[Seite 18↓]

2  Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Biologisches Material

2.1.1.1 Humane Zellinien

SKOV-3 (ATCC# HTB-77)

Seröses Karzinom des Ovars

Cell Lines Service, Heidelberg

OVCAR-3

(ATCC# HTB-161)

Seröses Karzinom des Ovars

Cell Lines Service, Heidelberg

OAW42

Seröses Karzinom des Ovars

Cell Lines Service, Heidelberg

CAOV-3 (ATCC# HTB-75)

Seröses Karzinom des Ovars

WAK Chemie Medical GmbH, Bad Soden

A27/80

Seröses Karzinom des Ovars

European Collection of Cell Cultures, Salisbury, England

A27/80cis

A27/80 Cisplatin-resistent

PD Dr. H. Lage, Berlin

ES-2 (ATCC# CRL-1978)

Klarzellkarzinom des Ovars

WAK Chemie Medical GmbH, Bad Soden

MDAH 2774
(
ATCC# CRL-10303)

Seröses Karzinom des Ovars

WAK Chemie Medical GmbH, Bad Soden

PA-1 (ATCC# CRL-1572)

Teratokarzinom des Ovars

Cell Lines Service, Heidelberg

HOSE

Oberflächenepithel des Ovars, durch HPV-Transfektion immortalisiert

Dr. S.W. Tsao, Hong Kong,

VR China67

2.1.1.2 Plasmide in E. coli

I.M.A.G.E.-Consortium cDNA Clones68 lt. Tabelle 2,

Vektor pT7T3D-Pac mod1

 

Resource Center of the German Human Genome Project

Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin

IMAGE Consortium Homepage: http://image.llnl.gov


[Seite innerhalb Tabelle 19↓]

Tabelle 2: IMAGE-Klone

Clone ID
IMAGE-Consortium

IMAGE

ID

enthaltene Phosphatase

IMAGp998P205928Q2

2387203

DUSP1

IMAGp998D031197Q2

501842

DUSP6

Die Auswahl der Klone erfolgte unter Nutzung der Internetressourcen GenBank, UniGene und BLAST des National Center for Biotechnology Information der National Library of Medicine der National Institutes of Health, Bethesda, USA.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

2.1.2 Chemikalien und Enzyme


[Seiten innerhalb Tabelle 20 - 21↓]

Acrylamid

 

Appligene, Illkirch-Graffenstaden, Frankreich

Agarose

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Ammoniumperoxodisulfat (APS)

 

Merck, Darmstadt

Ampicillin

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

AmpliTaq DNA Polymerase 5U/µl, cat# N801-0060

 

Perkin Elmer, Branchburg, USA

Aquatex

 

Merck, Darmstadt

Bacto Agar

 

Difco Laboratories, Detroit, USA

Bacto Hefeextrakt, cat# 0127.17

 

Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich

Bacto Trypton, cat# 0123-17

 

Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich

Bromphenolblau

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

CDP-Star

 

Tropix, Bedford, USA

2´-Desoxyribonucleosid-5´- Triphosphate (dNTP´s), je 2,5mM

 

Gibco BRL, Life Technologies, Karlsruhe

Dimethylsulfoxid (DMSO)

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Dinatriumhydrogenphosphat

 

Merck, Darmstadt

Dithiothreitol (DTT)

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

DNA-Längenstandard 100bp,

cat# 15628-050

 

Gibco BRL, Life Technologies, Karlsruhe

Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM), cat# BE12-707F

 

Bio Whittaker, Verviers, Niederlande

Essigsäure

 

Mallinckrodt Baker, Deventer, Niederlande

Ethanol

 

Mallinckrodt Baker, Deventer, Niederlande

Ethidiumbromid

 

ICN Biomedicals Inc, Aurora, USA

Ethylendiamintetraessigsäure- di-Natriumsalz (EDTA)

 

Merck, Darmstadt

ExpressHyb Hybridization Solution, cat# 8015-2

 

Clontech, Palo Alto, USA

Fast Red TR/Naphthol AS-MX

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Foetales Kälberserum (FCS),

cat# 3402-P992203

 

PAN Biotech, Aidenbach

Formaldehydlösung 37%

 

Merck, Darmstadt

Formamid

 

Merck, Darmstadt

L-Glutamin

 

Bio Whittaker, Verviers, Niederlande

Glycerol anhydrous

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Glycin

 

Boehringer Ingelheim, Heidelberg

I-Block

 

Tropix, Bedford, USA

p38-Inhibitor SB203580,

cat# 270-179-M001

 

Alexis Biochemicals, Grünberg

raf-MKK1-Inhibitor PD 98059,
cat# 385-023-M005

 

Alexis Biochemicals, Grünberg

pI3-Kinase-Inhibitor LY 294002,

cat# 270-038-M001

 

Alexis Biochemicals, Grünberg

PKC-Inhibitor Ro-31-8220, cat#557520

 

Calbiochem, San Diego, USA

PKC-Inhibitor GF109203X, cat#203290

 

Calbiochem, San Diego, USA

Interleukin 1β (IL-1β), rekombinant, human, cat# 201-LB

 

R&D Systems, Wiesbaden

Interleukin 6 (IL-6), rekombinant, human, cat# 1138600

 

R&D Systems, Wiesbaden

Low-Melting-Agarose

 

FMC Bioproducts, Maine, USA

Magnesiumchlorid (MgCl2 • 6 H2O)

 

Merck, Darmstadt

MCDB 105 Medium, cat# M-6395

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Medium 199, cat# M-2154

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

ß-Mercaptoethanol

 

Merck, Darmstadt

MKP-1-Antikörper, cat# M-3787

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

MMLV Reverse Transkriptase,

200 U/µl

 

Gibco BRL, Life Technologies, Karlsruhe

3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS)

 

ICN, Aurora, USA

Natriumacetat

 

Merck, Darmstadt

Natriumchlorid

 

Merck, Darmstadt

Natriumdihydrogenphosphat

 

Merck, Darmstadt

Natriumdodecylsulfat (SDS)

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Natriumhydroxid

 

Merck, Darmstadt

10 x PCR-Puffer,

15mM MgCl2, cat# N808-0006

 

Perkin Elmer, Branchburg, USA

Random Hexamere, cat# C1181

 

Promega, Madison, USA

Rnasin, 40 U/µl, cat#N251B

 

Promega, Madison, USA

Salzsäure

 

Merck, Darmstadt

Sucrose

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

N,N,N´,N´-Tetramethyl-

ethylenediamine (TEMED)

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)

 

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Tri-Natriumcitrat-Dihydrat

 

Merck, Darmstadt

Tris(Hydroxymethyl)- aminomethan (Tris-Base)

 

Merck, Darmstadt

Tris(Hydroxymethyl)- aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl)

 

Merck, Darmstadt

Trypsin / EDTA-Lösung

0,5% / 0,2% (w/v) in PBS

(10-fach konzentriert)

 

Biochrom KG, Berlin

Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα),

cat# 210-TA

 

R&D Systems, Wiesbaden

Tween 20

 

Serva, Heidelberg

Zitronensäure

 

Merck, Darmstadt

2.1.3 Kits

BCA Protein Assay Reagent

 

Pierce, Rockford, USA

Megaprime DNA

Labelling System

 

Amersham Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, England

Mini Prep Kit

 

Qiagen, Hilden

QIAEX II Gel Extraction Kit

 

Qiagen, Hilden

RNeasy Mini Kit

 

Qiagen, Hilden

RNeasy Midi Kit

 

Qiagen, Hilden

Super Sensitive Detection Kit

 

BioGenex, San Ramon, USA

2.1.4 Radiochemikalien

α32P-dCTP 3000 Ci/mmol

 

ICN Biochemicals, Eschwege


[Seite 22↓]

2.1.5  Oligonukleotide

human G3PDH cDNA

control probe, cat# 9805-1

 

Clontech, Palo Alto, USA

Primer lt. Tabelle 3

 

BioTez, Berlin

Tabelle 3: Primer

Bezeichnung

Sequenz

Länge des
PCR-Produktes

GAPDH fwd

5´-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3´

452 bp

GAPDH rev

5´-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3´

DUSP1 fwd

5´-CCG CGC AAG TCT TCT TCC TC-3´

383 bp

DUSP1 rev

5´-GTC AAT GGC CTC GTT GAA CC-3´

DUSP4 fwd

5´-GTT AAG CAG CGC CGC AGC AT-3´

409 bp (Var. 1)

410 bp (Var. 2)

DUSP4 rev

5´-TTC TGG CTG GCC TCG TCG TT-3´

DUSP5 fwd

5´-AAG GAA GGC CAA GCC ATT AC-3´

514 bp

DUSP5 rev

5´-CTG AGA AGA GGT GGA ATG AG-3´

DUSP6 fwd

5´-GAG GCC TTA TGC AGA AGC TC-3´

524 bp

DUSP6 rev

5´-CTA TGC GCT TGG AAG TCC TC-3´

DUSP9 fwd

5´-AGC CGC GAG CTG TAC GAG TC-3´

449 bp

DUSP9 rev

5´-GCC TCG GAT TCC GCA TCA GA-3´

DUSP10 fwd

5´-GCT GAA GAG GAG CGC CAG AT-3´

415 bp

DUSP10 rev

5´-GAG GTT CCG ATG GCA GTG GT-3´

Die Auswahl der Primersequenzen erfolgte mit Hilfe der Software Primer Designer V3.0
(Scientific & Educational Software).

2.1.6 Kulturmedien, Lösungen

DMEM, serumhaltig:

500

ml

DMEM

DMEM, serumfrei:

500

ml

DMEM

 

10

ml

L-Glutamin

 

10

ml

L-Glutamin

 

50

ml

FCS

    

LB-Medium:

10

g

Bacto Trypton

LB-Medium mit

1000

ml

LB-Medium

 

5

g

Bacto Hefe Extrakt

Agar:

15

g

Bacto Agar

 

10

g

Natriumchlorid

    
  

pH 7,0 einstellen

    
 

ad 1000

ml

H2O

    


[Seite innerhalb Tabelle 23↓]

10 x PBS:

82,3

g

Di-Natriumhydrogenphosphat

 

23,5

g

Natrium-di-hydrogenphosphat

 

40,0

g

Natriumchlorid

 

ad 1000

ml

H2O

  

pH 7,2 einstellen

Tris-HCl 0,5M:

30,25

g

Tris-Base

Tris-HCl 1,5M:

90,75

g

Tris-Base

 

ad 500

ml

H2O

 

ad 500

ml

H2O

  

pH 6,8 einstellen

  

pH 8,8 einstellen

Tris-HCl 1,0M:

60,50

g

Tris-Base

TE:

1,0

ml

1M TrisHCl

 

ad 500

ml

H2O

 

0,2

ml

0,5M EDTA

  

pH 8,0 einstellen

 

ad 100

ml

H2O

50 x TAE:

242,0

g

Tris-Base

25 x MOPS:

20,5

g

Natriumacetat

 

57,1

ml

Essigsäure

 

7,3

g

EDTA

 

100,0

ml

EDTA 0,5M

 

209,3

g

MOPS

 

ad 1000

ml

H2O

 

ad 1000

ml

H2O

  

pH 7,5 – 7,8 einstellen

autoklavieren

  

pH 7,0 einstellen

20 x SSC:

220,0

g

Tri-Natriumcitrat-dihydrat

DNA-Auftragspuffer:

4,0

g

Sucrose

 

337,5

g

Natriumchlorid

 

2,5

mg

Bromphenolblau

 

ad 2500

ml

H2O

 

10

ml

TE

RNA-Auftragspuffer:

300,0

µl

deionisiertes Formamid

 

22,5

µl

25 x MOPS

 

105,0

µl

Formaldehyd

 

3,0

µl

Ethidiumbromid

 

1

Krümel

Bromphenolblau

 

40,0

µl

Glycerin

Waschpuffer 1:

1,0

g

SDS

Waschpuffer 2:

1,0

g

SDS

(Northern Blot)

100,0

ml

20 x SSC

(Northern Blot)

5,0

ml

20 x SSC

 

ad 1000

ml

H2O

 

ad 1000

ml

H2O

Protein-Lysispuffer:

1,2

ml

0,5M Tris-HCl

Western-Blot-Elektrophoresepuffer

30,3

g

Tris-Base

 

2,0

ml

10% SDS

 

144,0

g

Glycin

 

1,0

ml

Glycerol

 

2,8

g

SDS

 

0,5

ml

DTT

 

ad 1000

ml

H2O

 

5,3

ml

H2O

  

pH 8,3-8,4 einstellen

 

WB-Sammelgel

3,20

ml

H2O

WB-Trenngel

3,2

ml

H20

(4%)

0,50

ml

Acrylamid

(12%)

3,0

ml

Acrylamid

 

1,25

ml

0,5M Tris-HCl

 

2,5

ml

1,5M Tris-HCl

 

50

µl

10% SDS

 

100

µl

10% SDS

 

50

µl

10% APS

 

50

µl

10% APS

 

10

µl

TEMED

 

5

µl

TEMED


[Seite innerhalb Tabelle 24↓]

WB-
Blocking-Puffer

300

ml

1 x PBS

10 x WB-Transferpuffer

58,0

g

Tris-Base

 

0,6

g

I-Block

(nach Verdünnung

29,0

g

Glycin

  

auf ca. 80°C erhitzen

20 Vol% Methanol

3,7

g

SDS

 

300

µl

Tween 20

frisch zugeben)

 

pH 8,3 einstellen

     

ad 800

ml

H2O

Waschpuffer

(Western Blot)

50

ml

10 x PBS

10 x WB-
Assay-Puffer

24,2

g

Tris-Base

 

0,5

ml

Tween 20

 

2,033

g

MgCl2 • 6 H2O

 

ad 500

ml

H2O

 

ad 1000

ml

H2O

     

pH 9,8 einstellen

Immunhistologie –
Citratpuffer

3,78

g

Zitronensäure

 

24,21

g

Tri-Natriumcitrat-Dihydrat

 

ad 1000

ml

H2O

  

pH 6,0 einstellen

2.1.7 Verbrauchsmaterial

Chromatographiepapier

3MM CHR

 

Whatman, Maidstone, England

Deckgläser

 

Menzel-Gläser, Braunschweig

Filter

 

Schleicher & Schuell, Dassel

Hyperfilm ECL

 

Amersham Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, England

Microtest Zellkulturplatten 96 well

 

Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, USA

Objektträger SuperFrostPlus

 

Menzel-Gläser, Braunschweig

Parafilm

 

American National Can, Menasha, USA

Petrischalen für Bakterien

 

Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich

Petrischalen für Zellkultur

 

Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich

Protein-Transfermembran Protran BA83 0,2 µm

 

Schleicher & Schüll, Dassel

RNA-Transfermembran Hybond N+

 

Amersham Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, England

Röntgenfilme Biomax MS

 

Eastman Kodak, Rochester, USA

Serologische Pipetten

 

Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich

Zellkulturflaschen 75 cm2

 

Falcon-Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich

Zellschaber

 

Costar, Corning, USA

2.1.8 Geräte


[Seite innerhalb Tabelle 25↓]

Abzug

 

Captair, Düsseldorf

Bakterienwerkbank

 

Clean Air, Göttingen

Dampfsterilisator Varioclav

 

H+P Labortechnik, München

Dampfsterilisator

Technoclav 50 (für Bakterien)

 

Tecnomara, Fernwald-Steinbach

Densitometer GS 670

 

Bio-Rad, München

Elektrophoresekammern Agagel Maxi und Mini

 

Biometra, Göttigen

Elektrophoresenetzgerät

Savant PS250

 

Savant Instruments, Holbrook, USA

ELISA-Reader

 

Bio-Tek Instruments, Winooski, USA

Filmentwickler Hyperprocessor

 

Amersham Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, England

Geldokumentationsanlage

 

MWG Biotech, Ebersberg

Heizblock 100°C

 

Roth, Karlsruhe

Hybridisierungsofen

 

Hybaid, Heidelberg

Hybridisierungsröhrchen

 

Biometra, Göttigen

Magnetrührer Variomag

 

H+P Labortechnik, München

pH-Meter

 

Mettler, Schwerzenbach, Schweiz

Photometer GeneQuant II

 

Amersham Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, England

Pipetboy

 

Integra Biosciences, Fernwald

Schüttelinkubator 3032

 

GFL Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel

Schüttler

 

Biometra, Göttingen

Thermocycler

Trio-Thermoblock

 

Biometra, Göttingen

Thermomixer

 

Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg

Tischzentrifuge Biofuge Pico

 

Heraeus, Hanau

UV-Crosslinker

 

Hoefer, San Francisco, USA

UV-Transilluminatoren

 

MWG Biotech, Ebersberg

Biometra, Göttingen

Verstärkungsfolie für Röntgenfilme Biomax MS

 

Eastman Kodak, Rochester, USA

Vortexer Reax 2000

 

Heidolph, Schwabach

Zellkulturmikroskop IMT-2

 

Olympus Optical, Hamburg

Zellkulturbrutschrank BB 16

 

Heraeus, Hanau

Zellkulturwerkbank

 

Gelaire Flow Laboratories, Meckenheim

2.2 Methoden

2.2.1 Zellkultur

Die Ovarialkarzinomzellinien SKOV-3, OVCAR-3, OAW42 und CAOV-3 wurden in 75 cm2-Zellkulturflaschen in Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) mit 10% FCS kultiviert. Für die Oberflächenepithelzellinie HOSE wurde MCDB 105 Medium und Medium 199 zu gleichen Teilen mit 15%igem FCS-Zusatz verwendet. Die Inkubation im Zellkulturschrank erfolgte in wassergesättigter Atmosphäre bei 37°C und einem 5%igen Volumenanteil CO2.

Alle Zellkulturarbeiten erfolgten unter einer sterilen Werkbank unter Verwendung steriler Materialien und Lösungen. Die Trypsin-Lösung wurde zusätzlich bei der Zugabe filtriert.

Der Austausch des Kulturmediums erfolgte alle 3-4 Tage. Bei ca. 80%iger Konfluenz wurden die Zellen wie folgt passagiert: Zunächst wurde das verbrauchte Medium abgesaugt und die Zellen mit 2 ml Trypsin gespült. Nach erneuter Absaugung wurde 1 ml frisches Trypsin über den gesamten Flaschenboden verteilt. Im Anschluß erfolgte die Inkubation bei 37°C, bis sich unter mikroskopischer Kontrolle alle Zellen vom Untergrund gelöst und vereinzelt hatten. Die Trypsinwirkung wurde durch Zugabe von 9 ml Medium gestoppt. Von der resultierenden Zellsuspension wurden abhängig von Zellinie 0,25 ml bis 5 ml in der Kulturflasche belassen und diese mit Medium auf 10 ml aufgefüllt.


[Seite 26↓]

2.2.2  Versuchsanordnung

Die aus der Passagierung zur Verfügung stehende Zellsuspension wurde je nach Bedarf mit Medium verdünnt und gleichmäßig in Petrischalen ausgesät. Nach der Ergänzung von Medium auf ein Volumen von jeweils 4 ml folgte die Inkubation im Brutschrank für 2-3 Tage. Nach dem Erreichen von mind. 70%iger Konfluenz wurde das Medium durch 4 ml serumfreies Medium ausgetauscht.

Am folgenden Tag erfolgte die Stimulation mit Zytokinen, TPA oder Cisplatin. Hierbei wurde für jeden Zeitpunkt eine bis auf die Stimulantienzugabe gleich behandelte Kontrolle, sowie pro Versuchsreihe eine zum Zeitpunkt 0 geerntete Kontrolle mitgeführt.

Sofern bei Versuchen Inhibitoren verwendet wurden, erfolgte deren Zugabe 30 min vor der Zytokinstimulation; den Kontrollen wurden gleiche Volumina des Inhibitor-Lösungsmittels DMSO zugesetzt.

2.2.3 Western-Blot

2.2.3.1 Protein-Isolierung

Nach Ablauf der jeweiligen Inkubationszeit erfolgte die Zell-Lyse durch Zugabe von 100 µl des Protein-Lysis-Puffers pro Petrischale. Einer 5-minütigen Inkubationszeit auf Eis folgte die mechanische Ablösung mit Hilfe eines Zellschabers und die Überführung in Eppendorfgefäße. Durch mehrmaliges Aufziehen in eine Insulinspritze (0,45 mm-Kanüle) wurde die Homogenisierung abgeschlossen. Die Lagerung erfolgte bei –20°C.

2.2.3.2 Protein-Konzentrationsbestimmung

Die Bestimmung der Protein-Konzentrationen erfolgte mit dem BCA Protein Determination Kit nach Pierce. Hierbei wird Cu2+ durch die Proteine reduziert, die reduzierten Cu+-Ionen bilden mit Bicinchoninsäure einen farbigen Komplex, dessen Farbintensität als Maß des Reaktionsumfangs in einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 562 nm quantifiziert wurde. Die Durchführung erfolgte nach den Anweisungen des Herstellers, die Inkubationszeit betrug 1 h. Mit Hilfe einer unter gleichen Bedingungen mitgeführten Protein-Standardreihe konnten die Protein-Konzentrationen berechnet werden.


[Seite 27↓]

2.2.3.3  Elektrophorese und Transfer

Die Elektrophorese wurde als SDS-PAGE unter Verwendung eines 4%igen Sammel- und 12%igen Trenngels durchgeführt. Die Angleichung des Proteingehalts der einzelnen Proben geschah zuvor durch Zugabe von Lysispuffer. Weiterhin erfolgte eine 5-minütige Lyse bei 95°C. Die Auftrennung der Proben und eines Längenmarkers verlief über 30 min bei 30 V und anschließend über 90 min bei 100 V.

Der Transfer der Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran erfolgte als Semi-Dry-System bei 100mA über 90 min. Durch die Inkubation in Blocking-Puffer über Nacht wurden unspezifische Bindungsstellen blockiert.

2.2.3.4 Antikörper-Bindung und Belichtung

Die Primärantikörper gegen MAPK, Phospho-MAPK und ß-Actin wurden 1:1000 mit Blocking-Puffer verdünnt, die Inkubationszeit betrug 1,5 h. Nach mehrfachem Waschen mit Waschpuffer erfolgte die Zugabe des AP-gekoppelten, 1:5000 verdünnten Sekundärantikörpers für einen Zeitraum von 45 min. Die Zugabe des aktivierten Chemolumineszens-Systems CDP-Star nach erneutem Waschen und 4-minütiger Pufferung in Assay-Puffer ermöglichte die Belichtung von ECL-Hyperfilmen über unterschiedliche Zeiträume. Zur Auswertung wurden die entwickelten Filme densitometrisch quantifiziert.

2.2.4 RT-PCR

2.2.4.1  RNA-Isolierung

Die RNA-Isolation erfolgte mit Hilfe des RNeasy Mini Kits. Hierzu wurde dem zum Kit gehörenden Lysispuffer RLT anweisungsgemäß 1% ß-Mercaptoethanol als RNase-Inhibitor zugesetzt. Nach dem Absaugen des Mediums wurde in jede Petrischale 600 µl Lysispuffer gegeben und durch 2-minütiges Schwenken gleichmäßig verteilt. Anschließend folgte eine 5 Minuten dauernde Inkubation auf Eis. Das Lysat wurde schließlich mit einem Zellschaber vollständig abgelöst und in Eppendorfgefäße pipettiert. Dort erfolgte durch mehrmaliges Pipettieren eine weitere Verflüssigung der gelartigen Substanz. Die Lagerung der Proben erfolgte bei –80°C.

Zur Ausfällung der DNA wurden zu jeder Probe 600 µl 70%iges Ethanol gegeben und die ausfallenden Fragmente durch Pipettieren zerkleinert. Das entstehende Gemisch wurde in zwei Schritten auf eine RNeasy-Säule geladen, diese jeweils 1 min bei 11.500 U/min zentrifugiert und das Filtrat verworfen. Die [Seite 28↓]spezifische Pufferzusammensetzung führte hierbei zur selektiven Bindung der RNA an die Säulenmembran. Es folgte die Zugabe von 700 µl RW1-Puffer, eine 2-3 minütige Inkubationszeit und eine erneute Zentrifugation bei 11.500 U/min für 1 Minute. In diesem Schritt wurden weitere nicht erwünschte Lysefragmente ausgewaschen. Durch die Zugabe von 500 µl RPE-Puffer, der zuvor mit Ethanol gemäß Anweisung vervollständigt wurde, und erneuter 1-minütiger Zentrifugation bei 11.500 U/min mußten nun die in den zuvor eingesetzten Lösungen enthaltenen Salze aus der Säule gelöst werden. Eine weitere Zugabe von 500 µl RPE-Puffer mit anschließender Zentrifugation bei 13.000 U/min für 2 Minuten schloß die Reinigung ab.

Die nun in der Säule verbliebene RNA wurde durch die zweimalige Zugabe von 30µl H2O, im ersten Schritt gefolgt von einer 10-minütigen Inkubationszeit, und jeweiliger Zentrifugation bei 11.500 U/min für 1 Minute in ein Eppendorfgefäß eluiert und bei –80°C gelagert.

Die Isolierung aus Tumormaterial erfolgte analog mit Hilfe des RNeasy Midi Kits nach den Empfehlungen des Herstellers.

2.2.4.2  RNA-Konzentrationsbestimmung

Die Bestimmung der RNA-Konzentration beruht auf dem UV-Absorptionsmaximum von RNA bei einer Wellenlänge von 260 nm. Von jeder Probe wurden zur Doppelbestimmung zwei 1:50 Verdünnungen hergestellt, deren OD bei 260 nm im UV-Spektrometer bestimmt wurde. Aus dem Mittelwert ergibt sich unter Einbezug des Verdünnungsfaktors und eines weiteren, für einzelsträngige Nukleinsäuren geltenden Faktors von 40 µg/µl die Probenkonzentration.

2.2.4.3 Reverse Transkription

Mittels Reverser Transkription wird die isolierte RNA in cDNA umgeschrieben, die als Basis für die folgende PCR dient. Hierzu wurde je Ansatz das 1 µg RNA enthaltende Volumen in einem 0,5 ml Eppendorfgefäß vorgelegt und auf 5 µl mit H2O ergänzt. Als Negativkontrolle diente ein weiterer, lediglich aus 5 µl Wasser bestehender Ansatz. Hinzu kamen jeweils 15 µl des Master-Mixes, der in einem getrennten Gefäß für alle Proben gemeinsam vorbereitet wurde und wie folgt zusammengesetzt war:


[Seite innerhalb Tabelle 29↓]

7

µl

H2O

2

µl

10 x PCR-Puffer

2

µl

dNTP

2

µl

Hexamere

1

µl

RNasin (40 U)

1

µl

MMLV (200 U)

Die Ansätze durchliefen im Thermocycler folgendes Programm:

10

min

22°C

(Anlagerung der Hexamere)

45

min

42°C

(Transkription durch MMLV)

5

min

95°C

(Denaturierung der Doppelstränge)

2.2.4.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Durch die PCR wird die vorgelegte cDNA durch vielfach wiederholte Denaturierung und Gegenstrangsynthese vervielfältigt. Die Spezifität wird durch ein für das jeweilige Produkt ausgewähltes Primerpaar erreicht, wovon sich jeweils ein Primer an den zu ihm komplementären Template-Strang anlagert und durch die Polymerase verlängert wird.

Als Template wurden je Probe 10 µl aus der Reversen Transkription vorgelegt, die um 90 µl Master-Mix, in einem getrennten Gefäß für alle Proben vorbereitet, ergänzt wurden. Der Master-Mix hatte folgende Zusammensetzung:

69,5

µl

H2O

10,0

µl

10 x PCR-Puffer

8,0

µl

dNTP

1,0

µl

forward Primer (2 µM)

1,0

µl

reverse Primer (2 µM)

0,5

µl

AmpliTaq-Polymerase (2,5 U)

Die Ansätze durchliefen im Thermocycler folgendes Programm:

a)

1

min

94°C

(initiale Denaturierung)

 

b)

1

min

94°C

(Denaturierung)

 

c)

1

min

55°C

(Annealing der Primer)

 

d)

1

min

72°C

(Elongation durch Polymerase)

 

e)

10

min

72°C

(finale Elongation)

 

f)

 

4°C

  

Die Schritte b) – d) durchliefen 50 (Phosphatasen) bzw. 22 Zyklen (GAPDH).


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2.2.4.5  Auftrennung von PCR-Produkten

Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in 2%igem Agarose-Gel, das mit 1 x TAE-Elektrophoresepuffer unter Zusatz von 0,1‰ Ethidiumbromid gegossen wurde. Nach der Ergänzung von 10 Vol% DNA-Ladepuffer wurden von jeder Probe 10 µl, sowie zur Bestimmung der Fragmentlängen eine 100bp-Standard-Leiter aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte 30 min bei 100 V in 1 x TAE-Elektrophoresepuffer; die Banden wurden anschließend bei 254 nm auf einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht und dokumentiert.

2.2.4.6 DNA-Isolierung

Zur Isolierung der DNA wurde das QIAEX II Gel Extraction Kit gemäß Anweisung des Herstellers verwendet.

2.2.4.7 DNA-Konzentrationsbestimmung

Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte analog zur RNA-Konzentrationsbestimmung (Kapitel 2.2.4.2, S. 21), jedoch unter Verwendung des für DNA geltenden Faktors von 50 µg/µl.

2.2.4.8 Sequenzierung

Die Sequenzierung führte Herr Dr. Martin Meixner am Institut für Genetik der Humboldt-Universität Berlin durch.

2.2.5 Northern-Blot

2.2.5.1 Bakterienkultur

Die Grundlage der Bakterienkultur waren die mit den Plasmiden transfizierten E. coli-Bakterien. Neben den Zielsequenzen enthalten die Plasmide ein Ampicillin-Resistenz-Gen, wodurch die Bakterien selektierbar waren. Daher wurde für alle hier beschriebenen Schritte das LB-Medium mit 30 µg/ml Ampicillin versetzt.


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Die gelieferten E. coli-Pellets wurden mit jeweils 500 µl Medium überschichtet und 6 h bei 37°C im Schüttelinkubator inkubiert. Außerdem wurde pro Bakterien-Klon eine 10 cm-Petrischale mit 12 ml LB-Agar gegossen.

Nach der Inkubation wurden anfangs jeweils 200µl des Überstands auf einer Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Ausstrichvolumen wurde aufgrund zu starken Wachstums bei einigen Klonen bis auf 30 µl reduziert.

Am Folgetag wurden je Klon 4 Einzelkolonien in etwa 4 ml Medium überführt und erneut über Nacht bei 37°C inkubiert. Hiervon wurden am nächsten Morgen jeweils 1,5 ml in ein Eppendorfgefäß überführt und 10 min bei 13.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Eppendorfgefäß durch Ausklopfen von verbliebener Flüssigkeit befreit und bei –20°C eingefroren.

Weitere 900 µl wurden jeweils mit 900 µl Glycerol versetzt und als Glycerolstock bei –80°C gelagert.

2.2.5.2 Plasmid-Isolierung

Die Isolierung der Plasmide aus den Bakterienpellets erfolgte mit Hilfe des Qiagen Mini Prep Kits. Hierzu wurden die Pellets in je 250 µl P1-Puffer resuspendiert und in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Durch die Zugabe von 250 µl P2-Puffer wurde die alkalische Lyse zu einer klaren, gelartigen Substanz sowie der RNA-Verdau durch im Puffer enthaltene RNasen erreicht. Die Zugabe von 350 µl N3-Puffer führte zur Denaturierung der Proteine, außerdem wurden pH-Wert und Salzkonzentrationen auf das Optimum zur Bindung der DNA an die Mini Prep-Säulen eingestellt. Durch 10-minütige Zentrifugation bei 13.000 U/min erfolgte die Sedimentation der wolkig ausgefallenen Proteine zu einem weißen Pellet. Die Überstände wurden auf die Säulen überführt, die Pellets mit dem Eppendorfgefäß verworfen. Durch eine 1-minütige Zentrifugation konnte die an der Säulenmembran gebundene DNA von den weiteren Lösungsbestandteilen getrennt werden, letztere wurden mit dem Filtrat verworfen. Die noch vorhandenen Endonukleasen wurden durch Zugabe von 500 µl PB-Puffer und erneuter 1-minütiger Zentrifugation bei 13.000 U/min entfernt. Entsprechend erfolgte das Auswaschen der Salze durch 750 µl PE-Puffer.

Die nun in der Säule verbliebene DNA wurde durch 50µl des DNA stabilisierenden Puffers PE und Zentrifugation bei 13.000 U/min für 1 Minute in ein Eppendorfgefäß eluiert und bei –20°C gelagert.


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2.2.5.3  Sondenamplifizierung mittels PCR

Aus den zuvor isolierten Plasmiden wurden durch PCR die gewünschten Sondenabschnitte amplifiziert. Folgender PCR-Ansatz kam zur Anwendung:

2,0

µl

Plasmid-Lösung, 1:100 mit H2O verdünnt

12,5

µl

H2O

2,0

µl

10 x PCR-Puffer

1,0

µl

dNTP

1,0

µl

forward Primer (2 µM)

1,0

µl

reverse Primer (2 µM)

0,5

µl

AmpliTaq DNA Polymerase (2,5 U)

Die Kombination von Plasmid und Primern erfolgte gemäß der aus Tabelle 2 (S. 13) zu entnehmenden Zugehörigkeiten. Zu jedem Klon wurde eine H2O-Negativkontrolle mitgeführt.

Die Ansätze durchliefen im Thermocycler folgendes Programm:

a)

60

s

94°C

(initiale Denaturierung)

 

b)

60

s

94°C

(Denaturierung)

 

c)

90

s

60°C

(Annealing der Primer)

 

d)

90

s

72°C

(Elongation durch Polymerase)

 

e)

10

min

72°C

(finale Elongation)

 

f)

 

4°C

  

Die Schritte b) – d) durchliefen 36 Cyclen.

2.2.5.4 Elektrophoretische Auftrennung der DNA

Die elektrophoretische Auftrennung der amplifizierten DNA erfolgte in 1%igem Agarose-Gel, das mit
1 x TAE-Elektrophoresepuffer unter Zusatz von 0,1‰ Ethidiumbromid gegossen wurde. Nach der Ergänzung von 15 Vol% DNA-Ladepuffer wurden die vollständigen Ansätze sowie eine 100bp-Standard-Leiter zur Bestimmung der Fragmentlängen aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte
30 min bei 100 V in 1 x TAE-Elektrophoresepuffer.


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2.2.5.5  Isolierung der gewünschten DNA-Bande

Auf einem UV-Transilluminator mit einer Wellenlänge von 254 nm wurden im Anschluß die Banden sichtbar gemacht, auf die korrekte Länge überprüft und etwa 1-2 mm vor jeder zu isolierenden Bande ein schmales, bandenbreites Rechteck des Gels ausgeschnitten. Dieses wurde mit zuvor erhitzter 0,4%igen Low-Melting-Agarose großzügig ausgefüllt, anschließend das gesamte Gel zu deren Aushärtung 30 min bei 4°C inkubiert. Schließlich folgte eine erneute Elektrophorese für wenige Minuten, bis die gewünschte Bande unter UV im Low-Melting-Gel zu finden war. Dieses, nun die gebrauchsfertige Northern-Blot-Sonde enthaltend, wurde in ein Eppendorfgefäß überführt und bei –20°C gelagert.

2.2.5.6 Elektrophoretische Auftrennung der RNA

Die Isolierung der RNA wurde bereits im Kapitel 2.2.4.1, S. 20 beschrieben. Deren elektrophoretische Auftrennung erfolgte in Agarose-Gelen folgender Zusammensetzung:

2

g

Agarose

156

ml

H2O

36

ml

Formaldehyd

8

ml

25 x MOPS

Formaldehyd und MOPS wurden erst nach dem Aufkochen und Abkühlen des Gels auf ca. 60°C zugegeben.

Von jeder Probe wurden 20 µl RNA-Lösung aliquotiert und aufgrund des beschränkten Taschenvolumens der Gele ca. 45 min im Vakuum reduziert. Anschließend wurden die Proben mit 18 µl RNA-Auftragspuffer versehen.

Die Proben wurden schließlich zur Degeneration 5 min auf 65°C erhitzt und bis zur Auftragung, jedoch mind. 2 min, auf Eis gelagert.

Die Elektrophorese erfolgte initial 10 min bei 240 V und eine weitere Stunde bei 200 V. Als Elektrophoresepuffer wurde 1 x MOPS verwendet.

Nach einer orientierenden Kontrolle der Auftrennung bei 254 nm auf einem UV-Illuminator wurde das Gel 20 min in H2O sowie 2 x 20 min in 20 x SSC gewaschen.


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2.2.5.7  Transfer

Zum Transfer der aufgetrennten RNA auf eine Nylonmembran wurde folgender Blot luftblasenfrei aufgebaut: Auf einer Glasplatte, die eine mit 20xSSC gefüllte Wanne überdeckte, bildete ein auf 8,5 x 19,5 cm zurechtgeschnittenes Whatmanpapier die Basis. Darauf stellte ein weiteres Whatmanpapier in gleicher Breite, aber in Längsrichtung beidseits in die Wanne reichend, die Verbindung zum 20xSSC-Vorrat her. Das gewendete Gel, dessen Transferfläche durch Parafilm eingegrenzt wurde, sowie die auf Gelgröße zurechtgeschnitte Transfermembran folgten. Den Abschluß bildeten drei auf 7,5 x 19,5 cm zurechtgeschnittene Whatmanpapiere und 15 aus je zwei Lagen gefaltete Zellstoffpakete. Die Membran wurde zuvor in H2O aktiviert, anschließend wie alle Whatmanpapiere in 20 x SSC getränkt.

Der Transferturm wurde durch eine weitere Glasplatte abgedeckt und unter einem Gewicht von ca. 1 kg mind. 36 h inkubiert.

Nach dem Abbau erfuhr die Membran einen 5-minütigen Spülschritt in 2xSSC, nach der folgenden Lufttrocknung wurde die RNA im UV-Crosslinker fixiert.

2.2.5.8 Radioaktive Sondenmarkierung

Die radioaktive Markierung der zuvor hergestellten Sonden beruht auf der Neusynthese eines komplementären DNA-Strangs, in den 32P-markierte Nukleotide eingebaut werden. Hierzu wurde das Megaprime DNA Labelling System verwendet. Für jede zu hybridisierende Membran wurden 10 µl Sonde vorgelegt, 5 µl der im Kit enthaltenen Random-Primer und 18 µl H2O ergänzt. Zur Denaturierung wurden die Ansätze 5 min auf 99°C erhitzt. Anschließend wurden 10 µl Labelling-Puffer, 5 µl 32P-dCTP und 2 µl Klenow-Enzym hinzugefügt. Die Synthese des markierten Strangs erfolgte in der folgenden 30-minütigen Inkubation bei 37°C, nach der die Enzymaktivität durch 5 µl 0,2M EDTA gestoppt wurde. Zur Denaturierung der beiden Sondenstränge wurden die Ansätze nochmals 5 min auf 99°C erhitzt und direkt auf Eis gelagert, um eine erneute Hybridisierung der gerade getrennten Stränge zu vermeiden.

2.2.5.9 Hybridisierung

Zunächst erfolgte die 30-minütige Vorhybridisierung der Membranen mit jeweils 10 ml Hybridisierungslösung bei 68°C, bevor die Sonden zur 1-stündigen Hybridisierung bei gleichbleibender Temperatur zugegeben wurden. Anschließend erfolgten zwei 20- bis 30-minütige Waschschritte mit Waschpuffer 1 bei Raumtemperatur sowie zwei ebenfalls 20- bis 30-minütige Waschschritte mit Waschpuffer 2 bei 50°C. Schließlich folgte die Exposition von BIOMAX MS-Röntgenfilmen durch die in Haushaltsfolie versiegelten Blots unter Verwendung einer Verstärkerfolie bei –80°C.


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2.2.5.10  Densitometrische Auswertung

Zur Auswertung wurden die entwickelten Filme densitometrisch quantifiziert. Die Verrechnung potentieller Fehler, etwa bedingt durch unterschiedliche Auftragsmengen oder ungleichmäßigen Transfer, erfolgte durch den Vergleich mit einer GAPDH-Re-Hybridisierung der jeweiligen Blots. Bei Vergleichen verschiedener Blots diente die basale Expression zum Zeitpunkt 0 als Orientierung, diese erhielt willkürlich den Wert 100%.

2.2.6 Immunhistologie

2.2.6.1 Patientenkollektiv

Die immunhistochemische Analyse erfolgte retrospektiv an Proben der Routinediagnostik, bei denen das Einverständnis zur Verwendung für wissenschaftliche Untersuchungen vorlag. Die Auswahl wurde auf primäre Ovarialkarzinome aus den Jahren zwischen 1991 und 2001 mit ausreichend archiviertem Tumormaterial begrenzt. Das Kollektiv umfaßte 66 invasive primäre Ovarialkarzinome sowie 13 Borderline-Tumore. Weiterhin wurden 11 benigne Zystadenome sowie 11 normale Ovarien untersucht.

Alle Fälle wurden von Prof. Dr. med. Steffen Hauptmann hinsichtlich der klinisch-pathologischen Diagnose, histologischem Typ, Staging und Grading reevaluiert.

Das Gesamtüberleben wurde definiert als Zeit zwischen Diagnose und Tod, entsprechende Daten wurden vom Landeseinwohneramt unter Einhaltung der Richtlinien des Datenschutzes erfragt. Das rezidivfreie Überleben wurde bestimmt als Zeit zwischen Diagnose und dem Auftreten von lokalen oder fernen Rezidiven, die klinisch oder pathologisch festgestellt wurden. Entsprechende Aufzeichnungen waren für 46 der 66 Patientinnen mit primärem Ovarialkarzinom verfügbar.

2.2.6.2 Immunhistologische Färbung

Die ca 5 µm dicken Schnitte wurden zunächst in Xylol entparaffiniert, anschließend folgte die Fixation in absteigender Alkoholreihe. Eine 5-minütige Erhitzung unter Überdruck in Zitratpuffer ging der Antikörper-Färbung voraus, die bei 4°C mit dem 1:1000 verdünnten, polyklonalen MKP-1-Antikörper über Nacht erfolgte. Die Inkubation mit dem biotinyliertem anti-rabbit-Zweitantikörper sowie dem multilink biotin-streptavidin-amplified detection system erfolgte über jeweils 20 Minuten bei Raumtemperatur, die Anfärbung schließlich durch das fast-red chromogen system. Als Positivkontrolle wurde Nerven- und Gangliongewebe gefärbt69. Die immunhistologische Färbung erfolgte größtenteils durch Frau Ines Koch.


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2.2.6.3  Auswertung

Die Färbungen wurden unabhängig voneinander durch zwei Pathologen (Prof. Dr. med. Steffen Hauptmann und Dr. med. Carsten Denkert) ausgewertet. Die Einteilung erfolgte in MKP-1-negative Fälle (keine oder schwache Färbung) und MKP-1-positive Fälle (moderate und starke Färbung).

2.2.6.4 Statistik

Die Signifikanz wurde in SPSS V10.0 unter Nutzung des χ²- bzw. des Fisher-Tests berechnet. Die univariaten Überlebenskurven entstanden nach der Methode von Kaplan und Meier, die vergleichende Signifikanz-Berechnung erfolgte mit dem log-rank-Test. Die multivariate Analyse basierte auf dem „Cox proportional hazard regression model“.

Generell wurden p-Werte < 0,05 als signifikant betrachtet.


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10.05.2005