2  Material und Methoden

Soweit nicht anders gekennzeichnet, wurden Chemikalien folgender Hersteller verwendet:

Radioaktive Chemikalien wurden von NEN Life Science Products, Boston, USA, bezogen.

Humane Burkitt-Lymphom-Linie BL60-2, Dr. P.Daniel, Robert-Rössle-Klinik, Berlin,
Humane Erythroleukämie-Linie HEL, Dr. S.Ansieau, Max-Delbrück-Centrum, Berlin

Medien und Zusätze für die Zellkultur wurden von GIBCO-BRL/ Lifetechnologies, Eggenstein, sowie von Biochrom, Berlin, bezogen.

Echerischia coli JM109, Echerischia coli TOP10

Zusätze für die Bakterienkultur wurden von Difco Laboratories, Detroit, USA, bezogen.

LB-Medium: 10g Trypton, 5g Hefe-Extrakt, 10g NaCl, H₂O bidest zu 1l

LB-Platten: 10g Trypton, 5g Hefe-Extrakt, 10g NaCl, 15g Agar, H₂O bidest zu 1l

Ampicilinhaltige Medien: Endkonzentration Ampicilin 100 mg/l

Tetracyclinhaltige Medien: Endkonzentration Tetracyclin 20mg/l

DNA-Oligonukleotide wurden bezogen von BioTeZ, Berlin. Sequenzen sind in 5’=>3’-Richtung aufgeführt.

Wenn nicht anders angegeben, wurden Puffer und Lösungen mit deionisiertem Wasser angesetzt.

[Seiten 25 - 28↓]

Die hier genannte Methode ist zum Verständnis der vorliegenden Arbeit von grund-legender Bedeutung und wird daher kurz dargestellt.

Das Verfahren der Differential Display RT-PCR wurde 1992 von Liang und Pardee als Methode zur Identifikation von differentiell exprimierten Genen entwickelt (Liang and Pardee,1992; Matz and Lukyanov,1998). Das Grundprinzip der Methode besteht in der vergleichenden Analyse des Genexpression zweier Zellpopulationen unter Einsatz der Polymerase-Ketten-Reaktion. Die hier verwandte Methode stellt eine Weiterentwicklung der ursprünglichen DD RT-PCR dar und ist als Delta RNA Fingerprint System (Clontech) kommerziell erhältlich.

Als Ausgangsmaterial wird die RNA der zu vergleichenden apoptotischen und nichtapoptotischen Zellpopulationen eingesetzt. Unter Verwendung von oligo-dT Primern erfolgt die Umschreibung der mRNA in einsträngige cDNA durch das Enzym Reverse Transkriptase. Im Anschluss daran wird die cDNA mittels PCR amplifiziert (Fingerprint-PCR). Dabei können 10 P-Primer (Länge: 25 Nukleotide) mit 9 T-Primern (Länge: 29 Nukleotide) zu je einem Primerpaar kombiniert werden. Unter Zugabe von [α-³³P]-dATP sowie Taq-Polymerase erfolgt die Amplifikation in insgesamt 25 Zyklen. Zur Kontrolle werden pro Primer-Paar und Zellpopulation zwei cDNA-Ansätze amplifiziert. Die dabei enstehenden PCR-Produkte sind in der Regel zwischen 100 bp und 2000 bp gross. Die PCR-Ansätze werden danach durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (5% Polyacrylamid, 8M Harnstoff) aufgetrennt (max. bis 700 bp) und die entsprechenden Banden der Amplifikationsprodukte durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Intensität von Banden korrespondierender Ansätze der beiden Populationen wird verglichen und bei differentiellen Banden die jeweils stärkere Bande aus dem Gel ausgeschnitten und eluiert. Um eine grössere Menge an DNA zu erhalten, ist eine Reamplifikation mit der jeweiligen Primerkombination notwendig. Nach Aufreinigung der

PCR-Produkte (Qiaex, Qiagen) stehen diese für die Klonierung zur Verfügung. Die nachfolgende Abbildung gibt einen Überblick über die Vorarbeiten.

	Abbildung 4 Übersicht der Vorarbeiten

BL60-2-Zellen werden in RPMI1640-Medien mit entsprechenden Zusätzen bei 37°C und 5% CO₂-Gehalt kultiviert, die Zelldichte soll 5x10⁵Zellen/ml nicht überschreiten. Der Zusatz von α—Thioglycerol (TG) verbessert die Proliferationsrate durch Bildung von L-Cystein, Bathocuproin-Säure (BCS) verhindert als Calciumchelator die Calcium-abhängige Autooxidation von Thiolen wie TG. Zur Aufbewahrung in flüssigem Stickstoff (-196°C) werden Aliquots zu 1 ml mit 1x10⁷ Zellen/ml in 80% FCS und 20% DMSO eingefroren. Nach zügigem Auftauen (3min, 37°) werden die Zellen in 10 ml Medium [Seite 32↓]aufgenommen, abzentrifugiert (10 min, 500x g) und in Medium resuspendiert. Zur Bestimmung der Zellzahl werden 20µl Zellsuspension mit 20 µl Trypanblau (1:10 in PBS) versetzt und mittels Neubauer-Zählkammer ausgezählt

Zur Auslösung von Apoptose wird die BL60-2-Zellsuspension eingestellt auf 10⁶ Zellen/ml und mit (Endkonzentration 1,5 µg/ml) inkubiert. Die Apoptoserate von anti-IgM-stimulierten Zellen und unstimulierten Zellen wird nach 24 h mikroskopisch durch die Auszählung der fragmentierten Kerne bestimmt. Acridin-Orange interkaliert in DNA - Doppelstränge und fluoresziert nach Anregung durch UV-Licht. Zur Anfärbung werden auf einem Objektträger 20 µl Zellsuspension mit 2 µl Acridin–Orange-Lösung versetzt, danach erfolgt die Auszählung von mindestens 100 Zellen.

Eine weitere Methode zur Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen an einer Zellpopulation ist die Durchflusszytometrie. Hierbei wird die Expression von Phos-phatidylserin (PS) auf der Oberfläche apoptotischer Zellen durch FITC-markiertes, mit hoher Affinität Phosphatidylserin bindendes Annexin nachgewiesen und der Anteil PS-positiver Zellen quantifiziert. Da auch nekrotische Zellen PS exprimieren, wird mit Propidiumjodid (PI) gegengefärbt. PI wird von nekrotischen Zellen aufgenommen (PI positiv), aufgrund ihrer intakten Zellmembran nicht von apoptotischen (PI negativ). Zur Färbung werden 5x10⁵ Zellen abzentrifugiert (10 min, 500x g), in 200 µl FITC-Puffer resuspendiert, erneut abzentrifugiert und in 50 µl FITC-Puffer aufgenommen. Die Zellen werden mit 5 µl Annexin-FITC und 5 µl PI inkubiert (20 min, RT), anschliessend werden mittels FACSort-Durchflusszytometer 10.000 Zellen analysiert (s.u.).

Ein Merkmal apoptotischer Zellen ist die Expression von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche. Dieser Unterschied zu nicht-apoptotischen Zellen wird bei magnetischen Trennungsverfahren ausgenutzt: Zur Gewinnung einer möglichst reinen Population apoptotischer BL60-2-Zellen, deren Anteil an der Gesamtpopulation 24 Stunden nach Inkubation mit anti-IgM 50% -70% beträgt, werden die Zellen mit Annexin-FITC, das an PS bindet, sowie mit anti-FITC-gekoppelten paramagnetischen Partikeln (beads) inkubiert. Beim anschliessenden Durchlaufen einer Säule, die sich in einem magnetischen Feld befindet, werden die beads-gekoppelten Zellen zurückgehalten und [Seite 33↓]so von den durchlaufenden, nicht-apoptotischen Zellen getrennt. Dadurch gelingt es, den Anteil apoptotischer Zellen auf 95% zu erhöhen. Die spontane Apoptoserate von BL60-2-Zellen in der Zellkultur beträgt ca. 5%. Zur Entfernung dieser Zellen aus der Kontrollpopulation wird wiederum mit Annexin-FITC und anti-FITC-beads inkubiert und der Ansatz über eine magnetisierte Säule gegeben. Die in der Durchlauf-Fraktion vorhandenen nichtapoptotischen Zellen werden so von den in der Säule verbleibenden apoptotischen Zellen getrennt.

5x10⁷ Zellen werden abzentrifugiert (10 min, 500 g), danach wird der Überstand abgenommen und das Pellet in 2ml Guanidinium-Lösung durch resupendiert. Weitere 7,5 ml Guanidinium-Lösung werden dazugegeben und der Ansatz wird gemischt, bis eine klare Lösung entsteht. Die so lysierten Zellen werden mit einer 10 ml-Spritze und aufgesetzter Kanüle (0,90x70) mehrmals resuspendiert, wodurch die enthaltene DNA geschert wird. In ein Zentrifugationsröhrchen (12ml) werden 2,6ml Cäsiumchloridlösung vorgelegt, das Lysat wird vorsichtig darüber geschichtet und der Ansatz in der Ultrazentrifuge zentrifugiert (22 h, 150000x g, 18°C). Der Überstand wird abgenommen, das RNA-Pellet wird getrocknet und zur Fällung in 360µl TE-Puffer aufgenommen. Der Ansatz wird in ein Eppendorf-Gefäss überführt und mit 40 µl Natriumacetat (3M) sowie 1ml Ethanol (100%) gemischt, für 30min inkubiert (-80°C) und anschliessend pelletiert (30min, 10000g, 4°C). Nach Abnehmen des Überstandes wird das RNA-Pellet in 100µl DEPC-H₂O resuspendiert und nochmals mit Natriumacetat (3M, 12µl) und Ethanol (100%, 278µl) gefällt (30min, -80°C). Nach erneutem Abzentrifugieren wird das Pellet 2 mal mit 500µl Ethanol (70%) gewaschen und anschliessend in 200µl DEPC-H₂O aufgenommen. Nach Messung der RNA-Konzentration wird die RNA aliquotiert und bei -80°C gelagert.

Die RNA wird 1:50 verdünnt und photometrisch wird die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm (A₂₆₀) bestimmt. Bei 260nm und einer OD von 1 beträgt die Konzentration an einzelsträngiger RNA 40 µg/ml. Die Konzentration c (µg/µl) berechnet sich demnach als

Gleichung (1) c = A₂₆₀ x 40 x 50.

Zur Bestimmung der Reinheit der präparierten RNA wird zusätzlich die Absorption bei 280 nm gemessen und der Quotient A₂₆₀ / A₂₈₀ gebildet. Dieser liegt bei reiner RNA, d.h. bei geringer Proteinkontamination, um 2,0.

Beim Northern Blot werden RNA-Moleküle in einem denaturierenden Agarose-Gel elektrophoretisch ihrer Grösse nach aufgetrennt und anschliessend auf eine Membran transferiert. Zur Präparation des Agarose-Gels wird Agarose (Endkonzentration 1,2 %) in DEPC-H₂O aufgekocht und im Wasserbad auf 60°C abgekühlt. Unter dem Abzug werden dann 10xMOPS (Endkonzentration 1x) sowie Formaldehyd (37 %, Endkonzen-tration 0,4 M bzw. 1.11 %) hinzugefügt, gemischt und in die Gelbox (10x15cm) gegossen. Nach dem der Gelkamm eingesteckt ist, bleibt das Gel für 30 min zum Aushärten stehen, wird dann in die Gelkammer eingesetzt und mit 1xMOPS-Puffer bedeckt. 10 µg RNA werden in insgesamt 11 µl DEPC-H₂O aufgenommen, dazu werden 39 µl RNA-Premix, 10 µl RNA-Ladepuffer sowie 2 µl Ethidiumbromid gegeben. Die im Ansatz enthaltene RNA wird denaturiert (15min, 55°C), kurz abzentrifugiert und in die Geltaschen überführt. Die Gelelektrophorese läuft bei konstanter Spannung (70 V) und einer Stromstärke zwischen 80 und 100 mA. Nach 20 min wird zusätzlich der Anoden- und Kathodenpuffer kontinuerlich umgepumpt. Insgesamt wird die RNA in ca. 3 Stunden aufgetrennt. Die Dokumentation der Auftrennung erfolgt photographisch nach Anregung des in die RNA intercalierten Ethidiumbromids durch UV-Licht. Ein Lineal wird an das Gel angelegt und mitphotographiert, um die Abstände der sichtbaren RNA-Fraktionen (28S, 18S sowie 5,8S) bestimmen zu können (Abbildung 5).

	Abbildung 5 Elektrophoretische Auftrennung von RNA. BL60-2-RNA aus Zellen ohne Inkubation ( 0 ) und nach Inkubation mit anti-IgM ( 2, 4, 8, 12, 24 Stunden Inkubation). RNA Blot.18S/28S: rRNA.

Das Gel wird für 15min in 20x SSC gebadet, anschliessend wird die RNA über Nacht auf eine Nylon-Membran geblottet. Nach Trocknen der Membran wird die RNA durch UV-Strahlung (120 mJ) auf der Membran fixiert und unter UV-Licht werden die sicht-baren RNA-Banden dünn mit Bleistift markiert (Kroczek,1993).

Zur Generierung radioaktiv-markierter DNA-Sonden wird das High-Prime-labeling-Verfahren (Boehringer-Mannheim) nach Herstellerangaben angewandt. Die Abtrennung der radioaktiv markierten DNA-Fragmente von freien Nukleotiden und Oligonukleotiden (<20 Nukleotide) wird mit vorgefertigten Sephadex-G50-Säulen (Nick-Spin-Columns, Pharmacia) durchgeführt.

Radioaktiv-markierte RNA-Sonden werden durch in vitro-Transkription (Riboprobe-System, Promega) hergestellt. Der Reaktionsansatz (Gesamtvolumen 20µl) wird entsprechend den Hersteller-Angaben mit 1 µg linearisiertem Plasmid und 5 µl [α - ³²P] UTP gemischt und inkubiert (60 min, 37°C). Die Abtrennung freier Nukleotide von den RNA-Sonden erfolgt durch Ethanol-Fällung. Dazu werden zu 20µl Reaktionsansatz 10µl Ammoniumacetat (7,5 M) sowie 50 µl Ethanol (100%) gemischt und inkubiert (30 min, -80°C), anschliessend wird der Ansatz zentrifugiert (5 min,12000 g). Nach Abnehmen des Überstandes wird das Pellet in 100 µl Ammoniumacetat (7,5 M) sowie 250 µl Ethanol (100%) resuspendiert und erneut gefällt (30 min, -80°C). Nach Zentrifugation wird das Sonden-Pellet in 100 µl DEPC-H₂O aufgenommen.

Die Bestimmung der Aktivität einer Probe dient der groben Abschätzung der Einbaurate radioaktiver Nukleotide in die synthetisierten Sonden. Zur Bestimmung der Gesamt-aktivität (Zerfälle pro Minute, cpm) wird ein Aliquot der Sondenlösung (1µl) in ein spezielles Plastikgefäss überführt und nach Cerencov-Protokoll im Szintillationszähler gemessen. Sondenansätze mit einer Aktivität grösser als 1x10⁴ cpm/µl sind aus-reichend markiert, wobei durch den effizienteren Einbau von [α³²P] UTP-Nukleotiden bzw. durch eine allgemein bessere Syntheseleistung die Aktivität der RNA-Sonden höher ist als die der DNA-Sonden (5x10⁴ - 1x10⁵ cpm/µl).

Die Membran mit der geblotteten RNA wird in 5 ml Hybridisierungspuffer für eine Stunde bei 52°C im Hybridisierungsofen inkubiert (Prähybridisierung). Die aufge-reinigten DNA-Sonden werden nach Denaturierung (5 min, 95°C) in 5 ml Hybridi-sierungspuffer gegeben und gegen die Prähybridisierungslösung ausgetauscht. Der Blot wird bei 52°C über Nacht (16-24 h) inkubiert, anschliessend wird nach Abgiessen der Hybridisierungslösung die Membran gewaschen (Waschlösung1: 15 min, RT; Waschlösung2: 15 min, RT; Waschlösung3:15 min, 68°C). Die RNA-Sonden werden ebenfalls in 5ml Hybridisierungspuffer aufgenommen und nach Abgiessen der Prähybridiesierungslösung zur Membran gegeben. Die Hybridisierung erfolgt bei 60°C, danach wird der Blot wie oben beschrieben gewaschen. Nach den Waschschritten wird die Membran nach kurzem Abtropfen in einen Plastik-Beutel eingeschweisst, in eine Filmkassette mit Intensivierungsfolie gelegt und zusammen mit einem aufgelegten Röntgenfilm bei -80°C über Nacht gelagert. Die von den radioaktiven, [α³²P]-markierten Sonden ausgehende Strahlung führt zur Schwärzung des Films. Die Dauer der Exposition kann zwischen 10 Stunden und mehreren Tagen variieren.

Zur Herstellung von mRNA wird das PolyA-Tract-System IV (Promega) benutzt. Dazu werden nach Herstellerangaben 1 mg Gesamt-RNA mit biotinyliertem Oligo-dT-Primer inkubiert, über Streptavidin-gekoppelte Magnetpartikel wird dann die Primer-markierte mRNA von der restlichen RNA getrennt. Nach Fällung mit 0,1 Volumen Natriumacetat (3 M) und 1,0 Volumen Ethanol (100%) sowie Waschen mit 1 ml Ethanol (75%) wird das mRNA-Pellet Vacuum-getrocknet, in 5 µl DEPC-H₂O aufgenommen und bei -80°C aufbewahrt.

Die Synthese von einzelsträngiger cDNA aus Gesamt-RNA wird mit dem Superscript Preamplification System durchgeführt. Nach Angaben des Herstellers wird aus 5µg RNA mit Oligo-dT-Primern und 200U Reverse Transkriptase mRNA synthetisiert und bei -80°C aufbewahrt.

Zur exponentiellen Vervielfältigung von einzel-/doppelsträngiger DNA, wie z.B. Plasmiden, wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) benutzt.

Die PCR-Bedingungen sind durch entsprechende Annealing (Primer-Anlagerung)-Temperaturen den jeweiligen Primern angepasst:

Als Voraussetzung für weitere Anwendungen (in vitro-Translation, in vitro-Transkription, Sequenzierung) ist es sinnvoll, mit definierten DNA-Fragmenten zu arbeiten. Dazu werden PCR-Fragmente in Plasmid-Vektoren ligiert, die Ligationsprodukte werden in Bakterien transferiert und nach Anzucht werden Bakterienkolonien isoliert, die jeweils Plasmid-Konstrukte einer Ausgangszelle tragen. Zur Klonierung von PCR-Produkten wird der Vektor pGEM-T verwandt, der linearisiert vorliegt und an seinen 3’-Enden einzelne, überhängendeThymidin-Nukleotide besitzt. Da die TaqPolymerase während der PCR unspezifische Adenosin-Nukleotide an die 3’-Enden der PCR-Produkte anhängt, können diese mit pGEM-T ligiert werden:

Der Ansatz wird bei 16°C für 12 h – 16 h inkubiert. Eine verbesserte Ligationsrate wird durch kurzzeitiges Erwärmen (1 min, 50°C) von pGEM-T-Vektor und Insert (PCR-Produkt) vor Zugabe der restlichen Zusätze erreicht. Die Berechnung der eingesetzten Menge an PCR-Produkt erfolgt nach Gleichung (2):

Gleichung (2): m_Insert =(m_VektorL_Insert / L_Vektor)(R_{Insert/Vektor})

mit der Masse m (ng), der Fragmentlänge L (bp) eines Fragments sowie dem gewünschten molaren Verhältnis R von Insert und Vektor.

Um die Aufnahme freier DNA durch E. coli zu ermöglichen, werden die Bakterien durch Vorbehandlung Aufnahme-kompetent gemacht. Dazu werden 10 ml eines Kultur-ansatzes (16 h, 37°C) in 100 ml LB-Medium gegeben und kultiviert bis zu einer OD₅₈₀ von 0,5, bei der sich die Bakterien zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Danach werden die Zellen abgekühlt (5 min, Eis) und pelletiert (10 min, 2500x g, 4°C), alle weiteren Schritte erfolgen bei 4°C. Das Pellet wird in 40 ml TFB I resuspen-diert, 5 min in Eis inkubiert und erneut zentrifugiert (10 min, 2500x g, 4°C), resuspen-diert (4 ml TFB II) und in Eis für 5 min inkubiert. Nach Aliquotierung (200µl) in vorge-kühlte Eppendorfgefässe werden die Zellen in flüssigem Stickstoff (-196°C) schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt. Ein Aliquot kompetenter Zellen (50 µl) wird auf Eis aufgetaut, zu 2 µl Ligationsansatz gegeben und für 15 min bei 4°C inkubiert. Anschliessend wird der Ansatz für exakt 50 s auf 42°C erhitzt, 2 min bei 4°C inkubiert und nach Zugabe von 1 ml LB-Medium für 50 min bei 37°C geschüttelt. LB-Agar-Platten werden mit IPTG (4 µl, Stock-Lösung 200 mg/ml) und X-Gal (40 µl, Stock-Lösung 20 mg/ml) behandelt und bei 37°C vorgewärmt. Nach Zentrifugation (5 min, 5000x g) wird das Pellet in 50 µl LB-Medium resuspendiert. Die Bakterien werden auf Ampicillin-haltige LB-Agar-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Durch α-Komplementierung werden Bakterienkolonien (Klone) identifiziert, die ein Plasmid mit Insert tragen (weisse Kolonien) bzw. lediglich den religierten Vektor enthalten (blaue Kolonien) (Sambrook et al.,1989).

Um die Plasmide aus den Bakterien zu isolieren, wird mit dem Qiaprep-System gearbeitet. Nach Anzucht einer Übernacht-Kultur (2 ml, 37°C) werden die Bakterien entsprechend Hersteller-Protokoll (Miniprep) alkalisch lysiert, das Lysat wird neu-tralisiert, auf eine hohe Salzkonzentration eingestellt und auf eine aus anorganischen Siliziumverbindungen bestehende Säule gegeben. Dort bindet selektiv die Plasmid-DNA und kann nach mehreren Waschschritten mit H₂O eluiert werden. Um grössere Mengen an Plasmid-DNA zu erhalten, wird nach dem für die Minipräparation geschilderten Prinzip DNA aus 100ml (Bakterienstämme mit hoher Plasmid-Anzahl) bzw. aus 500ml (Niedrige Plasmidzahl) Übernacht-Kultur gewonnen.

Die Bestimmung der DNA-Konzentration wird photometrisch durchgeführt (siehe RNA-Konzentrationsbestimmung). Bei einer Wellenlänge von 260nm und einer OD von 1 beträgt die Konzentration doppelsträngiger DNA 50µg/ml. Die Konzentration c (µg/µl) einer DNA-Lösung lässt sich unter Einbeziehung des Verdünnungsfaktors F_V mit Gleichung (3) berechnen:

Gleichung (3) c = A₂₆₀ x 50 x F_V.

Zur Bestimmung der Reinheit der DNA wird ausserdem die Absorption bei 280 nm gemessen und der Quotient A₂₆₀ / A₂₈₀ gebildet, der zwischen 1,8 und 2,0 liegen sollte.

Das Insert kann durch Restriktionsendonukleasen aus dem Gesamtplasmid herausgetrennt werden. Für Kontroll-Restriktionen reichen wenige ng (10 - 20) Plasmid-DNA aus. Der Restriktionsansatz wird aus DNA, Enzym - kompatiblem Puffer sowie den entsprechenden Enzymen (1U pro µg DNA) hergestellt und bei einer dem Temperatur-optimum der Enzyme entsprechenden Temperatur für eine Stunde inkubiert.

DNA-Fragmente können aufgrund ihrer negativen Gesamtladung elektrophoretisch der Grösse nach aufgetrennt werden. Entsprechend der erwarteten Fragment-Grösse werden dazu Agarose-Gele unterschiedlicher Konzentration benutzt. Bei Fragmenten zwischen 200 und 5000 bp z.B. werden 1,2% - ige Gele verwandt, die Ethidiumbromid (1 µg/ml Endkonzentration) enthalten. Durch die Anregung des in die DNA interkalierten Ethidiumbromids mit UV-Licht können die aufgetrennten Fragmente sichtbar gemacht und photographiert werden, anhand des DNA-Markers wird ihre Grösse bestimmt.

Die DNA-Sequenzierungen erfolgen mit dem System ABI-310, basierend auf dem Sanger-Prinzip. Das Plasmid oder die PCR-Produkte werden denaturiert, anschliessend werden Fragmente hergestellt, die mit modifizierten Didesoxy-Nukleotiden markiert sind. Die Fragmente werden elektrophoretisch in einem Kapillarsystem aufgetrennt, so dass für jede Position der Ausgangssequenz ein spezifisch markiertes Fragment vorliegt. Durch Messung der laserinduzierten Fluoreszenz der Fragmente beim Austritt aus der Kapillare wird die Basenabfolge bestimmt. Die DNA-Sequenzen wurden anschliessend mit nichtredundanten Datenbanken (NCBI) unter Verwendung des BLAST-Algorithmus verglichen (Altschul et al.,1990).

Zur Gewinnung von Gesamtprotein werden die Zellen mit Lämmli-Puffer lysiert und kurz denaturiert (5 min, 90°C). Das Lysat wird direkt für Protein-Gelelektrophorese benutzt. Mittels SDS-Lyse-Puffer kann ebenfalls Gesamtprotein aus Zellen gewonnen werden. Dazu wird ein Zellpellet von 5 x 10⁶ Zellen in 100µl SDS-Lyse-Puffer (auf 80°C vorgewärmt) resuspendiert, inkubiert (15 min, 95°C) und zentrifugiert (15 min, 12000xg). Der Überstand enthält die Proteine und kann bei -20°C eingefroren werden.

Proteinkonzentrationen werden mit dem BCA Protein Assay bestimmt. Nach Angaben des Herstellers wird die Protein-Probe mit BCA Reagenz inkubiert und nach Erstellen einer Standardkurve mit bekannten Proteinkonzentrationen (Rinderserum-Albumin) erfolgt die photometrische Messung der proportional zur Proteinkonzentration gebildeten BCA-Cu¹⁺-Komplexe bei einer Wellenlänge von 562nm (A₅₆₂).

Bei der diskontinuierlichen SDS-PAGE werden 2 Gele (Sammel- und Trenngel), die sich in der Acrylamid-Konzentration sowie im pH-Wert unterscheiden, übereinander geschichtet. Sammelgel (5%) und Trenngel (10-15%) werden nach Sambrook hergestellt (Sambrook,1989). Die Polymerisierung erfolgt ausgehend von Acrylamid (monomer) und Bisacrylamid (bifunktional) und wird durch Zugabe von TEMED und APS gestartet. Das Gel wird in die Gelkammer eingespannt und mit SDS-PAGE-Laufpuffer bedeckt. Die Proteinproben, in Lämmli-Puffer aufgenommen und kurz aufge-kocht (5min, 90°C), werden in die Geltaschen gefüllt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt bei einer Spannung von 80 V bis150 V. An der Grenze zwischen Sammel- und Trenngel entsteht zunächst eine scharfe Protein-Bande, im Trenngel erfolgt dann die Auftrennung der Proteine.

Der Transfer von Proteinen auf eine (Nitrozellulose-) Membran und der Nachweis membrangebundener Proteine mit entsprechenden Antikörpern wird als Western-Blot-Verfahren bezeichnet. Zum Proteintransfer wird ein elektrophoretisches Blotverfahren benutzt, die verwendete Apparatur (Blotter) besteht aus zwei Graphit-Platten (Anode und Katode). Die Anode wird mit Blotting-Lösung 1 befeuchtet und mit drei Lagen Whatman-Papier ( in Blotting-Lsg. 1 getränkt) sowie zwei weiteren, mit Blotting-Lsg. 2 getränkten Lagen Papier bedeckt. Auf die ebenfalls mit Lsg. 2 angefeuchtete Nitrozellulose-Membran wird das Proteingel gelegt. Bedeckt wird das Gel mit 5 Lagen Whatman-Papier (Blotting-Lösung 3) und der Katoden-Platte. Der Transfer erfolgt bei einer Spannung von 20 V für 90 min. Anschliessend wird die Membran für 2 min in Ponceau-Lösung gefärbt. Die Banden des Proteinmarkers werden auf der Membran [Seite 43↓]gekennzeichet und die Membran wird zwischen zwei Lagen Whatman-Papier getrocknet. Die Nitrozellulose-Membran wird zur Absättigung von Proteinbindungs-stellen in Blotto-Lösung gebadet (3 h, RT oder über Nacht, 4°C). Dann wird der 1. Antikörper, in Blotto-Lsg. verdünnt (1:5000 - 1:20000), zur Membran gegeben und die Membran für 90 min in der Lösung inkubiert. Nach 3 Waschschritten (5 min in Blotto-Lösung) wird der 2. Antikörper in vom Hersteller angegebener Verdünnung mit der Membran inkubiert. Die Detektion wird mit dem ECL System durchgeführt, ent-sprechend den Herstellerangaben wird der Blot mit der ECL-Lösung inkubiert und anschliessend ein Röntgenfilm aufgelegt. Das am 2. Antikörper fixierte Enzyme erzeugt durch Substrat-Umsatz Chemilumineszenz, die zur Schwärzung des Röntgenfilms führt.

Zur Isolation von membranhaltigen Zellbestandteilen werden 10⁷ Zellen pelletiert, in 1ml MP-Lösung A resuspendiert und 5 Min. im Douncer zerkleinert. Nach Zentrifugation (10min, 1000x g, 4°C) wird der Überstand abgenommen und erneut zentrifugiert (10min, 10.000x g, 4°C). Der Überstand wird anschliessend ultrazentrifugiert (45 min, 100.000x g). Nach Abnehmen des Überstandes (Kontrollfraktion) wird das verbliebene Pellet in 500 μl MP-Lösung 2 (+ 5 μl 100mM PMSF) resuspendiert, homogenisiert (Kanülen Grösse 18) und erneut ultrazentrifugiert (45 min, 100.000x g). Der Überstand wird abgenommen und es wird die Proteinkonzentration bestimmt.

Zur Expression klonierter cDNA’s werden die entsprechenden cDNA-Fragmente in die Plasmid-Vektoren pREP9 oder pEBV-His kloniert. Da sich diese Vektoren in der Zielzelle unabhängig vom Zellzyklus replizieren und nicht in das zelleigene Genom integrieren, werden sie als episomal-stabile Vektoren bezeichnet. Für die Elektroporation von Zellen der BL60-2-Linie werden die Zellen 24 h vor Beginn der Transfektion auf eine Zellzahl von 1x10⁵ Zellen/ml eingestellt, um gute Proliferations-voraussetzungen zu schaffen. Pro Transfektionsansatz werden 5x10⁶ Zellen abzentri-fugiert, in 500 µl RPMI 1640 - Medium (ohne Zusätze) resuspendiert. Nach Zugabe von 10 - 50 µg DNA wird der Ansatz 5 min bei RT inkubiert, in die Elektroporationsküvetten (d = 0,4 cm) umgefüllt und kurz aufgeschüttelt. Die Elektroporation erfolgt bei U_max = 250 V, C=960 µF und RT, die Ansatz-spezifische Zeitkonstante T beträgt zwischen [Seite 44↓]15ms und 20ms, der Widerstand R demnach zwischen 15,6 Ohm und 20,83 Ohm. Anschliessend wird die Zellsuspension in 10 ml vorgewärmtes (37°C) Kulturmedium umgesetzt. Durch Trypanblau-Färbung wird die Anzahl abgestorbener Zellen ermittelt.

Da bei der Elektroporation ca. 30-50% der in der Zellsuspension vorhandenen Zellen zerstört werden und dies zu Veränderungen des pH-Wertes und anderer Parameter des Mediums führt, ist eine Abtrennung der geschädigten Zellen von den noch intakten Zellen sinnvoll. Zur Auftrennung werden 2 ml Ficoll-Lösung in ein Falcon-Röhrchen vorgelegt und die aufzureinigende Zellsuspension in einem Volumen von 1 ml vorsichtig darüber geschichtet. Der Gesamtansatz wird zentrifugiert (20 min, 300x g, RT) und anschliessend werden die das Interphase-Pellet bildenden, intakten Zellen abgesaugt und in vorgewärmtes Medium überführt.

Eine Möglichkeit zur Bestimmung der Transfektionseffizienz ist die Expression von GFP (green fluorescent protein) – codierenden Plasmiden. GFP ist ein Protein, das durch die Qualle Aequorea victoria produziert wird. Das entsprechende Gen wurde 1992 kloniert (Prasher et al.,1992) und seitdem in verschiedenen Zellarten exprimiert (Chalfie et al.,1994). Biophysikalische Grundlage der Fluoreszenz von GFP ist ein chromogenes, posttranslational zyklisiertes und oxidiertes Tripeptid (Ser–Tyr–Gly). In A. victoria erfolgt die Aktivierung durch Elektronentransfer von Ca²⁺ - aktiviertem Aequorin auf GFP oder allgemein durch UV - bzw. Blaulicht (395 nm bzw. 470 nm), ohne das weitere Cofaktoren notwendig sind. Nach Anregung emitieren die Proteine grünes Licht mit einem Emissionsmaximum bei 509 nm. Um die Expression des Proteins in humanen Zellen zu erhöhen, wurden in der wtGFP-cDNA durch Austausch der entsprechenden Nukleotide Codons generiert, die eine erhöhte Translationseffizienz in humanen Expressionssystemen ermöglichen.

EGFP (enhanced GFP) stellt eine modifizierte Form des wtGFP dar, das neben humanisierten Codons eine verstärkte Fluoreszenz aufweist. Durch Mutationen im Bereich der Tripeptid-Sequenz konnte das Exzitationsmaximum von EGFP auf 490 nm [Seite 45↓]verschoben werden (red shifted variants). Da die bei der Detektion mit FACS-Geräten bzw. Lasermikroskopen benutzten Argon-Laser das Licht mit einem Maximum von 488 nm abgeben, kann eine stärkere Anregung mit entsprechend höherer Fluoreszenz erreicht werden. Zur Quantifizierung der Transfektionseffizienz für die Elektroporation von BL60–2–Zellen wird ein pREP9-EGFP-Konstrukt verwendet. Die Transfektion erfolgt wie oben beschrieben, anschliessend können die Zellen mit Fluoreszenzmikroskop (FITC – Filter, s.u.) oder Durchflusszytomter (Filter FL1, s.u.) analysiert werden.

Zur Anreicherung transfizierter BL60–2–Zellen werden die aufzureinigenden Zellen mit einem pRep9-ΔCD4–Konstrukt cotransfizert. ΔCD4 kodiert für eine Form des T–Zell-spezifischen Oberflächenantigens CD4, die durch Deletion der entsprechenden cDNA-Abschnitte keine zytoplasmatische, signaltransduzierende Domäne besitzt. Da BL60–2– Zellen kein endogenes CD4 exprimieren, sind nur ΔCD4–Transfektanten nach Inkubation mit Anti–CD4–Antikörper CD4–positiv.

Die Anreicherung ΔCD4–exprimierender Zellen erfolgt durch immunomagnetische Separation, bei der para-magnetische Partikel (Dynabeads, DYNAL) eingesetzt werden. Für die Anreicherung CD4-positiver BL60–2–Zellen werden 5x10⁶ Zellen abzentrifugiert und in 2 ml PBS-FCS-Medium resuspendiert. 150 µl der CD4–gekoppelten Dynabeads (1,4x10⁸/ml, insgesamt ca. 2x10⁷) werden in ein Eppendorf-Gefäss (1,5 ml) überführt und das Gefäss wird in einen Magnetständer gestellt. Nach 2 min wird der Überstand vorsichtig abpipettiert und das Wandpellet in 2 ml PBS-FCS-Medium resuspendiert. Dieser Waschschritt wird 2 mal wiederholt und das Pellet wird in 150 µl PBS-FCS-Medium aufgenommen. Die gewaschenen Partikel werden dann mit der BL60–2– Suspension unter ständigem, vorsichtigem Mischen inkubiert (60 min, 4°C), wobei die Partikel in vierfachem Überschuss vorliegen. Anschliessend wird das Reaktionsgefäss in den Magnetständer gestellt, der Überstand nach 2 min vorsichtig entfernt und das Pellet in Medium gewaschen. Nach weiteren 2 Waschschritten kann die Suspension zur Kultur verwandt werden oder es können die Magnetpartikel von den Zellen abgelöst werden. Der hierbei verwendete AK besitzt eine starke Affinität zum beads-gekoppelten anti - CD4 - AK und bewirkt dadurch die Verdrängung des ΔCD4-Moleküls aus der Bindung. Dazu wird das Pellet nach dem letzten Waschschritt in 100 µl Medium [Seite 46↓]resuspendiert und 10 µl der Anti–Fab(Anti–CD4)-Lösung zum Ansatz gegeben. Nach Inkubation (60 min, RT) wird nochmals magnetisch separiert, die von den Zellen abgelösten Partikel verbleiben als Pellet und die Zellen können kultiviert werden.

Zur Sortierung und Charakterisierung von Zellen und Zellbestandteilen können immunzytometrische Verfahren benutzt werden. Nach Anregung einzelner Zellen mit Laserlicht definierter Wellenlänge können die Zellen durch Bestimmung der Lichtabsorption und -emission (z.T. nach Inkubation mit markierten Antikörpern) morphologisch und immunologisch analysiert oder sortiert (FACS) werden.

Die immunzytometrische Analyse umfasst 3 Teilschritte: die Markierung der Zellen, die zytometrische Messung und die Datenauswertung. Zur Bestimmung der Expression von Oberflächenantigenen (extrazelluläres FACS) werden 5x10⁶ Zellen abzentrifugiert, in AKV-Medium (200 µl) aufgenommen, inkubiert (15 min, 4°) und anschliessend abzentrifugiert. Nach Resuspension in AKV-Medium (50 µl) und Zugabe von 5 µl gekoppeltem Antikörper (bzw. entsprechend der Herstellerangaben) wird inkubiert (30 min, 4°C). Als nächstes werden die Zellen 3 mal mit AKV-Medium gewaschen, in PBS-Puffer resuspendiert und mit dem Durchflusszytometer analysiert. Bei Verwendung von 1. und 2. Antikörper wird noch ein weiterer Inkubationsschritt eingefügt. Die zytometrische Messung (Gerät FACScan) sowie die Datenauswertung (Software CellQuest) ist in den entsprechenden Handbüchern ausführlich beschrieben.

Zur mikroskopischen Darstellung von intrazellulären oder extrazellulären Antigenen werden die zu untersuchenden Zellen auf Objektträgern immobilisiert und mit direkter oder indirekter Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Dazu werden die Suspensions-zellen auf sterile Objektträger (mit mehren Vertiefungen / multi well) aufgetragen (je Vertiefung 40 µl von 5x10⁵ Zellen/ml) und inkubiert (1 h, 37°C). Anschliessend wird das Medium abgesaugt und die sedimentierten Zellen werden für 3 min luftgetrocknet. Die Zellen werden nun mit 3% Formaldehyd fixiert (5 min, RT), danach mit NP40-Puffer gewaschen (1 min) und permeabilisiert (NP40-Puffer, 10 min). Die jeweiligen Antikörper werden in entsprechender Verdünnung mit den Zellen inkubiert (jeweils 30 min, RT). Nach erneutem Waschen werden die Zellen mit Einbettmedium überschichtet, das [Seite 47↓]Deckglas aufgelegt und mit Nagellack luftdicht versiegelt. Die mikroskopischen Aufnahmen erfolgen im Hellfeld mit Phasenkontrast sowie im Dunkelfeld mit Filtern entsprechend den verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen.

Durch Einbau ³⁵S-haltiger Aminosäurenwerden neu synthetisierte Proteine in vivo radioaktiv markiert und sind dadurch autoradiographisch detektierbar. Hierzu werden 5x10⁷ Zellen in Minusmedium gewaschen, in 20ml Minusmedium resuspendiert und inkubiert (15min, 37°C). Nach Zentrifugation wird das Zellpellet in 20 ml Minusmedium resuspendiert, dazu werden 100 µl Express Labeling Mix (³⁵S-haltiges Methionin, Endkonzentration: 0,05 mCi/ml)) gegeben. Nach Inkubation (4 h, 37°C) werden die Zellen mit PBS gewaschen, in 1 ml NP40–Puffer lysiert (20min, Eis, mehrmals mischen) und zentrifugiert (20 min, 4°C, 10.000x g). Der Überstand enthält das ³⁵S-markierte Gesamtprotein.

Die Anreicherung oder Detektion eines definierten Proteins kann durch Immunpräzipitation erfolgen. Dazu wird ein Antikörper, der gegen das gesuchte Protein gerichtet ist, mit Agarose A gekoppelt (30 min, Eis, mehrmals mischen). Anschliessend wird das Konjugat mit NP40 - Puffer (1% in PBS) gewaschen und resuspendiert. Gleichzeitig werden Zellen mit [³⁵S]–haltigen Aminosäuren inkubiert und lysiert (s.o.). Zur Vermeidung unspezifischer Protein–Agarose-Interaktionen sollte eine Vorinkubation des Zell - Lysates mit Agarose A erfolgen. Das Antikörper–Agarose–A–Konjugat wird dann mit vorgereinigtem Zell–Lysat inkubiert (16h, 4°C, Rotor). Die hierbei entstehenden, an Agarose A gebundenen Protein-Antikörper-Komplexe werden nach mehrmaligem Waschen in Lämmli–Puffer aufgenommen und können mittels SDS– PAGE aufgetrennt werden. Die im Gel aufgetrennten Proteine werden autoradio-graphisch oder mit Western Blot detektiert.

Die autoradioigraphische Detektion von ³⁵S-markierten Proteinen erfordert aufgrund ihrer geringen Sensitivität eine Vorbehandlung des Proteingels. Nach Fixierung des SDS-Polyacrylamid-Gels in Fixierungslösung (30 min, RT, Schüttler) erfolgt die Inkubation mit Amplify-Lösung (30 min, RT, Schüttler). Anschliessend wird das Gel auf Whatman-Papier getrocknet (Geltrockner: 60 min, 80°C), das Papier in Folie eingeschweisst und mit Röntgenfilm in eine Kassette eingelegt (2 h bis mehrere Tage).

Die Elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden von Dr. Vogel, MDC Berlin, angefertigt.

Die tryptische Proteolyse mit nachfolgender Massenspektrometrie wurde von Dipl. - Chemiker Volker Badock, MDC Berlin, durchgeführt.