Schmitt, Roland: Die Expression von Natrium-Transportproteinen im distalen Rattennephron während der Ontogenese

50

Kapitel 5. Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurden detaillierte, ontogenetische Expressionsmuster für die untersuchten Na+-transportassoziierten Proteine erarbeitet. Im folgenden sollen die Ergebnisse gegliedert nach den morphologischen Abschnitten des distalen Tubulus erläutert und diskutiert werden.

5.1 Henle´sche Schleife und Macula densa (MD)

In der primitiven Henle´schen Schleife wurde schon in Nephronen des Stadiums III eine starke Expression von NKCC2 gefunden. Damit beginnt die Expression dieses Transporters entscheidend vor Beginn der glomerulären Filtration. Das Signal war zunächst auf die Region der zukünftigen MD konzentriert und dehnte sich später in Richtung der Haarnadelbiegung der Henle´schen Schleife aus. Neben der frühen ontogenetischen Expression von NKCC2 zeigten die MD Zellen eine frühe ultrastrukturelle Spezialisierung, wie sie auch für MD-Zellen in der humanen Niere beschrieben wurde [Dörup et al. 1982]. Die frühe funktionelle sowie morphologische Differenzierung der MD wirft die Möglichkeit einer besonderen Bedeutung dieser Struktur während der Nephrogenese auf. Die MD bildet einen Bestandteil des juxtaglomerulären Apparates, der am Gefäßpol des Glomerulums lokalisiert ist und im Dienste renaler und systemisch relevanter Regulationsvorgänge steht. Nach der aktuellen Modellvorstellung sollen die MD-Zellen als Sensor für die tubuläre NaCl-Konzentration dienen, indem sie bei einem Anstieg der tubulären Strömungsrate bzw. der tubulären NaCl-Konzentration mehr NaCl reabsorbieren. Die so registrierte NaCl-Konzentration soll zwei unterschiedliche Mechanismen steuern, in die die NO-Synthase und die Cyclooxygenase-2 als Modulatoren involviert zu sein scheinen. Zum einen soll ein Anstieg der tubulären NaCl-Konzentration zur Abnahme der Filtrationsrate im korrespondierenden Glomerulum führen. Dieser Mechanismus, der vor allem der kurzzeitigen Anpassung der glomerulären Filtrationsrate dient, wird als sogenannter tubuloglomerulärer Feedback bezeichnet [Überblick in Bachmann 1997, und Schnermann 1998]. Ein zweiter eher langfristig wirkender Mechanismus soll die Reninsekretion der afferenten Arteriole so regulieren, daß über das Renin-Angiotensin-System die extrazelluläre Na+-Konzentration stabilisiert wird [Überblick


51

in Bachmann 1997, und Schnermann 1998]. Der Kotransporter NKCC2, für den eine hohe Expression in der adulten MD nachgewiesen ist [Obermüller et al. 1996], soll für die dem Tubulusstrom proportionale Reabsorption von NaCl verantwortlich sein und somit das biochemische Korrelat für das luminale NaCl-Sensorsystem darstellen [Lapointe et al. 1990, Schnermann 1998]. Als physiologischer Hintergrund für die frühe NKCC2-Expression in der MD, die in ähnlicher Weise auch in der Mäuseniere beobachtet wurde [Igarashi et al. 1995], wäre eine entwicklungsabhängige Rolle in den angesprochenen Regulationsmechanismen denkbar. Die möglichst frühe Initiation eines effektiven tubuloglomerulären Feedbacks, und damit die Möglichkeit die glomeruläre Filtration zu kontrollieren, könnte eine wichtige Bedeutung für den unreifen Organismus haben. Schließlich darf die Filtrationsrate die Reabsorptionskapazität des noch unreifen Tubulus angesichts der postnatal hohen Anfälligkeit für eine Volumen- und Elektrolytdepletion nicht überschreiten. Tatsächlich ist die glomeruläre Filtrationsrate der Rattenniere postnatal zunächst sehr niedrig und steigt erst über einen langen Zeitraum kontinuierlich an, bis sie nach ca. 8 Wochen adulte Werte erreicht hat [Aperia et al. 1992]. Daß die niedrige Filtrationsrate nicht einfach anatomisch durch die Unreife des Glomerulums bedingt sondern funktionell eingestellt ist, wurde durch Versuche an Kaninchen deutlich, die eine postnatale Volumenexpansion mit einer erhöhten glomerulären Filtrationsrate beantworteten [Goldsmith et al. 1979]. Die jungen Nephrone waren also bereits in der Lage auf eine Veränderung des inneren Milieus adäquat zu reagieren, was einen funktionierenden tubuloglomerulären Feedback wahrscheinlich macht. Darüberhinaus konnte in Mikropunktionsstudien gezeigt werden, daß die Reabsorptionskapazität im PT und auch im TAL postnatal niedrig ist [Horster 1978 und 1982, Aperia et al. 1992]. Da in diesen Tubulusabschnitten wenig reabsorbiert wird, ist am MD-Segment mit einer erhöhten Salzladung zu rechnen. Dies könnte in Anbetracht der nachgewiesen hohen Expression von NKCC2 mit einer erhöhten Salzreabsorption in der MD einhergehen und somit entsprechend dem oben diskutierten Feedbackmechanismus zu einer Abnahme der Filtrationsrate führen. Darüberhinaus könnte auch ein Bezug zu dem vermuteten zweiten, eher langfristig wirkenden Regulationsmechanismus hinsichtlich einer Stabilisierung der extrazellulären Na+-Konzentration über das Renin-Angiotensin-System von Bedeutung sein. Passend zu den angestellten Überlegungen konnte eine frühe Expression der in diese Mechanismen involvierten Enzyme NO-Synthase und Cyclooxygenase-2 in der MD sowie von Renin in der afferenten Arteriole gezeigt werden [Fischer et al. 1995, Zhang et al. 1997].


52

Die hohe Expressionsrate für NKCC2 in der MD und vor allem die Tatsache, daß NKCC2 schon vor Beginn der glomerulären Filtration detektiert werden konnte, könnte aber auch auf eine weitere, spezifisch entwicklungsphysiologische Funktion dieses Proteins bzw. der MD an sich hinweisen. In diesem Zusammenhang ist die neonatale Form des Bartter-Syndroms interessant, bei dem die homozygote Mutation für das NKCC2-kodierende Gen vorliegt. Dabei kommt es neben Volumen- und Elektrolytstörungen (s. 2.1) zu mikroanatomischen Abweichungen, wobei vor allem eine retardierte glomeruläre Entwicklung sowie eine Hypertrophie des juxtaglomerulären Apparates auffallen [Barajas et al. 1994, Taugner et al. 1988, Wong et al. 1996]. Diese Beobachtungen lassen sich möglicherweise dadurch erklären, daß der regulatorische Einfluß, den die MD-Zellen normalerweise auf die strukturelle Entwicklung des Glomerulums und des juxtaglomerulären Apparates haben könnten, von NKCC2 abhängt. Nach dieser Hypothese könnte eine Fehlexpression dieses Proteins, wie sie im Bartter-Syndrom auftritt, direkt zu den angesprochenen Entwicklungsstörungen führen. Möglicherweise spielt NKCC2 also während der Entwicklung eine besondere Rolle hinsichtlich der mikromorphologischen Differenzierung renaler Strukturen, die über seine prospektive Funktion als apikal-reabsorptivem Ionentransporter und NaCl-Sensor des juxtaglomerulären Apparates hinausgeht.

Zur vergleichenden Analyse des distalen und proximalen Anteils der Henle´schen Schleife wurde die Expression von NaPi2 untersucht. Die mRNA-Expression dieses Proteins zeigte ihr initiales Auftreten im unreifen proximalen Konvolut. Der PST hingegen war noch während einer längeren Entwicklungsphase frei von NaPi2-mRNA und begann erst spät mit der Expression. Im Vergleich war die Expression von NKCC2 im distalen Schenkel der Henle´schen Schleife bereits wesentlich früher zu detektieren. Die mikromorphologische Reifung der Henle´schen Schleife ist von Neiss sehr detailliert beschrieben worden [Neiss 1982a]. Demnach beginnt die entscheidende Verlängerung des zunächst sehr kurzen PST erst, wenn sich in der Henle´schen Schleife bereits ein tubuläres Lumen gebildet hat. Dabei wächst die unreife Schleife in distaler Richtung aus, wobei das undifferenzierte niedrige Epithel des absteigenden Schenkels durch bürstensaumtragendes proximales Tubulusepithel ersetzt wird. Betrachtet man die NaPi2-Expression als representativen Indikator für eine funktionelle Ausdifferenzierung des proximalen Tubulusepithels, so konnte in der vorliegenden Arbeit entsprechend den mikromorphologischen Beobachtungen von Neiss gezeigt werden, daß sich auch die funktionelle Differenzierung des PST relativ spät während der Nephrogenese


53

vollzieht. Die Expression von NaPi2 im PST begann sich langsam in distaler Richtung auszubreiten, als sich bereits ein tubuläres Lumen gebildet hatte. Gleichzeitig entwickelte sich distal des auswachsenden PST der dünne Teil des absteigenden Schenkels der Henle´schen Schleife (DTL = descending thin limb) aus dem niedrigen, unreifen Epithel des absteigenden Schenkels. In der adulten Niere ist das Epithel des DTL wenig differenziert und zeichnet sich duch eine geringe Cytoplasmamenge und eine Armut an Zellorganellen aus [Übersicht in Bachmann 1998]. Durch eine hohe Permeabilität für Wasser und NaCl und die anatomische Nähe zum TAL hat der reife DTL herausragende Bedeutung für das renale Gegenstromsystem, auf das der Mechanismus der Harnkonzentrierung aufbaut [Berliner 1976, Übersicht in Hierhozer et al. 1995]. Die demonstrierte relativ späte Entwicklung des DTL mag dazu beitragen, daß die Harnkonzentrierungskapazität bei Ratten erst im Alter von 6-8 Wochen und bei Menschen im Alter von 1,5 Jahren adulte Werte erreicht [Polácek 1965, Rane 1985].

In langen Henle´schen Schleifen, d.h. in Schleifen die bis in die innere Medulla reichen (s. Abb. 1), existiert ein dünner Teil im aufsteigenden Schenkel der Henle´schen Schleife (ATL = ascending thin limb). Der Übergang dieses ATL in den TAL markiert definitionsgemäß die Grenze zwischen innerer und äußerer Medulla. Im ATL finden im Gegensatz zum energieaufwendigen Elektrolyttransport des TAL hauptsächlich passive Tranportprozesse statt, das Epithel ist sehr niedrig, arm an Zellorganellen und exprimiert kein NKCC2 [Übersicht in Bachmann 1998, Obermüller et al. 1996]. Hinsichtlich des ATL-Epithels beschreibt Neiss eine im Vergleich zum DTL-Epithel unterschiedliche Genese [Neiss 1982a]. Während sich der DTL wie bereits erwähnt direkt aus dem niedrigen Epithel des unreifen absteigenden Schenkels bildet, entwickelt sich im gesamten aufsteigenden Schenkel der Schleife zunächst hohes distaltubuläres TAL-Epithel. Die spätere Konversion vom hohen TAL-Epithel in das niedrige Epithel des ATL vollzieht sich nach Neiss, der in diesem Tubulussegment Autophagosomen und hohe lysosomale Aktivität nachweisen konnte, durch autolytische Prozesse. In Einklang mit diesen morphologischen Befunden wurde in der vorliegenden Arbeit in Nephronen des Stadiums IV NKCC2-mRNA noch im gesamten aufsteigenden Schenkel der Henle´schen Schleife demonstriert, was den TAL-Charakter dieses Segmentes unterstreicht. Dabei exprimierten am 1. Tag post partum auch die aufsteigenden Schenkel und Schleifenbiegungen jener Henle´schen Schleifen, die bis in die innere Medulla reichten, noch durchweg NKCC2. Die Differenzierung des NKCC2-negativen


54

ATL begann erst nach dem 1. Tag. Diese Beobachtung korrespondiert mit den Befunden von Neiss, der den Beginn der Umformung von TAL- in ATL-Zellen um den ersten Tag postnatal datiert [Neiss 1982a]. Die Differenzierung des ATL aus TAL-Zellen stellt eine Konversion von funktionell zumindest teilweise schon differenziertem Epithel in eine andere Epithelform dar. Es ist denkbar, daß dieser Prozeß als Antwort auf die entwicklungsabhängige Reifung der tubulären Transportkapazität und der zunehmenden Tubuluslänge verstanden werden kann. So könnte die weite Ausdehnung der NKCC2-Expression, die zunächst den gesamten aufsteigenden Schenkel und die Schleifenbiegung in allen Henle´schen Schleifen miteinbezieht, einen notwendigen Kompensationsmechanismus für die unreife, weniger effektive Reabsorptionsfähigkeit anderer Tubulussegmente darstellen. Mit zunehmender Zellspezialisierung und der Ausreifung einer effektiven Reabsorptionskapazität wäre dann eine relative Verkürzung des NKCC2-exprimierenden Segmentes möglich und ein Teil der energieaufwendigen TAL-Zellen könnte durch energiesparende ATL-Zellen ersetzt werden. Dabei bestimmt anscheinend die histotopographische Lokalisation, d.h. ob sich die Tubuluszellen innerhalb oder außerhalb des inneren Markes befinden, über das Beibehalten der TAL-Charakteristika oder die Umformung zu ATL-Zellen.

Da das Auftreten von NKCC2 und NaPi2 in dieser Arbeit nur auf mRNA-Ebene untersucht wurde, ist es bei allen angestellten Überlegungen natürlich auch nicht auszuschließen, daß die kodierenden Gene zwar früh transkribiert werden, daß dies aber nicht mit der Synthese funktionellen Proteins einhergeht. In weiterführenden Versuchen müßte zur Absicherung der Ergebnisse daher ein analoger Nachweis mittels Antikörpermarkierung auf Proteinebene folgen.

5.2 Distales Konvolut (DCT)

Der adulte DCT, der kurz hinter der MD beginnt, exprimiert über seine gesamte Länge NCC [Obermüller et al. 1995, Bachmann et al. 1995]. Die ontogenetische Expression von NCC wurde zuerst im distalen Teil des DCT beobachtet. Später dehnte sie sich nach proximal aus, bis sie schließlich den Schnittpunkt mit dem post-Macula Segment des TAL erreichte. In


55

bezug auf die Relation zwischen mRNA und translatiertem Protein konnte dabei nachgewiesen werden, daß schon die früheste Expression von mRNA für NCC mit der Bildung des immunreaktiven Proteins einherging. Dabei war die Immunreaktivität, wie für den adulten Tubulus beschrieben [Bostanjoglo et al. 1998, Plotkin et al. 1996], schon beim ersten Auftreten des Transporters am apikalen Zellpol der DCT-Zellen konzentriert. Offenbar wird das Protein von Anfang an gezielt in die lumenseitige Plasmamembran eingebaut. Im Gegensatz dazu wurde für andere Transporter, wie z.B. die Na+/K-ATPase, beschrieben, daß der Einbau in die Membran der Tubuluszelle zu Beginn der Expression im Unterschied zur reifen Zelle nicht vollständig polarisiert ist [Minuth et al. 1987]. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß die Expression von NCC erst in einem vergleichsweise späten Stadium beginnt. Insofern könnter der von Anfang an polarisierte Membraneinbau von NCC durch ein zu diesem Zeitpunkt schon suffizient ausgereiftes System zellulärer Polarisierungsmechanismen erklärt werden. Viele Aspekte der einzelnen Vorgänge, die zur epithelialen Polarisierung beitragen, sind noch weitgehend unklar, jedoch konnten verschiedene Komponenten der beteiligten Systeme charakterisiert werden [Ekblom 1989; Nelson 1992, Brown et Stow 1996]. Inwieweit diese in den polarisierten Membraneinbau der renalen Na+-Transporter involviert sind, ist gegenwärtig weitgehend unbekannt. Im Hinblick auf mögliche Störungen bei der epithelialen Polarisierung und den zellulären Fehleinbau von Elektrolyttransportern, wie z.B. bezüglich des Pathomechanismus der polyzystischen Nierenerkrankung diskutiert [Übersicht in Wilson 1997], wäre eine genauere Untersuchung dieser Korrelation während der Ontogense interessant.

Wenn sich die Expression von NCC in proximaler Richtung bis zum post-Macula Segment ausgedehnt hat, schließt sich eine Entwicklungsphase an, in der ein kurzes Tubulussegment existiert, in dem sich NCC und NKCC2 überlappen. Zu dieser Überlappung, die im adulten Nephron nicht vorkommt [Obermüller et al. 1995], kam es im morphologisch schon relativ reifen Stadium IV, was darauf hindeutet, daß die endgültige Determination der Zellfunktion in der Übergangszone zwischen TAL und DCT erst spät während der Ontogense stattfindet.

Ähnlich spät kam es in bezug auf die distale Grenze des DCT, also den Übergang in den CNT, zur endgültigen Determination. Der Übergang zwischen dem DCT und dem CNT war zunächst von Vorgängen proportionaler Verschiebung gekennzeichnet. Auffällig war vor allem der Übergangsbereich, in dem verschiedene Generationen von Tubuli zu Arkaden


56

fusionierten. In der Rattenniere nimmt jedes Sammelrohr jeweils 5-6 Nephrone auf. Davon werden nur die beiden am weitesten subkapsulär gelegenen, also zuletzt induzierten, Nephrone über einen individuellen CNT drainiert. Die CNT der 3-4 juxtamedullär und mediokortikal gelegenen Nephrone hingegen erreichen das Sammelrohr über eine gemeinsame Arkade [Neiss 1982b]. Im adulten Nephron beginnt das typische Epithel des CNT etwas proximal der Arkadenformation [Kaissling et al. 1979], so daß das Tubulussegment vor der Arkade den CNT-typischen Transporter NaCa exprimiert, gleichzeitig aber frei von NCC ist. In der sich entwickelnden Niere hingegen wurde NCC im Tubulussegment direkt proximal der Arkade stark exprimiert, während die Immunreaktivität für NaCa in diesem Segment schwach war. Erst im Laufe der späten Reifung nahm die Anzahl der Zellen ohne NCC-Expression, aber mit starkem NaCa-Signal, proximal des Übergangs in die Arkade zu, so daß das Segment ein CNT-typisches Aussehen erhielt. Morphologische Untersuchungen auf ultrastruktureller Ebene haben ebenfalls gezeigt, daß sich während der Nephronreifung lange Zeit keine klare Grenze zwischen dem Ende des DCT und dem Beginn des CNT ziehen läßt [Dörup et al. 1982, Neiss 1982b]. Eine gewisse Flexibilität hinsichtlich der Proportion des DCT scheint in der adulten Niere beibehalten zu werden. Jedenfalls weisen darauf Experimente von Loffing et al. an Ratten hin, in denen eine durch chronische Furosemidinfusion erhöhte Salzladung im DCT zu einer Hyperplasie der DCT-Zellen führte [Loffing et al. 1995]. Ein weiterer ähnlich aufgebauter Versuchsansatz derselben Arbeitsgruppe ist an dieser Stelle unter einem anderen Aspekt interessant. Wurde statt Furosemid ein Thiaziddiuretikum in hoher Konzentration verabreicht, stellten sich bei den untersuchten Ratten peritubuläre Entzündung und Apoptose von DCT-Zellen ein [Loffing et al. 1996]. Dabei war erstaunlicherweise nur der DCT1 von diesen Schäden betroffen, während der DCT2 verschont blieb. Loffing et al. führten die Apoptose und die strukturellen Schäden der DCT-Zellen auf ein osmotisches Phänomen zurück. Dabei gingen sie davon aus, daß die Blockade von NCC durch Thiazidgabe zu einem Mangel an intrazellulärem Na+ mit osmotischen Konsequenzen führt. Da die Schäden aber nur im DCT1 auftraten, schlußfolgerten Loffing et al., daß es im DCT2 neben dem Transportweg via NCC einen weiteren Na+-Transportweg geben müßte. Würde der Transportweg via NCC durch Thiazide unterbrochen, so könnte dieser zweite thiazidunabhängige Na+-Reabsorptionsweg den intrazellulären Na+-Bestand sichern und den DCT2 so vor dem vermuteten osmotischem Streß bewahren. Nach den Untersuchungen von Duc et al., die rENaC im DCT lokalisiert hatten [Duc et al. 1994], wurde rENaC als wahrscheinlicher Kandidat für diesen zweiten Na+-Transportweg vorgeschlagen [Loffing et al. 1996]. In ihrer Studie hatten Duc et al. die

57

Ausdehnung der rENaC-Expression im DCT, den sie nach rein morphologischen Kriterien als solchen bestimmt hatten, allerdings nicht spezifiziert und stattdessen pauschal über eine Expression von rENaC entlang des gesamten DCT berichtet. Wäre rENaC aber tatsächlich entlang des gesamten DCT exprimiert, so hätte der von Loffing et al. vermutete Mechanismus auch die Zellen des DCT1 vor Schäden durch Thiazidgabe bewahren müssen. In der vorliegenden Arbeit ist es durch Kolokalisationsnachweise mit NCC und NaCa gelungen den exakten Beginn der rENaC-Expression am Übergang vom DCT1 in den DCT2, während der Entwicklung und im weitgehend reifen Nephron, zu demonstrieren. Damit wird nicht nur das Ergebnis von Duc et al. konkretisiert, sondern außerdem die Hypothese von Loffing et al. in bezug auf den postulierten zweiten Na+-Transportweg via rENaC in DCT2-Zellen gestützt.

Im Hinblick auf die ontogenetisch schon frühe Expression von rENaC im DCT2 sind außerdem Ergebnisse älterer Mikropunktionsstudien interessant. Während der adulte DCT ungefähr 7% des glomerulär filtrierten NaCl reabsorbiert, geht aus Mikropunktionen an neonatalen Ratten, Hunden und Meerschweinchen hervor, daß die Reabsorptionsfraktion des postnatalen DCT deutlich höher liegt [Kleinman 1975, Aperia et al. 1981, Merlet-Benichou et al. 1977]. Als mögliche Ursache für die größere Na+-Reabsorptionsleistung durch den DCT wurde ein Einfluß des postnatal erhöhten Spiegels an zirkulierendem Mineralokortikoid diskutiert [Henning 1978, Merlet-Benichou et al. 1977]. Ein hoher Mineralokortikoidspiegel könnte für die nachgewiesene, starke Expression von rENaC im DCT2 verantwortlich sein, und folglich über Na+-Transport via rENaC zu der erhöhten Na+-Reabsorptionsfraktion im DCT beitragen. In jüngeren Arbeiten wurde darüberhinaus auch für NCC eine beachtliche Induktion durch Mineralokortikoid demonstriert [Velázquez et al. 1996, Kim et al. 1998]. Obwohl die Expression von NCC in frühen Stadien zunächst nur im distalen DCT nachweisbar war, ließ sich in späteren Stadien eine hohe Expressionrate von NCC entlang des gesamten DCT demonstrieren, was ebenfalls zur postnatal erhöhten Reabsorptionsfraktion des DCT beitragen könnte. Allerdings sind im adulten DCT zwar ca. 50% der Na+-Reabsorption mineralokortikoidinduziert [Morel et al. 1981 und 1992], jedoch ist die postnatale Ansprechbarkeit der Rattenniere auf Mineralokortikoide relativ gering (s. 6.4) [Stephenson et al. 1984]. Unabhängig von der Mineralokortikoidwirkung könnte deshalb auch die Heterogenität in der funktionellen Reifung des Tubulussystems für den prozentual hohen Anteil der Na+-Reabsorption im DCT entscheidend sein. Aperia et al. verweisen in diesem Zusammenhang auf eine funktionelle Unreife des PT während sich der DCT schon früh in


58

einem funktionell effizienten Stadium befindet [Aperia et al. 1981].

5.3 Verbindungstubulus (CNT)

Es ist seit längerem bekannt, daß der CNT nicht nur als “Zubringer“ von Tubulusharn an den CD verstanden werden darf, sondern daß dieses Segment darüber hinaus besondere funktionelle Bedeutung hat. So spielt der CNT als das am weitesten distal gelegene Segment, welches Ca++ unter dem Einfluß von Parathormon reabsorbiert, eine wichtige Rolle für die Ca++-Homöostase [Morel et al. 1992, Chabardés et al. 1975]. Dies spiegelt sich in der spezifischen Expression des Proteins Calbindin-D28K, das cyotosolisches Ca++ bindet, und in der Expression des Transportproteins NaCa wider [Borke et al. 1989, Reilly et al. 1993]. In der Rattenniere produzieren die CNT-Zellen zudem selektiv Kallikrein [Barajas et al. 1986] und besitzen Bradikinin B2-Rezeptoren, was eine funktionelle Rolle des CNT im Kallikrein-Kinin-System nahelegt [Figueroa et al. 1995]. Entwicklungsgeschichtlich gibt der Ursprung des CNT immer wieder Anlaß zu Disskussionen. Dabei wird spekuliert, ob sich der CNT aus der einwachsenden Ureterknospe entwickelt, worin die Erklärung für die gemeinsamen Merkmale von CNT und CD zu finden sein könnte [Kaissling et al. 1995], oder ob er aus dem metanephrogenen Blastem hervorgeht, worauf histologische Beobachtungen während der Entwicklung hindeuten [Neiss 1982a]. In der vorliegenden Arbeit fiel eine sehr frühe Expression der mineralokortikoidassoziierten Proteine rENaC und 11HSD im morphologisch noch relativ unreifen CNT auf. Dabei ging das Auftreten dieser Proteine dem frühesten Erscheinen von NaCa, als CNT-spezifischem Marker, deutlich voraus. Generell könnte die frühe und starke Expression von rENaC und 11HSD in morphologisch undifferenzierten CNT-Zellen auf eine spezifische Rolle von mineralokortikoidinduzierten Effekten während der Zelldifferenzierung des CNT hindeuten. Dabei würde die enzymatische Wirkung von 11HSD bereits in recht unreifen Zellen eine Selektivität des ansonsten unspezifischen MR erlauben. In bezug auf den Ursprung des CNT ist die frühe Expression von 11HSD und rENaC ohne Koexpression von NaCa interessant, da dieses Expressionmuster normalerweise für den CD typisch ist [Bostanjoglo et al. 1998, Duc et al. 1994]. Die vorübergehende, selektive Expression von 11HSD und rENaC könnte dafür sprechen, daß der CNT vom Gewebe der Sammelrohranlage abstammt und er seine CNT-spezifischen Charakteristika erst


59

im Laufe der Reifung durch induktive Vorgänge im Wechselspiel mit dem distalen Nephron annimmt. Andererseits kann durch das spätere Auftreten von NaCa im CNT natürlich nicht ausgeschlossen werden, daß der CNT trotzdem vom nephrogenen Blastem abstammt. Die zeitweise exklusive Expression von 11HSD und rENaC in prospektiven CNT-Zellen könnte dabei einfach Ausdruck eines spezifischen Differenzierungsprogrammes sein, welches eine spätere Expression von NaCa determiniert. Außer der Expression gemeinsamer Proteine besteht eine weitere Übereinstimmung zwischen CNT und CD im Vorhandensein von Schaltzellen, die im CNT 20-30% und im CD 35-45% der Epithelzellen ausmachen. Die Schaltzellen haben essentiellen Anteil an der renalen Regulation des Säure-Base-Haushaltes, während sie für die Reabsorption von Na+ keine direkte Rolle spielen [Überblick in Tisher et al. 1996]. In Übereinstimmung damit wurde in dieser Arbeit immunhistochemisch gezeigt, daß Schaltzellen im Gegensatz zu den sie umgebenden Zellen rENaC nicht exprimierten. Außerdem exprimierten sie im CNT auch NaCa nicht. Schaltzellen waren gleichzeitig früh im unreifen CNT und in weiten Teilen des CD zu identifizieren, was mit den Ergebnissen von Kim et al. übereinstimmt, die die Genese von Schaltzellen in CNT und CD ausführlich untersucht haben [Kim et al. 1994 und 1996]. Danach entstehen Schaltzellen sehr früh während der Reifung aus undifferenzierten Tubuluszellen und vermehren sich später mitotisch. Das Vorkommen von Schaltzellen in CNT und CD wurde als Indiz für das Abstammen des CNT von der CD-Anlage gewertet [Kaissling et al. 1979]. Nach den Ergebnissen von Kim et al. gibt es aber keinen gemeinsamen Ausgangsfokus für die Schaltzelldifferenzierung in CNT und CD, stattdessen differenzieren sich die Schaltzellen unabhängig voneinander. Demnach könnte der CNT hinsichtlich der Schaltzellgenese ebensogut Abkömmling des nephrogenen Blastems sein. Das Entstehen von Schaltzellen würde durch teilweise Übereinstimmung im zellulären Differenzierugsprogramm von Zellen der CD-Anlage und Zellen des nephrogenen Blastems zu erklären sein.

Neben der schon angesprochenen Ca++-reabsorptiven Funktion des CNT ist dieser Tubulusabschnitt auch am mineralokortikoidabhängigen Transport von Na+ beteiligt, was zunächst durch physiologische Studien [Madsen et al. 1986] und später durch den histochemischen Nachweis von rENaC in CNT-Zellen [Duc et al. 1994] belegt wurde. Da bei pathologischen Mineralokortikoidspiegeln Störungen der renalen Ca++-Exkretion vorkommen, gibt es offensichtlich eine funktionelle Relation zwischen der renalen Ca++-Reabsorption und der Wirkung von Mineralokortikoiden. So ist der Hypoaldosteronismus, wie er beim Morbus


60

Addison vorkommt, häufig von einer erhöhten renalen Ca++-Reabsorption begleitet, während der Hyperaldosteronismus, wie er beim Morbus Conn vorkommt, mit erniedrigter Ca++-Reabsorption bzw. erhöhter Ca++-Exkretion einhergeht [Walser et al. 1963, Massry et al. 1967, Rossi et al. 1995]. Dieser Effekt kommt offenbar nicht durch den direkten Einfluß von Mineralokortikoiden auf die Ca++-Reabsorption zustande [Massry et al. 1967], sondern durch einen indirekten Einfluß über die Na+-Reabsorption. Einem funktionellen Zellmodell zufolge gelangt Ca++ vom Tubuluslumen, wahrscheinlich über einen apikalen Kanal, in die Epithelzelle und wird basolateral über eine ATP-abhängige Pumpe oder über den sekundär aktiven Transport via NaCa in das peritubuläre Interstitium befördert [Bourdeau et al. 1991]. Ein verstärkter apikaler Na+-Einstrom, wie durch Mineralokortikoide bewirkt, führt zu einer Erhöhung des intrazellulären Na+-Gehaltes, und damit zur Abnahme des Na+-Konzentrationsgradienten. Da der Na+-Konzentrationsgradient aber die Antriebskraft für den basolateralen Transport von Ca++ durch den sekundär aktiven NaCa darstellt, wird der basolaterale Ca++-Auswärtstransport durch einen Abfall dieses Gradienten gebremst. Im Extremfall könnte der Transport über NaCa sogar in seiner Richtung umgekehrt werden, so daß Ca++ von der Blutseite her in die Zelle gelangt, anstatt die Zelle auf diesem Weg zu verlassen [Bourdeau et al. 1991]. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Expression von NaCa im reiferen Nephron tatsächlich über ihre ganze Ausdehnung in Koexpression mit rENaC stattfindet. Die Expression beider Proteine beginnt zusammen am Beginn des DCT2 und setzt sich entlang des gesamten CNT in Kolokalisation fort. Damit besteht also eine plausible histotopographische Grundlage für die Hypothese, daß der beschriebene Einfluß von Mineralokortikoiden auf den Ca++-Haushalt durch rENaC vermittelt ist. Auch die Kolokalisation von NCC und NaCa im DCT2 könnte in diesem Zusammenhang eine Rolle spielen. Denn analog zum rENaC-vermittelten Na+-Einstrom kann der Na+-Konzentrationsgradient natürlich auch durch den sekundär-aktiven Na+-Transport via NCC beinflußt werden. Damit könnte eine mineralokortikoidstimulierte Aktivierung von NCC (s. 6.2) ebenfalls zu dem oben beschriebenen Mechanismus beitragen und zu erhöhter Ca++-Exkretion führen.


61

5.4 Sammelrohr (CD)

Durch die subkapsuläre Induktion neuer Nephrone vergrößert sich die Niere während ihrer Ontogenese exzentrisch. Gleichzeitig verlängert sich das CD-System durch zentrifugales Auswachsen, neue Nephrongenerationen zu induzieren und zu drainieren [Osatanondh et al. 1966]. Daraus ergibt sich für den CD ein von subkapsulär nach medullär zunehmender Reifegradient. Während der jüngste Teil des CD, die subkapsuläre Ampulle, keines der untersuchten Proteine exprimierte, wies der ältere CD-Anteil während der ersten postnatalen Tage ein interessantes Expressionsmuster auf. So war rENaC schon am 1. Tag post partum im gesamten subampullären CD in hoher Konzentration nachweisbar, wohingegen 11HSD zunächst nur in den reiferen CD-Anteilen, medullär sowie innerkortikal, zu finden war. Diese Beobachtung ist von Bedeutung, weil die Expression von rENaC einerseits auf eine frühe Mineralokortikoidwirkung im äußeren CD hinweist, andererseits aber durch das Fehlen von 11HSD noch keine Steroidhormonselektivität des MR vorliegen kann. Daß der MR schon sehr früh im CNT und CD exprimiert wird, konnte an Kaninchen- [Farman 1992] und Mäusenieren (unveröffentlichte Ergebnisse von Prof. Dr. N. Farman) gezeigt werden. Bei der neonatalen Rattenniere wurde MR zwar nicht in situ lokalisiert, es wurde aber in homogenisiertem Nierengewebe ein hoher MR-Spiegel sowohl auf Protein- [Stephenson et al. 1984] als auch auf mRNA-Ebene gemessen [Kalinyak et al. 1992]. Da der protektive Effekt für den MR durch 11HSD im postnatalen äußeren CD offenbar noch nicht vorliegt, müßte auch Glukokortikoid an den MR binden können. Glukokortikoid müßte somit während der ersten extrauterinen Tage analog zu den physiologischen Mineralokortikoid-effekten als Na+-retinierendes Hormon wirken. Dieser Zustand, der im adulten Organismus dem Pathomechanismus des AME (s. 2.1) zu Grunde liegt, könnte sich positiv für das Neugeborene auswirken. Angesichts einer noch unreifen renalen Volumenregulation und einer postnatal verminderten tubulären Reabsorptionskapazität muß nämlich eine positive Volumen- und Na+-Balance aufrechterhalten werden. Eine positive Na+-Balance ist für die normale postnatale Entwicklung essentiell [Überblick in Aperia et al. 1992 und Nigam et al. 1996]. Postnataler Na+-Mangel führt zu Wachstumsverzögerung und zu Veränderungen im Stoffwechsel [Fine et al. 1987, Wassner 1989], während eine Na+-Substitutionstherapie bei Frühgeborenen zu signifikanter Wachstums- und Gewichtszunahme führen kann [Chance et al. 1977]. Ein Entwicklungsabschnitt, in dem der MR teilweise ohne Schutz durch 11HSD vorliegt, also zusätzlich zu zirkulierendem Mineralokortikoid auch Glukokortikoid bindet,


62

könnte unter diesem Aspekt von Vorteil sein. Der diskutierte Mechanismus könnte dem Neugeborenen helfen während der postnatalen Phase, in der es besonders anfällig ist für Volumen- und Elektrolytverlust, sein inneres Milieu aufrecht zu erhalten. Am 8. postnatalen Tag war 11HSD schließlich auch im äußeren CD zu finden, so daß davon ausgegangen werden kann, daß der MR zu diesem Zeitpunkt entlang des gesamten distalen Tubulus Mineralokortikoidselektivität aufwies. Dazu passen die Ergebnisse von Stephenson et al., die Rattenjunge im Alter von 7-9 Tagen mit Aldosteron- und Kortikosteroninjektionen behandelt haben. Insgesamt war die Ansprechbarkeit der neonatalen Niere auf Steroide gering. Trotzdem konnte gezeigt werden, daß die Applikation von Aldosteron zu einer Erniedrigung der Na+-Exkretion auf ein Drittel führte, während die exogene Zufuhr von Kortikosteron keine Veränderung in der Na+-Ausscheidung bewirkte [Stephenson et al 1984]. Zu dieser offensichtlichen Mineralokortikoidselektivität paßt das in der vorliegenden Arbeit demonstrierte Expressionsmuster von 11HSD in der 8 Tage alten Niere.

Die gewonnenen Befunde zur Expression von 11HSD sind darüberhinaus auch hinsichtlich einer potentiellen entwicklungsspezifischen Rolle des Enzyms interessant. Die Nephrogenese stellt ein exzellentes Beispiel für die Differenzierung pluripotenter Zellen in hochspezialisierte Epithelzellen dar. Bei diesem Vorgang spielen neben Wachstumsfaktoren, Protoonkogenen und extrazellulären Matrixproteinen, vor allem Hormone eine Rolle [Überblick in Kanwar et al. 1997]. Eine für das Wachstum entscheidende Hormonklasse stellen dabei die Glukokortikoide dar, die während der Entwicklung Einfluß auf das Wachstum und die Differenzierung vieler verschiedener Organsysteme nehmen [Henning 1981, Kloet et al. 1988]. Dabei ist es von großer Wichtigkeit, daß der zirkulierende Spiegel freien Glukokortikoids eine gewisse Grenze nicht überschreitet, da das Hormon sonst zu strukturellen und funktionellen Fehlentwicklungen führt [Meyer 1985, Munck et al. 1992]. Als entscheidender Faktor, um den Fetus vor einem erhöhten Glukokortikoidspiegel zu bewahren, wird die durch 11HSD katalysierte Dehydratation des Hormones diskutiert [Moisan et al. 1992]. Dabei ist von Bedeutung, daß das durch 11HSD katalysierte Glukokortikoidderivat nicht nur, wie unter 2.1 beschrieben, seine Bindungsfähigkeit für den MR einbüßt, sondern auch an den Glukokortikoidrezeptor selber nur noch sehr schwach binden kann [Fuller et al. 1990]. Da 11HSD während der Ontogense in vielen Geweben exprimiert ist [Brown et al. 1996, Stewart et al. 1994], wurde deshalb spekuliert, daß 11HSD neben seiner bekannten Rolle als “Wächter“ über den MR während der Entwicklung auch als


63

“Wächter“ über den Gukokortikoidrezeptor fungieren könnte [Moisan et al.1992]. In der vorliegenden Arbeit wurde für die postnatale Niere allerdings gezeigt, daß die Verteilung von 11HSD schon früh sehr spezifisch ist, und der adulten Verteilung ähnelt. 11HSD wurde in distalen Tubulusepithelzellen, für die eine Mineralokortikoidabhängigkeit bekannt ist, exprimiert und nicht etwa in Zellen des PT, die den Glukokortikoidrezeptor exprimieren [Farman 1992]. Demnach scheint der Haupteffekt von 11HSD, zumindest in der postnatalen Rattenniere, auch schon während der Entwicklung die gezielte Vermittlung der MR-Spezifität zu sein und weniger ein zusätzlicher Schutz des Glukokortikoidrezeptors vor einem möglichen Überangebot an Glukokortikoiden.

Funktionell ist bekannt, daß die Na+-Reabsorption im CD der inneren Medulla sensitiv gegenüber Amilorid, abhängig von Mineralokortikoid und elektrogen ist [Husted et al. 1990, Diezi et al. 1973]. In Übereinstimmung damit wurde in Northern Blots mRNA für alle drei Untereinheiten von rENaC in der inneren Medulla nachgewiesen [Volk et al.1995]. Dennoch konnten Duc et al. in ihrer umfassenden Lokalisationsstudie für rENaC rENaC immunhistochemisch und via In situ Hybridisierung zwar im CD des Kortex und der äußeren Medulla nachweisen, jedoch nicht in der inneren Medulla. Als mögliche Gründe dafür haben sie über eine weitere noch unbekannte Spleißvariante von rENaC und über eine zu geringe Sensitivität ihres Detektionssystems spekuliert [Duc et al. 1994]. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von rENaC, sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt. Dabei fiel am 1., 3. und 4. Tag post partum eine starke Expression des Proteins auf, die sich entlang des medullären CD-Anteils bis zur Papillenspitze erstreckte. Da die anatomische Unterteilung in innere und äußere Medulla anhand des Überganges vom ATL in den TAL definiert ist, ist die Frage ab welchem Zeitpunkt während der Ontogenese die Unterteilung in innere und äußere Medulla zulässig ist, schwierig zu beantworten. Kim et al. stellen zwar fest, daß in der Ratte ab dem 3. Tag post partum eine klare Unterteilung möglich ist [Kim et al. 1994], jedoch verändert sich die Ausdehnung des ATL, und damit der histotopographische Bezug zur Unterteilung in innere und äußere Medulla, noch bis zum 8. Tag post partum [Neiss 1982a]. Trotzdem kann hinsichtlich der nachgewiesenen Expression von rENaC im CD des innersten Bereiches der Medulla am 3. und 4. Tag post partum wohl davon gesprochen werden, daß rENaC in der inneren Medulla exprimiert war. Hinzu kommt, daß die Expression von rENaC in diesem Bereich am 8. Tag zwar etwas abgeschwächt aber immer noch deutlich vorhanden war. Während der frühen postnatalen Entwicklung läßt sich rENaC


64

demnach mit histochemischen Mitteln im inneren MCD nachweisen, was mit den oben angesprochenen physiologischen [Husted et al. 1990, Diezi et al. 1973] und molekularbiologischen [Volk et al. 1995] Befunden übereinstimmt. In der adulten inneren Medulla ist die Expressionsrate für rENaC im CD-Epithel dann offenbar so niedrig, daß die mRNA bzw. das Protein unter der histochemischen Nachweisgrenze liegen [Duc et al. 1994]. Möglicherweise liegt auch hier der physiologische Nutzen der zunächst hohen Expression in einer Kompensation für die noch unreife Reabsorptionsleistung proximaler Tubulusegmente. In der Abnahme der Transkriptionsrate am 8. Tag könnte sich die Tatsache widerspiegeln, daß die proximale Transportkapazität mit zunehmender Reife wächst, so daß die Expressionsrate von rENaC im innermedullären CD ohne das Risiko eines Elektrolytverlustes auf ein niedrigeres Niveau reguliert werden kann.

Die Hauptfunktion des renalen Tubulusepithels ist der Transport. Deshalb stellt das Auftreten von Transportproteinen im Tubulus einen entscheidenden Schritt zur funktionellen Reifung der Niere dar. Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, geht dem Auftreten der tubulären Transporter die mikrostrukturelle Reifung des Nephrons bis zu einem gewissen Grad voraus. Die untersuchten Transportproteine traten erst zu einem Zeitpunkt auf, als sich die Tubulusmorphologie schon grob differenziert hatte, während in den frühesten nephrogenen Stadien noch keine Expression feststellbar war. Trotzdem fanden auch nach der initialen Expression der Transporter noch weitgehende morphologische Wachstums- und Umbauvorgänge statt. In diesem Zusammenhang ist von Interesse, daß der extra- und der intrazelluläre Na+-Gehalt bedeutenden Einfluß auf die Funktion und das Wachstum von Tubuluszellen haben. So wurde gezeigt, daß eine erhöhte Salzaufnahme im Anschluß an eine partielle Nephrektomie die kompensatorische Hyperplasie der Restniere beschleunigt [Tingle et al. 1973]. Aus renalen Zellkulturen ist bekannt, daß eine Erhöhung der intrazellulären Na+-Konzentration zu erhöhter Proteinsynthese, Wachstum und Zellteilung führt [Toback 1980, Johnson et al. 1998]. Speziell für das distale Nephron wurde demonstriert, daß es auf eine erhöhte Na+-Reabsorption mit Zellhypertrophie und -hyperplasie reagiert [Stanton et al. 1989]. Demnach ist es denkbar, daß der Na+-Transport, der durch die untersuchten Proteine vermittelt wird, auch auf das Wachstum und die strukturelle Differenzierung in der fortgeschrittenen Nephrogenese Einfluß nimmt. Auf welche konkrete Weise Umbauvorgänge


65

und Zellteilung durch eine erhöhte Na+-Konzentration stimuliert werden, konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden. Hinsichtlich proximaler Tubuluszellen wurde aber demonstriert, daß der extrazelluläre Na+-Spiegel einen direkten, positiven Einfluß auf das Tubuluswachstum ausübt, ohne daß dabei in der Niere ansonsten relevante Wachstumsfaktoren und Cytokine involviert wären [Johnson et al. 1998]. Es wäre interessant, den postnatalen Na+-Transport über die untersuchten Proteine selektiv zu blockieren, um im Anschluß daran etwaige Störungen in der zellmorphologischen Entwicklung oder funktionelle Verschiebungen der tubulären Segmentproportionen zu untersuchen. Ein solcher Versuchsansatz könnte interessante Rückschlüsse auf eine spezifische potentielle Funktion der renalen Na+-Transporter während der Ontogenese ermöglichen.


[Titelseite] [Abkürzungsverzeichnis] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [Bibliographie] [Selbständigkeitserklärung] [Lebenslauf] [Anhang]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Mon Feb 19 17:53:03 2001