Schmitt, Roland: Die Expression von Natrium-Transportproteinen im distalen Rattennephron während der Ontogenese

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Expression von NKCC2 und NaPi2

Vom adulten Nephron ist bekannt, daß NKCC2 in Tubuluszellen entlang des gesamten TAL, einschließlich der Macula densa (MD) und des kurzen post-Macula Segmentes exprimiert wird [Obermüller et al. 1996].

Während der ersten postnatalen Tage waren die zuletzt induzierten Nephrone direkt unterhalb der Nierenkapsel frei von Signal für NKCC2-mRNA (Abb. 3 a). Am 8. Tag post partum hingegen, zu einem Zeitpunkt, an dem die Formation neuer Nephrone abgeschlossen ist, waren direkt subkapsulär gelegene Tubulussegmente mit starker NKCC2-Expression zu erkennen (Abb. 3 a´). Die früheste Expression von NKCC2 wurde in Nephronen des Stadiums III in solchen Tubuluszellen gefunden, deren direkte Nachbarschaft zum korrespondierenden Glomerulum ihre Natur als zukünftige MD Zellen andeutete (Abb. 4 a, c). Während die Feinstruktur dieser Zellen zu Beginn der NKCC2-Expression noch sehr undifferenziert war, folgte in der sich anschließenden Entwicklungsphase eine schnelle Ausdifferenzierung der MD Zellen (Abb. 4 b, d, s.u. Abb. 5 d-f). Mit Elongation der Henle´schen Schleife im frühen Stadium IV, nahm die NKCC2-Expression innerhalb der MD Region an Intensität zu und breitete sich entlang des aufsteigenden Schenkels der Schleife - also entgegegesetzt zur zukünftigen Flußrichtung - aus (Abb. 5 a, b, c). Während dieses Vorgangs zeigte das Glomerulum bereits deutlich differenzierte Kapillarschlingen, deren Anzahl allerdings noch sehr begrenzt war (Abb. 5 d). Die ultrastrukturelle Morphologie der prospektiven MD-Zellen zeigte bereits frühzeitig charakteristische Merkmale der adulten Form. So waren basolaterale Membranauffaltungen innerhalb der MD-Zellen bereits zahlreich vorhanden (Abb. 5 e), während Tubuluszellen in direkter Nachbarschaft noch keine solchen

Spezialisierungen aufwiesen (Abb. 5 g). Obwohl noch kein tubuläres Lumen entstanden war, imponierten am apikalen Pol der MD-Zellen desmosomale Verbindungskomplexe und Microvilli (Abb. 5 f).


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Abb. 3: Übersichtsaufnahmen von In situ-Hybridisierungen mit Digoxigenin-markierten Riboproben für NKCC2 (a, a´), NaPi2 (b, b´) und NCC (c, c´). Die Nieren sind 3 (oben) bzw. 8 (unten) Tage alt. Für keines der Proteine ist eine Expression direkt innerhalb der nephrogenen Zone (Pfeilspitzen) zu beobachten. Am 8. Tag, wenn die Formation neuer Nephrone abgeschlossen ist, ist mRNA-Signal für alle drei Proteine in Tubulusquerschnitten direkt unterhalb der renalen Kapsel sichtbar. Die kortiko-medulläre Grenze ist in den Nieren vom 8. Tag durch gestrichelte Linien markiert. Vergrößerungen: x 110


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Abb. 4: Mittels In situ-Hybridisierung ist die Expression von NKCC2 in juxtaglomerulären Zellen von Nephronen im frühen Stadium III (a) und im fortgeschrittenen Stadium III (c) dargestellt. Entsprechende Stadien von Semidünnschnitten verdeutlichen die zunehmende Differenzierung des Nephrons (b, d). Vergrößerungen: x 520.


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Abb. 5: Die Expression von NKCC2 in der sich entwickelnden Henle´schen Schleife ist durch In situ-Hybridisierung demonstriert. Während die Henle´sche Schleife im frühen Stadium IV auswächst, nimmt die Signalintensität für NKCC2 in den MD-Zellen zu (a, b) und das Signal beginnt sich entlang des aufsteigenden Schenkels der Henleschen Schleife auszudehnen (c); (AL = aufsteigender Schenkel; DL = absteigender Schenkel der Henleschen Schleife). Die Expression endet einige Zellen distal der MD-Region (c). Die elektronenmikroskopische Darstellung d zeigt die ultrastrukturelle Morphologie einer analogen Henle´schen Schleife im frühen Stadium IV. Im Ausschnitt e ist die basolaterale Membranspezialisierung der MD dargestellt, während g das Fehlen solcher Membranspezialisierung im unreifen aufsteigenden Schenkel der Henleschen Schleife demonstriert. Luminal fallen in den Zellen der MD-Region primitive Microvilli und desmosomale Komplexe auf (f). Vergrößerungen: x 520 (a, b), x 480 (c), x 580 (d), x 71.000 (e) und x 11.100 (e, g).


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Zur vergleichenden Analyse des Entwicklungsstandes des PT wurde die Expression von NaPi2 untersucht. Im adulten Nephron wird NaPi2 entlang des gesamten PT einschließlich des gestreckten Teils des proximalen Tubulus (PST = proximal straight tubule) exprimiert, wobei eine Zunahme in der Expressionsintensität vom äußeren Kortex in Richtung Medulla nachgewiesen wurde [Custer et al. 1994].

Während der Nephrogenese zeigten sich erste Zeichen von NaPi2-Expression in Nephronen des fortgeschrittenen Stadiums III, die sich direkt unterhalb der nephrogenen Zone befanden (Abb. 3 b). Ein kortikomedullärer Gradient in der Expressionsstärke wie bei der adulten Niere war zuerst nicht erkennbar, begann sich aber am 8.Tag post partum abzuzeichnen (Abb. 3 b´). Auf Einzelnephronebene wurde die initiale Expression von NaPi2 zuerst in geringer Intensität innerhalb des unreifen proximalen Konvoluts lokalisiert (Abb 6 a). In der Gegenüberstellung zum DT fiel auf, daß die Expression von NKCC2 in Zellen der MD-Region analoger Stadien schon relativ stark war (Abb. 6 c). Während sich in Stadium IV der typische Bürstensaum im PT zu bilden begann, nahm die Expressionstärke von NaPi2 sukzessive zu und dehnte sich auch auf die zunächst signalnegativen, am glomerulären Harnpol gelegenen proximalen Zellen des PT aus (Abb. 6 b). Zum genaueren Vergleich der zeitgleichen Expression von NaPi2 und NKCC2 wurden Riboproben für beide Proteine parallel appliziert. Dabei bestätigte sich eine im Vergleich zur proximalen NaPi2-Expression protrahierte Expression von NKCC2 im aufsteigenden Schenkel der Henle´schen Schleife und speziell in den Zellen der MD. So herrschte im primitiven PT des frühen Stadiums IV typischerweise ein schwaches NaPi2-Signal vor, während die MD-Region desselben Nephrons eine signifikante NKCC2-Expression präsentierte (Abb. 6 f). Zu diesem Zeitpunkt, aber auch noch lange während des anschließenden Auswachsens der Henle´schen Schleife, endete das NaPi2-Signal am Übergang des proximalen Konvoluts in den absteigenden Schenkel der Henle´schen Schleife (Abb. 7 a). Der auswachsende PST blieb lange Zeit frei von Signal. Erst im bedeutend fortgeschrittenen Stadium IV, als der sich spät entwickelnde, dünne Teil der absteigenden Henle´schen Schleife bereits morphologisch abgrenzbar wurde, lies sich eine NaPi2-Transkription im PST nachweisen (Abb. 7 b, c).

Die Expression von NKCC2 im TAL dehnte sich entgegengesetzt der zukünftigen tubulären Stromrichtung kontinuierlich aus (Abb. 7 d, e), bis das mRNA-Signal schließlich nicht nur im


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gesamten aufsteigenden Schenkel der Henle´schen Schleife, sondern auch in der U-förmigen Schleifenbiegung zu finden war (Abb. 7 f). Die Biegungen der längsten Schleifen reichten am ersten Tag post partum bis in die Papillenregion, so daß im prospektiven inneren Nierenmark NKCC2-mRNA nachgewiesen werden konnte. Der dünne Abschnitt der aufsteigenden Henle´schen Schleife, ohne NKCC2-Expression, wie er in langen Henle´schen

Schleifen der adulten Niere gefunden wird, differenzierte sich erst spät, offenbar aus dem zuvor bereits NKCC2-exprimierenden TAL-Gewebe. Distal reichte die Ausdehnung der NKCC2-Expression während der Entwicklung konstant bis einige Zellen hinter die MD an den Übergang in den DCT (Abb. 5 c, 8 a).


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Abb. 6: Initiale, schwache NaPi2-Expression im typischerweise zunächst kapselwärts ausgerichteten primitiven proximalen Konvolut von Nephronen des späten Stadiums III (a), dargestellt durch In situ-Hybridisierung. Zu beachten ist, daß in MD-Zellen analoger Stadien bereits ein starkes NKCC2-Signal vorhanden ist (c). Die proximalen Tubuluszellen am Urinpol des Glomerulums sind zunächst frei von NaPi2-Signal (a), aber beginnen sobald sich ein deutliches Lumen im PT etabliert hat, mit der Expression (b). In d und e sind morphologisch analoge Stadien zu a und b als Semidünnschnittpräperate dargestellt. Die parallele Applikation von Riboproben für NKCC2 und NaPi2 in f veranschaulicht, die frühere Expression von NKCC2 in prospektiven MD-Zellen, im Vergleich zur schwachen NaPi2-Expression im PT, Vergrößerungen: x 580 (a-e), x 520 (f).


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Abb. 7: In a ist ein Nephron im fortgeschrittenen Stadium IV dargestellt, in dem sich das Ende der schwachen Expression von NaPi2 am Übergang in den DL durch In situ-Hybridisierung lokalisieren läßt (Pfeil in a). Mit dem Auswachsen der Henle´schen Schleife und der Differenzierung eines dünnen epithelialen Teils des absteigenden Schenkels dehnt sich das NaPi2-Signal sukzessive in den DL aus (b). Die analoge Morphologie zu b ist als Semidünnschnitt in c dargestellt. Das Signal für NKCC2 nimmt im fortgeschrittenen Stadium IV bereits einen großen Teil des AL ein (d), dazu analoges Stadium als Semidünnschnitt in (e). Die U-förmigen Biegungen der Henle´schen Schleifen zeigen die Expression von NKCC2 im inneren Markbereich einer Niere vom 1. Tag post partum ( f). Vergrößerungen: x 480 (b, c), x 520 (a, d, e, f).


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4.2 Expression von NCC und NaCa

Im adulten Nephron wird NCC von Tubuluszellen entlang des gesamten DCT exprimiert. Die Expression beginnt hinter dem NKCC2-positiven post-Macula Segment und erstreckt sich bis zum Übergang des DCT in den CNT [Obermüller et al. 1995]. Für den reifen DCT ist eine Unterteilung beschrieben, die zwischen einem proximalen DCT-Teil (DCT1) und einem distalen DCT-Teil (DCT2) unterscheidet [Bostanjoglo et al. 1998, Loffing et al. 1996]. Während der DCT1 Charakteristika aufweist, die für das distale Konvolut typisch sind, zeigt der DCT2 ein hybrides Bild, indem er zum einen Spezifitäten des DCT, zum anderen aber auch des CNT zeigt. So wird NCC im DCT1 alleine exprimiert, dagegen im DCT2 zusammen mit NaCa, der im übrigen typisch für den Ratten-CNT ist [Reilly et al. 1993, Obermüller et al. 1995].

Zum Zeitpunkt der initialen Expression von NCC befanden sich die Nephrone im frühen Stadium IV, womit die Expression von NCC in einem späteren Stadium startete als die von NKCC2 oder NaPi2. Diese Beobachtung spiegelte sich auch darin wider, daß die Nephrone, in denen ein initiales mRNA-Signal für NCC zu finden war, weiter von der nephrogenen Zone entfernt lagen als jene, die NKCC2 oder NaPi2 initial exprimierten (Abb.3 c). Dieser “Rückstand“ hatte sich am 8.Tag ausgeglichen, so daß auch in direkt subkapsulär gelegenen Tubulussegmenten starke NCC-Expression vorhanden war (Abb. 3 c´). NCC wurde sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene untersucht. Mit dem initialen Auftreten von NCC-mRNA ging eine positive NCC-Proteinimmunreaktion einher, deren Signal sich am apikalen Zellpol konzentrierte.

Während der frühen NCC-Expression schien der distale Anteil des DCT meist eine höhere Expressionsintensität als der proximale Teil aufzuweisen. Um diese Beobachtung, die auf einen Expressionsstart im distalen DCT hindeutete, zu überprüfen, wurden Doppelmarkierungen mit NCC-Antikörpern und NKCC2-Riboproben durchgeführt. Aus den Doppelmarkierungen ging hervor, daß der Tubulusabschnitt distal des NKCC2-exprimierenden post-Macula Segmentes, im Gegensatz zu der adulten Situation, lange Zeit NCC-negativ bleibt (Abb. 8 a, a´). Diese Beobachtung zeigt zum einen, daß die initiale Expression von NKCC2 in der MD-Region nicht nur früher stattfindet als die von NaPi2 im PT, sondern auch früher als die von


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NCC im proximalen DCT. Zum anderen wird die Vermutung gestützt, daß die erste Expression von NCC tatsächlich im distalen Teil des DCT startet. Der Beginn des DCT war nämlich selbst dann noch frei von NCC-mRNA und auch von Protein, als sich die Nephrone schon im fortgeschrittenen Stadium IV befanden, zu einem Zeitpunkt also, zu dem sie distal schon NCC exprimierten.

Später, im reiferen Stadium IV, hatte sich die NCC-Expression von distal entlang des gesamten DCT nach proximal ausgedehnt, so daß sowohl NCC-mRNA, als auch NCC-Protein über die ganze Ausdehnung des DCT gleichzeitig demonstriert werden konnte. Das Signal begann distal des aufsteigenden Schenkels der Henle´schen Schleife und erstreckte sich bis in den Übergang zum CNT (Abb. 8 c). In diesem Stadium wies die zugehörige Henle´sche Schleife im Regelfall bereits ein tubuläres Lumen auf, das TAL-Epithel war aber noch aus unreifen, kubischen Zellen aufgebaut, denen die im Adulten typische basale Streifung und die zellulären Interdigitationen weitgehend fehlten (Abb. 8 d). Zum Zeitpunkt der in den proximalsten Abschnitt des DCT ausgebreiteten NCC-Expression, wurde zunächst ein partielles Überlappen des luminalen NCC-Immunosignals mit NKCC2-In situ-Hybridisierungssignal im post-Macula Segment beobachtet (Abb. 8 e, e´). Im Gegensatz dazu war der proximale Expressionsbeginn von NCC in reiferen Stadien abrupt, und es bestand keine Überlappung mit NKCC2.

Als morphologischer Anhaltspunkt zur Beurteilung der distalen Ausdehnung der frühen NCC-Expression erwies sich vor allem jener Tubulusabschnitt, an dem sich aufeinanderfolgende CNT-Generationen zu Arkaden vereinigen, als bedeutsam (zur Mikromorphologie der Arkarden s. 6.2, Absatz 2). Die NCC-Signale jüngerer Tubulusgenerationen reichten anfangs bis in die Arkaden, d.h. bis in einen in der adulten Form als CNT definierten Bereich, hinein. In älteren Generationen nahm der proximal des Arkadenanfangs lokalisierte Tubulusabschnitt dann einen CNT-spezifischen Charakter an. Das Ende des NCC-Signals zog sich nach proximal zurück, und die anfangs schwache Immunreaktivität für NaCa nahm in diesem Bereich an Intensität zu (Abb. 9 a,a´,c,c´).


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Abb. 8: Wie durch Doppelmarkierung mit NKCC2-Riboprobe und fluoreszenzmarkiertem Antikörper für NCC dargestellt, dehnt sich die Expression von NKCC2 im forgeschrittenen Stadium IV aus (a), während das sich distal anschließende Tubulussegment unreaktiv für NCC bleibt (a´). Die analoge Morphologie ist als Semidünnschnittes in b dargestellt. C zeigt ein schwaches In situ-Hybridisierungssignal für NCC, das sich über die gesamte Länge des primitiven distalen Konvolutes erstreckt. Zu dieser Zeit besteht bereits ein tubuläres Lumen im AL, jedoch setzt sich das Epithel immer noch aus unreif-kubischen Zellen zusammen, denen die typischen Interdigitationen und die basale Streifung weitgehend fehlen (Semidünnschnitt, d). Im Übergangsbereich zwischen post macula-Segment und DCT (Grenze in e, e´ mit einem Balken markiert) überlappt sich das mRNA-Signal für NKCC2 mit dem luminalen Immunosignal für NCC im späten Stadium IV (Pfeilspitze in e, e´). Vergrößerungen: x 520 (a, b, e, e´), x 400 (c), x 580 (d).


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Abb. 9: Die Abbildungen a, a´, c, c´ und d zeigen aufeinanderfolgende CNT-Generationen, die zu einer Arkade fusionieren (ältere CNT sind mit 1, jüngere mit 2 gekennzeichnet). Die Komarkierung mit NCC-Antikörper und NaCa-Antikörper (a, a´), bzw NCC-Riboprobe und NaCa-Antikörper (c, c´) zeigt, daß sich das NCC-Signal in jüngeren Generationen bis in die Arkade erstreckt (2), während es in älteren Generationen weiter proximal endet (1). Das NaCa-Signal nimmt parallel dazu in älteren CNT-Generationen an Intensität zu. (d) veranschaulicht in Analogie zu c, c´ die Arkadenmorphologie als Semidünnschnitt. In b ist die typische Verteilung von NaCa immunreaktiven CNT an Tag 4 post partum dargestellt (die nephrogene Zone ist durch Pfeilspitzen markiert.) Vergrößerungen: x 420 (a, a´), x 240 (b), x 480 (c, c´, d).


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Eine Subsegmentierung des DCT in DCT1 und DCT2, wie sie für den adulten Tubulus typisch ist, war erst in Nephronen klar zu erkennen, die morphologisch bereits weitgehend ausdifferenziert waren. An das Ende des NKCC2-Signals schloß sich in Richtung stromabwärts ein abrupter Beginn von NCC-Immunreaktivität an. Es folgte ein Tubulusabschnitt variierender Länge, in dem das NCC-Signal ohne gleichzeitige NaCa-Immunreaktivität vorlag, während im Anschluß daran ein Segment folgte, dessen Epithel beide Signale in Kolokalisation aufwies (Abb. 10).

Abb. 10: Die typische Unterteilung des DCT, wie sie für den adulten Tubulus beschrieben ist, ist mittels dreifach-Markierung von NKCC2-mRNA, NCC- und NaCa-Protein in einem juxtamedullären Nephron der Rattenniere vom 1. Tag post partum dargestellt. Das NKCC2-positive post-Macula Segment (a) ist gefolgt vom NCC-positiven DCT1 (a´). Der Beginn des DCT2 zeichnet sich durch die Koexpression von NCC und NaCa aus (a´´). Vergrößerung: x 520.


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4.3 Expression von 11HSD

Im adulten Rattennephron ist 11HSD im Epithel des DCT2 und des CNT lokalisiert. Außerdem im Epithel des Sammelrohres (CD = collecting duct), in dem die Expressionsintensität vom CCD stromabwärts in Richtung innerer Medulla abnimmt [Bostanjoglo et al. 1998].

Es wurde die 11HSD-Expression während der Nephrogenese auf mRNA- und auf Proteinebene untersucht. Auf beiden Ebenen wurde das früheste Auftreten von 11HSD im CNT von Nephronen im fortgeschrittenen Stadium III gefunden. Hinsichtlich dieser frühen Expression fiel die starke Signalintensität sowohl bei In situ-Hybridisierung als auch bei Antikörpernachweis auf. Dabei ging die mRNA-Expression von 11HSD im CNT dem Auftreten von NaCa-Immunreaktivität voraus, das sich erst im frühen Stadium IV detektieren ließ. Im Gegensatz zur Situation in der adulten Niere konnte damit für den CNT eine Entwicklungsperiode demonstriert werden, die durch das Vorliegen von11HSD ohne Kolokalisation von NaCa gekennzeichnet war. Diese im Vergleich zu NaCa frühere Expression von 11HSD blieb in dem zuletzt auswachsenden CNT-Abschnitt, proximal der Einmündung in den CD, bzw. in den Arkaden noch lange Zeit während der Nephronreifung erhalten (Abb. 11 c-c´´).

Im frühen Stadium IV konnte 11HSD-mRNA in Kolokalisation mit NCC-Immunreaktivität im DCT-Epithel nachgewiesen werden. Dabei fielen gewundene Tubulusabschnitte auf, die für 11HSD und NCC positiv, jedoch für NaCa negativ waren (Abb. 11 b-b´´). Ein solches Expressionsmuster deutete auf eine in der Nephronreifung vorkommende Expression von 11HSD im proximalen DCT hin und kommt im adulten Nephron, in dem die Expression von 11HSD und NaCa gemeinsam am Startpunkt des DCT2 beginnt, nicht vor [Bostanjoglo et al. 1998].

In bezug auf den CD war am 1., 3. und 4. Tag post partum eine schwache Expression im kortikalen und eine starke 11HSD-Expression im medullären Anteil festzustellen (Abb. 11 a). Die Expressionsintensität im CD nahm stromabwärts in kortikomedullärer Richtung zu. Es bot sich damit ein Bild, welches genau entgegengesetzt zum adulten Expressionsgradienten (s.o.) war. Am postnatalen Tag 8 hatte die Expressionsstärke im MCD ab- und im CCD


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zugenommen (Abb. 11 a´) und hatte sich damit der adulten Form stärker angeglichen. Die Ampulle war zu allen untersuchten Zeitpunkten frei von 11HSD.

Abb. 11: Übersichtsaufnahme einer In situ-Hybridisierung für 11HSD am 3. Tag (a) und am 8. Tag (a´). Die Expression in CNT-Segmenten ist zu beiden Zeitpunkten gleich stark. Im medullären Teil des CD hingegen ist die Expressionsintensität am 3. Tag hoch, während es am 8. Tag schwächer, dafür aber im kortikalen CD stärker geworden ist. In der Region direkt unterhalb der nephrogenen Zone (durch Pfeilspitzen markiert) kann 11HSD in unreifen Tubulussegmenten nachgewiesen werden. Diese exprimieren teilweise gleichzeitig NCC aber kein NaCa, wie in b-b´´ durch Dreifachmarkierung dargestellt. Die distale Einmündung des CNT in den CD ist in c-c´ als Doppelmarkierung mit Antikörper gegen 11HSD und NaCa gezeigt (c´´ zeigt die korrespondierende Aufnahme zu c und c´ im Interferenzkontrast). Das 11HSD-Signal erstreckt sich weiter in den unreifen CNT als das Immosignal für NaCa und endet erst wenige Zellen vor der Einmündung in den CD. Im äußerkortikalen CD ist die Immunreaktivität für 11HSD schwach und endet am Übergang in die Ampulle (Pfeilspitze). S markiert ein S-förmiges Körperchen. Vergrößerungen: x 110 (a, a´), x 520 (b-b´´), x 400 (c-c´´).


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4.4 Expression von rENaC

Im adulten Nephron ist die Expression von rENaC in Zellen des DCT, des CNT, des CCD und des äußeren MCD beschrieben worden [Duc et al. 1994].

Zur Detektion von rENaC während der Entwicklung wurden in der vorliegenden Arbeit für die mRNA-Ebene autoradioaktiv markierte Ribosonden für die beta- und die gamma-Untereinheit eingesetzt. Darüberhinaus wurden zum Nachweis des Proteins Antikörper gegen die alpha-, beta- und gamma-Untereinheit verwendet.

Im unreifen CNT des sich entwickelnden Nephrons wurde rENaC sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene in einem frühen Entwicklungsstadium gefunden. Die zugehörigen Nephrone befanden sich in Stadium III und waren in kurzer Distanz zur renalen Kapsel lokalisiert (Abb.12 b, c). Auffallend war dabei die fast exakte Kolokalisation von rENaC und 11HSD im gesamten CNT. Die einzige Ausnahme stellten wenige Zellen proximal des Übergangs in die Ampulle dar. In diesen Zellen wurde rENaC exklusiv, also ohne Kolokalisation von 11HSD, nachgewiesen (Abb. 12 a, a´). Dabei zeigten die rENaC und 11HSD exprimierenden Zellen am distalen Ende des CNT eine noch wenig differenzierte Zellmorphologie mit großer Kern:Plasma-Relation und wenig Organellen (Abb. 12 a´´). rENaC wurde im CNT zunächst ohne Kolokalisation von NaCa detektiert. Daraus ergab sich analog zu den Ergebnissen der 11HSD-Expression (s. 5.3), daß auch die Expression von rENaC im CNT früher einsetzte als die von NaCa. In späteren nephrogenen Stadien dagegen fiel der proximale Startpunkt der Immunreaktivität für rENaC unmittelbar mit dem für NaCa zusammen (Abb. 13 a, a´). Der gemeinsame Startpunkt lag im distalen Konvolut und blieb während der Ausreifung des Nephrons bestehen. Die Intensität der Immunreaktivität für rENaC war proximal über einige Tubuluszellen sehr niedrig und nahm nach distal zu (Abb. 13 a). Selten wurde allerdings auch beobachtet, daß der Startpunkt der tubulären rENaC-Immunreaktivität etwas weiter distal lokalisiert war als für die NaCa-Immunreaktivität. Hierbei könnte es sich tatsächlich um eine Heterogenität in der proximalen Ausdehnung von rENaC innerhalb unterschiedlicher Nephrone gehandelt haben, oder aber es lag schlicht ein Sensitivitätsproblem zugrunde, was in Anbetracht der proximal wenig intensiven Immunreaktivität für rENaC am wahrscheinlichsten ist.


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Abb. 12: : Die Expression von beta-rENaC im distalen CNT Segment am 4. Tag post partum, nachgewiesen durch autoradiographische In situ-Hybridisierung, die mit Hämatoxylin-Eosin gegengefärbt wurde (a). In analoger Lokalisation zeigt a´ die Immunreaktivität für 11HSD (Nachweis mit der PAP-Methode). In a´´ ist die entsprechende Morphologie als Semidünnschnitt dargestellt, wobei auffällt, daß die Kern:Plama-Relation noch hoch ist, und daß die Zellen noch keine basale Zellspezialisierung aufweisen. Die Expression von rENaC reicht bis zum Übergang in die Ampulle, A, die Expression von 11HSD endet wenige Zellen proximal dieses Punktes. Die schwarzen Balken markieren den Übergang vom CNT in die Ampulle; die subkapsulären S-förmigen Körperchen sind durch S markiert. In b und c sind subkapsuläre Ausschnitte der Expression von gamma-rENaC als autoradioaktiv markierte In situ-Hybridisierung dargestellt. Das Expressionsmuster stimmt mit der Expression der beta-Untereinheit überein (vgl. a und b). Die frühe Expression von rENaC im CNT ist auffallend stark, während sie im subkapsulären Anteil des CD zunächst relativ schwach ist. Vergrößerungen: x 520 (a-a´´), x 400 (c-e).


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Während der Tubulusreifung ließ sich durch Applikation von Antikörpern gegen rENaC und NCC auf Konsekutivschnitten eine signifikante Kolokalisation der beiden Transportproteine im DCT-Epithel demonstrieren (Abb. 13 a, a´´). Die Kolokalisation erstreckte sich nach distal bis in gestreckte Tubulusabschnitte mit CNT-Charakter. Mit Ausreifung des DCT nahm die Koexpression in ihrer Ausdehnung ab, bis sie schließlich im differenzierten Nephron der 8 Tage alten Niere auf den DCT2 beschränkt war (Abb. 13 b,b´). In DCT2 und CNT aller untersuchten Stadien fielen einzelne Zellen auf, die unreaktiv gegenüber rENaC- und NaCa-Antikörpern waren (Abb. 13 c, c´). Die fehlende Expression von rENaC bzw. von NaCa legte die Identität dieser Zellen als Schaltzellen nahe. Diese Vermutung wurde durch Doppelmarkierungen mit einem Antikörper gegen Bande 3, der Zwischenzellen des Typ A markiert [Alper et al. 1989, Madsen et al. 1992], bestätigt.

Im Gegensatz zur Situation in der adulten Niere konnte rENaC auf mRNA- und Proteinebene entlang des gesamten Sammelrohres, mit Ausnahme der Ampulle, die in der in Regel frei von Signal war (Abb. 12 a, b) nachgewiesen werden. Dabei fiel in den 1, 3 und 4 Tage alten Nieren eine Zunahme an Signalintensität von der Ampulle abwärts in Richtung Medulla auf. Im CD der inneren Medulla war das Signal am stärksten ausgeprägt (Abb. 13 d, e). Am 8. Tag post partum war die Signalintensität in dieser Region leicht abgeschwächt, aber immer noch klar detektierbar (Abb. 13 f). Im kortikalen CD hatte die Expression von rENaC zugenommen.

Bei den durchgeführten Experimenten gab es keine Anzeichen für eine unterschiedliche Expression oder Variation in der Zusammenstellung der untersuchten rENaC-Untereinheiten, stattdessen waren die Untereinheiten stets kolokalisiert.


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Abb. 13: Als Detailvergrößerung von der 3 Tage alten Niere zeigt die Doppelmarkierung a und a´, daß der Startpunkt einer schwachen beta-rENaC Immunreaktivität mit dem Startpunkt der Immunreaktivität für NaCa im subkapsulären DCT zusammentrifft (die Balken markieren den Übergang in den immunreaktiven Abschnitt). Nach distal nimmt die Immunreaktivität für rENaC an Intensität zu. In a´´ ist auf einem Konsekutivschnitt gezeigt, daß das Epithel des proximaler gelegenen DCT-Abschnittes exklusiv immunreaktiv für NCC-Antikörper ist. Im sich anschließenden Tubulussegment überlappen sich die drei Signale. Ein ähnlicher Übergangsbereich ist in b und b´ als Ausschnitt der 8 Tage alten Niere dargestellt. Die proximal zunächst schwache Reaktivität von beta-rENaC ist über einige Zellen kolokalisiert mit dem NCC-Signal. Nach distal nimmt das Signal für beta-rENaC an Intensität zu, während das Signal für NCC schwächer wird. Als typischer Befund wurden bei Antikörpernachweisen in allen Stadien Tubulusanschnitte beobachtet, die neben ihrer positiven Immunreaktivität für rENaC und NaCa zwischenliegende unreaktive Schaltzellen aufwiesen (in c und c´ mit Pfeilen markiert). Am 4. Tag zeigte der MCD eine starke Expression von rENaC, wie in d mittels Antikörper und in e mittels autoradiographischer In situ Hybrisierung für beta-rENaC demonstriert. Die etwas schwächere rENaC-Expression im MCD, wie sie am 8. Tag zu finden war, ist anhand einer In situ-Hybridisierung für gamma-rENaC in f dargestellt. Vergrößerungen: x 420 (a-a´´, b, b´), x 1000 (c, c´), x 400 (d-f).


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Abb. 14: Die schematische Darstellung aus Abb. 2 ist hier wieder aufgegriffen, um die Verteilung der untersuchten Proteine während der Ontogenese synoptisch zu verdeutlichen (A). B gibt die physiologische Funktion der Proteine wider und erklärt ihre jeweilige Kodierung in Schema a durch Farben und Linien.


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