Schmitt, Roland: Die Expression von Natrium-Transportproteinen im distalen Rattennephron während der Ontogenese

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Natrium transportierende Proteine im distalen Nephron

Angesichts sich ständig ändernder Umweltbedingungen muß im Säugerorganismus die Zusammensetzung des “inneren Milieus“, d. h. die Zusammensetzung der Körperflüssigkeiten, in relativ engen Grenzen konstant gehalten werden. Dabei kommt der Niere als Regulationsorgan für die extrazelluläre Volumen- und Elektrolythomöostase eine besondere Bedeutung zu. Um die Anpassung an wechselnde biologische Verhältnisse zu ermöglichen, ist die adaptative Einstellung der renalen Natriumexkretion und -konservierung entscheidend. Natrium (Na+), das das Hauptelektrolyt des extrazellulären Milieus darstellt, wird im Glomerulum frei filtriert und entlang des Tubulus unter Normalbedingungen fast vollständig reabsorbiert. Obwohl sich der Hauptteil der Na+-Reabsorption (ca. 60%) bereits im proximalen Tubulus (PT) abspielt, ist der distale Tubulus (DT) das entscheidende Segment für die adaptative Einstellung der renalen Na+-Ausscheidung. Weitgehend unabhängig vom aktuellen Zustand des inneren Milieus reagiert der PT nämlich auf eine Änderung der filtrierten Na+-Menge mit einer Anpassung seiner Reabsorptionsleistung. Durch diesen Mechanismus, der als “glomerulotubuläre Balance“ beschrieben wird, bleibt der prozentuale Anteil der proximaltubulären Reabsorption, unabhängig von der glomerulär filtrierten Menge, praktisch konstant [Brunner et al. 1966]. Die Reabsorption des DT hingegen steht in entscheidendem Maße unter hormoneller Kontrolle und wird je nach Zustand des inneren Milieus reguliert. Somit stellt das distale Tubulussegment die eigentliche Regelstrecke für die renale Volumen- und Elektrolythomöostase dar [Überblick in Hierholzer et al. 1995].

Der DT setzt sich zusammen aus dem dicken Teil der aufsteigenden Henle´schen Schleife (TAL = thick ascending limb of the loop of Henle), dem distalen Konvolut (DCT = distal convoluted tubule), dem Verbindungstubulus (CNT = connecting tubule) und dem kortikalen sowie dem medullären Sammelrohr (CCD = cortical collecting duct; MCD = medullary collecting duct) [Überblick in Bachmann 1998]. Jedes dieser Segmente weist ein spezifisches Expressionmuster an luminalen Ionentransportern auf, die die Rückresorption von Na+ bestreiten. In jüngerer Zeit ist es gelungen, verschiedene dieser Na+-reabsorbierenden


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Transportproteine, die entlang des distalen Tubulus exprimiert werden, zu klonieren und zu charakterisieren [Canessa et al. 1993, Gamba et al. 1994, Igarashi et al. 1995, Überblick in Bachmann 1999]. Das große Interesse, das diesen Transportern seither entgegengebracht wurde, erklärt sich nicht zuletzt dadurch, daß die Gene, die für diese kodieren, potentielle “Kandidatengene“ für die salzabhängige Form der essentiellen Hypertonie darstellen [Rossier 1997]. Nachdem schon vor längerer Zeit spekuliert wurde, daß die wahrscheinlichsten der lange gesuchten Kandidatengene der essentiellen Hypertonie entlang des Nephrons exprimiert sein könnten [Guyton 1991], hat die Klonierung der distaltubulären Na+-Transportproteine einen konkreten Einblick in jene Mechanismen, die bei der individuellen Blutdruckvariabilität eine Rolle spielen könnten, ermöglicht. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Na+-Transporter und die Krankheitsbilder, die aus einer Dysfunktion dieser Transporter resultieren, sind im folgenden beschrieben.

Ein elektroneutral arbeitender Kotransporter, der jeweils ein Ion Na+ zusammen mit einem Ion Kalium (K) und zwei Chloridionen (Cl-) transportiert, tritt in zwei Isoformen auf. Die erste Isoform ist sekretorisch und kommt in salzsezerniereden Epithelien vor (NKCC1), die zweite Isoform (NKCC2) ist reabsorptiv und kann durch Diuretika wie Furosemid, Bumetanid oder Etacrynsäure gehemmt werden [Überblick in Haas 1994]. NKCC2 wird in Tubuluszellen entlang des TAL exprimiert. Ein verwandter, ebenfalls elektroneutral arbeitender Kotransporter (NCC) wird in DCT-Zellen exprimiert, wo er Na+ und Cl- in einer Stöchiometrie von 1:1 in die Zelle befördert. Dieser Kotransporter ist durch Benzothiadiazinderivate wie Chlorothiazid hemmbar [Gamba et al. 1993, Bachmann et al. 1995]. Beide Transportproteine sind in die apikale Membran der Tubuluszelle eingebaut und arbeiten sekundär aktiv, indem sie den Na+-Konzentrationsgradienten, der durch die basolateral lokalisierte Na+/K-ATPase aufrechterhalten wird, ausnutzen.

Inzwischen sind für die Gene, die für die beiden Kotransporter kodieren, Mutationen beschrieben worden, die in homozygoter Form zu klinischen Syndromen führen. So resultiert aus einer Mutation des für NKCC2-kodierenden Gens der Typ I des sogenannten Bartter-Syndroms [Simon et al. 1996a, Simon et al. 1998]. Das Bartter-Syndrom zeichnet sich durch eine hypokaliämische Alkalose, Hyperkalziurie, renalen Salzverlust und erniedrigten Blutdruck aus. Mutationen in dem für NCC kodierenden Gen führen zum Gitelman-Syndrom,


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bei dem es ebenfalls zu hypokaliämischer Alkalose, renalem Salzverlust und erniedrigtem Blutdruck kommt, wo aber statt der Hyperkalziurie eine Hypokalziurie vorherrscht [Simon et al. 1996b, Simon et al. 1998]. Da sich das Bartter- und auch das Gitelman-Syndrom erst dann klinisch manifestieren, wenn die mutierten Allele in homozygoter Form vorliegen, sind diese Krankheitsbilder relativ selten. Einer interessanten Hypothese zufolge könnte aber auch die wesentlich häufiger vorkommende heterozygote Form der entsprechenden Genmutationen eine klinisch relevante Rolle spielen [Lifton 1996, Simon et al. 1998]. Demnach würde der heterozygote Genstatus zu einer latent leicht verminderten distaltubulären Salzreabsorption führen, was mit einer antihypertensiven, niedrigdosierten Diuretikadauertherapie vergleichbar wäre. Dies könnte einen genetischen, also vererbbaren, Schutz vor salzabhängiger Hypertonie darstellen und zur Erklärung der sehr individuellen Blutdruckabhängigkeit bei salzreicher Diät beitragen. Darüberhinaus könnte der heterozygote Trägerstatus einer Mutation für NKCC2 durch latente Hyperkalziurie aber auch zu einer erhöhten Prädisposition für Nephrolithiasis und Osteoporose führen [Simon et al. 1998]. Eine heterozygote Mutation für NCC mit latenter Hypokalziurie könnte hingegen eine unterdurchschnittlich geringe Anfälligkeit für diese Leiden erklären. Auch in bezug auf Patienten, die auf niedrig dosierte Diuretikatherapie mit einem unerwartet hohen K-Verlust reagieren, wurde als mögliche Ursache ein heterozygoter Allelstatus diskutiert [Simon 1996a]. Dabei würde die Diuretikatherapie ein normalerweise weitgehend kompensiertes Defizit an distaler Salzreabsorption durch NKCC2 oder NCC in klinische Erscheinung treten lassen.

Neben NKCC2 und NCC spielt der aldosteronabhängige, epitheliale Na+-Kanal (ENaC oder rENaC für die Ratte) eine herausragende Rolle bei der distaltubulären Na+-Reabsorption. Dieser für Na+ hochselektive Kanal ist aus drei Untereinheiten (alpha-,beta-und gamma-Untereinheit) aufgebaut und durch Amiloriddiuretika inhibierbar [Canessa et al. 1993 und 1994, Rossier et al. 1994, Überblick in Rossier 1997]. Er ermöglicht den apikalen Einstrom von Na+ entlang des Konzentrationsgefälles in die Tubuluszelle. Unter Stimulation durch Mineralokortikoide wird ENaC verstärkt exprimiert und aktiviert, was sich darin äußert, daß die Na+-Reabsorption via ENaC von einem Niveau unterhalb der Nachweisgrenze innerhalb weniger Stunden auf ein sehr hohes Niveau anwachsen kann [Rossier et al. 1992 und 1994].

Für ENaC sind Mutationen beschrieben, die sowohl zu einer Unter- als auch zu einer Überfunktion des Kanals führen können. So liegt beim sogenannten Liddle-Syndrom ein


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Defekt in der der beta- oder der gamma-Untereinheit von ENaC vor, der zu einer verlangsamten physiologischen Degradation und damit zur Überfunktion des Kanals führt [Shimkets et al. 1994, Hansson et al. 1995]. Es resultiert eine autosomal-dominant vererbare Krankheit, die durch eine frühe und schwerwiegende Form der Hypertonie mit Hypokaliämie und metabolischer Alkalose charakterisiert ist. Eine mutationsbedingte Unterfunktion von ENaC liegt beim Pseudohypoaldosteronismus Typ I vor [Chang et al. 1996]. Ursache ist eine Mutation des für die alpha-Untereinheit kodierenden Gens, woraus bei homozygotem Vorliegen eine hypovolämische Hyponatriämie mit Hyperkaliämie und metabolischer Azidose resultiert.

Physiologischerweise steht die Funktion ENaCs unter der Kontrolle durch Aldosteron. Dabei passiert zirkulierendes Aldosteron die Zellmembran von Mineralokortikoidzielzellen und bildet zusammen mit dem intrazellulären Mineralokortikoidrezeptor (MR) einen Komplex, der auf epigenetischer Ebene Transkriptionsvorgänge reguliert [Arriza et al. 1987], welche u.a. die Aktivität von EnaC steuern [Rossier et al. 1994]. Bei der selektiven Bindung von Aldosteron an den MR spielt ein interessanter Mechanismus, der durch das Enzym 11beta-Hydroxysteroid-dehydrogenase Typ 2 (11HSD) vermittelt wird, eine entscheidende Rolle. Es ist bekannt, daß der MR in bezug auf seine hormonbindende Domäne eine ausgeprägte Homologie zum Glukokortikoidrezeptor besitzt, und daß er in vitro Glukokortikoide und Mineralokortikoide mit gleicher Affinität bindet [Arriza et al. 1987, Krozowski et al. 1983, Funder et al. 1988]. Bedenkt man nun, daß in vivo hundert- bis tausendfach mehr Glukokortikoid als Mineralokortikoid vorliegt, wäre anzunehmen, daß der MR permanent durch Glukokortikoide besetzt sein müßte. Erstaunlicherweise präsentiert sich der Rezeptor in vivo aber mineralokortikoidspezifisch. Diese Spezifität wird durch 11HSD vermittelt, welches die natürlichen Glukokortikoide (im Menschen Kortisol und in der Ratte Kortikosteron) in ihre 11-Dehydro-Metabolite umsetzt. Für diese Metabolite weist der MR nur sehr geringe Affinität auf [Funder et al. 1988]. Ist die katalytische Wirkung von 11HSD gestört, wie es bei einer Mutation im kodierenden Gen vorkommen kann, so bezeichnet man das sich daraus ergebende klinische Bild als apparenten Mineralokortikoidüberschuß (AME). Dabei kommt es durch eine starke Stimulation des MR durch Glukokortikoide zu schwerer Hypertonie und Hypokaliämie [Ulick et al. 1989]. Eine mildere Form dieses Krankheitsbildes resultiert aus einer chemischen Inhibition von 11HSD durch Glycyrrhizinsäure, einem Bestandteil des Süßholzstrauches, der in verschiedenen Süßigkeiten, vor allem in Lakritz, enhalten ist. Die Inhibition von 11HSD erklärt somit die aldosteronähnliche Wirkung, die bei


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übermäßigen Verzehr von Lakritz beobachtet wird, und die gut auf Behandlung mit Spironolacton anspricht [Armanini et al. 1983, Walker et al. 1991].

Die besondere klinische Relevanz der distaltubulären Na+-Transporter geht aber nicht nur auf die oben beschriebenen klinischen Syndrome und ihren möglichen Einfluß auf die salzabhängige Blutdruckvariabilität zurück, sondern auch auf die entscheidende Rolle, die die Transporter als Angriffspunkt klinisch täglich eingesetzter Diuretika spielen. Obwohl der distale Na+-Transport schon seit Jahrzehnten den Hauptangriffspunkt der wichtigsten Diuretika darstellt [Überblick in Ellison 1994], ist es erst durch das Klonieren der angesprochenen Transporter möglich geworden den genauen Wirkmechanismus der verschiedenen Diuretikaklassen zu erforschen und ihren diuretischen Effekt definierten Tubulussegmenten zuzuordnen. Inzwischen wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen eine detaillierte Lokalisation der Proteine im adulten Nephron erarbeitet [Bostanjoglo et al. 1998, Duc et al. 1994, Obermüller et al. 1995 und 1996, Plotkin et al. 1996]. Durch die Ergebnisse dieser Arbeiten wurde es möglich, eine präzise, funktionelle Subsegmentation des distalen Nephrons zu erstellen, die über eine rein morphologische Gliederung hinausgeht [Überblick in Bachmann 1999].


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Abb. 1: Schema eines mediokortikalen Nephrons. Die in 1.1 beschriebenen Tubulussegmente sind durch Balken voneinander getrennt, und ihre jeweilige Na+-Transportkapazität ist in Prozent angegeben. Die im Text erwähnten distaltubulären Syndrome sind den Tubulusabschnitten zugeordnet, in denen sich ihr Pathomechanismus manifestiert; (in modifizierter Form wiedergegeben aus Bachmann 1998).


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1.2 Einführung in die Nephrogenese der Säugerniere

Um die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Begriffe der renalen Ontogenese zu verdeutlichen, sind im folgenden die entscheidenden Schritte der Nephrogenese unter einem morphologischen Gesichtspunkt zusammengefaßt. Im Säugetier vollzieht sich die Nierenentwicklung in kraniokaudaler Richtung, wobei es zunächst im späteren Hals- und Brustbereich zur Formation von renalen Übergangsgebilden (Pronephros und Mesonephros) und später in der Beckenregion zur Bildung der bleibenden Niere (Metanephros) kommt. Das Entstehen von Nierengewebe wird durch ein induktives Wechselspiel zwischen der Ureterknospe, die eine Aussprossung des Urnierengangs darstellt, und dem mesodermalen metanephrogenen Blastem, in das die Ureterknospe einwächst, bestimmt. Die Derivate der Ureterknospe, die nach mehrfacher dichotomer Teilung die Anlage für das spätere Sammelrohrsystem bilden, induzieren bei ihrem Einsprossen in das metanephrogene Blastem die Bildung von Nephronen. Dieser Vorgang findet im äußersten Teil der Nierenanlage, in der sogenannten “nephrogenen Zone“ direkt unterhalb der Nierenkapsel, statt. Mit zunehmender Reife werden die älteren nephrogenen Stadien durch in der nephrogenen Zone neu induzierte Nephrone tiefer in die Nierenanlage verlagert, so daß sich ein zentrifugales Muster für die verschiedenen Reifegrade der Nephogenese ergibt. Die ältesten nephrogenen Stadien befinden sich in der tiefen Kortexregion nahe dem Nierenmark, während die jüngsten Stadien unterhalb der renalen Kapsel zu finden sind (Abb. 2) [Osathanondh et al. 1966].

Die Entwicklung des Nephrons läßt sich in fünf klar differenzierbare Stadien aufteilen [Kazimierczak 1970]. Stadium I entspricht dem Nierenbläschen (renales Vesikel) und ist genau wie Stadium II, welches dem S-förmigen Körperchen (S-shaped Body) entspricht, in der nephrogenen Zone lokalisiert. In Stadium III ist das entstehende Glomerulum oval geformt, und die typischen glomerulären Kapillarschlingen beginnen sich zu entwickeln. Dabei stehen die zylindrisch bis kubisch geformten, viszeralen Epithelzellen des Glomerulums sehr dicht zueinander und sind nur durch enge Interzellularspalten voneinander getrennt. In diesem Stadium werden die ersten Anzeichen für den Beginn einer morphologischen Segmentierung des Tubulus offensichtlich. In Stadium IV ist das Glomerulum größer und die Kapillarschlingen zahlreicher als im vorangegangenen Stadium. Die primitive Henle´sche Schleife ist über den medullären Pol des Glomerulums


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hinausgewachsen, weist aber noch kein tubuläres Lumen auf. Im fortgeschrittenen Stadium IV hingegen ist in der Henle´schen Schleife ein Lumen vorhanden, wodurch nach Neiss die primitive Schleife zur sogenannten unreifen Schleife wird [Neiss 1982a]. Auf dieser Entwicklungsstufe trägt das Epithel des PT den typischen Bürstensaum, und es lassen sich alle tubulären Segmente, die vom adulten Nephron bekannt sind, auf grob-struktureller Ebene erkennen. In Stadium V kommt es zur terminalen Reifung des Nephrons mit dem endgültigen Auswachsen der einzelnen Segmente.

Verglichen mit anderen Organsystemen erstreckt sich die Entwicklung der Niere und speziell die Formation neuer Nephrone über einen ausgedehnten Zeitraum und wird erst relativ spät während der Ontogenese abgeschlossen. In der Ratte beginnt die Nephrogense der bleibenden Niere um den 12. Schwangerschaftstag, und es werden noch bis zum 6.-7. Tag post partum neue Nephrone induziert [Larsson 1975, Nigam et al. 1996]. Dadurch liegen wärend der ersten extrauterinen Tage in der Rattenniere praktisch alle nephrogenen Entwicklungsstadien parallel zueinander vor und ermöglichen eine gleichzeitige Untersuchung anhand eines representativen Querschnitts. Beim Menschen beginnt die Induktion der bleibenden Nephrone in der 8. Schwangerschaftswoche und endet zwischen der 28. und 36. Schwangerschaftswoche, so daß nur bei Frühgeborenen die Nephrogenese noch nach der Geburt fortläuft [Nigam et al. 1996].


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Abb. 2: : Schematische Darstel-ung der nephrogenetischen Entwicklung, die das zentrifugale Reifungsmuster in der Nierenrinde verdeutlicht. Direkt subkapsulär befinden sich die kurz zuvor induzierten S-förmigen Körperchen, während die Nephrone in Richtung Medulla an Reife zunehmen; (umgezeichnet in Anlehnung an Osathanondh 1966).


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Mon Feb 19 17:53:03 2001