMR-Spektroskopie (Newkirk et al., 1994; Schnuchel et al., 1993) und Röntgenkristallographie (Schindelin et al., 1993; Schindelin et al., 1994) herausgefunden, dass [Seite 9↓] die beiden wichtigsten Kälte-Schock-Proteine von E.coli (CspA) und B.subtilis (CspB) in ihrer Struktur weitgehend übereinstimmen. 5 antiparallel angeordnete β -Stränge bilden eine geschlossene β -Röhre. Ein weiteres 3-strängiges β -Faltblatt enthält das RNA-bindende Motiv RNP1 und ein Motiv, welches dem RNP2 ähnlich ist, und besitzt auf seiner Oberfläche zahlreiche basische und aromatische Reste, die als Bindungsstellen für Einzelstrang-DNA dienen. Wie Landsman 1992 feststellen konnte, besitzen die Familie der RNA-bindenden Proteine und die Familie jener Proteine, die Kälte-Schock-Domänen enthalten, ein identisches RNP1-Motiv.

1.1.2 Struktur der eukaryontischen Y-Box-Proteine

Eine hervorzuhebende Eigenschaft von Y-Box-Proteinen ist deren Erhaltung durch die Evolution. Die zentrale Nukleinsäure-bindende Domäne der Wirbeltierproteine ist zu 43 % identisch mit dem Kälteschock-Protein (CS7.4 bzw. CspA) von Escherichia coli.

Die eukaryontischen Y-Box-Proteine wurden anfangs durch ihre Interaktion mit Doppelstrang-DNA, welche die Sequenz CCAAT enthält, charakterisiert. Vergleiche der Aminosäuresequenz verschiedener Y-Box-Proteine zeigten eine über 90 %ige Übereinstimmung in einer Region von 78 Aminosäuren, die als Nukleinsäure-Erkennungsregion der Proteine angesehen wird (Tafuri und Wolffe, 1992).

Das humane Protein YB-1 zeigte eine relative Spezifität für Doppelstrang-DNA mit der Sequenz CTGATTGG (C/T)(C/T)AA, welche als Y-Box bekannt ist (Didier et al., 1988). Diese Sequenz enthält eine reverse CCAAT-Box (oben unterstrichen), die man in Transkriptions-Kontroll-Regionen einer Reihe von eukaryontischen Genen finden kann. So zum Beispiel in den Major-Histocompatibility-Complex-Class II (MHC II)-Genen von Säugetieren, den Gameten-spezifischen Genen von Wirbeltieren und dem MDR1-Gen des Menschen (Dorn et al., 1987; Wolffe et al., 1992; Goldsmith et al., 1993).

Eukaryontische Y-Box-Proteine sind aus drei verschiedenen Domänen aufgebaut: ein variabler N-Terminus, eine hochkonservierte zentrale Nukleinsäure-bindende Domäne (die Kälteschock-Domäne) und ein hydrophiles C-terminales Ende. Die Enddomäne besteht aus alternierenden Regionen, in denen jeweils basische oder saure Aminosäuren vorherrschen. Jede dieser Regionen enthält ungefähr 30 Aminosäuren (Wolffe, 1994). Die sauren Regionen formen eine α -Helix (Tafuri und Wolffe, 1992), wohingegen die basischen Regionen eine wenig organisierte Struktur aufweisen. Sie sind jedoch reich an Phenylalanin- und Tyrosinresten und werden daher auch basisch / aromatische (B/A) Inseln genannt (Murray et al., 1992). Die Phenylalanin- und Tyrosinreste ermöglichen einen engen Kontakt zu RNA-Basen (Ladomery und Sommerville, 1994). Die basischen Regionen sind weiterhin reich an Arginin, Glutamin und Prolin und ähneln den Protaminen (Tafuri und Wolffe, 1990; Wolffe et al., 1992). Sie kommen in Gruppen vor, so dass extensive Wechselwirkungen mit negativ geladenen Zucker-Phosphat-Molekülen verhindert werden können. Diese Domäne enthält außerdem einige potentielle Stellen für eine Phosphorylierung durch die Kaseinkinase II.

In einigen Versuchen wurde durch Deletion nachgewiesen, dass für die Erkennung von Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA und von RNA allein die zentrale Kälteschock-Domäne benötigt wird (Tafuri und Wolffe, 1992; Kolluri et al., 1992). Das C-terminale Ende stabilisiert Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren und vermittelt Interaktionen zwischen Proteinen.

1.1.3 Y-Box-Proteine in Pflanzen und Pilzen

In Saccharomyces cerevisiae wurden einige Kälteschock-induzierbare Gene gefunden (Kondo und Inouye, 1991). Unter diesen befindet sich ein an Glycin und Arginin reiches Protein, das ebenfalls einige RNA-bindende Motive, eingeschlossen das RNP1, enthält. Dieses Protein, welches als NSR1 bezeichnet wird, spielt eine Rolle beim Aufbau der Prä-rRNA in Hefezellen (Kondo + Inouye, 1991; Kondo et al., 1992).

Gleichartige Glycin-reiche Proteine, die eine Homologie zu RNA-bindenden Proteinen aufweisen und ein RNP1-Motiv besitzen, wurden in Pflanzen beschrieben (van Nocker + Vierstra, 1993). Aber auch Proteine mit einer Homologie zu Y-Box-Proteinen wurden in Pflanzen gefunden. Sie [Seite 10↓] bestehen, wie alle Y-Box-Proteine, aus einer Kälteschock-Domäne. Diese ist jedoch an eine Glycin-reiche Domäne gekoppelt, welche außerdem Serin-, Arginin- und Tyrosinreste enthält. Sie sind also ebenfalls reich an Glycin (de Oliviera et al., 1990; Obokata et al., 1991) und wurden deshalb GRP (glycine-rich proteins) genannt. Wahrscheinlich spielen auch diese Y-Box-Proteine eine Rolle im RNA-Metabolismus. Interessant ist auf jeden Fall die Tatsache, dass einige Pflanzenproteine, die Glycin-reiche Domänen enthalten, durch Umweltstress, wie zum Beispiel Verletzungen, induziert werden können (van Nocker und Vierstra, 1993).

1.1.4 Funktion von Y-Box-Proteinen

Eukaryontische Y-Box-Proteine können spezifisch sowohl an Einzelstrang-DNA als auch an Doppelstrang-DNA binden. Dabei konnte für das YB-1 der Säugetiere festgestellt werden, dass es bei seiner spezifischen Bindung an den DRA-Promotor des MHC-Klasse-II-Gens einzelsträngige Bereiche den doppelsträngigen vorzieht (Mac Donald et al., 1995). Für viele Y-Box-Faktoren konnte eine hohe Spezifität bei der Bindung an die sogenannte Y-Box, eine inverse CCAAT-Box, nachgewiesen werden, so z.B. für FRGY1 und FRGY2 aus X. laevis oder für YB-1.

Für einige andere Y-Box-Faktoren wurden andere Spezifitäten im Bindungsverhalten entdeckt. Das RSV-EF-II z.B., ein Y-Box-Faktor, der an die Enhancer-Region des Rous-Sarcoma-Virus bindet, bindet selektiv an eine einzelsträngige Oktamer-DNA-Sequenz, welche 5'-GTACCACC-3' lautet. Er bindet jedoch nicht an die inverse CCAAT-Box, die sich ebenfalls im RSV finden lässt (Claevinger et al., 1996).

Die im Bindungsverhalten von NSEP-1 bevorzugte Sequenz zeigt eine starke Asymmetrie zwischen Purin- und Pyrimidin-reichen DNA-Strängen. Diese asymmetrische Struktur kann man im Promotor des c-myc-Gens finden. Sie ist in der Lage, eine komplexe H-DNA-Struktur zu bilden, die sowohl H-y3 als auch H-y5 enthält und daher als "tandem H-DNA" bezeichnet wird (Firulli et al., 1992).

Im Gegensatz zum NSEP-1 bevorzugt der Y-Box-Faktor von Hühnern, chkYB-1, in seiner Bindung Pyrimidin-reiche DNA-Stränge, ohne dass dabei die Anwesenheit einer Y-Box eine Rolle spielt (Grant et al., 1993).

Bei der Expression von Genen gibt es grundsätzlich zwei Ebenen, an denen regulatorische Mechanismen ansetzen können. Zum einen handelt es sich dabei um die Transkription von DNA zu RNA und zum anderen um die Translation der gebildeten mRNA in Proteine. Die Transkription findet im Kern statt, während die Translation im Zytoplasma abläuft. Kontrollmechanismen während der Transkription beruhen auf der Tatsache, dass die Rekrutierung von RNA-Polymerasen mit unterschiedlicher Effizienz vonstatten geht, je nachdem, wie die DNA-Regulations-Elemente im Chromatin verpackt sind und welche Transkriptionsfaktoren gebunden haben. Unter der großen Vielfalt von Transkriptionsfaktoren lassen sich auch die Y-Box-Proteine finden. Y-Box-Proteine können die Transkription sowohl stimulieren als auch hemmen. So wurde festgestellt, dass im Promotor des hsp70-Gens in X. laevis eine Y-Box für die Expression in Oozyten essentiell ist. Ein Y-Box-bindender Transkriptionsfaktor interagiert mit einem Hitzeschock-Transkriptionsfaktor, woraufhin die Affinität von letzterem für den Promotor, und damit auch die Transkription, steigt (Bienz, 1986).

YB-1 wurde als ein negativer regulierender Faktor bei der Transkription von MHC-II-Genen beschrieben. Es unterdrückt die durch γ— Interferon induzierte Transkription von diesen Genen, indem es einzelsträngige Regionen innerhalb des Promotors bindet bzw. die Ausbildung von DNA-Einzelstrang-Strukturen fördert. Die so entstehende offene DNA-Struktur verhindert die Bindung anderer, positiv regulierender, Transkriptionsfaktoren (Didier et al., 1988; Ting et al., 1994; Mac Donald et al., 1995).

Es ist bekannt, dass das MDR1-Gen eine Y-Box enthält, welche für seine Expression essentiell ist. Dem Y-Box-Protein YB-1 konnte auch bei diesem Gen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Transkription zugeschrieben werden (Goldsmith et al., 1993; Asakuno et al., 1994; Bargou et al., 1997).

Auch in Viren konnte eine transkriptionelle Kontrolle durch Y-Box-Proteine festgestellt werden. Im HTLV-I z.B. findet sich ein Element, das "downstream regulatory element" (DRE-1) genannt wird und für die basale Transkription des Virus benötigt wird. Es wurde ein Protein gefunden, das [Seite 11↓] spezifisch an das DRE-1 bindet und das zunächst als p37 bezeichnet wurde. Tatsächlich handelt es sich bei p37 um YB-1, welches die basale HTLV-I-Transkription in T-Lymphozyten stark erhöht (Kashanchi et al., 1994). Auch beim humanen neurotropen JC-Polyoma-Virus spielt das YB-1 eine Rolle in der Transkriptionsregulation. YB-1 steigert die Transkription, indem es die Affinität von p65 für die NF-kappa-B-Region, einen Bestandteil der Transkriptions-Kontroll-Region des Virus, erhöht (Raj et al., 1996). Beim Humanen Papillomavirus (HPV) Typ 18 wurden ebenfalls Interaktionen zwischen YB-1 und der Enhancerregion des Virus beobachtet (Spitkovskii et al., 1993).

YB-1 spielt eine Rolle bei der Reaktion auf verschiedene Stressreize. Es scheint die Zellen vor den zytotoxischen Effekten von bestimmten Medikamenten, wie Cisplatin und Mitomycin C, sowie von UV-Strahlung zu schützen. Dabei fungiert der Transkriptionsfaktor als ein Erkennungsprotein für geschädigte DNA und spielt eine Rolle bei der DNA-Reparatur und bei der zellulären Antwort auf die DNA-Schädigung (Ohga et al., 1996; Ise et al., 1999). Für diese Funktion spricht auch die Tatsache, dass YB-1, welches sich hauptsächlich im Zytoplasma finden lässt, bei Einwirkung von UV-Strahlung in den Kern befördert wird (Koike et al., 1997).

Da die der nukleären Transkription der DNA folgende Translation der mRNA im Zytoplasma stattfindet, muss ihr ein Transport der gebildeten mRNAs aus dem Kern in das Zytoplasma vorausgehen. Es wird vermutet, dass dieser selektive mRNA-Export zwei Phasen aufweist. Zum einen die Freisetzung von messenger-Ribonukleoprotein-Partikeln (mRNP) aus speziellen nukleären Ankern und zum anderen die Bindung an spezielle Bestandteile, die sich in den Kernporen befinden (Maquat, 1991). Der Export von mRNA aus dem Nukleus wird von spezifischen Faktoren gesteuert. Sofort nachdem die mRNPs im Zytoplasma angelangt sind, wird die RNA auf die Ribosomen verteilt, wo die Translation stattfindet. Hier setzt die Kontrolle der Translation an. Die mRNA bleibt in Ribonukleoprotein-Partikeln verpackt, wobei einige der nukleären Proteine, die mit der mRNA zu einem Komplex zusammengefügt sind, durch zytoplasmatische Proteine ersetzt werden (Pinol-Roma + Dreyfuss, 1992). Die am meisten vorkommenden Proteine in den mRNPs sind Y-Box-Proteine. Bei in vitro-Experimenten konnte festgestellt werden, dass Y-Box-Proteine die Translation unterdrücken, wenn sie in großen Mengen an mRNA gebunden werden (Richter + Smith, 1984; Minich + Ovchinikov, 1992; Minich et al., 1993).

Am besten konnten die Translations-Regulations-Vorgänge bisher in der frühen Entwicklungsphase des Xenopus laevis erforscht werden. In den Oozyten von X. laevis wird mütterliche mRNA in zytoplasmatischen mRNPs gebunden. In diesen Partikeln ist die mRNA maskiert, d.h. sie ist translationsinaktiv. Erst nach der Befruchtung werden spezielle Teile der mRNA aktiviert und dem Prozess der Translation zugeführt (Tafuri und Wolffe, 1993). Die Hauptrolle bei der Verpackung der mRNA spielen Y-Box-Proteine. Es ist möglich, dass sie der RNA gleichsam als "Histone" dienen. Das FRGY2 wird in X. laevis in großer Anzahl zusammen mit der mRNA in den mRNPs gefunden. Die Expression von FRGY2 fördert die selektive Unterdrückung der Translation der mRNA (Ranjan et al., 1993; Bouvet und Wolffe, 1994). FRGY2 übt seinen Einfluss auf die Translation aus, indem es in der Lage ist, spezielle RNA-Sequenzen zu erkennen. Dazu benötigt es die den Y-Box-Proteinen eigene Kälteschock-Domäne. Erleichtert wird die RNA-Bindung durch die N- bzw. C-terminalen Domänen, welche die zentrale Kälteschock-Domäne flankieren (Bouvet et al., 1995).

Zusammenfassend kann man feststellen, dass Y-Box-Proteine eine zentrale Rolle bei der Regulation der Genexpression spielen, wobei sie sowohl auf der Ebene der Transkription als auch der Translation wirken können.

1.2 Multidrug-Resistenz

Ein großes Problem bei der Behandlung von Malignomen, so auch von Brustkrebs, stellt deren Resistenz gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika dar. Dieses Phänomen wird als Multidrug Resistenz (MDR) bezeichnet. Die Tumoren können von Beginn an ein Ansprechen auf die Chemotherapie vermissen lassen oder auch erst im Laufe der Therapie eine Resistenz entwickeln.

Im folgenden sollen generelle molekulare Mechanismen, die der MDR zugrunde liegen können, sowie die drei bis jetzt näher charakterisierten Phänotypen der MDR näher beschrieben werden. Zu ihnen zählen die atypische MDR, die non P-Glykoprotein (P-gp)-assoziierte-MDR und die klassische, P-Glykoprotein-assoziierte MDR.


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1.2.1 Die atypische Multidrug-Resistenz

Es werden verschiedene Mechanismen unter dem Begriff der atypischen MDR zusammengefasst. Zum einen ist die atypische MDR assoziiert mit quantitativen und qualitativen Veränderungen der Topoisomerase II. Dies ist ein Kern-Enzym, welches aktiv an den letalen Vorgängen von zytotoxischen Medikamenten teilnimmt. DNA–Topoisomerasen wirken mit bei verschiedenen Schritten des DNA–Metabolismus, wie z.B. bei bestimmten genetischen Rekombinationen, bei der DNA–Transkription und bei der Chromosomentrennung. Sie sind ein Angriffsziel für verschiedene Chemotherapeutika wie Doxorubicin, Mitoxantron und VP16. Die Veränderungen führen zu einer verminderten Expression des wirksamen Enzyms. Diese Tatsache ist assoziiert mit einer Resistenz gegenüber Chemotherapeutika (Harris und Hochhauser, 1992).

Die atypische MDR kann auch assoziiert sein mit einer gesteigerten Aktivität von Glutathion und Glutathion-Transferasen. Letztere sind Enzyme, die Glutathion mit chemisch reaktiven Gruppen, basischen, sauren oder neutralen, konjugieren. Es wurde gezeigt, dass die Konjugation von Anthrazyklinen mit Glutathion den Eintritt der Therapeutika in den Kern verhindert. Dadurch werden deren zytotoxische Effekte verringert und eine verstärkte Aktivität des Glutathion-Systems kann zu Resistenzen gegenüber Chemotherapeutika im Brustkrebs beitragen (Serafino et al., 1998).

Ein weiterer Mechanismus, der unter dem Begriff der atypischen MDR zusammengefasst wird, beruht auf einer gesteigerten DNA–Reparatur. Defekte DNA–Reparaturmechanismen können ein prädisponierender Faktor für die Entstehung zum Beispiel von Brustkrebs sein. Gesteigerte Reparaturmechanismen jedoch werden verantwortlich gemacht für die Resistenz zum Beispiel gegenüber Cisplatin. Es gibt einige Gene, die durch DNA–Schäden, wie sie durch Chemotherapeutika hervorgerufen werden, induziert werden und zu einer gesteigerten Aktivität der DNA–Reparatur führen (Harris und Hochhauser, 1992).

Als ein Mechanismus der atypischen MDR gilt auch die sog. Medikamenten–Aktivierung. Einige Chemotherapeutika, wie Mitomycin C, Cyclophosphamid und VP16 müssen erst aktiviert werden, um ihre Wirkung zu entfalten. In einigen resistenten Tumoren wurden verringerte Mengen an Cytochrom p450–Reduktase gefunden, was eine verringerte Aktivierung der Therapeutika zur Folge hat. So gelten die erniedrigten Mengen der Reduktase als assoziiert mit einer Resistenz gegenüber Mitomycin C (Harris und Hochhauser, 1992).

1.2.2 Die non-P-Glykoprotein-assoziierte Multidrug-Resistenz

Die nicht mit P-Glykoprotein assoziierte (non-Pgp) MDR beruht, ebenso wie die klassische, P-gp-assoziierte MDR auf einer Aktivierung von membrangebundenen Transportproteinen. Der non-Pgp Phänotyp wird verursacht durch die Überexpression des „multidrug resistance-associated protein“ (MRP)-Gens. Dieses kodiert für ein 190 kD membrangebundenes Glykoprotein, welches, wie das P-gp, der „ATP-binding cassette“ (ABC)–Superfamilie der Transportsysteme angehört. Das Glykoprotein arbeitet wahrscheinlich mit einer direkten Entfernung der Chemotherapeutika aus der Zelle und / oder mit einer Verbesserung der Sequestration der Medikamente in intrazelluläre Kompartimente. Dies führt zu einer Verringerung der wirksamen intrazellulären Konzentration der Medikamente und somit zu einer Verringerung ihrer zytotoxischen Effekte (Nooter und Stoter, 1996).

Ein weiteres Transporterprotein, welches nicht identisch ist mit P-gp oder MRP, wurde in Mitoxantron-resistenten Zelllinien entdeckt. Dieses Protein, das als „breast cancer resistance protein“ (BCRP) bezeichnet wird, ist ebenfalls ein „ATP-binding cassette“ (ABC) Transporter, der assoziiert ist mit der Resistenz gegenüber Mitoxantron und Anthrazyklinen. Eine Überexpression von BCRP mRNA wird häufig in gegenüber Chemotherapeutika resistenten Zelllinien beobachtet, so dass von einer Bedeutung dieses Proteins in der Entwicklung von Resistenzen bei Brustkrebs ausgegangen werden muss (Ross et al., 1999).

1.2.3 Der klassische Phänotyp der Multidrug-Resistenz

Der klassische Phänotyp der MDR basiert auf der Expression des „multidrug resistance 1“–Gens (MDR1). MDR1 kodiert für ein membrangebundenes Transporterprotein der Superfamilie der ABC-[Seite 13↓] Transporter, das P-Glykoprotein. P-Glykoprotein ist ein 170 kD Protein, welches zwei ATP-bindende Kassetten besitzt. Es ist in der Lage, Substanzen mit hydrophoben Regionen aus der Zelle zu schleusen. Dadurch führt es zu einer verringerten zellulären Akkumulation von vielen in der Tumorbehandlung eingesetzten Chemotherapeutika. Verschiedene Modelle für den Arbeitsmechanismus des Multidrug–Transporters (P-gp) werden diskutiert. Am Anfang wurde die Therapeutika–Resistenz als Folge einer Reduktion der Permeabilität der Plasmamembran für verschiedene Therapeutika gedeutet (Kasahara et al., 1991). Später wurde allein die Aktivität des P-gp als eine Ausstrom–Pumpe als Ursache für eine verringerte intrazelluläre Medikamenten–Anhäufung gesehen (Gottesman + Pastan, 1988a; Gottesman und Pastan, 1988b). Heute wird diskutiert, dass der Multidrug–Transporter beides kann, sowohl den Einstrom der Medikamente in das Zytosol reduzieren als auch deren Ausstrom steigern (Amada et al., 1995; Hamada et al., 1994). Das derzeitige Modell besitzt zwei Grundzüge. Zum einen werden die Medikamente erkannt, wenn sie in die Plasmamembran eindringen und werden im Sinne eines „hydrophoben Staubsaugers“ ausgestoßen. Dieser Effekt ist die Ursache für den erniedrigten Wirkstoffspiegel im Zytosol. Zum anderen erfolgt der Transport nur durch einen einzigen Kanal im Transporter (Gottesman und Pastan, 1993). P-gp transportiert jedoch nicht alle beliebigen Chemotherapeutika. Eine Voraussetzung für den Transport von Medikamenten durch P-gp ist deren relative Hydrophobie (Zamora et al., 1988; Nogae et al., 1989). P-Glykoprotein verrichtet seine Arbeit ATP-abhängig. Es ist bekannt, dass beide ATP-bindende Kassetten zur Entfaltung der vollen Effizienz der Transporteraktivität benötigt werden (Azzaria et al., 1989), und dass die Medikamente selbst die ATPase–Aktivität stimulieren (Sarkadi et al., 1992; Ambudkar et al., 1992).

MDR1 wird in vielen normalen Geweben exprimiert. So lässt seine Lokalisation in Hirn-, Hoden- und Plazentagewebe auf eine mögliche Barriere-Funktion von P-Glykoprotein schließen, die verhindern soll, dass sich toxische Stoffe in diesen Geweben anreichern.

Die höchste Expression von P-gp wird in solchen Tumoren gefunden, die von jenen Geweben abstammen, die normalerweise das MDR1-Gen exprimieren. Dies sind Tumoren der Leber, des Darmes, der Nieren, des Pankreas (Goldstein et al., 1989). Diese Tumoren zeigen klinisch eine Resistenz gegenüber Chemotherapeutika. Entsprechende Chemotherapeutika sind Anthrazykline, Vincaalkaloide, Epipodophyllotoxine und Taxane (Gottesmann und Pastan, 1993). Andere Tumoren, wie zum Beispiel der Brustkrebs, die von einem Gewebe abstammen, das normalerweise kein P-gp exprimiert, zeigen eine geringere Expression von MDR1 in einem variablen Prozentsatz der Fälle. So ist in 30 % der primären Brustkrebsfälle eine P-gp-Überexpression zu finden (Sanfilippo et al, 1991). Oft sind diese Tumoren anfangs sensibel gegenüber der Chemotherapie, werden jedoch im Laufe der Behandlung resistent gegenüber den Therapeutika. In 60 bis 70 % des metastatischen Brustkrebses konnten demnach auch erhöhte Expressionen des P-gp nachgewiesen werden (Verelle et al., 1991; Schneider et al., 1994; Lehnert, 1998). Dies führte zu der Vermutung, dass P-gp und somit die MDR einen prognostischen Marker in diesen Tumoren darstellt (Bradley und Ling, 1994). Allerdings wird diese Vermutung auch sehr kontrovers diskutiert, so dass der prognostische Stellenwert des P-gp von anderen Seiten noch sehr in Frage gestellt wird (Kaye, 1997). Es ist möglich, dass in Tumoren, die nicht natürlicherweise P-gp exprimieren, die Expression von MDR1 erhöht wird als die Konsequenz eines Phänotyps größerer Malignität bzw. durch die Induktion von P-gp als Folge einer Chemotherapie. Zumindest im Brustkrebs wurde eine positive Korrelation zwischen P-gp-Expression und einem Phänotyp größerer Malignität gefunden (Linn et al., 1996).

1.2.4 Regulation der Transkription des MDR1-Gens

Das MDR1–Gen ist in seiner Expression stress-induzierbar. Es wird durch Hitzeschock, Schwermetalle (Chin et al., 1990a), zytotoxische Medikamente (Chin et al., 1990b), Karzinogene, Onkogene sowie Tumor-Suppressor-Gene (Chin et al., 1992) und einen Defekt in der regulierenden Untereinheit von cAMP–abhängigen Proteinkinasen (Abraham et al., 1990) reguliert.

Ein stromaufwärts (upstream) und ein stromabwärts (downstream) gerichteter Promotor regulieren das MDR1-Gen (Gottesman und Pastan, 1993). Der stromabwärts gerichtete Promotor wird in Medikamenten–selektierten Zellen aktiviert. Er wird stimuliert durch Produkte des c-Ha-Ras Onkogens und des mutierten p53 Tumor-Suppressor-Gens. Diese Genprodukte sind ihrerseits assoziiert mit Tumor-Progression (Chin et al., 1992). Diese Tatsache unterstützt die Vermutung, dass die Expression des MDR1–Gens assoziiert ist mit der Aktivierung von Onkogenen und / oder dem Verlust an Funktionen von Tumor-Suppressor-Genen während der Tumorentstehung. [Seite 14↓] Inzwischen ist deutlich geworden, dass an der Regulierung des MDR1-Gens ebenfalls nukleäre Faktoren beteiligt sind (Kohno et al., 1994). Ein solcher regulierender Transkriptionsfaktor ist z.B. MDR-NF1, das, wie mit Hilfe von Sequenz–Analysen festgestellt werden konnte, dem YB-1 entspricht.

Der stromabwärts gerichtete Promotor des MDR1–Gens besitzt kein TATA–Element, aber neben einer Reihe von Erkennungssequenzen für verschiedene Transkriptionsfaktoren eine Y-Box, welche für die basale Expression des humanen MDR1–Gens in Gewebekulturen notwendig ist (Goldsmith et al., 1993). Analysen zeigten, dass eine Region zwischen den Nukleotid–Positionen –85 und –70 die Sequenz CTGATTGGCT enthält, welche mit der Sequenz der Y-Box übereinstimmt. Eine Mutation dieser Sequenz zu CTGAGT GGCT hatte zur Folge, dass Proteine nicht mehr gebunden werden konnten, und eine Deletion der Y-Box–Region führte zu einer merklich reduzierten Expression von MDR–Promotor / CAT–Konstrukten. Diese Tatsache weist auf eine mögliche Beteiligung von Y-Box–Proteinen an der Regulation des MDR1–Gens hin (Goldsmith et al., 1993; Asakuno et al., 1994).

Bargou et al. untersuchten 1997 eine mögliche Beteiligung von YB-1 an der Regulation der intrinsischen MDR1-Genexpression. Mit immunzytochemischen Methoden wurden Medikamenten-sensitive MCF-7 Brustkrebszellen und Multidrug-resistente MCF-7 Brustkrebszellen, die in der Anwesenheit von Doxorubicin entstanden sind, auf eine YB-1 und P-Glykoprotein Expression untersucht. Die sensitiven Zellen exprimierten kein P-gp, und YB-1 zeigte sich nur im Zytoplasma. Eine Behandlung dieser Zellen mit Doxorubicin hatte den Zelltod zur Folge. Die resistenten Zellen hingegen exprimierten P-gp und wiesen eine YB-1 Lokalisation ebenfalls im Nukleus auf. Diese Ergebnisse legten die Vermutung nahe, dass die nukleäre YB-1 Lokalisation als Folge der Doxorubicin-Behandlung auftrat und dass YB-1 in die Regulation der MDR1-Genexpression eingreift. Mit immunhistochemischen Methoden wurden weiterhin 27 unbehandelte Gewebsproben primärer Mammakarzinome dahingehend untersucht, ob es eine Korrelation gibt zwischen der YB-1 Expression und der P-Glykoprotein Expression. In allen 27 Proben wurde im Zytoplasma eine YB-1 Überexpression gefunden. In 9 von den 27 konnte eine P-gp Expression festgestellt werden. In diesen 9 Proben war YB-1 im Nukleus zu finden. Bemerkenswert war diese Feststellung insofern als dass jene Proben, bei denen YB-1 nur im Zytoplasma zu finden war, keine P-gp Expression aufwiesen. Somit konnte zusammenfassend die Vermutung aufgestellt werden, dass eine erhöhte und nukleäre YB-1 Expression funktionell mit der P-gp Expression und der MDR1-Genexpression im Brustkrebs verbunden ist, und dass YB-1 daher einen potentiellen molekularen Mechanismus für die Entstehung der Multiplen Medikamentenresistenz in diesen Tumoren darstellt.

1.3 YB-1 als Marker für Prognose und Therapieerfolg beim Brustkrebs

Es wurden schon einige Marker als aussagekräftig im Hinblick auf die Prognose und den Therapieerfolg beim Brustkrebs angesehen. Das Multidrug Resistenz–assoziierte Protein (MRP) wird als ein Marker für eine schlechte Prognose bei Patientinnen mit Brustkrebs diskutiert (Ito et al., 1998). Weiterhin wurde herausgefunden, dass die nukleäre Anhäufung des mutierten Tumor-Suppressor-Gens p53 oft gleichzeitig stattfindet mit der Expression von P-Glykoprotein. Diese gleichzeitige Expression von p53 und P-gp ist assoziiert mit einer kürzeren Überlebenszeit von Patientinnen mit klinisch fortgeschrittenem Brustkrebs (Linn et al., 1996). Die Expression des MDR1-Gens und dessen Genprodukts, des P-Glykoproteins, ist ebenfalls von Interesse im Hinblick auf Prognose und Therapieerfolg bei Patientinnen mit Brustkrebs. Die Bedeutung des P-gp als ein prognostischer Marker im Brustkrebs wird kontrovers diskutiert. Die Expression des P-gp variiert und ist mit einer Resistenz gegenüber bestimmten Chemotherapeutika und mit einer kürzeren progressionsfreien Überlebenszeit verbunden (Verelle et al., 1991). Damit wird vermutet, dass das MDR1 im Brustkrebs einen negativen prognostischen Marker darstellt (Bradley und Ling, 1994), was von anderer Seite (Kaye, 1997) jedoch sehr stark hinterfragt wird. Auch scheint eine positive Korrelation zu bestehen zwischen der P-gp-Expression und einem Phänotyp, der mit einer höheren Malignität einhergeht (Linn et al., 1996). Jedoch lässt die P-gp-Expression keine Aussagen über das Ansprechen einer Chemotherapie zu (Linn et al., 1997) und sie stellt keinen unabhängigen prognostischen Marker für die (krankheitsfreie) Überlebenszeit dar (Honkoop et al., 1998). Wie oben erwähnt, wurde nachgewiesen, dass YB-1 bei der Transkription des MDR1-Gens eine entscheidende Rolle spielt (Bargou et al., 1997). Aufgrund dieser Korrelation zwischen einer nukleären Lokalisation von YB-1 und der Expression von P-gp in Brustkrebszellen, liegt die Vermutung nahe, dass die nukleäre Lokalisation von YB-1 ein Marker für den klinischen Verlauf bei Patientinnen mit Brustkrebs sein könnte. Diese Überlegung wird dadurch unterstützt, dass [Seite 15↓] festgestellt werden konnte, dass die nukleäre Expression von YB-1 im Ovarialkarzinom als ein prognostischer Marker angesehen werden kann und die Sensitivität von Ovarialkarzinomen auf Chemotherapie widerspiegelt (Kamura et al., 1999). Die Aufklärung des prognostischen und / oder prädiktiven Wertes von YB-1 im Brustkrebs ist die Hauptfrage dieser Arbeit und ist von großem Interesse und klinischer Bedeutung in der Therapie des Brustkrebses.

1.4 Zielstellung der Arbeit

1. YB-1, ein humanes Y-Box-bindendes Protein, ist ein Nukleinsäure-bindendes Protein, das die Genexpression auf DNA– und RNA-Ebene beeinflussen kann. Es fungiert als ein Transkriptionsfaktor.

1997 konnten Bargou et al. feststellen, dass in MCF-7 Brustkrebszellen eine nukleäre YB-1 Lokalisation als Folge einer Doxorubicin-Behandlung auftrat, und dass diese Zellen resistent waren gegen Doxorubicin, wohingegen Zellen, die nur eine zytoplasmatische YB-1 Lokalisation aufweisen, sensitiv waren für Doxorubicin. Eine Rolle der nukleären YB-1 Lokalisation wurde daher diskutiert. Bargou et al. untersuchten ebenfalls, ob es eine Korrelation gibt zwischen der YB-1 Expression und der Expression von P-Glykoprotein in primären unbehandelten Mammakarzinomen. Dabei konnte in allen Gewebsproben eine YB-1 Überexpression gefunden werden. In ca. 30 % der Fälle konnte eine P-gp Expression festgestellt werden. Genau diese Proben wiesen eine nukleäre YB-1 Lokalisation auf, während Proben mit zytoplasmatischer Lokalisation von YB-1 eine P-gp Expression vermissen ließen. Somit lag die Vermutung nahe, dass YB-1 einen Einfluss auf die MDR-1 Genexpression und damit auf die P-gp Expression hat und über diesen Einfluss die Entstehung einer Multiplen Medikamentenresistenz begünstigt.

Das Interesse galt daher auch in der vorliegenden Arbeit der Verteilung von nukleärer und zytoplasmatischer YB-1 Lokalisation und der Frage inwiefern die Lokalisation einen Einfluss hat auf die Ausübung der Funktionen von YB-1 und damit auf einen möglichen prognostischen und prädiktiven Aussagewert des Proteins.

2. Eine Beteiligung von YB-1 an der Regulation der Expression des MDR1–Gens wurde in verschiedenen Veröffentlichungen nachgewiesen. MDR1 und sein Genprodukt, das P-Glykoprotein, scheinen aufgrund ihrer Assoziation mit einer Multidrug–Resistenz negative prognostische Marker für den Brustkrebs darzustellen (Verrelle et al., 1991; Bradley und Ling 1994). Es konnte festgestellt werden, dass eine positive Korrelation besteht zwischen der P-Glykoprotein–Expression und der Ausprägung eines Phänotyps höherer Malignität (Linn et al., 1996). Daraus ergibt sich die entscheidende Zielstellung, herauszufinden, ob eine Korrelation besteht zwischen der Expression von YB-1 in primären Brustkrebsgeweben und der Prognose der Patientinnen mit Blick auf ein Ansprechen auf die Chemotherapie, das rezidivfreie Intervall oder die Überlebenszeit. Die Tatsache, dass nachgewiesen werden konnte, dass im Ovarialkarzinom tatsächlich eine Korrelation besteht zwischen der nukleären YB-1 Expression und der Länge des krankheitsfreien Intervalls bzw. der Sensitivität gegenüber einer Chemotherapie (Kamura et al., 1999), unterstützt das entscheidende Ziel dieser Arbeit, nämlich die Aufklärung des prognostischen Wertes von YB-1 im Mamma-Karzinom und die Fragestellung, ob auch YB-1 mit einem Phänotyp höherer Malignität assoziiert ist. Von großer klinischer Bedeutung ist die Frage, ob YB-1 einen Marker für den klinischen Verlauf, die Tumoraggressivität oder das Ansprechen auf eine Zytostatikatherapie beim Mammakarzinom darstellt, der es erlaubt, Risikostratifizierungen durchzuführen.

Die Frage nach dem prognostischen Wert von YB-1 im Brustkrebs spielt insofern eine große Rolle als dass die Inhibierung des Transkriptionsfaktors eine Alternative zur pharmakologischen Blockade des P-Glykoproteins in der Behandlung der Multidrug–Resistenz spielen könnte.

3. Weiterhin gilt das Interesse dieser Arbeit der Frage, ob es Korrelationen gibt zwischen der Expression des YB-1 Proteins und etablierten histomorphologischen Parametern wie Lymphknotenstatus, Tumorgröße, histologisches Grading und Hormonrezeptorstatus für Östrogen und Progesteron. Außerdem stellt sich die Frage nach einer möglichen Assoziation von YB-1 mit den biologischen Faktoren uPA (urokinase-type plasminogen activator) und PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), die als Komponenten des Plasminogen-Aktivierungssystems eine Rolle bei der Invasion und Metastasierung von Tumorzellen spielen und als unabhängige prognostische Faktoren im Mammakarzinom gelten (Grondahl-Hansen et al., 1997; Knoop et al., 1998; Harbeck et al., 2000; Foekens et al., 2000; Jänicke et al., 2001).


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Da noch nicht bekannt ist, in wiefern YB-1 eine klinische Relevanz besitzt, sollte in dieser Arbeit geklärt werden, welchen Einfluß eine YB-1 Expression, verglichen mit Faktoren, die zur Zeit für klinische Risikoklassifizierung genutzt werden, auf den klinischen Verlauf von Brustkrebspatientinnen ausübt.


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18.02.2004