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3  Ergebnisse

3.1 Basale MAPK-Phosphatasen-Expression (PCR)

Zur Orientierung über Vorhandensein und basale Expression der MAPK-Phosphatasen erfolgte ein initiales PCR-Screening von 8 humanen Tumorzellinien:

Abbildung 4: PCR-Screening. Gleichmäßige Expression von MKP-1 und MKP-3, MKP-5 lediglich in A27/80 reduziert. MKP-2 in PA-1, MDAH2774, ES-2 und CAOV-3 deutlich, in SKOV-3, A27/80 und OAW42 schwach und in OVCAR-3 nicht exprimiert. MKP-4 und B23 nicht oder nur schwach exprimiert.

MKP-1, MKP-3 und MKP-5 zeigen in allen dargestellten Zellinien eine gleichmäßige Expression, lediglich A27/80-Zellen weisen eine geringfügige Reduktion der MKP-5 auf.


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Im Screening auf MKP-2 wurde neben der zu erwartenden Bande bei 409 bp eine weitere bei etwa 340 bp sichtbar. Durch Sequenzierung konnte die 409bp-Bande als MKP-2 identifiziert werden. Somit fehlt in OVCAR-3-Zellen die MKP-2, in SKOV-3, A27/80 und OAW42 besteht eine reduzierte MKP-2-mRNA-Produktion. Die Phosphatasen MKP-4 und B23 werden von den untersuchten Zellen ohne Stimulation nicht oder nur schwach exprimiert.

Die funktionelle Bedeutung der Phosphatasen ist durch die Untersuchung der Basalexpression nicht ausreichend beschrieben. Vielmehr ist ihre Regulation in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen zu betrachten.

3.2 Regulation der Phosphatasen MKP-1 und MKP-3

3.2.1 Auswahl der Aktivatoren und Zellinien

3.2.1.1 Induktion der MKP-1 durch IL-1β und TNFα

Zunächst wurden die Zellinien SKOV-3 und OVCAR-3 mit einigen potentiellen Aktivatoren untersucht. Zum Einsatz kamen Interleukin-1β (10 ng/ml), Interleukin-6 (10 ng/ml), Tumor-Nekrose-Faktor α (10 ng/ml) und der Phorbol-Ester TPA (2,5 nmol/ml).

Abbildung 5: MKP-1-Northern Blot. Stimulation mit TPA, IL-1β und TNFα für 10 min, 30 min und 6 h. Deutliche Induktion 30 min nach IL-1β– oder TNFα–Zugabe in SKOV-3(A) und OVCAR-3(B). In OVCAR-3 Nachweis der MKP-1 noch 6 h nach IL-1β–Zugabe. SKOV-3 zeigt zusätzlich eine MKP-1-Expression 6 h nach TPA.


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Die MKP-1-Expression beider Zellinien reagiert deutlich auf IL-1β und TNFα, bei SKOV-3 ist zusätzlich eine TPA-bedingte Induktion nach 6 Stunden zu erkennen. Dagegen beeinflußt IL-6 die MKP-1 zu keinem Zeitpunkt. Die weiteren Versuche wurden nur noch mit den deutlichen Induktoren IL-1β und TNFα durchgeführt.

Im Gegensatz zum zuvor gezeigten PCR-Screening zeigt der Northern Blot keine Basalexpression der MKP-1 in OVCAR-3. Dieser vermeintliche Widerspruch erklärt sich aus den unterschiedlichen Nachweisgrenzen der beiden Methoden.

Aufgrund der unterschiedlichen MKP-1-Regulation in den beiden Zellinien wurde nachfolgend das Verhalten in weiteren Zellinien gegenübergestellt.

3.2.1.2 MKP-1-Induktion in Abhängigkeit von der Zellinie

Unter Verwendung der aktivierenden Zytokine IL-1β und TNFα erfolgte nun ein Induktionsversuch in vier Ovarialkarzinomzellinien:

Abbildung 6: MKP-1-Northern-Blot. SKOV-3 und OVCAR-3 zeigen keine basale Expression bei deutlicher Induzierbarkeit durch IL-1β und TNFα. OAW42 und CAOV-3 exprimieren MKP-1 bereits ohne Zytokin-Zugabe, nach Zugabe zeigt sich nur eine mäßige Steigerung.

Der deutlichen Induzierbarkeit in SKOV-3 und OVCAR-3 steht eine deutlich schwächere Induzierbarkeit in OAW42 und CAOV-3 gegenüber. Letztere exprimieren das Enzym jedoch konstitutiv.

Für die fein abgestimmte Regulation der MAP-Kinasen ist darüber hinaus der Zeitverlauf der Phosphatasen-Expression von großer Bedeutung. Dieser wurde nachfolgend untersucht:


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3.2.2  Zytokin-induzierte mRNA-Expression (MKP-1)

Um unterschiedliche Zeitverläufe zu erfassen, wurden nachfolgend Zeitreihen der MKP-1-Expression nach IL-1β bzw. TNFα-Zugabe in allen vier Karzinom-Zellinien untersucht. Zur Orientierung über den physiologischen Zustand ist zudem das Verhalten in der aus gesundem Oberflächenepithel etablierten Zellinie HOSE dargestellt:

3.2.2.1 HOSE

Abbildung 7: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in HOSE nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 2(A) bzw. 3(B) unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Nach IL-1β deutlicher Anstieg nach 30 min und bereits nach kurzer Zeit Rückgang zum basalen Level. Ähnliches Verhalten nach TNFα mit hoher Signifikanz nach 30 min (p=0,0001).


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Im Verlauf zeigt HOSE nach beiden Zytokinen einen deutlichen MKP-1-Anstieg nach 30 min, im Anschluß sinkt die MKP-1-Expression innerhalb weniger Stunden wieder auf das Ausgangsniveau ab.

3.2.2.2 SKOV-3

Abbildung 8: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in SKOV-3 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 3 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Durch IL-1β signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,023) und 1 h (p=0,008), nach 3 h Rückgang auf Basalwert. Durch TNFα-Zugabe Anstieg nach 30 min (p=0,038) und 1 h (p=0,025). Nach 3 h Rückgang unter die Signifikanz-Grenze.

In SKOV-3 beträgt die MKP-1-mRNA-Expression nach IL-1β und TNFα-Zugabe zu den Zeitpunkten 30 min und 1 h mindestens das 4-fache der jeweiligen Kontrolle. Nach 3 h ist in beiden Fällen keine signifikante Erhöhung mehr nachzuweisen.


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3.2.2.3  OVCAR-3

Abbildung 9: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in OVCAR-3 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 3 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Durch IL-1β signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,0001), Höchstwert nach 1 h (p=0,019) und langsamer Abfall bis 24 h (3 h: p=0,009, 6 h: p=0,0004, 24 h:p=0,049). Durch TNFα-Zugabe kurzfristiger Anstieg nach 30 min, der jedoch keine Signifikanz erreicht (p=0,057).

OVCAR-3 zeigt ebenfalls eine deutliche MKP-1-Erhöhung 30 min und 1 h nach IL-1β-Zugabe. Im Vergleich zu SKOV-3 ist diese Aktivierung jedoch über viele Stunden deutlich prolongiert, erst der 24 h –Wert deutet bei noch signifikanter Erhöhung einen Rückgang zum Ausgangsniveau an. Die Induktion durch TNFα nach 30 min und 1 h erreicht keine Signifikanz.


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3.2.2.4  OAW42

Abbildung 10: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in OAW42 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 3 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Keine Reaktion unter IL-1β. Nach TNFα zunächst signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,012), nach 1 h und 3 h signifikanter Abfall (1 h: p=0,036, 3 h: p=0,002).

OAW42 zeigt unter IL-1β keine MKP-1-Reaktion. Im Zeitverlauf nach TNFα findet sich nach 30 min zunächst eine MKP-1-Induktion. Im weiteren Verlauf fällt jedoch eine Reduktion der MKP-1-Expression nach 1 h und 3 h auf. In ergänzenden Versuchen zeigte sich diese auch nach 2 h (nicht gezeigt). Zum 24 h-Meßpunkt liegt die MKP-1-Expression nach TNFα-Zugabe wieder im Bereich der mitgeführten Kontrolle.


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3.2.2.5  CAOV-3

Abbildung 11: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in CAOV-3 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 2(A) bzw. 3(B) unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Keine Reaktion unter IL-1β. Nach TNFα zunächst signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,002) und 1 h (p=0,020). Zum Zeitpunkt 3 h signifikanter Abfall unter den Kontrollwert (p=0,0001), nach 24 h erneuter Anstieg.

Die Reaktion der Zellinie CAOV-3 ist mit dem Verhalten der zuvor gezeigten vergleichbar. Unter IL-1β zeigt sich keinerlei Reaktion. TNFα bewirkt zunächst eine Induktion, später eine Reduktion des MKP-1-Niveaus. Ein Unterschied findet sich allerdings im Zeitverlauf – die initiale Induktion hält bis zum Zeitpunkt 1 h an, erst danach fällt die MKP-1-Expression unter den Wert der mitgeführten Kontrolle ab. Ein zweiter Anstieg zeigt sich 24 h nach Stimulation mit TNFα.


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3.2.2.6  Übersichts-Tabelle

Tabelle 4: maximale MKP-1-Induzierbarkeit nach 30 min bzw. 1 h

 

MKP-1-Expression

 

basal

IL-1 β

TNFα

HOSE

+

4,5

5,0

SKOV-3

+

8,0

6,0

OVCAR-3

(+)

16,0*)

6,0

OAW42

++

(1,5)

2,0**)

CAOV-3

+

(1,0)

2,5**)

*) verlängerte Aktivität bis 24 h
**) nach initialer Induktion hochsignifikanter Abfall unter den Kontrollwert nach 3 h


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3.2.3  p38-Aktivität im Zeitverlauf (Western-Blot)

Die Induktion der MAPK-Phosphatasen ist im Zusammenspiel mit ihren Zielproteinen zu betrachten. Daher ist nachfolgend exemplarisch der Aktivitätsverlauf der p38-MAPK in OVCAR-3, gemessen am Anteil des phosphorylierten Proteins, im Western-Blot dargestellt. Densitometrisch wurde das Verhältnis des phosphorylierten Anteils zum Gesamtprotein bestimmt.

Abbildung 12: p38-Western Blot. Deutliche Phosphorylierung nach 10 min und 30 min.

Demnach erfolgt in OVCAR-3 nach TNFα-Stimulation eine schnelle Aktivierung des p38-MAPK-Signalweges innerhalb einiger Minuten.

3.2.4 Untersuchungen der MKP-1 auf Proteinebene

Neben den Untersuchungen der Zielproteine wurden auch Western Blots zum Nachweis der MKP-1 durchgeführt. Diese zeigten andeutungsweise den erwarteten Anstieg der Proteinmenge nach etwa 1 h, die Signale waren jedoch zu schwach, um auswertbare Abbildungen zu erhalten. Als Ursache ist wohl die Instabilität der MKP-1 anzusehen, durch die im Verlauf der Aufarbeitung ein Großteil des Proteins verloren geht. Da die Regulation der MKP-1 auf Transkriptionsebene erfolgt60,70,71, wurde auf eine Optimierung des Proteinnachweises verzichtet.


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3.2.5  Zytokin-induzierte mRNA-Expression (MKP-3)

Die unterschiedlichen Zeitverläufe nach IL-1β bzw. TNFα-Zugabe wurden nachfolgend auch für die Phosphatase MKP-3 in allen vier Karzinom-Zellinien sowie der Vergleichszellinie HOSE untersucht. Exemplarisch ist der Verlauf in OVCAR-3-Zellen abgebildet:

3.2.5.1 OVCAR-3

Abbildung 13: MKP-3-Northern Blot. MKP-3-Induktion durch IL-1β(A) bereits nach 30 min bis über 72 h hinaus, Maximum bei 1 h. Nach TNFα(B) Induktion nach 30 min und 1 h.

In OVCAR-3 wird die MKP-3 bei sehr geringer Basalexpression sowohl durch IL-1β als auch durch TNFα deutlich induziert, das Maximum liegt jeweils bei 1 h. Nach Induktion durch IL-1β findet sich ein kontinuierlicher Abfall des MKP-3-Niveaus, die minimale Basisexpression wird auch nach 72 h noch nicht erreicht. Im Gegensatz dazu ist diese Phosphatase nach TNFα-Zugabe bereits 3 h später kaum noch nachweisbar.

Das densitometrisch bestimmte Ausmaß der Induktion sowie die Induzierbarkeit in anderen Zellinien sind der nachfolgenden Tabelle 5 zu entnehmen.


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3.2.5.2  Übersichts-Tabelle

Tabelle 5: maximale MKP-3-Induzierbarkeit nach 30 min bzw. 1 h

 

MKP-3-Expression

 

basal

IL-1 β

TNFα

HOSE

+

(1,0)

(1,0)

SKOV-3

+

2,0*)

1,5

OVCAR-3

-

50,0**)

50,0

OAW42

+

(1,5)

(1,0)*)

CAOV-3

(+)

(1,0)

4,0

*) Reduktion nach 3 h
**) verlängerte Aktivität bis 72 h


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3.3  Suppression der Phosphatasen durch verschiedene Inhibitoren

MAPK-Phosphatasen greifen mit unterschiedlicher Affinität inaktivierend in die verschiedenen MAPK-Signaltransduktionswege ein. Bisher ist allerdings nur wenig über die Aktivierungswege der Phosphatasen bekannt. Die unterschiedlichen Expressionsmuster der Phosphatasen in verschiedenen Zellinien ließen sich möglicherweise durch zellinienabhängige Unterschiede in diesen Signalwegen oder deren Aktivitätsgrad erklären. Daher wurden mehrere Signalwege mittels spezifischer Inhibitoren ausgeschaltet. Hierbei ist zu beachten, daß die Spezifität von Inhibitoren nur innerhalb bestimmter Konzentrationsbereiche sichergestellt ist. Bei höheren Konzentrationen besteht die Möglichkeit der Hemmung weiterer Proteine mit ähnlicher Struktur, beispielsweise weiterer Varianten einer Proteinfamilie.

3.3.1 Inhibitoren des MAPK-Signalweges

3.3.1.1 Hemmung der MKP-1 in SKOV-3

Abbildung 14: MKP-1-Northern-Blot. Einfluß der Inhibitoren SB203580 und PD 98059 auf die MKP-1-Expression in SKOV-3 nach Zugabe von TNFα. Darstellung eines Blots und densitometrischer Quantifizierung: Mittelwert aus 2 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz TNFα-stimuliert zur unstimulierten Kontrolle. Die DMSO-Kontrolle reagiert signifikant auf TNFα (p=0,046), bei SB-Vorbehandlung (10 µM) zeigt sich keine Reaktion (p=0,941). Unter PD-Einfluß ergibt sich wieder eine signifikante Reaktion (p=0,015), die Dimension der DMSO-Kontrolle wird jedoch nicht erreicht.


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Die Aktivierung der MKP-1 durch TNFα kann durch Zugabe von Inhibitoren des MAPK-Signalweges beeinflußt werden: Der p38-MAPK-Inhibitor SB203580 (SB) blockiert in einer Konzentration von 10 µM die MKP-1-Induktion fast vollständig. Der Inhibitor PD98059, der den p42/44-MAPK-Signalweg zwischen raf und MKK1 blockiert, läßt eine signifikante Induktion durch TNFα zu. Das Niveau der DMSO-Kontrolle wird jedoch nicht erreicht.

Diese Inhibitoreffekte fanden sich auch in OVCAR-3-Zellen unter TNFα (nicht gezeigt).

3.3.1.2 Hemmung der MKP-3 in SKOV-3

Abbildung 15: MKP-3-Northern Blot. Einfluß von MAPK-Inhibitoren auf die MKP-3-Expression unter TNFα in SKOV-3. Nach 30 min unabhängig von Stimulation deutlicher MKP-3-Rückgang durch PD98059. Etwas schwächere Reaktion unter SB203580. Keine eindeutige Inhibition nach 24 h.

Analog zur Phosphatase MKP-1 sollten auch für die Phosphatase MKP-3 die potentiellen Aktivierungswege untersucht werden. Hier zeigte sich, daß die Zugabe des p42/44-MAPK-Inhibitors PD98059 nach 30 min eine deutlichere Reduktion des MKP-3-Levels im Vergleich zum ebenfalls inhibierenden p38-Inhibitor SB203580 hervorrufen konnte. Diese Effekte waren unabhängig von der TNFα-Zugabe. Nach 24 h war keine eindeutige Inhibition mehr erkennbar.


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3.3.2  Inhibitoren der atypischen PKC

3.3.2.1 Hemmung der MKP-1

Abbildung 16: MKP-1-Northern-Blot. Einfluß der Inhibitoren GF109203X und Ro-31-8220 auf die MKP-1-Expression in SKOV-3(A) und OVCAR-3(B) nach Zugabe von IL-1β. Einfluß von hohen Konzentrationen des Inhibitors GF109203X auf die MKP-1-Expression in OVCAR-3 nach Zugabe von IL-1β und TNFα (C). Jeweils Blot und densitometrische Quantifizierung. Deutliche Inhibierung durch Ro in beiden Zellinien, nur geringe Reaktion auf 2,5µM und 5 µM GF. Bei einer GF-Konzentration von 20 µM mäßige Reduktion der MKP-1-Induktion nach IL-1β.

[Seite 52↓]In beiden Zellinien ist durch den Inhibitor Ro-31-8220 eine deutliche Inhibierung des Interleukin-1β-Effektes auf MKP-1 zu erkennen. Diese wird bereits bei einer Konzentration von 2,5 µM erreicht. Ro-31-8220 gilt als Inhibitor aller bekannten Varianten der PKC.

Bei Verwendung des Inhibitors GF109203X tritt keine wesentliche Hemmung auf. Dieser Inhibitor hat eine hohe Selektivität gegenüber den PKC-Isoformen α, β, γ, δ und ε.

Erst bei einer GF-Konzentration von 20 µM, bei der die Hemmung weiterer Isoformen denkbar ist, findet sich in OVCAR-3-Zellen nach IL-1β-Zugabe im Gegensatz zu den Konzentrationen 2,5 µM und 5 µM eine deutliche Reduktion der MKP-1-Expression.

3.3.2.2 Hemmung der MKP-3

Abbildung 17: MKP-3-Northern Blot. Einfluß der Inhibitoren GF109203X und Ro-31-8220 auf die MKP-3-Expression in OVCAR-3 nach Zugabe von IL-1β. Deutliche Inhibierung durch Ro, nur geringe Reaktion auf GF.

Analog zur Reaktion der MKP-1 konnte auch die IL-1β-induzierte MKP-3-Expression in OVCAR-3-Zellen durch den Inhibitor Ro-31-8220 gehemmt werden. Bei Verwendung des Inhibitors GF109203X zeigt sich erst bei steigender Konzentration eine Reduktion des Phosphatasen-Levels.

3.3.3 Inhibitoren des PI3K-Signalweges

Versuche mit dem PI3-Kinase-Inhibitor LY294002 brachten aufgrund einer erheblichen Zytotoxizität keine eindeutigen Ergebnisse.


[Seite 53↓]

3.4  Expression im Ovarialkarzinom und prognostische Bedeutung

3.4.1  Expressionsunterschiededer MKP-1 auf mRNA-Ebene in Tumormaterial

Neben der Untersuchung von Zellinien wurde auch Tumormaterial auf das Vorhandensein der MKP-1 im Northern-Blot untersucht. Hierdurch sollte ein möglicher Zusammenhang zwischen der MKP-1-Expression und histologischem Typ bzw. Grading aufgedeckt werden. Die Auswahl der Proben erfolgte anhand der zur RNA-Isolierung ausreichenden Verfügbarkeit von Tumormaterial.

Abbildung 18: MKP-1-Northern-Blot. Expressionsunterschiede in Tumormaterial ohne Korrelation mit histologischer Differenzierung oder Grading.

Die Abbildung zeigt erhebliche Unterschiede der MKP-1-mRNA-Transkription in verschiedenen Tumoren. Ein offensichtlicher Zusammenhang zu histologischer Differenzierung und Grading besteht nicht.

Daher wurde nachfolgend ein größeres Kollektiv immunhistologisch untersucht.


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3.4.2  Immunhistologische Untersuchungen

Abbildung 19: MKP-1 Immunhistologie. Exemplarische Abbildung positiver und negativer immunhistologischer Färbungen.


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3.4.3  MKP-1 ist in invasiven Karzinomen geringer exprimiert

Insgesamt wurden von 101 Patientinnen Ovarialtumoren, Zystadenome oder normale Ovarien immunhistologisch untersucht. Das Durchschnittsalter der Patientinnen zum Zeitpunkt der Operation betrug 58 Jahre bei einer Standardabweichung von 12,6 Jahren.

Unter den 66 invasiven primären Ovarialkarzinomen waren 35 (53%) serös, 5 (8%) muzinös,
8 (12%) endometroid, 2 (3%) klarzellig, 1 (1%) transitionalzellig und 15 (23%) undifferenziert.

Die 13 Borderline-Tumoren wurden in 10 Fällen als serös, in 2 als muzinös und in einem Fall als serös-muzinöser Mischtumor diagnostiziert.

Darüber hinaus befanden sich 11 Zystadenome und 11 normale Ovarien in der untersuchten Population.

Die Verteilung der MKP-1-Expression ist in der nachfolgenden Tabelle 6 wiedergegeben:

Tabelle 6: MKP-1-Expression in normalen Ovarien und Tumoren

 

MKP-1-Expression

 
 

negativ

positiv

Gesamt

invasive Karzinome

28

(42,4 %)

38

(57,6 %)

66

(100%)

Borderline-Tumore

7

(53,8 %)

6

(46,2 %)

13

(100 %)

Zystadenome

1

(9,1 %)

10

(90,9 %)

11

(100 %)

normale Ovarien

0

(0 %)

11

(100 %)

11

(100 %)

Der MKP-1-Verlust invasiver Karzinome war im Vergleich zur Gesamtheit der übrigen Proben signifikant (p = 0,011, χ²-Trend-Test).

Ein ähnlicher Anteil MKP-1-negativer Karzinome fand sich bereits auf mRNA-Ebene (vgl. 3.4.1, S. 43), hier waren 5 von 10 (50 %) der invasiven Karzinome MKP-1-negativ.


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3.4.4  Univariate Überlebensanalyse

3.4.4.1 Keine Korrelation der MKP-1 mit bekannten Prognosefaktoren

Innerhalb der Gruppe der invasiven Karzinome wurde nachfolgend die MKP-1-Expression mit den wichtigsten klinisch-pathologischen Prognosefaktoren auf Zusammenhänge untersucht
(χ²-Test und Fisher´s Test). Hierbei ergaben sich keine signifikanten Korrelationen mit dem histologischen Typ, Grading, FIGO Stadium, Nodalstatus, Metastasierungsgrad und Patientenalter (nicht gezeigt).

3.4.4.2 MKP-1 hat keinen Einfluß auf das Gesamtüberleben

Zur Erfassung der prognostischen Relevanz standen die Überlebensdaten von 46 der 66 Patienten mit invasivem Karzinom zur Verfügung. Im Gegensatz zu FIGO Stadium, Staging
(pT und pM), Klassifizierung als undifferenziertes Karzinom, Silverberg-Grading und Alter zum Diagnose-Zeitpunkt hatte die MKP-1-Expression keinen Einfluß auf das Gesamtüberleben (nicht gezeigt).

3.4.4.3 Kürzeres rezidivfreies Überleben bei MKP-1-positiven Tumoren

In der univariaten Analyse des rezidivfreien Überlebens zeigte sich jedoch die MKP-1-Expression als signifikant mit kürzerem rezidivfreiem Überleben assoziiert (p = 0,019; log-rank Test). Ebenfalls signifikant war ein Silverberg-Grading G3 (p=0,0013), ein Tumorstaging pT3 (p=0,016) sowie ein FIGO-Stadium III-IV (p=0,028).

Exemplarisch sind nachfolgend die Kaplan-Meier-Kurven des rezidivfreien Überlebens für MKP-1-Expression und FIGO-Stadium abgebildet:


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Abbildung 20: Univariate Analysen


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3.4.5  Multivariate Überlebensanalyse

Mit Hilfe des „Cox proportional hazards regression model“ wurde in einer exploratorischen multivariaten Überlebensanalyse die Unabhängigkeit der MKP-1-Expression als prognostischer Marker für ein kürzeres rezidivfreies Überleben gezeigt (relatives Risiko (RR) = 4,03;
95%CI = 1,72-9,48; p = 0,001). Hierbei wurden alle Parameter berücksichtigt, die in der univariaten Analyse Signifikanz zeigten: FIGO-Stadium III/IV und Silverberg-Grading G3. Das Tumorstaging pT wurde als Bestandteil der FIGO-Klassifikation berücksichtigt.

Neben der MKP-1 war das Silverberg-Grading ein signifikanter unabhängiger Prognoseparameter für das rezidivfreie Überleben. Das FIGO-Stadium erreichte nur eine grenzwertige Signifikanz:

Tabelle 7: Multivariate Überlebensanalyse

 

relatives Risiko (RR)

95% CI

p-Wert

MKP-1-Expression

   

negativ

1,00

  

positiv

4,03

1,72 – 9,48

0,001

FIGO-Stadium

   

I-II

1,00

  

III-IV

3,481

1,002 – 12,09

0,050

Silverberg-Grading

   

G1-G2

1,00

  

G3

4,03

1,61 – 10,05

0,003

Die Überlebenskurve in Abhängigkeit von der MKP-1-Expression ist nachfolgend wiedergegeben:


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Abbildung 21: Multivariate Analyse


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3.5  Phosphatasen-Induktion durch Cisplatin

3.5.1 Induktion der MKP-1 durch Cisplatin in OVCAR-3

Die erheblichen prognostischen Unterschiede in Abhängigkeit von der MKP-1-Expression sind unter Berücksichtung der primären Therapie zu betrachten. Diese basiert nach radikaler Tumorentfernung typischerweise auf Cisplatin-basierten Chemotherapieprotokollen.

Die nachfolgende Abbildung zeigt die Reaktion der MKP-1 nach Cisplatin-Zugabe in OVCAR-3-Zellen:

Abbildung 22: MKP-1-Induktion in OVCAR-3 durch Cisplatin
(repräsentative Abbildung aus 2 unabhängigen Versuchen)

Cisplatin bewirkt in OVCAR-3-Zellen eine deutliche Induktion der MKP-1 mit zunehmender Intensität. Nach 24 h ist eine erhebliche Reduktion der GAPDH zu verzeichnen (nicht gezeigt).


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3.5.2  Induktion der MKP-3 durch Cisplatin in OVCAR-3

Analog zur Phosphatase MKP-1 wurde auch das Verhalten der MKP-3 unter Cisplatin-Zugabe untersucht:

Abbildung 23: MKP-3-Northern Blot. Induktion in OVCAR-3 durch Cisplatin
(repräsentative Abbildung aus 2 unabhängigen Versuchen)

Bereits nach 1 h zeigt sich eine deutliche Reaktion der MKP-3 auf Cisplatin, die bis 6 h nach Zugabe etwas abgeschwächt fortbesteht. Nach 9 h steigt die Expression wieder an.


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3.5.3  Verhalten der MKP-1 in einer Cisplatin-resistenten Zellinie

Die Induktion der MKP-1 wurde nachfolgend zwischen der nativen Zellinie A27/80 sowie der daraus etablierten Cisplatin-resistenten Zellinie A27/80cis verglichen.

Abbildung 24: MKP-1-Induktion in A27/80 durch Cisplatin

In der nativen Zellinie A27/80 steigt die MKP-1-Transkription erst nach dem deutlichen Rückgang der GAPDH als Zeichen der zytotoxischen Wirkung des Cisplatins an. Die resistente Zellinie A27/80cis reagiert bereits 3 h nach Cisplatin-Zugabe mit erhöhter MKP-1-Produktion – ein Abfall der GAPDH läßt sich nicht nachweisen.


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10.05.2005