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3  Methoden

3.1 Immunhistochemischer Nachweis von YB-1

Die Tumorgewebeproben wurden mittels Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Das in der Arbeit untersuchte Antigen YB-1 wurde mit Hilfe immunhistochemischer Methoden nachgewiesen. Dabei wurde nach den gängigen Protokollen des Nachweises mittels Alkalischer-Phosphatase-Anti-Alkalischer-Phosphatase verfahren.

3.1.1 Prinzip des immunhistochemischen APAAP-Nachweises

1970 entwickelte Sternberger den immunhistochemischen Nachweis mittels Peroxidase-Anti-Peroxidase, dessen Methode als Vorbild für die heutigen immunhistochemischen Nachweise dient. Bei der direkten Methode können im Gewebe liegende Antikörper oder Antigene direkt nachgewiesen werden. Bei der indirekten Methode, zu der auch der Nachweis mit Alkalischer-Phosphatase-Anti-Alkalischer-Phosphatase gehört, wird das entsprechende nachzuweisende Antigen mit einem Primärantikörper, einem Sekundärantikörper und erst dann mit einer Markersubstanz inkubiert (Abbildung 1). Durch diese verschiedenen "Etagen" von Antikörpern wird eine Verstärkung des Signals erreicht, da die Bindungsstellen für die Markersubstanz vervielfacht werden. Dadurch können auch geringe Mengen an Antigenen nachgewiesen werden.

Bei fixierten Gewebsschnitten muss vor der Inkubation mit den Antikörpern die Fixierung entfernt werden. Danach wird mit der absteigenden Alkoholreihe gespült, was zu einer besseren Penetration der Antikörper führen soll. Die Lösung der Antikörper in Rinderserum soll dafür sorgen, dass nicht-spezifische antigene Bestandteile des Gewebes blockiert werden.

Der Primärantikörper wird gewonnen, indem man das entsprechende (humane) Antigen in ein Tier injiziert. Somit erhält man einen tierischen Antikörper gegen das humane Antigen. Im Fall des YB-1 Nachweises mit der APAAP- Methode wurde der Primärantikörper von einem Kaninchen gebildet. Der Sekundärantikörper soll die Brücke bilden zwischen dem Primärantikörper und dem APAAP-Komplex. Der Sekundärantikörper ist ein IgG-Antikörper, der gegen die konstante Region des Primärantikörpers gerichtet ist. Folglich muss er einen anderen tierischen Ursprung aufweisen. Im Fall des YB-1 Nachweises stammt der Sekundärantikörper aus der Maus und richtet sich mit einem Fab gegen den Kaninchen-Primärantikörper und mit dem anderen Fab gegen den ebenfalls aus dem Kaninchen stammenden Tertiärantikörper, der mit der Alkalischen Phosphatase verbunden ist. Dieses Enzym hat die Funktion, ein farbloses Chromogen in ein finales Produkt umzuwandeln, das dem markierten Antigen eine rote Farbe geben kann. Das wird erreicht, indem zum Schluss eine Inkubation erfolgt mit einem IgG, das gegen die Alkalische Phosphatase gerichtet ist und aus der Maus stammt. Der gesamte Komplex wird mit Neufuchsin eingefärbt und erhält so seine rote Farbe.

Abbildung 1 : Antigen-Antikörper-Komplex bei der APAAP-Methode

Die Abbildung 1 veranschaulicht das Prinzip der Signalverstärkung durch das Auftragen mehrerer "Etagen" von Antikörpern. Der Primärantikörper bindet an das Antigen, während der Sekundärantikörper eine Brücke darstellt zwischen dem Primärantikörper und dem [Seite 21↓] Tertiärantikörper, der das Enzym trägt. Erst als vierte "Etage" wird das IgG gegen das Enzym aufgetragen, welches nun mehrere Bindungsstellen zur Verfügung hat.

3.1.2 Reagenzien für den Nachweis mit der APAAP-Methode

Folgende Reagenzien wurden für die immunhistochemische Nachweismethode mittels der APAAP-Methode benötigt:

Xylol

absteigende Alkoholreihe:
( Rotisol, 80 %ige Ethanollösung, 70 %ige Ethanollösung, 50 %ige Ethanollösung)

destilliertes Wasser

Tris Puffer:
(Tris-Base, Tris-Salzsäure, Natriumchlorid, destilliertes Wasser)

RPMI – Verdünnungsmedium:
(RPMI, destilliertes Wasser, inaktiviertes Rinderserum, Natriumazid)

polyklonaler Primärantikörper (Anti-YB-1) aus Kaninchen

monoklonaler Sekundärantikörper (Anti-Kaninchen) aus Maus

mit Alkalischer Phosphatase gespicktes Anti-Mausimmunglobulin aus Kaninchen

APAAP (monoklonal) aus Maus

Neufuchsin-Entwicklerlösung:
Entwicklungstrispuffer:

(Tris-Base, Tris-Salzsäure, Natriumchlorid, destilliertes Wasser)

AMPD-Levamisol-Lösung:
(Levamisol, 0,2M 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol: AMPD, destilliertes Wasser)

Naphthol-As-Bi-Phosphat

N, N-Dimethylformamid

4 %ige Natriumnitritlösung:
(Natriumnitrit, destilliertes Wasser)

5 %ige Neufuchsin-Stammlösung:
(Neufuchsin, 2 N Salzsäure)

2 N Salzsäure (Eichlösung)

Hämatoxylin

Mowiol

3.1.3 Der immunhistochemische Nachweis von YB-1

Die Brustkrebs-Gewebsschnitte wurden entparaffiniert mit Xylol, worin sie zweimal je 10 Minuten aufbewahrt wurden. Anschließend wurden sie mittels einer absteigenden Alkoholreihe dehydriert. Um überschüssige Alkoholreste zu entfernen, wurden die Objektträger danach mit destilliertem Wasser gespült.

Um die Arbeitsschritte der Färbung beginnen zu können, wurden die Objektträger mit Hilfe des Tris-Puffers auf Klammern aufgezogen. Dieser Arbeitsschritt soll eine gleichmäßige Verteilung der aufzutragenden Antikörper auf den Objektträgern und eine ebenso gleichmäßige Färbung gewährleisten. Danach wurden die Objektträger mit den Klammern in einer speziellen Halterung befestigt.


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Schritt 1 der Färbung ist das Auftragen des Primärantikörpers. Dieser wurde in einer Verdünnung von 1:300 mit dem Verdünnungsmedium RPMI auf die Objektträger gegeben. Das RPMI-Medium wurde zuvor wie folgt angesetzt:

50 ml RPMI

450 ml destilliertes Wasser

50 ml inaktiviertes Rinderserum

0,5 g Natriumazid

Das RPMI-Medium wurde auf einen pH-Wert von 7,4 - 7,6 eingestellt.

Im RPMI-Verdünnungsmedium wurde der Primärantikörper - wie alle im weiteren Verlauf der Färbung verwendeten Antikörper - für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf den Objektträgern belassen. Nichtgebundene Antikörper wurden nach der Einwirkzeit mit Tris-Puffer abgespült.

Nach 10 Minuten wurde der Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:200 aufgetragen. Nach anschließender erneuter Spülung mit Tris-Puffer wurde der Brückenantikörper in einer Verdünnung von 1:100 auf die Objektträger gegeben. Nachdem wiederum mit Tris-Puffer gespült wurde, wurde APAAP in einer Verdünnung von 1:80 aufgetragen und wie die Antikörper 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wurden die Objektträger von den Klammern getrennt und nachdem sie mit destilliertem Wasser abgespült wurden, in eine Küvette mit Neufuchsin-Entwicklerlösung gegeben.

Die Neufuchsin-Entwicklerlösung wurde zuvor wie folgt frisch zubereitet:

Ansatz für eine Standküvette (=60 ml):

Glas A:

 
 

44 ml Entwicklungs-Tris-Puffer:

 

(4,9 g Tris-Base

 

und 1,5 g Tris-HCl

 

und 8,7 g NaCl

 

ad 1 l mit Aqua bidest.

 

auf pH 8,7 mit 1 N HCl einstellen)

 

15,5 ml AMPD-Levamisol-Lösung

 

(25 ml Levamisol gelöst in:

 

15,5 ml 0,2 M 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol: 21 g AMPD und 1 l Aqua bidest.))

Glas B:

 
 

31 mg Naphthol-As-Bi-Phosphat

 

375 ml N, N-Dimethylformamid

Glas C:

 


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320 ml 4 %ige Na-nitritlösung:

 

(12,8 mg Na-nitrit

 

und 320 ml Aqua bidest.)

 

125 ml 5 %ige Neufuchsin-Stammlösung:

 

5 g Neufuchsin

und 100 ml 2 N HCl

Erst den Inhalt von Glas C in Glas A geben und durch leichtes Schütteln eine Lösung der verschiedenen Substanzen abwarten. Dann Glas B dazu geben und ca. 1 Minute reagieren lassen. Den pH-Wert wurde unter ständigem Rühren mit Hilfe von 1 N HCl auf 8,7 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung filtriert und in eine Standküvette eingefüllt.

Die Küvette wurde mit den Objektträgern auf einen Schüttler gestellt und dort 30 Minuten belassen.

Die Objektträger wurden aus der Entwicklerlösung entfernt und Reste der Lösung mit destilliertem Wasser abgespült. Anschließend wurde mit Hilfe von Hämatoxylin gegengefärbt. Die Objektträger wurden wenige Minuten im Hämatoxylin belassen und anschließend in Leitungswasser gestellt bis eine zufriedenstellende Färbung erzielt war. Die so gefärbten Objektträger wurden zum Schluss mit Hilfe von Mowiol eingedeckt.

3.2 Tumoreigenschaften

Verschiedene Eigenschaften der Tumoren wurden erfasst. Die Tumorgröße, der Lymphknotenstatus und das histologische Grading wurden, wie bei Harbeck et al. (1999a) beschrieben, bestimmt. Weiterhin wurde der Steroidrezeptorstatus für Östrogen (ER) und Progesteron (PR) untersucht. Wie bei Schmitt et al. (1997) beschrieben, wurde er in "positiv" und "negativ" eingeteilt. Der Rezeptorstatus wurde als positiv angesehen, wenn Rezeptoren entweder eines der beiden Hormone oder beider Hormone gefunden wurden.

3.3 Immunhistochemische Bewertung der YB-1 Expression

Nach der Durchführung des unten beschriebenen immunhistochemischen Nachweises von YB-1 wurde der Prozentsatz der in einer Gewebsprobe YB-1 - positiven Zellen bestimmt und dann in 4 Kategorien eingeteilt: unter 10%, unter 50%, unter 80% und über bzw. gleich 80%. Die Intensität der Färbung wurde mittels einer Skala von 0 (keine Färbung) bis 3 (starke Färbung) beurteilt. Aus diesen beiden Merkmalen wurde eine immunoreaktive Wertung erstellt (von 0-12), indem die Kategorie des Prozentsatzes der YB-1 - positiven Zellen mit dem Skalenwert der Färbungsintensität multipliziert wurde (Beck et al., 1994). Somit wurden bei dieser Wertung sowohl die Quantität als auch die Qualität der immunhistochemischen Färbung berücksichtigt.

3.4 Statistik

Die statistische Auswertung der Ergebnisse wurde durch Frau Ursula Berger, Institut für Medizinische Statistik und Epidemiologie der Technischen Universität München, und PD Dr. med. Nadia Harbeck, Frauenklinik der Technischen Universität München, vorgenommen. Um Patientinnen mit niedrigem Risiko von denen mit hohem Risiko zu unterscheiden, wurden kontinuierliche Variablen in zweiwertige Variablen umgewandelt (Harbeck et al., 1999a). Für die immunoreaktive Wertung wurde mittels eines logarithmischen Rangsystems ein optimierter Diskriminatorwert eingeführt. Die Diskriminatorwerte wurden jeweils für Patientinnen mit und Patientinnen ohne postoperative Chemotherapie getrennt erstellt. Für Patientinnen mit postoperativer Chemotherapie wurde als Diskriminatorwert eine immunoreaktive Wertung von 4 für YB-1 im Tumorgewebe (YB-1 / Tumor) und eine Wertung von 0 für YB-1 im Tumor-assoziierten Brustepithelgewebe (YB-1 / Epithel) ermittelt. In der Gruppe der Patientinnen ohne postoperative Chemotherapie wurden immunoreaktive Wertungen von 1 für YB-1 im Tumorgewebe und 4 für YB-1 im Tumor-assoziierten Brustepithelgewebe als Diskriminatorwert bestimmt. Die Kombination von YB-1 / Tumor und YB-1 / Epithel wurde bewertet mit der Unterteilung, dass entweder beide Faktoren hoch sind oder beide Faktoren niedrig. Zum Vergleich der YB-1 Immunoreaktivität zwischen dem Tumorgewebe, dem Tumor-assoziiertem Brustepithel und normalen Kontrollen wurden, soweit angebracht, der Wilcoxon Test, der Mann-Whitney U-Test oder der chi2 -Test eingesetzt. Mittels des Mann-Whitney U-Tests wurden mögliche Zusammenhänge zwischen YB-1 und anderen zweiwertigen Variablen untersucht. Die krankheitsfreie Überlebenszeit (disease-free survival, DFS) wurde gemäß Kaplan und Meier (1958) kalkuliert und mit Hilfe einer logarithmischen [Seite 24↓] Rangstatistik verglichen. Aufgrund der geringen Anzahl von Patientinnen wurden die p-Werte von den exakten Verteilungen der logarithmischen Rangstatistik ermittelt. Alle Tests wurden bei einem Signifikanzwert von α =0.05 durchgeführt.


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18.02.2004