Schmitt, Roland: Die Expression von Natrium-Transportproteinen im distalen Rattennephron während der Ontogenese

Aus dem Institut für Anatomie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Die Expression von Natrium-Transportproteinen im distalen Rattennephron während der Ontogenese

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Roland Schmitt ,
aus Bonn

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. S. Bachmann
Prof. Dr. H. Koepsell
Prof. Dr. V. Vallon

Datum der Promotion: 22. Mai 2000

Abstract (english)

The mammalian distal nephron plays a pivotal role adjusting urinary sodium excretion. During the past several years, sites of expression of sodium transport proteins in tubules from adult kidneys have been described and correlated with functional properties. Less information is available concerning sites of expression during tubule morphogenesis. In the current studies, patterns of renal axial differentiation were defined by mapping the expression of ion transport pathways during neprhogenesis in the rat. Combined in situ hybridization and immunohistochemistry were used to localize the Na-Pi cotransporter type 2 (NaPi2), the bumetanide-sensitive Na-K-2Cl cotransporter (NKCC2), the thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter (NCC), the Na/Ca exchanger (NaCa), the epithelial sodium channel (rENaC), and the 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase (11HSD). In parallel the morphologic development of the distal nephron was analyzed to correlate functional and structural properties. The onset of expression of the investigated proteins began in post-S-shape stages. NKCC2 was initially expressed at the macula densa region later extended into the nascent ascending limb of the loop of Henle (TAL), whereas differentiation of the proximal tubular part of the loop of Henle showed a comparatively retarded onset when probed for NaPi2. The NCC was initially found at the distal end of the nascent distal convoluted tubule (DCT) and later extended toward the junction with the TAL. After a period of changing proportions, subsegmentation of the DCT into a proximal part expressing NCC alone and a distal part expressing NCC together with NaCa was evident. Strong coexpression of rENaC and 11HSD was observed in early nascent connecting tubule (CNT) and collecting ducts and later also in the distal portion of the DCT. These data present a detailed analysis of the relations between the anatomic differentiation of the developing renal tubule and the expression of tubular transport proteins.

Keywords:
nephrogenesis, ion transport, tubular segmentation, rat kidney

Abstract (deutsch)

Das distale Nephron spielt eine herausragende Rolle in der Elektrolyt- und Volumenhomöostase. In jüngerer Zeit ist es gelungen einige Proteine, die entscheidend in den tubulären Natriumtransport involviert sind, zu klonieren und auf Tubulusebene zu lokalisieren. Dabei ist das Expressionsmuster dieser Proteine während der Morphogenese weitgehend unbekannt. Die vorliegende Studie beschreibt den Ablauf renaler Differenzierung durch Lokalisation von Natriumtransport-assoziierten Proteinen während der Nephrogenese in der Rattenniere. Der Expressionsnachweis des Na+-Phosphat Kotransporters Typ 2 (NaPi2), des Bumetanid-sensitiven Na+-K+-2Cl--Kotransporters (NKCC2), des Thiazid-sensitiven Na+-Cl--Kotransporter (NCC), des basolateralen Na+/Ca++-Austauscher (NaCa), des epithelialen Na+-Kanals der Ratte (rENaC) und des Enzyms 11beta-Hydroxysteroiddehydrogenase Typ 2 (11HSD) erfolgte mittels kombinierter RNA-In situ Hybridizierung und hochauflösender Immunhistochemie. Parallel dazu wurde die morphologische Entwicklung des distalen Nephrons analysiert, um die funktionelle Reifung mit der strukturellen Reifung korrelieren zu können. Die Expression der untersuchten Proteine begann in post-S-shaped Stadien. Die Expression von NKCC2 wurde zuerst in der Macula densa Region lokalisiert und dehnte sich später in den aufsteigenden Schenkel der Henle´schen Schleife (TAL) aus, während die Differenzierung des proximalen Teils der Henle´schen Schleife, wie durch die Expression von NaPi2 gezeigt, erst später erfolgte. NCC wurde zunächst am distalen Ende des auswachsenden distalen Konvolutes (DCT) gefunden und dehnte sich später in Richtung des Überganges zum TAL aus. Nach einer Entwicklungsperiode, in der sich die Propotionen des DCT noch verändern, zeigte sich eine Subsegmentierung des DCT in einen proximalen Teil, der NCC alleine exprimiert, und eine distalen Teil, der NCC zusammen mit NaCa exprimiert. Eine starke Expression von rENaC und 11HSD wurde im jungen Verbindungstubulus und in den Sammelrohren und später auch im distalen Segment des DCT gefunden. Anhand der gewonnenen Daten ist es gelungen, ein detailliertes Expressionsmuster für die entscheidenden Na+-Transport-assoziierten Proteine des distalen Nephrons und des Sammelrohrsystems während der Ontogenese zu erarbeiten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß einerseits die strukturelle Entwicklung des Nephrons der Expression dieser Proteine bis zu einem gewissen Grad vorausgeht. Andererseits aber auch, daß die Proteinexpression teilweise deutlich vor Beginn der glomerulären Filtration startet. Hieraus ergibt sich die Möglichkeit einer speziellen Funktion der untersuchten Proteine während der Nephrondifferenzierung, die über ihre spätere Rolle als harnmodifizierende Elemente hinausgeht. Die histotopographische Darstellung der Befunde beschreibt die normale Entwicklung der Nephronreifung und bildet damit eine wichtige Grundlage für die Erforschung funktioneller und morphologischer Abweichungen in der renalen Differenzierung.

Schlagwörter:
Nephrogenese, Ionentransport, Tubulussegmentierung, Rattenniere


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteDie Expression von Natrium-Transportproteinen im distalen Rattennephron während der Ontogenese
Abkürzungsverzeichnis Im Text verwendete Abkürzungen
1 Einleitung
1.1Natrium transportierende Proteine im distalen Nephron
1.2Einführung in die Nephrogenese der Säugerniere
2 Zielsetzung der Arbeit
3 Material und Methoden
3.1Versuchstiere und Gewebeprozessierung
3.1.1Perfusionsfixierung und Gewebsprozessierung für Immunhistochemie und In situ-Hybridisierung
3.1.2Perfusionsfixierung und Gewebsprozessierung für feinstrukturelle Morphologie
3.2Morphologische Analyse
3.2.1Lichtmikroskopische Morphologie
3.2.2Elektronenmikroskopische Morphologie
3.3In situ-Hybridisierung
3.3.1In situ-Hybridisierung mit nicht-radioaktivem Detektionssystem
3.3.1.1Präparation der cDNA-Matrizen
3.3.1.2In vitro-Transkription zur Herstellung Digoxigenin-markierter Riboproben
3.3.1.3Hybridisierung Digoxigenin-markierter Riboproben
3.3.1.4Entfernen nicht hybridisierter Riboproben
3.3.1.5Detektion der hybridisierten Riboproben
3.3.2Autoradioaktiv markierte In situ-Hybridisierung
3.3.2.1Präparation der cDNA-Matritzen
3.3.2.2In vitro-Transkription zur Herstellung (35S)-markierter Riboproben
3.3.2.3Hybridisierung (35S)-markierter Riboproben
3.3.2.4Entfernen nicht hybridisierter Riboproben
3.3.2.5Detektion der hybridisierten Sonden
3.4Immunhistochemie
3.4.1Verwendete Primärantikörper
3.4.2Antikörperinkubation und Antikörperdetektion
3.5Kombinierte In situ-Hybridisierung und Immunhistochemie
4 Ergebnisse
4.1Expression von NKCC2 und NaPi2
4.2Expression von NCC und NaCa
4.3Expression von 11HSD
4.4Expression von rENaC
5 Diskussion
5.1Henle´sche Schleife und Macula densa (MD)
5.2Distales Konvolut (DCT)
5.3Verbindungstubulus (CNT)
5.4Sammelrohr (CD)
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf
Anhang A Publikationsliste

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Schema eines mediokortikalen Nephrons. Die in 1.1 beschriebenen Tubulussegmente sind durch Balken voneinander getrennt, und ihre jeweilige Na+-Transportkapazität ist in Prozent angegeben. Die im Text erwähnten distaltubulären Syndrome sind den Tubulusabschnitten zugeordnet, in denen sich ihr Pathomechanismus manifestiert; (in modifizierter Form wiedergegeben aus Bachmann 1998).
Abb. 2: : Schematische Darstel-ung der nephrogenetischen Entwicklung, die das zentrifugale Reifungsmuster in der Nierenrinde verdeutlicht. Direkt subkapsulär befinden sich die kurz zuvor induzierten S-förmigen Körperchen, während die Nephrone in Richtung Medulla an Reife zunehmen; (umgezeichnet in Anlehnung an Osathanondh 1966).
Abb. 3: Übersichtsaufnahmen von In situ-Hybridisierungen mit Digoxigenin-markierten Riboproben für NKCC2 (a, a´), NaPi2 (b, b´) und NCC (c, c´). Die Nieren sind 3 (oben) bzw. 8 (unten) Tage alt. Für keines der Proteine ist eine Expression direkt innerhalb der nephrogenen Zone (Pfeilspitzen) zu beobachten. Am 8. Tag, wenn die Formation neuer Nephrone abgeschlossen ist, ist mRNA-Signal für alle drei Proteine in Tubulusquerschnitten direkt unterhalb der renalen Kapsel sichtbar. Die kortiko-medulläre Grenze ist in den Nieren vom 8. Tag durch gestrichelte Linien markiert. Vergrößerungen: x 110
Abb. 4: Mittels In situ-Hybridisierung ist die Expression von NKCC2 in juxtaglomerulären Zellen von Nephronen im frühen Stadium III (a) und im fortgeschrittenen Stadium III (c) dargestellt. Entsprechende Stadien von Semidünnschnitten verdeutlichen die zunehmende Differenzierung des Nephrons (b, d). Vergrößerungen: x 520.
Abb. 5: Die Expression von NKCC2 in der sich entwickelnden Henle´schen Schleife ist durch In situ-Hybridisierung demonstriert. Während die Henle´sche Schleife im frühen Stadium IV auswächst, nimmt die Signalintensität für NKCC2 in den MD-Zellen zu (a, b) und das Signal beginnt sich entlang des aufsteigenden Schenkels der Henleschen Schleife auszudehnen (c); (AL = aufsteigender Schenkel; DL = absteigender Schenkel der Henleschen Schleife). Die Expression endet einige Zellen distal der MD-Region (c). Die elektronenmikroskopische Darstellung d zeigt die ultrastrukturelle Morphologie einer analogen Henle´schen Schleife im frühen Stadium IV. Im Ausschnitt e ist die basolaterale Membranspezialisierung der MD dargestellt, während g das Fehlen solcher Membranspezialisierung im unreifen aufsteigenden Schenkel der Henleschen Schleife demonstriert. Luminal fallen in den Zellen der MD-Region primitive Microvilli und desmosomale Komplexe auf (f). Vergrößerungen: x 520 (a, b), x 480 (c), x 580 (d), x 71.000 (e) und x 11.100 (e, g).
Abb. 6: Initiale, schwache NaPi2-Expression im typischerweise zunächst kapselwärts ausgerichteten primitiven proximalen Konvolut von Nephronen des späten Stadiums III (a), dargestellt durch In situ-Hybridisierung. Zu beachten ist, daß in MD-Zellen analoger Stadien bereits ein starkes NKCC2-Signal vorhanden ist (c). Die proximalen Tubuluszellen am Urinpol des Glomerulums sind zunächst frei von NaPi2-Signal (a), aber beginnen sobald sich ein deutliches Lumen im PT etabliert hat, mit der Expression (b). In d und e sind morphologisch analoge Stadien zu a und b als Semidünnschnittpräperate dargestellt. Die parallele Applikation von Riboproben für NKCC2 und NaPi2 in f veranschaulicht, die frühere Expression von NKCC2 in prospektiven MD-Zellen, im Vergleich zur schwachen NaPi2-Expression im PT, Vergrößerungen: x 580 (a-e), x 520 (f).
Abb. 7: In a ist ein Nephron im fortgeschrittenen Stadium IV dargestellt, in dem sich das Ende der schwachen Expression von NaPi2 am Übergang in den DL durch In situ-Hybridisierung lokalisieren läßt (Pfeil in a). Mit dem Auswachsen der Henle´schen Schleife und der Differenzierung eines dünnen epithelialen Teils des absteigenden Schenkels dehnt sich das NaPi2-Signal sukzessive in den DL aus (b). Die analoge Morphologie zu b ist als Semidünnschnitt in c dargestellt. Das Signal für NKCC2 nimmt im fortgeschrittenen Stadium IV bereits einen großen Teil des AL ein (d), dazu analoges Stadium als Semidünnschnitt in (e). Die U-förmigen Biegungen der Henle´schen Schleifen zeigen die Expression von NKCC2 im inneren Markbereich einer Niere vom 1. Tag post partum ( f). Vergrößerungen: x 480 (b, c), x 520 (a, d, e, f).
Abb. 8: Wie durch Doppelmarkierung mit NKCC2-Riboprobe und fluoreszenzmarkiertem Antikörper für NCC dargestellt, dehnt sich die Expression von NKCC2 im forgeschrittenen Stadium IV aus (a), während das sich distal anschließende Tubulussegment unreaktiv für NCC bleibt (a´). Die analoge Morphologie ist als Semidünnschnittes in b dargestellt. C zeigt ein schwaches In situ-Hybridisierungssignal für NCC, das sich über die gesamte Länge des primitiven distalen Konvolutes erstreckt. Zu dieser Zeit besteht bereits ein tubuläres Lumen im AL, jedoch setzt sich das Epithel immer noch aus unreif-kubischen Zellen zusammen, denen die typischen Interdigitationen und die basale Streifung weitgehend fehlen (Semidünnschnitt, d). Im Übergangsbereich zwischen post macula-Segment und DCT (Grenze in e, e´ mit einem Balken markiert) überlappt sich das mRNA-Signal für NKCC2 mit dem luminalen Immunosignal für NCC im späten Stadium IV (Pfeilspitze in e, e´). Vergrößerungen: x 520 (a, b, e, e´), x 400 (c), x 580 (d).
Abb. 9: Die Abbildungen a, a´, c, c´ und d zeigen aufeinanderfolgende CNT-Generationen, die zu einer Arkade fusionieren (ältere CNT sind mit 1, jüngere mit 2 gekennzeichnet). Die Komarkierung mit NCC-Antikörper und NaCa-Antikörper (a, a´), bzw NCC-Riboprobe und NaCa-Antikörper (c, c´) zeigt, daß sich das NCC-Signal in jüngeren Generationen bis in die Arkade erstreckt (2), während es in älteren Generationen weiter proximal endet (1). Das NaCa-Signal nimmt parallel dazu in älteren CNT-Generationen an Intensität zu. (d) veranschaulicht in Analogie zu c, c´ die Arkadenmorphologie als Semidünnschnitt. In b ist die typische Verteilung von NaCa immunreaktiven CNT an Tag 4 post partum dargestellt (die nephrogene Zone ist durch Pfeilspitzen markiert.) Vergrößerungen: x 420 (a, a´), x 240 (b), x 480 (c, c´, d).
Abb. 10: Die typische Unterteilung des DCT, wie sie für den adulten Tubulus beschrieben ist, ist mittels dreifach-Markierung von NKCC2-mRNA, NCC- und NaCa-Protein in einem juxtamedullären Nephron der Rattenniere vom 1. Tag post partum dargestellt. Das NKCC2-positive post-Macula Segment (a) ist gefolgt vom NCC-positiven DCT1 (a´). Der Beginn des DCT2 zeichnet sich durch die Koexpression von NCC und NaCa aus (a´´). Vergrößerung: x 520.
Abb. 11: Übersichtsaufnahme einer In situ-Hybridisierung für 11HSD am 3. Tag (a) und am 8. Tag (a´). Die Expression in CNT-Segmenten ist zu beiden Zeitpunkten gleich stark. Im medullären Teil des CD hingegen ist die Expressionsintensität am 3. Tag hoch, während es am 8. Tag schwächer, dafür aber im kortikalen CD stärker geworden ist. In der Region direkt unterhalb der nephrogenen Zone (durch Pfeilspitzen markiert) kann 11HSD in unreifen Tubulussegmenten nachgewiesen werden. Diese exprimieren teilweise gleichzeitig NCC aber kein NaCa, wie in b-b´´ durch Dreifachmarkierung dargestellt. Die distale Einmündung des CNT in den CD ist in c-c´ als Doppelmarkierung mit Antikörper gegen 11HSD und NaCa gezeigt (c´´ zeigt die korrespondierende Aufnahme zu c und c´ im Interferenzkontrast). Das 11HSD-Signal erstreckt sich weiter in den unreifen CNT als das Immosignal für NaCa und endet erst wenige Zellen vor der Einmündung in den CD. Im äußerkortikalen CD ist die Immunreaktivität für 11HSD schwach und endet am Übergang in die Ampulle (Pfeilspitze). S markiert ein S-förmiges Körperchen. Vergrößerungen: x 110 (a, a´), x 520 (b-b´´), x 400 (c-c´´).
Abb. 12: : Die Expression von beta-rENaC im distalen CNT Segment am 4. Tag post partum, nachgewiesen durch autoradiographische In situ-Hybridisierung, die mit Hämatoxylin-Eosin gegengefärbt wurde (a). In analoger Lokalisation zeigt a´ die Immunreaktivität für 11HSD (Nachweis mit der PAP-Methode). In a´´ ist die entsprechende Morphologie als Semidünnschnitt dargestellt, wobei auffällt, daß die Kern:Plama-Relation noch hoch ist, und daß die Zellen noch keine basale Zellspezialisierung aufweisen. Die Expression von rENaC reicht bis zum Übergang in die Ampulle, A, die Expression von 11HSD endet wenige Zellen proximal dieses Punktes. Die schwarzen Balken markieren den Übergang vom CNT in die Ampulle; die subkapsulären S-förmigen Körperchen sind durch S markiert. In b und c sind subkapsuläre Ausschnitte der Expression von gamma-rENaC als autoradioaktiv markierte In situ-Hybridisierung dargestellt. Das Expressionsmuster stimmt mit der Expression der beta-Untereinheit überein (vgl. a und b). Die frühe Expression von rENaC im CNT ist auffallend stark, während sie im subkapsulären Anteil des CD zunächst relativ schwach ist. Vergrößerungen: x 520 (a-a´´), x 400 (c-e).
Abb. 13: Als Detailvergrößerung von der 3 Tage alten Niere zeigt die Doppelmarkierung a und a´, daß der Startpunkt einer schwachen beta-rENaC Immunreaktivität mit dem Startpunkt der Immunreaktivität für NaCa im subkapsulären DCT zusammentrifft (die Balken markieren den Übergang in den immunreaktiven Abschnitt). Nach distal nimmt die Immunreaktivität für rENaC an Intensität zu. In a´´ ist auf einem Konsekutivschnitt gezeigt, daß das Epithel des proximaler gelegenen DCT-Abschnittes exklusiv immunreaktiv für NCC-Antikörper ist. Im sich anschließenden Tubulussegment überlappen sich die drei Signale. Ein ähnlicher Übergangsbereich ist in b und b´ als Ausschnitt der 8 Tage alten Niere dargestellt. Die proximal zunächst schwache Reaktivität von beta-rENaC ist über einige Zellen kolokalisiert mit dem NCC-Signal. Nach distal nimmt das Signal für beta-rENaC an Intensität zu, während das Signal für NCC schwächer wird. Als typischer Befund wurden bei Antikörpernachweisen in allen Stadien Tubulusanschnitte beobachtet, die neben ihrer positiven Immunreaktivität für rENaC und NaCa zwischenliegende unreaktive Schaltzellen aufwiesen (in c und c´ mit Pfeilen markiert). Am 4. Tag zeigte der MCD eine starke Expression von rENaC, wie in d mittels Antikörper und in e mittels autoradiographischer In situ Hybrisierung für beta-rENaC demonstriert. Die etwas schwächere rENaC-Expression im MCD, wie sie am 8. Tag zu finden war, ist anhand einer In situ-Hybridisierung für gamma-rENaC in f dargestellt. Vergrößerungen: x 420 (a-a´´, b, b´), x 1000 (c, c´), x 400 (d-f).
Abb. 14: Die schematische Darstellung aus Abb. 2 ist hier wieder aufgegriffen, um die Verteilung der untersuchten Proteine während der Ontogenese synoptisch zu verdeutlichen (A). B gibt die physiologische Funktion der Proteine wider und erklärt ihre jeweilige Kodierung in Schema a durch Farben und Linien.

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Mon Feb 19 17:53:03 2001