Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung

  • 1.1 Bedeutung und Hintergründe des Ovarialkarzinoms

  • 1.2 Tumor und Entzündung

    • 1.2.1 Entzündungsmediatoren fördern das Tumorwachstum

    • 1.2.2 Therapeutische Beeinflussung des Entzündungsgeschehens

  • 1.3  Der MAPK-Signalweg

    • 1.3.1 ERK-MAP-Kinase

    • 1.3.2 p38-MAP-Kinase

    • 1.3.3 JNK / SAPK-MAP-Kinase

    • 1.3.4  Funktionelle Bedeutung des MAPK-Netzwerkes

  • 1.4  Die Familie der MAPK-Phosphatasen

    • 1.4.1  MKP-1 / CL100

      • 1.4.1.1 Komplexe Induzierbarkeit

      • 1.4.1.2 Spezifität und intrazelluläre Lokalisation

      • 1.4.1.3  Regulation

    • 1.4.2 MKP-3 / Pyst-1

    • 1.4.3 Weitere Phosphatasen

    • 1.4.4 Aktivität und Spezifität gegenüber MAP-Kinasen

    • 1.4.5  Funktionelle Bedeutung der Phosphatasen

  • 1.5  Fragestellung

• 2  Material und Methoden

  • 2.1 Material

    • 2.1.1 Biologisches Material

      • 2.1.1.1 Humane Zellinien

      • 2.1.1.2 Plasmide in E. coli

    • 2.1.2 Chemikalien und Enzyme

    • 2.1.3 Kits

    • 2.1.4 Radiochemikalien

    • 2.1.5  Oligonukleotide

    • 2.1.6 Kulturmedien, Lösungen

    • 2.1.7 Verbrauchsmaterial

    • 2.1.8 Geräte

  • 2.2 Methoden

    • 2.2.1 Zellkultur

    • 2.2.2  Versuchsanordnung

    • 2.2.3 Western-Blot

      • 2.2.3.1 Protein-Isolierung

      • 2.2.3.2 Protein-Konzentrationsbestimmung

      • 2.2.3.3  Elektrophorese und Transfer

      • 2.2.3.4 Antikörper-Bindung und Belichtung

    • 2.2.4 RT-PCR

      • 2.2.4.1  RNA-Isolierung

      • 2.2.4.2  RNA-Konzentrationsbestimmung

      • 2.2.4.3 Reverse Transkription

      • 2.2.4.4 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

      • 2.2.4.5  Auftrennung von PCR-Produkten

      • 2.2.4.6 DNA-Isolierung

      • 2.2.4.7 DNA-Konzentrationsbestimmung

      • 2.2.4.8 Sequenzierung

    • 2.2.5 Northern-Blot

      • 2.2.5.1 Bakterienkultur

      • 2.2.5.2 Plasmid-Isolierung

      • 2.2.5.3  Sondenamplifizierung mittels PCR

      • 2.2.5.4 Elektrophoretische Auftrennung der DNA

      • 2.2.5.5  Isolierung der gewünschten DNA-Bande

      • 2.2.5.6 Elektrophoretische Auftrennung der RNA

      • 2.2.5.7  Transfer

      • 2.2.5.8 Radioaktive Sondenmarkierung

      • 2.2.5.9 Hybridisierung

      • 2.2.5.10  Densitometrische Auswertung

    • 2.2.6 Immunhistologie

      • 2.2.6.1 Patientenkollektiv

      • 2.2.6.2 Immunhistologische Färbung

      • 2.2.6.3  Auswertung

      • 2.2.6.4 Statistik

• 3  Ergebnisse

  • 3.1 Basale MAPK-Phosphatasen-Expression (PCR)

  • 3.2 Regulation der Phosphatasen MKP-1 und MKP-3

    • 3.2.1 Auswahl der Aktivatoren und Zellinien

      • 3.2.1.1 Induktion der MKP-1 durch IL-1β und TNFα

      • 3.2.1.2 MKP-1-Induktion in Abhängigkeit von der Zellinie

    • 3.2.2  Zytokin-induzierte mRNA-Expression (MKP-1)

      • 3.2.2.1 HOSE

      • 3.2.2.2 SKOV-3

      • 3.2.2.3  OVCAR-3

      • 3.2.2.4  OAW42

      • 3.2.2.5  CAOV-3

      • 3.2.2.6  Übersichts-Tabelle

    • 3.2.3  p38-Aktivität im Zeitverlauf (Western-Blot)

    • 3.2.4 Untersuchungen der MKP-1 auf Proteinebene

    • 3.2.5  Zytokin-induzierte mRNA-Expression (MKP-3)

      • 3.2.5.1 OVCAR-3

      • 3.2.5.2  Übersichts-Tabelle

  • 3.3  Suppression der Phosphatasen durch verschiedene Inhibitoren

    • 3.3.1 Inhibitoren des MAPK-Signalweges

      • 3.3.1.1 Hemmung der MKP-1 in SKOV-3

      • 3.3.1.2 Hemmung der MKP-3 in SKOV-3

    • 3.3.2  Inhibitoren der atypischen PKC

      • 3.3.2.1 Hemmung der MKP-1

      • 3.3.2.2 Hemmung der MKP-3

    • 3.3.3 Inhibitoren des PI3K-Signalweges

  • 3.4  Expression im Ovarialkarzinom und prognostische Bedeutung

    • 3.4.1  Expressionsunterschiededer MKP-1 auf mRNA-Ebene in Tumormaterial

    • 3.4.2  Immunhistologische Untersuchungen

    • 3.4.3  MKP-1 ist in invasiven Karzinomen geringer exprimiert

    • 3.4.4  Univariate Überlebensanalyse

      • 3.4.4.1 Keine Korrelation der MKP-1 mit bekannten Prognosefaktoren

      • 3.4.4.2 MKP-1 hat keinen Einfluß auf das Gesamtüberleben

      • 3.4.4.3 Kürzeres rezidivfreies Überleben bei MKP-1-positiven Tumoren

    • 3.4.5  Multivariate Überlebensanalyse

  • 3.5  Phosphatasen-Induktion durch Cisplatin

    • 3.5.1 Induktion der MKP-1 durch Cisplatin in OVCAR-3

    • 3.5.2  Induktion der MKP-3 durch Cisplatin in OVCAR-3

    • 3.5.3  Verhalten der MKP-1 in einer Cisplatin-resistenten Zellinie

• 4  Diskussion

  • 4.1 MAPK-Phosphatasen sind in verschiedenen Zellinien nachweisbar

  • 4.2 Beeinflussung der Phosphatasenexpression durch Zytokine

    • 4.2.1 Induktion der Phosphatase MKP-1

    • 4.2.2 komplexe Reaktion der Phosphatase MKP-3

  • 4.3  aktivierende Signalwege

    • 4.3.1 Einfluß der MAPK-Kaskade

      • 4.3.1.1 Beeinflussung der MKP-1

      • 4.3.1.2 Beeinflussung der MKP-3

    • 4.3.2  Einfluß der Protein Kinase C

      • 4.3.2.1  Beeinflussung der MKP-1

      • 4.3.2.2 Beeinflussung der MKP-3

    • 4.3.3 Bistabilität des MAPK-Signalweges

  • 4.4  MKP-1-Expression in primären humanen Ovarialkarzinomen

    • 4.4.1 Erhebliche Expressionsunterschiede auf mRNA-Ebene

    • 4.4.2 MKP-1 ist in invasiven Karzinomen geringer exprimiert

  • 4.5 Korrelation der MKP-1-Expression mit der Prognose

    • 4.5.1 Vergleich der MKP-1 mit klinisch-pathologischen Prognosefaktoren

    • 4.5.2 MKP-1 korreliert mit kürzerem rezidivfreiem Überleben

    • 4.5.3  MKP-1 ist unabhängiger Prognoseparameter

  • 4.6 Bedeutung der MKP-1 im Rahmen der Chemotherapie

    • 4.6.1 Die Bedeutung des MAPK-Signalweges bei der Apoptose

      • 4.6.1.1 JNK und p38 sind mit Apoptose assoziiert

      • 4.6.1.2  ERK wirkt anti-apoptotisch

    • 4.6.2 Die kritische Rolle der MKP-1 „zwischen Leben und Tod“

    • 4.6.3 Verhalten des MAPK-Signalweges unter Chemotherapeutika

  • 4.7 Ausblick

• Abkürzungsverzeichnis

• Literaturverzeichnis

• Publikationen

• Danksagung

• Selbständigkeitserklärung

• Lebenslauf

• Tabelle 1: MAPK-Phosphatasen

• Tabelle 2: IMAGE-Klone

• Tabelle 3: Primer

• Tabelle 4: maximale MKP-1-Induzierbarkeit nach 30 min bzw. 1 h

• Tabelle 5: maximale MKP-3-Induzierbarkeit nach 30 min bzw. 1 h

• Tabelle 6: MKP-1-Expression in normalen Ovarien und Tumoren

• Tabelle 7: Multivariate Überlebensanalyse

• Abbildung 1: MAPK-Signalwege im Überblick^12,15,16. Vereinfachte Darstellung. MEKK1 darstellungsbedingt doppelt aufgeführt. Transkriptionsfaktoren: MAPKAPK 5 = PRAK, p90RSK = MAPKAPK 1A

• Abbildung 2: funktionelle Signalmodule durch Gerüstmolekül JIP-1^12,16

• Abbildung 3: MAPK-Phosphatasen-Spezifität

• Abbildung 4: PCR-Screening. Gleichmäßige Expression von MKP-1 und MKP-3, MKP-5 lediglich in A27/80 reduziert. MKP-2 in PA-1, MDAH2774, ES-2 und CAOV-3 deutlich, in SKOV-3, A27/80 und OAW42 schwach und in OVCAR-3 nicht exprimiert. MKP-4 und B23 nicht oder nur schwach exprimiert.

• Abbildung 5: MKP-1-Northern Blot. Stimulation mit TPA, IL-1β und TNFα für 10 min, 30 min und 6 h. Deutliche Induktion 30 min nach IL-1β– oder TNFα–Zugabe in SKOV-3(A) und OVCAR-3(B). In OVCAR-3 Nachweis der MKP-1 noch 6 h nach IL-1β–Zugabe. SKOV-3 zeigt zusätzlich eine MKP-1-Expression 6 h nach TPA.

• Abbildung 6: MKP-1-Northern-Blot. SKOV-3 und OVCAR-3 zeigen keine basale Expression bei deutlicher Induzierbarkeit durch IL-1β und TNFα. OAW42 und CAOV-3 exprimieren MKP-1 bereits ohne Zytokin-Zugabe, nach Zugabe zeigt sich nur eine mäßige Steigerung.

• Abbildung 7: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in HOSE nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 2(A) bzw. 3(B) unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Nach IL-1β deutlicher Anstieg nach 30 min und bereits nach kurzer Zeit Rückgang zum basalen Level. Ähnliches Verhalten nach TNFα mit hoher Signifikanz nach 30 min (p=0,0001).

• Abbildung 8: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in SKOV-3 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 3 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Durch IL-1β signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,023) und 1 h (p=0,008), nach 3 h Rückgang auf Basalwert. Durch TNFα-Zugabe Anstieg nach 30 min (p=0,038) und 1 h (p=0,025). Nach 3 h Rückgang unter die Signifikanz-Grenze.

• Abbildung 9: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in OVCAR-3 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 3 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Durch IL-1β signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,0001), Höchstwert nach 1 h (p=0,019) und langsamer Abfall bis 24 h (3 h: p=0,009, 6 h: p=0,0004, 24 h:p=0,049). Durch TNFα-Zugabe kurzfristiger Anstieg nach 30 min, der jedoch keine Signifikanz erreicht (p=0,057).

• Abbildung 10: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in OAW42 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 3 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Keine Reaktion unter IL-1β. Nach TNFα zunächst signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,012), nach 1 h und 3 h signifikanter Abfall (1 h: p=0,036, 3 h: p=0,002).

• Abbildung 11: MKP-1-Northern-Blot. Zeitreihen in CAOV-3 nach Zugabe von IL-1β(A) bzw. TNFα(B), jeweils Darstellung eines repräsentativen Blots und densitometrischer Quantifizierung. Mittelwert aus 2(A) bzw. 3(B) unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz zur Kontrolle. Keine Reaktion unter IL-1β. Nach TNFα zunächst signifikanter Anstieg nach 30 min (p=0,002) und 1 h (p=0,020). Zum Zeitpunkt 3 h signifikanter Abfall unter den Kontrollwert (p=0,0001), nach 24 h erneuter Anstieg.

• Abbildung 12: p38-Western Blot. Deutliche Phosphorylierung nach 10 min und 30 min.

• Abbildung 13: MKP-3-Northern Blot. MKP-3-Induktion durch IL-1β(A) bereits nach 30 min bis über 72 h hinaus, Maximum bei 1 h. Nach TNFα(B) Induktion nach 30 min und 1 h.

• Abbildung 14: MKP-1-Northern-Blot. Einfluß der Inhibitoren SB203580 und PD 98059 auf die MKP-1-Expression in SKOV-3 nach Zugabe von TNFα. Darstellung eines Blots und densitometrischer Quantifizierung: Mittelwert aus 2 unabhängigen Versuchen mit Standardabweichung. *: Signifikanz TNFα-stimuliert zur unstimulierten Kontrolle. Die DMSO-Kontrolle reagiert signifikant auf TNFα (p=0,046), bei SB-Vorbehandlung (10 µM) zeigt sich keine Reaktion (p=0,941). Unter PD-Einfluß ergibt sich wieder eine signifikante Reaktion (p=0,015), die Dimension der DMSO-Kontrolle wird jedoch nicht erreicht.

• Abbildung 15: MKP-3-Northern Blot. Einfluß von MAPK-Inhibitoren auf die MKP-3-Expression unter TNFα in SKOV-3. Nach 30 min unabhängig von Stimulation deutlicher MKP-3-Rückgang durch PD98059. Etwas schwächere Reaktion unter SB203580. Keine eindeutige Inhibition nach 24 h.

• Abbildung 16: MKP-1-Northern-Blot. Einfluß der Inhibitoren GF109203X und Ro-31-8220 auf die MKP-1-Expression in SKOV-3(A) und OVCAR-3(B) nach Zugabe von IL-1β. Einfluß von hohen Konzentrationen des Inhibitors GF109203X auf die MKP-1-Expression in OVCAR-3 nach Zugabe von IL-1β und TNFα (C). Jeweils Blot und densitometrische Quantifizierung. Deutliche Inhibierung durch Ro in beiden Zellinien, nur geringe Reaktion auf 2,5µM und 5 µM GF. Bei einer GF-Konzentration von 20 µM mäßige Reduktion der MKP-1-Induktion nach IL-1β.

• Abbildung 17: MKP-3-Northern Blot. Einfluß der Inhibitoren GF109203X und Ro-31-8220 auf die MKP-3-Expression in OVCAR-3 nach Zugabe von IL-1β. Deutliche Inhibierung durch Ro, nur geringe Reaktion auf GF.

• Abbildung 18: MKP-1-Northern-Blot. Expressionsunterschiede in Tumormaterial ohne Korrelation mit histologischer Differenzierung oder Grading.

• Abbildung 19: MKP-1 Immunhistologie. Exemplarische Abbildung positiver und negativer immunhistologischer Färbungen.

• Abbildung 20: Univariate Analysen

• Abbildung 21: Multivariate Analyse

• Abbildung 22: MKP-1-Induktion in OVCAR-3 durch Cisplatin (repräsentative Abbildung aus 2 unabhängigen Versuchen)

• Abbildung 23: MKP-3-Northern Blot. Induktion in OVCAR-3 durch Cisplatin (repräsentative Abbildung aus 2 unabhängigen Versuchen)

• Abbildung 24: MKP-1-Induktion in A27/80 durch Cisplatin

• Abbildung 25: molekulare Struktur von Cisplatin und Transplatin