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4  Diskussion

4.1 MAPK-Phosphatasen sind in verschiedenen Zellinien nachweisbar

Die PCR-basierte Untersuchung verschiedener Ovarialkarzinomzellinien auf die Basalexpression von sechs MAPK-Phosphatasen erlaubt aufgrund der hohen Zyklenzahl nur qualitative Aussagen. Mit Ausnahme der MKP-2 konnten alle untersuchten Phosphatasen in allen Zellinien nachgewiesen werden. In der Literatur werden gelegentlich MAPK-Phosphatasen als Tumorsuppressorgene angesehen.72 Mit Ausnahme der MKP-2 in einer Zellinie konnte dies jedoch nicht bestätigt werden.

4.2 Beeinflussung der Phosphatasenexpression durch Zytokine

4.2.1 Induktion der Phosphatase MKP-1

Bei der Betrachtung der Phosphatasen-Expression nach Zytokin-Zugabe wurde zunächst der MKP-1-Zeitverlauf in der aus unauffälligem ovariellem Oberflächenepithel etablierten Zellinie HOSE untersucht. Im Vergleich mit den entarteten Zellinien dürfte ihre Reaktion auf Zytokine dem physiologischen Verhalten am nächsten kommen. In dieser zeigt die Phosphatase MKP-1 nach Zytokinzugabe eine deutliche kurzzeitige Aktivierung, sie dürfte normalerweise für die schnelle, aber zeitlich begrenzte Inaktivierung der MAP-Kinasen nach Zytokin-Aktivierung verantwortlich zu sein.

In den beiden Zellinien SKOV-3 und OVCAR-3 zeigt die MKP-1 insgesamt ein mit HOSE vergleichbares Verhalten. Bei näherer Betrachtung fällt jedoch in OVCAR-3 nach IL-1β-Stimulation eine bis zum 24 h-Meßwert signifikant erhöhte MKP-1-Expression auf. Diese verlängerte Aktivität deutet auf eine Fehlregulation innerhalb der aktivierenden Signalkaskaden hin.

Die Zellinien OAW42 und CAOV-3 weichen erheblich von dem bisher beschriebenen Verhaltensmuster ab. So ist bereits unstimuliert eine deutliche MKP-1-Expression nachweisbar. Nach Zugabe von IL-1β zeigt keine der beiden Zellinien eine signifikante Reaktion. Möglicherweise sind Teile des IL-1β-Signalweges dauerhaft aktiviert und lassen sich durch Zugabe von IL-1β nicht weiter stimulieren.


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Die Zugabe von TNFα führt in beiden Zellinien zunächst zu dem erwarteten Expressionsanstieg der MKP-1, überraschenderweise kommt es jedoch 3 h nach der Zytokin-Zugabe zu einer hochsignifikanten Reduktion des MKP-1-Levels unter das Basis-Niveau. Dieses in der Literatur bisher nur für die Phosphatase MKP-3 nach Dexamethason-Zugabe beschriebene Phänomen63 ließe sich durch ein negatives Feedback innerhalb des Phosphatasen-aktivierenden Signalweges erklären – denkbar wäre aber auch ein von diesem unabhängiger durch TNFα ausgelöster Mechanismus, der hemmend auf die Expression der MKP-1 einwirkt.

Diese Beobachtung unterstreicht einmal mehr die Komplexität der Signalkaskaden, ohne deren Verständnis eine gezielte Beeinflussung der MAP-Kinasen unter Beachtung der induzierten Wechselwirkungen kaum möglich erscheint.

4.2.2 komplexe Reaktion der Phosphatase MKP-3

Die im Gegensatz zur nukleären MKP-1 im Zytoplasma lokalisierte Phosphatase MKP-3 weist zu großen Teilen ein ähnliches Verhalten auf. So ist die prolongierte Aktivität in OVCAR-3 auch bei der MKP-3 zu finden, diese erstreckt sich sogar bis zum 72 h-Meßwert.

Eine Reduktion der MKP-3-Expression 3 h nach TNFα zeigt sich jedoch nur in OAW42-Zellen. Bemerkenswerterweise geht dieser keine Induktion der MKP-3 voraus, so daß ein Feedback-Mechanismus offensichtlich nicht durch diese Phosphatase selbst ausgelöst wird. Außerdem kann eine Reduktion der MKP-3 unter das Basis-Niveau nicht nur durch dieses Zytokin ausgelöst werden: SKOV-3-Zellen reagieren nach der initialen Induktion durch IL-1β ebenfalls mit einer Reduktion der MKP-3-Expression. Der zur Hemmung der Phosphatasen führende Mechanismus dürfte demzufolge ebenso komplex sein wie das Aktivierungssystem.


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4.3  aktivierende Signalwege

4.3.1 Einfluß der MAPK-Kaskade

Für das Verständnis der großen MAPK-Signalweg-Familie sind neue Erkenntnisse über die Aktivierungsmechanismen der MAPK-Phosphatasen unentbehrlich. Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit die Reaktion der Phosphatasen unter dem Einfluß einiger Signalweg-Inhibitoren beobachtet werden.

4.3.1.1 Beeinflussung der MKP-1

Zur Untersuchung der aktivierenden Signalwege wurden zwei gebräuchliche Inhibitoren verwendet. Der Inhibitor SB203580 blockiert die wesentlichen Isoformen der p38-MAPK, p38α und p38β, bei der verwendeten Konzentration fast vollständig, die Untersuchung weiterer Kinasen ergab unter diesen Bedingungen keine unspezifische Beeinflussung.73 Der Inhibitor PD98059 verhindert die Aktivierung der MEK 1 und 2 und gilt damit als Inhibitor des ERK-Signalweges. Selbst bei Verwendung einer Konzentration von 50µM wurde bisher kein Einfluß auf andere Kinasen beschrieben.73

In eigenen Versuche führte der p38-Inhibitor SB203580 zu einer fast vollständigen Blockade der MKP-1-Induktion durch TNFα. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf die Bedeutung des p38-Signalweges im Rahmen der Phosphatasen-Regulation. Mit dem Inhibitor PD98059 konnte die durch TNFα ausgelöste Induktion der MKP-1 in zwei Zellinien deutlich reduziert werden. Die ERK-Kaskade ist also zumindest teilweise an der Regulation der MKP-1 beteiligt, möglicherweise jedoch nicht nur abhängig vom Stimulus sondern auch von dem jeweiligen Zelltyp.

In der Literatur wurden bisher verschiedene, teilweise widersprüchliche Aktivierungswege der MKP-1 diskutiert. So wurde 1996 in Fibroblasten die Induktion über den JNK-Signalweg vermutet74. Neben bekannten JNK-aktivierenden extrazellulären Stimuli konnte auch durch konstitutive Expression der vermeintlich JNK-spezifischen MEKK eine MKP-1-Expression erreicht werden. Die dauerhafte Aktivität der zur ERK-Kaskade gehörenden MEK führte hingegen nicht zu einer MKP-1-Induktion.


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Im Jahr 1997 wurde erneut gezeigt, daß der ERK-Signalweg nicht zur MKP-1-Induktion ausreicht.29 Kürzlich wurde sogar ein ERK-induzierter Abbau der MKP-1 durch den Ubiquitin-Proteasom-Weg diskutiert,62 der durch den MEK-Inhibitor PD98059 (25µM) in einer Reihe von Säuger-Zellinien gehemmt werden konnte. Ebenfalls im Jahr 1997 wurde jedoch in der Hamster-Fibroblasten-Zellinie CCL39 eine Hemmung der MKP-1 durch diesen Inhibitor in einer Konzentration von 10 µM beschrieben.30

Die ursprünglich angenommene direkte Induktion der MKP-1 durch JNK oder p38 wird durch die UV-induzierte JNK- und p38-Aktivierung ohne folgende MKP-1-Induktion widerlegt,33 auch wenn der p38-Inhibitor SB203580 eine fast vollständige Blockade der MKP-1-Induktion durch TNFα bewirkt (eigene Ergebnisse).

Eine weitere wesentliche Rolle scheinen auch Calcium-Ionen-abhängige Signalwege zu spielen. Einerseits kann durch Calcium-Bindung die MKP-1-Induktion verhindert werden, andererseits ist durch die Zugabe von Calcium-Ionen sogar eine MAPK-unabhängige MKP-1-Induktion möglich.75

Insgesamt wird zunehmend deutlich, daß zur Aktivierung dieser Phosphatase mehrere Signale gemeinsam notwendig sind.

4.3.1.2 Beeinflussung der MKP-3

Neben der Induzierbarkeit durch Zytokine in einzelnen Ovarialkarzinomzellinien konnte die Phosphatase MKP-3 durch die Inhibitoren SB203580 und PD98059 unabhängig von einer parallelen TNFα-Zugabe supprimiert werden. Hierbei zeigte PD98059 den stärkeren Effekt.

Für diese bereits basal exprimierte Phosphatase wurde in der Literatur bisher nur die Induzierbarkeit durch NGF ohne Hinweise auf die zugrundeliegenden Signalwege beschrieben45,76.


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4.3.2  Einfluß der Protein Kinase C

Neben Inhibitoren des MAPK-Signalweges wurden auch solche der PKC-Familie verwendet, die an vielen intrazellulären Signalen beteiligt sind. Dabei wird zwischen den klassischen (alpha, α, beta, β und gamma, γ), den neuen (delta, δ, epsilon, ε, eta, η, theta, θ und my, µ) sowie den atypischen (zeta, ζ und iota, ι) Protein Kinasen C unterschieden. Die klassischen und neuen Kinasen aktivieren den MAPK-Signalweg über das Protein raf, die atypischen aktivieren MEK unabhängig von raf.77 Für die atypischen PKCs, die auch in die IL-1β-und TNFα-Signalwege involviert sind, wurde eine wesentliche Rolle in der Steuerung von Zellwachstum und Überleben gezeigt.78

Der Inhibitor GF109203X blockiert den Signalweg der konventionellen und neuen PKCs bei einer Konzentration von 1 µM fast vollständig. Für die atypischen PKCs wird die IC50 mit
6-10 µM angegeben.79

Der Inhibitor Ro-31-8220 unterscheidet sich von GF109203X nur in einer funktionellen Gruppe. Dadurch wird jedoch die Spezifität erheblich verändert. Neben allen Varianten der PKC werden auch die MAPKAPK-1b mit einer IC50 von nur 3nM und weitere Kinasen gehemmt.73 Außerdem scheint Ro-31-8220 den JNK-Signalweg unabhängig von der Protein Kinase C zu aktivieren.80

4.3.2.1  Beeinflussung der MKP-1

Die Versuche in zwei Ovarialkarzinomzellinien zeigen bei bis zu 5 µM GF109203X keine signifikante Reduktion der MKP-1-Expression nach Zugabe von IL-1β oder TNFα. Der Inhibitor Ro-31-8220 unterdrückte dagegen schon bei einer Konzentration von 2,5 µM die Phosphatase MKP-1 fast vollständig. Erst bei einer Steigerung der GF109203X-Konzentration auf 20 µM war eine leichte Reduktion der Zytokin-induzierten MKP-1-Expression nachweisbar.

In Makrophagen konnte mit 1-5 µM GF109203X die MKP-1-Induktion durch LPS unterdrückt werden. In Verbindung mit weiteren Versuchen wurde in diesem Fall die PKCε als ursächliche PKC Isoform angenommen.81 In Fibroblasten können beide Inhibitoren die Induktion der MKP-1 nach Zugabe von PMA blockieren. Die Induktion durch LPA und EGF war jedoch nur durch Ro-31-8220 hemmbar.80 Eine weitere Publikation zeigt lediglich eine Verringerung der MKP-1-Induktion durch PMA und FCS bei einer mit 30 µM recht hohen Konzentration GF109203X.30


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Die Regulation der MKP-1 wird somit offensichtlich in Abhängigkeit von Zelltyp und Stimulanz durch verschiedene PKC-Isoformen vermittelt. In den untersuchten Ovarialkarzinomen dürfte die Zytokin-induzierte MKP-1-Expression über atypische PKCs ausgelöst werden, die bereits bei niedrigen Konzentrationen von Ro-31-8220 gehemmt werden, von GF109203X jedoch erst bei höheren Mengen beeinflußt werden. Darüber hinaus ist aufgrund der breiten Spezifität der Inhibitoren jedoch auch ein PKC-unabhängiger Mechanismus für die gezeigten Ergebnisse denkbar.

4.3.2.2 Beeinflussung der MKP-3

In einem weiteren Versuch wurde auch das Verhalten der MKP-3 auf die PKC-Inhibitoren untersucht. Es zeigte sich ebenfalls eine deutliche Supprimierung der IL-1β-induzierten Phosphatasen-Expression unter Ro-31-8220. Bei 2,5 µM GF109203X war noch keine signifikante Hemmung der MKP-3 zu erkennen, eine GF-Konzentration von 5 µM genügte jedoch bereits für eine zunehmende Supprimierung.

Im Vergleich zur Regulation der MKP-1 zeigen sich nur geringe Abweichungen, so daß ähnliche Aktivierungskaskaden beider Phosphatasen anzunehmen sind. Die schon bei etwas niedrigeren GF-Konzentrationen eintretende Reduktion der MKP-3 könnte allerdings als Hinweis auf kleinere Unterschiede zu verstehen sein.

4.3.3 Bistabilität des MAPK-Signalweges

Alle bisherigen Beobachtungen zur Regulation der MAPK-Phosphatasen gingen von einem linearen Aktivierungsmechanismus aus, d.h. es wurde angenommen, daß eine bestimmte Konstellation von aktivierenden und hemmenden Signalen zu einer reproduzierbaren Reaktion der Phosphatasen führt. Im Jahr 2002 wurde jedoch neben der ohnehin schon erheblichen Komplexität der aktivierenden Signalwege ein bistabiles Verhalten des MAPK-Signalweges beschrieben. Dies wurde mit Hilfe eines theoretischen Modells simuliert und experimentell in Maus-Fibroblasten bestätigt.82


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Dabei ergibt sich folgender Rückkopplungsmechanismus: Die aktive MAPK aktiviert die cytoplasmatische Phospholipase A2 (cPLA2). Diese produziert Arachidonsäure, die wiederum die PKC stimuliert. Diese schließt durch ihre MAPK-aktivierende Wirkung den Regelkreis.

Eine Schlüsselrolle wird dabei der MKP-1-Konzentration zugeschrieben, die sich aus der ursprünglich vorhandenen Menge und der durch den Stimulus induzierten zusammensetzt. Bei einer niedrigen Ausgangsaktivität der Phosphatase führt ein ausreichend starker Stimulus zur Aktivierung des oben beschriebenen Rückkopplungsmechanismus, der MAPK-Signalweg schaltet auf ´high´ um. Für die Dimension des Stimulus gibt es dabei einen kritischen Punkt, ab dem der Umschaltmechanismus ausgelöst wird. Ist der Stimulus schwächer, reagiert die MAPK proportional zu diesem und kehrt zügig zu ihrem Ausgangsniveau zurück.

Bei einer hohen Ausgangskonzentration der MKP-1 kann die dauerhafte MAPK-Aktivierung nicht ausgelöst werden, der Signalweg reagiert proportional und kurzfristig auf die aktiverenden Stimuli. Diese Konstellation ist beispielsweise als Folge einer zuvor ausgelösten Umschaltens zum ´high´-Zustand denkbar. Somit ist das Verhalten der MAPK nicht nur von Art, Dauer und Stärke des aktuellen Stimulus abhängig, sondern auch von vorangegangenen Ereignissen.

Dieses zwiespältige Verhalten der MAPK findet sich auch bei der Beeinflussung der MKP-1 wieder. Bei einer dauerhaft aktiven MAPK wird der Abbau der MKP-1 durch das Ubiquitin-Proteasom-System gefördert,62 eine Inaktivierung der MAPK somit verhindert. Andererseits führt eine vorübergehende Aktivierung der MAPK zu einer stabilisierenden Phosphorylierung der MKP-1, ohne deren Funktion zu beeinflussen. In diesem Fall wird der Rückgang der MAPK-Aktivität sogar gefördert.

Zusammenfassend ergeben sich innerhalb des komplexen Netzwerks der MAP-Kinasen mehrere Rückkopplungsmechanismen, durch die das System eine Erinnerungsfunktion erhält. Dies muß bei zukünftigen Beobachtungen berücksichtigt werden. Bei den in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnissen kann durch die immer gleiche Wachstumsphase vor den Experimenten ein vergleichbarer Ausgangszustand vor den einzelnen Versuchen angenommen werden.


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4.4  MKP-1-Expression in primären humanen Ovarialkarzinomen

Untersuchungen auf Zellkulturebene ermöglichen eine Vielzahl von Experimenten zur Aufdeckung und Beeinflussung des MAPK-Signalweges. Sie lassen jedoch kaum Aussagen zu Korrelationen der Phosphatasen-Expression mit Diagnose und Prognose zu. Daher wurde die etablierte Technik des Northern Blots zur Bestimmung der MKP-1-mRNA-Expression in einigen Tumoren verwandt:

4.4.1 Erhebliche Expressionsunterschiede auf mRNA-Ebene

Die Untersuchung der MKP-1-mRNA in 10 Karzinomen und einem Borderline-Tumor zeigte erhebliche Expressionsunterschiede, die Zahl der zur Verfügung stehenden Tumoren genügte jedoch nicht, um Zusammenhänge zwischen MKP-1-Expression und Diagnose zu erkennen. Zur Erweiterung des untersuchten Kollektivs wurde die immunhistologische Färbung der MKP-1 etabliert, mit der eine größere Zahl von Präparaten untersucht wurde.

4.4.2 MKP-1 ist in invasiven Karzinomen geringer exprimiert

Von insgesamt 101 Patientenproben zeigten 11 normale Ovarien eine ausnahmslos positive MKP-1-Expression, in der gleichen Anzahl Zystadenome fand sich lediglich in einem Fall keine Anfärbung. In den Borderline-Tumoren sowie den invasiven Karzinomen war die MKP-1 jedoch bei über 40% nicht nachweisbar. Diese signifikant niedrigere MKP-1-Expression invasiver Karzinome im Vergleich mit normalen Ovarien wurde zuvor auch in zwei Publikationen beschrieben, allerdings mit deutlich geringer Fallzahl.83,84 Ein MKP-1-Verlust mit zunehmender Entartung wurde bereits in Prostata-, Kolon- und Blasenkarzinomen gezeigt, in Mammakarzinomen wurde jedoch selbst bei geringer Differenzierung eine hohe MKP-1-Expression gefunden.72 In Adenokarzinomen des Magens fand sich sogar eine erhöhte MKP-1 im Vergleich zu normaler Magenmukosa.85 Dieser scheinbare Widerspruch läßt sich jedoch durch unterschiedliche Funktionen der MKP-1 in den verschiedenen Tumorentitäten erklären. Der Verlust der Phosphatase mit zunehmender Entartung begünstigt durch die fehlende Hemmung der p38-MAPK das tumorinduzierte Entzündungsgeschehen und damit das Tumorwachstum. Auf der anderen Seite kann eine hohe MKP-1-Expression zur Unterdrückung [Seite 71↓]von Apoptose führen. Abhängig von den tumorspezifischen Zuständen und Reaktionsmustern der übrigen Signalwege können daher sowohl Unter- als auch Überexpression für den jeweiligen Tumor von Vorteil sein.

4.5 Korrelation der MKP-1-Expression mit der Prognose

4.5.1 Vergleich der MKP-1 mit klinisch-pathologischen Prognosefaktoren

Die unterschiedliche MKP-1-Expression in der Gruppe der invasiven Karzinome wurde mit einer Reihe bewährter klinisch-pathologischer Parameter verglichen. Es ergab sich jedoch kein Zusammenhang mit histologischem Typ, Grading, FIGO-Stadium, Nodalstatus, Metastasierungsgrad oder dem Patientenalter. Die vorliegenden Verteilungen dieser Parameter in dem untersuchten Kollektiv entsprachen etwa dem statistischen Verteilungsmuster in Ovarialkarzinomen, so daß von einem representativen Tumorkollektiv ausgegangen werden kann.

4.5.2 MKP-1 korreliert mit kürzerem rezidivfreiem Überleben

Im Gegensatz zu obigen Prognoseparametern hatte die MKP-1-Expression keinen Einfluß auf das Gesamtüberleben. Es ist somit offensichtlich, daß diese MAPK-Phosphatase keinen Marker für die Gesamtprognose darstellt.

Auffällig ist jedoch die Korrelation von hoher MKP-1-Expression und kürzerem rezidivfreiem Überleben. Eine solche findet sich auch für ein Silverberg-Grading G3, ein Tumorstaging pT3 und ein FIGO-Stadium III-IV. Im Gegensatz zur MKP-1 ist jedoch bei diesen, auch für das Gesamtüberleben signifikanten Prognosemarkern das frühere Auftreten von Rezidiven nicht überraschend.


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4.5.3  MKP-1 ist unabhängiger Prognoseparameter

In der multivariaten Analyse unter Berücksichtigung aller zuvor signifikanten Parameter war die MKP-1 ein hochsignifikant unabhängiger Prognosemarker des rezidivfreien Überlebens.

Die deutlichen Prognoseunterschiede MKP-1-positiver und MKP-1-negativer Tumoren bis zum Auftreten eines ersten Rezidivs deuten auf eine wesentliche Rolle der MKP-1 im Rahmen der Primärtherapie hin. Neben der chirurgischen Tumorentfernung beinhaltet diese die gezielte Auslösung des programmierten Zelltodes der entarteten Zellen durch Chemotherapeutika.

4.6 Bedeutung der MKP-1 im Rahmen der Chemotherapie

Obwohl die Chemotherapie in der Behandlung maligner Tumoren vielfach eingesetzt wird und inzwischen eine Vielzahl von Therapieprotokollen für verschiedene Malignome entwickelt wurden, ist der genaue Mechanismus, der zum selektiven Absterben der Tumorzellen führt, für viele der angewandten Substanzen noch unbekannt. Die bisherige Anwendung beruht auf bekannten Angriffspunkten der verwendeten Substanzen, beispielsweise Interaktionen mit der DNA oder Hemmung des Mitosemechanismus, und den Erfahrungen des schließlich resultierenden Zelltodes. Inzwischen gibt es eine Reihe von Publikationen, die die MAPK-Signalwege als kritischen Mechanismus zwischen diesen Ereignissen beschreiben.

4.6.1 Die Bedeutung des MAPK-Signalweges bei der Apoptose

4.6.1.1 JNK und p38 sind mit Apoptose assoziiert

Bereits vor einigen Jahren wurde gezeigt, daß in PC12-Zellen durch die Aktivierung der MAP Kinasen JNK und p38 unter bestimmten Bedingungen Apoptose ausgelöst werden kann.86 Die pro-apoptotische Wirkung der JNK wurde später auch in PIN (prostatic intraepithelial neoplasia) und Mamma-Karzinomen beschrieben.69,87 Eine JNK-Induktion fand sich weiterhin auch während der Apoptose nach TNFα- oder Cisplatin-Zugabe.88 Die Blockade der TNFα-induzierten Apoptose durch p38-Inhibitoren89 ist wiederum ein Hinweis auf die wesentliche Rolle der p38-MAPK bei der Entscheidung zwischen Überleben und Zelltod.


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4.6.1.2  ERK wirkt anti-apoptotisch

Im Gegensatz zu JNK und p38 wirkt die ERK anti-apoptotisch und bewirkt Proliferation, Differenzierung und Überleben.86 Dennoch genügt deren Blockade nicht unmittelbar zur Auslösung von Apoptose.90 Sie führt jedoch zu erhöhten Leveln von JNK und p3891 und sensitiviert beispielsweise promyeloleukämische Zellen für die medikamentös ausgelöste Apoptoseinduktion.92 Außerdem wurde gezeigt, daß durch Inhibitoren der ERK-aktivierenden MEK die TNFα-induzierte Apoptose gefördert wird.89

Insgesamt wird deutlich, daß die Entscheidung zwischen Apoptose oder Überleben nicht durch die Aktivierung oder Hemmung eines einzelnen Signalweges, sondern durch bestimmte Konstellationen der MAPK-Familie ausgelöst wird. Dies erklärt auch, warum die Apoptose-Induktion durch Überexpression der MEKK1 nicht durch Inhibitoren einzelner Signalwegsmitglieder hemmbar ist.93

4.6.2 Die kritische Rolle der MKP-1 „zwischen Leben und Tod“

Die MKP-1 scheint bei der dynamischen Entstehung der über Apoptose oder Überleben entscheidenden MAPK-Zustände eine wesentliche Rolle zu spielen. So zeigte sich in PIN, daß MKP-1-negative Läsionen eine höhere Apoptose-Rate aufweisen.69 Weiterhin finden sich sowohl in Mamma-Karzinomen als auch in PIN erhöhte Aktivitäten der MAP-Kinasen und der MKP-1.69,87 Eine Dysregulation der MKP-1 verhindert hier möglicherweise den durch JNK und p38 auszulösenden Zelltod.

Die erhebliche Bedeutung der MKP-1 zeigt sich jedoch besonders im Rahmen der Therapieoptionen maligner Tumoren: In einigen Fällen ist der strahlentherapeutische Therapieansatz wesentlich erfolgreicher als die Chemotherapie. Dieser Vorteil der Bestrahlung könnte auf die ausbleibende MKP-1-Induzierung zurückzuführen sein, die eine prolongierte und damit apoptoseinduzierende JNK-Aktivierung zuläßt.94 Für diese These spricht weiterhin, daß in einem experimentellen Ansatz die UV-induzierte Apoptose, die ebenfalls ohne MKP-1-Aktivierung einhergeht, durch konstitutive Expression der MKP-1 blockiert werden konnte.95 [Seite 74↓]Umgekehrt konnte in Zellen, die normalerweise resistent gegen TNFα-induzierte Apoptose sind, durch Hemmung der MKP-1 Apoptose ausgelöst werden.96

In hochgradig resistenten Leukämie-Zellen wurde die atypische PKCι (iota) als Mediator anti-apoptotischer Effekte beschrieben97. Unter der Annahme, daß die MKP-1 durch atypische Protein Kinasen C aktiviert wird (vgl. Kap. 4.3.2.1, S. 54) könnte sich die MKP-1 auch in diesem Fall als über Apoptose entscheidener Richter erweisen.

4.6.3 Verhalten des MAPK-Signalweges unter Chemotherapeutika

Die Ergebnisse zum Verhalten der MAPK-Phosphatasen zeigen in der Ovarialkarzinomzellinie OVCAR-3 unter einer zytotoxischen Cisplatin-Konzentration einen verzögerten Anstieg der MKP-1 Expression, der sich bis zum Absterben der Zellen kontinuierlich fortsetzt. Der Vergleich der Ovarialkarzinom-Zellinie A27/80 mit einer daraus etablierten Cisplatin-resistenten Linie ergibt unterschiedliche Zeitverläufe der Phosphatase MKP-1: In der sensitiven Zellinie steigt die MKP-1 erst verspätet an, der resistenten Zellinie gelingt es offenbar durch initialen MKP-1-Anstieg, die Apoptose zu verhindern.

In der Literatur sind bereits die Auswirkungen einiger Chemotherapeutika auf die MAPK-Familie beschrieben. So aktivieren Cisplatin und andere Platin-Derivate in einer Reihe von Zellinien die p38-MAP Kinase, durch Doxorubicin oder Taxol kann dieser Signalweg jedoch nicht aktiviert werden.98 In früheren Untersuchungen in der Ovarialkarzinom-Zellinie SKOV-3 konnte die Aktivierung der p38 durch Cisplatin hingegen nicht gezeigt werden, jedoch eine späte und lang anhaltende Aktivität der ERK und JNK.99 Eine Inhibition der ERK durch den Inhibitor PD98059 führte zu einer erhöhten Zytotoxizität von Cisplatin,99 eine Blockade der p38-MAP Kinase durch SB203580 bewirkte eine Resistenz.98 Dies bestätigt die zuvor beschriebenen Einflüsse der verschiedenen MAPK-Signalwege auf Apoptose und Überleben auch für die Behandlung mit Cisplatin.

Bemerkenswert ist die Auswirkung von Transplatin, welches sich als Isomer nur in der molekularen Struktur von Cisplatin unterscheidet (vgl. Abbildung 25).


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Abbildung 25: molekulare Struktur von Cisplatin und Transplatin

Obwohl Transplatin zumindest eine kurzfristige Aktivierung der p38-MAPK98 und JNK100 bewirkt, hat es selbst auf Zellkulturebene keinen Einfluß auf das Überleben.98 Eine klinische Anwendungsmöglichkeit existiert entsprechend nicht. Dennoch bietet sich der Vergleich der beiden Substanzen zur Untersuchung der zugrundeliegenden Effekte an. Offensichtlich ist zur Auslösung der Apoptose der Zeitverlauf der MAPK-Aktivierung von großer Bedeutung. Transplatin verursacht eine starke, kurze und transiente Aktivierung der JNK, nach Cisplatin hingegen findet sich eine langsame, aber andauernde Aktivität, welche mit einem Anstieg der Toxizität einhergeht.100

Einen deutlichen Unterschied zwischen Cis- und Transplatin findet sich auch bei der Betrachtung der Phosphatase MKP-1: Diese wird nur durch Transplatin deutlich induziert und ist vermutlich durch Inaktivierung der JNK für die unterschiedlichen Zeitverläufe verantwortlich. Die hingegen ausbleibende MKP-1-Induktion nach Cisplatin-Zugabe ermöglicht erst die tödlich-andauernde JNK-Aktivität. Diese Theorie konnte durch Verwendung von Natriumorthovanadat, einem Phosphatasen-Inhibitor, untermauert werden: Natriumorthovanadat führte in Kombination mit Transplatin zu einer verlängerten JNK-Aktivierung, bei der Anwendung zusammen mit Cisplatin genügte bereits ein Zehntel der Cisplatin-Dosis, um den gleichen zytotoxischen Effekt zu erreichen.100

Zu gleichen Ergebnisse führte schließlich der Vergleich von chemoresistenten Zellinien mit ihrer Mutterzellinie. In der humanen Cisplatin-sensiblen Ovarialkarzinomzellinie 2008 fand sich eine prolongierte Aktivität von JNK und p38-MAP Kinase nach Cisplatin-Zugabe. Die Cisplatin-resistente Zellinie 2008C13 hingegen zeigte nur eine 1-3 h dauernde, vorübergehende Aktivierung.101 Durch Blockade der beiden Signalwege konnte in der sensitiven Zellinie die induzierte Apoptose verhindert werden, umgekehrt führte in der resistenten Zellinie eine Stimulierung von JNK und p38-MAPK zur Sensitivierung.


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Aufgrund der ähnlichen Spezifität gegenüber den verschiedenen MAPK-Signalwegen scheint die Phosphatase hVH5 eine ähnliche Bedeutung zu haben.102 Für die Phosphatase MKP-3 konnte in dieser Arbeit zwar ebenfalls eine komplexe Regulation nachgewiesen werden, aufgrund der hohen Spezifität gegenüber der ERK-MAP Kinase werden die Apoptose-induzierenden Kinasen jedoch nicht beeinflußt.102

Insgesamt ergibt sich eine prognostisch relevante Bedeutung der dual-spezifischen Phosphatasen, insbesondere der MKP-1, im Rahmen der Chemotherapie von Ovarialkarzinomen. Neben der Entwicklung spezifischer Inhibitoren zur Optimierung der Chemotherapie sollten alternative Medikamente zur Therapie von Tumoren mit hoher MKP-1-Expression diskutiert werden.

4.7 Ausblick

Ein erster spezifischer MKP-1-Inhibitor wird derzeit von Incyte Inc, Palo Alto, CA, USA in Tierversuchen mit bemerkenswertem Erfolg getestet.103 Der Einsatz von Inhibitoren, sowohl experimentell als auch im Rahmen von Tumortherapien, muß jedoch immer unter Beachtung möglicher noch unerkannter Wechselwirkungen geschehen. Weitere möglichst spezifische Möglichkeiten der MKP-1-Blockade, insbesondere die in den letzten Jahren erheblich weiterentwickelte Anwendung von short-interfering RNA (siRNA), sollten daher etabliert werden.

Um bereits die Induktion der Phosphatasen zu verhinden, ist die weitere Untersuchung der aktivierenden Kaskaden notwendig, hier könnte ein Vergleich zwischen Cis- und Transplatin-induzierten Molekülen wegweisend sein.

Schließlich ist das bistabile Verhalten des MAPK-Signalweges in Verbindung mit der MKP-1 unter Therapiebedingungen zu untersuchen, um wiederholte Cisplatin-Gaben zu Zeitpunkten induzierter MKP-1-bedingter Resistenz zu vermeiden.


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10.05.2005