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3  Ergebnisse

3.1 Identifizierung Apoptose-assoziierter Gene und Charakterisierung des Genprodukts LAPTM5

3.1.1 Differential Display RT-PCR

Die anti-IgM-sensitive humane Burkitt-Lymphom-Linie BL60–2 (Rickers et al.,1998) wurde zur Auslösung von Apoptose für 16 Stunden mit anti-IgM inkubiert, ein Kontrollansatz wurde im gleichen Zeitraum ohne anti-IgM kultiviert. Der Anteil apoptotischer Zellen liegt nach Inkubation mit anti-IgM bei 50 - 70%. In der Kontrollpopulation sterben ca. 5% der Zellen spontan durch programmierten Zelltod. Abbildung 6 zeigt intakte und apoptotische Zellen nach Färbung mit Acridin-Orange.

Abbildung 6 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme, Dunkelfeld, Färbung mit Acridin-Orange. Links: BL60-2-Zellen vor Induktion von Apoptose. Rechts: 24 Stunden nach Induktion von Apoptose durch Inkubation mit anti-IgM. Acridin-Orange interkaliert in die DNA, wodurch die Zellkerne sichtbar werden. Im linken Bild sind intakte Zellen und Zellkerne zu sehen (nichtapoptische Population), rechts dagegen sind die Kerne deutlich fragmentiert (apoptotische Population).

Aus beiden Zellfraktionen wurde RNA isoliert und unter Verwendung von oligo-dTPrimer einzelsträngige cDNA hergestellt (Reverse Transkription). Anschliessend wurden aus 10 P-Primern und 9 T-Primern Primer-Paare gebildet und zur Synthese doppel-strängiger cDNA eingesetzt (PCR). Zur Objektivierung der Ergebnisse wurden jeweils 2 Ansätze pro Zellfraktion amplifiziert. Die Differential Display RT-PCR ist im Labor etabliert und wurde von Andreas Laubersheimer ausgeführt. Die PCR-Produkte wurden anschliessend elektrophoretisch aufgetrennt (denaturierendes Gel, 8M Harnstoff) und autoradiographisch analysiert (Abb. 7).


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Abbildung 7 Elektrophporetische Auftrennung von DD RT–PCR-Fragmenten

Banden von RT-PCR-Produkten, deren Intensität Unterschiede zwischen den Zellfraktionen zeigten, wurden aus dem Gel eluiert. Als potentiell differentielle Banden wurden diejenigen zur weiteren Analyse ausgewählt, die jeweils in beiden amplifizierten Ansätzen unterschiedliche Intensitäten gleicher Tendenz (Zunahme oder Abnahme der Intensität) aufwiesen. Insgesamt wurden 38 Banden-Paare mit einer eindeutigen Intensitätsänderung identifiziert. Die jeweils stärkeren Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und eluiert. Anschliessend erfolgte die Reamplifikation mit den in der DD RT-PCR benutzten Primern. Die Länge der entsprechenden PCR-Produkte lag zwischen 100bp und 700bp.

3.1.2 Klonierung und Sequenzanalyse von RT-PCR-Produkten

Nach Reamplifikation und Aufreinigung der RT-PCR-Produkte wurden diese in den Vektor pGEM-T kloniert und in E. coli transformiert (JM 109). Die Klonierung erfolgte vor allem, um spätere Experimente effizient durchführen zu können, z.B. durch Verwendung einheitlicher Primer bei Sequenzierungen. Von den ausgewählten 38 Reamplifikaten konnten 30 kloniert werden, bei den restlichen 8 gelang dies nicht.
Pro Klonierung wurden 8 Kolonien isoliert, da aus Vorversuchen bekannt war, dass die aus dem Gel ausgeschnittenen Banden unterschiedliche PCR-Produkte enthalten können. Die selektierten Klone wurden über Nacht kultiviert und die enthaltene Plasmid-DNA präpariert. Der anschliessende Kontrollverdau ergab wie erwartet ein inhomogenes Fragmentmuster (Abbildung 8).


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Abbildung 8 Beispiel für Kontrollverdau nach Klonierung von DD RT-PCR-Produkten. Die ursprüngliche PCR-Bande muss entsprechend dem inhomogenen Bandenmuster mindestens 3 unterschiedliche PCR-Produkte enthalten. M: DNA-Marker. 1-8: DNA selektierter Klone.

Die nach dem Kontrollverdau sichtbaren Längenunterschiede der Fragmente, die ursprüngliche eine annähernd gleiche Grösse besassen, können durch interne Schnittstellen in den Fragmenten hervorgerufen sein oder durch Verunreinigungen bei DD RT-PCR und Reamplifikation. Da jeder der Klone das für die unterschiedliche Bandenintensität verantwortliche DNA-Fragment enthalten kann, wurden für die weitere Arbeit alle Klone mit Ausnahme derer ausgewählt, deren Fragmente eine Grösse von weniger als 100 bp aufwiesen. Insgesamt standen dadurch 58 Klone für die nachfolgende Sequenzanalyse zur Verfügung.

Die in pGEM-T enthaltenen Fragmente wurden mit SP6- und T7-Primern sequenziert (ABI PRISM 310). Die Analyse der Fragmentsequenzen wurde nach Abtrennung der Vektor-Sequenzen mit HUSAR- sowie NCBI-Sofware, basierend auf dem BLAST (Basic local alignment search tool)-Algorithmus durchgeführt (Altschul et al.,1990):

Vergleich der Sequenzen eines Bandenansatzes (HUSAR)

Vergleich aller Sequenzen miteinander (HUSAR)

Vergleich der Sequenzen mit nichtredundanten Gen-Datenbanken (HUSAR/NCBI)

Vergleich der Sequenzen mit EST-Datenbanken (NCBI)

Die Ergebnisse der Sequenzanalyse aus nichtredundanten Genbanken sowie der EST-Datenbank (NCBI, Stand 6/1997) sind in Tabelle 4 zusammengefasst, aufgeführt sind jeweils die Sequenzen mit maximaler Homologie (e-value).


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Tabelle 3 Auswertung der Sequenzierungen ausgewählter DD RT-PCR-Fragmente

Klon

Accession-Nummer

NCBI blastn Resultate

0103HD

AC004016

Homo sapiens BAC clone RG424N05

0104HD

SU63963

Human CSF-1 receptor (FMS) gene and (SMF)gene

0108HD

AA801087

EST 190584, rat

0201HD

AA801087

EST 190584, rat

0205HD

U15177

Human cosmid CRI-JC2015

0206HD

AA711905

EST vu28h09.r1

0306HD

AA315456

EST 187298

0404HD

L42085

Homo sapiens subclone 9_e1 from P1 H16

0405HD

HSU93305

Homo sapiens A4 differentiation-dependent protein DNA

0408HD

HSU93305

Homo sapiens A4 differentiation-dependent protein DNA

0503HD

U51240

Human lysosomal-associated multitransmembrane Protein

0504HD

 

unbekannt

0607HD

AC000385

Human Chromosome 11 pac pDJ392a17

0706HD

AC005218

Homo sapiens chromosome 5, P1 clone 737H5

0802HD

 

unbekannt

0806HD

X03205

Human 18S ribosomal RNA

0902HD

Z99570

Homosapiens DNA sequence from PAC 119E23

0906HD

 

unbekannt

1006HD

 

unbekannt

1007HD

AB001895

Homo sapiens mRNA for B120

1104HD

X03205

Human 18S ribosomal RNA

1201HD

X93334

Homo sapiens mitochondrial DNA

1402HD

X59357

Human mRNA for EBV sRNAs (EBERs)associated protein

1603HD

X93334

Homo sapiens mitochondrial DNA

1608HD

M17987

Human beta-2-microglobulin gene, exon 2 and 3

1802HD

 

unbekannt

1803HD

 

unbekannt

1804HD

 

unbekannt

1805HD

AB001895

Homo sapiens mRNA for B120

1808HD

AB001895

Homo sapiens mRNA for B120

2002HD

M17987

Human beta-2-microglobulin gene, exon 2 and 3

2102HD

AC005288

Homo sapiens chromosome 17, clone hCIT.131

2201HD

 

unbekannt

2202HD

 

unbekannt

2204HD

M17987

Human beta-2-microglobulin gene, exon 2 and 3

2305HD

AB001895

Homo sapiens mRNA for B120

2307HD

AB001895

Homo sapiens mRNA for B120

2402HD

AC004197

Homo sapiens clone UWGC:y28c204

2403HD

 

unbekannt

2404HD

Z96698

Homo sapiens telomeric DNA sequence, clone 7PTEL064

2504HD

 

unbekannt

2505HD

M11167

Human 28S ribosomal RNA gene

2508HD

AC003043

Homo sapiens chromosome 17, clone HRPC1067M6

2602HD

U94747

Human WD repeat protein HAN mRNA

2802HD

 

unbekannt

2804HD

 

unbekannt

3001HD

 

unbekannt

3002HD

K03432

Human 18S ribosomal RNA

3008HD

 

unbekannt

3102HD

U17474

Human autoantigen mRNA

3103HD

 

unbekannt

3301HD

 

unbekannt

3302HD

 

Unbekannt

3405HD

AF042384

Homo sapiens BC-2 protein mRNA

3701HD

Z92844

Human DNA sequence from PAC 435C23

3704HD

AF052578

H. sapiens androgen receptor associated protein 24

3801HD

 

Unbekannt

3802HD

 

Unbekannt

Die Homologien der untersuchten 58 Sequenzen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

Spezifische humane Gensequenzen:

17

(29%)

Sequenzen von EST’s:

4

(7%)

Humane chromosomale DNA-Sequenzen:

11

(19%)

Ribosomale (4), mitochondriale (2) RNA-Sequenzen

6

(10%)

Sequenzen ohne Homologien:

20

(35%)


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Die anschliessend durchgeführte Auswahl der zu untersuchenden Sequenzen wurde aufgrund folgender Kriterien getroffen:

3.1.3 Northern Blot Hybridisierungen

Zur Bestätigung der Ergebnisse der DD-RT-PCR wurden auf der Basis der klonierten Fragmente nach Amplifikation radioaktiv markierte DNA-Sonden hergestellt und mit Northern Blots hybridisiert. Zur Herstellung der Northern Blots wurde RNA aus BL60-2 Zellen isoliert, die mit anti-IgM inkubiert wurden ( 4, 8, 12, 24 Stunden) bzw. nicht mit anti—IgM inkubiert wurden (bezeichnet als 0-Stunden-Wert). Für die zu Beginn untersuchten Fragmente

konnte die differentielle Expression nicht bestätigt werden. Entweder hybridisierten die Sonden gleich stark oder gar nicht. Die beobachtete hohe Anzahl falsch positiver Befunde ist ein generelles Problem der DD RT-PCR-Technik, in der Literatur liegen die Angaben dazu zwischen 10% und 70%.


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Die Northern-Hybridisierung mit Fragment 0503HD (Lysosomal-assoziiertes Membranprotein mit 5 Transmembran-Domänen, LAPTM5) bestätigte dessen differentielle Expression. Die verwendete Probe codiert für ein 350 bp-Fragment im 3‘-Bereich der LAPTM5-cDNA. Als Kontrolle wurde mit einer GAPDH-Sonde gegen-hybridisiert. GAPDH, als Enzym des Intermediär-Stoffwechsels ubiquitär in nahezu allen Zellen exprimiert, bleibt in seiner Expression konstant über einen weiten Bereich, in dem die Zelle inneren und äusseren Reizen (Temperaturänderungen, Serumentzug) ausgesetzt ist. Wegen seiner Funktion wird GAPDH, neben anderen Genen, als „housekeeping gene“ bezeichnet und eignet sich gut als Kontrolle für die Qualität des Northern Blots.

Die Hybridisierung der LAPTM5-Sonde mit BL60-RNA (Abb. 9) zeigt 2 Stunden nach Induktion von Apoptose einen Anstieg auf das 4-fache gegenüber der Wert der nicht-induzierten Vergleichspopulation (0 Stunden). Der zeitliche und qualitative Verlauf des Expressionsanstiegs konnte durch eine weitere Hybridisierung bestätigt werden. Der für diese Kontrollhybridisierung verwandte Northern Blot wurde aus RNA hergestellt, die nicht mit der für die Ersthybridisierung eingesetzten RNA identisch war.

Abbildung 9 Differentielle Hybridisierung von LAPTM5. A) Northern-Hybridisierung mit dem Fragment 0503HD (LAPTM5), sowie Gegenhybridisierung des Blots mit einer GAPDH-Sonde. Die Expression von LAPTM5 steigt nach 2 Stunden an. B) zeigt die im Agarose-Gel aufgetrennte RNA (nach Färbung mit Ethidium-Bromid), die für den Northern Blot benutzt wurde.

Aufgrund der Hinweise auf eine Funktion von LAPTM5 im Rahmen der Embryogenese sowie der Differenzierung hämatopoetischer Zellen wurde das Protein für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die verbliebenen DD RT-PCR-Fragmente wurden nicht weiter berücksichtigt.


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3.1.4  Western Blot von LAPTM5

Um die differentielle Expression von LAPTM5 auf Proteinebene zu überprüfen, wurde Protein aus Zellen ohne Inkubation und nach Inkubation mit anti-IgM extrahiert. Zur Detektion wurde ein anti-LAPTM5-Antikörper benutzt, der gegen den C-terminalen Anteil des Proteins gerichtet ist (Peptidsequenz: CSKTPEGGPAPPPYSEV, Dr. B. Lim, Boston). Als Kontrolle wurde der Blot mit einem anti-Tubulin-Antikörper inkubiert. Die Tubulin-Expression bleibt im beobachteten Zeitraum während der anti-IgM-induzierten Apoptose unverändert. Wie in Abbildung 10 zu sehen ist, liegt die LAPTM5-Bande bei ca. 27 kDa. Zwei Stunden nach Inkubation mit anti-IgM kommt es zum Anstieg der LAPTM5-Proteinmenge, die anschliessend nicht weiter zunimmt. Die verstärkte Expression der LAPTM5-mRNA korreliert mit der Zunahme der Proteinexpression nach ca. 2 Stunden. Die Hybridisierung mit anti-Tubulin-Antikörper zeigt eine gleichmässig starke Expression von Tubulin im untersuchten Zeitraum.

Abbildung 10 Western Blot-Analyse LAPTM5. Proteinextrakt aus BL60-2-Zellen ohne Inkubation (0) und nach Inkubation mit anti-IgM (2,4,8,12 Stunden). Die Expression nimmt 2 Stunden nach Inkubation mit anti-IgM deutlich zu.

3.1.5 Expressionsmuster von LAPTM5

Gene können in Abhängigkeit von der Funktion der Genprodukte in unterschiedlichen Differenzierungsstadien einer Zelle, in definierten Zellarten oder als Antwort auf ver-schiedenste Reize unterschiedlich stark exprimiert werden. Um die Expression von LAPTM5 in verschiedenen Geweben zu überprüfen, wurde auf Basis des in pGEM-T klonierten DD RT-PCR-Fragments eine radioaktive RNA-Sonde hergestellt (Riboprobe System, Promega). Diese wurde mit Northern Blots inkubiert, deren RNA aus mehreren humanen Geweben stammt (Multiple Tissue Northern, Clontech).


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Abbildung 11 Expressionsmuster von LAPTM5. Multiple Tissue Northern (2μg poly-A+-RNA), Blot humanes Gewebe (links) und Blot humanes Immunsystem (rechts). Hybridisiert wurden beide Blots mit einer LAPTM5-RNA-Sonde (Riboprobe) in einem Hybridisierungsansatz. Human: H=Herz, Hi=Hirngewebe, Pl=Placenta, Lu=Lunge, Le=Leber, SM=Skelettmuskulatur, Ni=Niere, P=Pankreas, Immunsystem: Sp=Milz, Lk=Lymphknoten, Th=Thymus, Ap=Appendix, L=Periphere Blut-Lymphozyten, Km=Knochenmark, FL=Fetale Leber.

LAPTM5 wird vorwiegend in Zellen des hämatopoetischen Systems bzw. Immunsystems sowie in quergestreifter Skelettmuskulatur und Herzmuskulatur exprimiert (Abb. 11). In geringen Mengen ist das Transkript jedoch auch in allen anderen untersuchten Geweben zu finden. Weiterhin wird deutlich, dass die Sonde mit mRNA unterschiedlicher Länge hybridisiert. Aufgrund der geringen Auftrennung der RNA konnte die Länge der detektierten RNA nur grob geschätzt werden. Die bei vollständiger Transkription zu erwartende Hybridisierung bei ca. 2,2 kbp fand sich in allen Geweben, möglicherweise mit Ausnahme des nicht sicher beurteilbaren Skelettmuskelgewebes. In Herzgewebe, Appendix sowie Knochenmark liegen jeweils zwei mRNA-Transkripte unterschiedlicher Länge vor. Zu beachten ist auch die stärkere Hybridisierung mit mRNA fetaler Leber im Vergleich zu mRNA adulter Leber.

3.1.6 Immunfluoreszenzmikroskopie LAPTM5

LAPTM5 wurde nach Kolokalisationsstudien unter Verwendung der lysosomalen Membranproteine LAMP1, LAMP2 und CD63 in Lysosomen der humanen Erythroleukämie-Zellinie HEL lokalisiert (Adra et al.,1996). Zur Bestimmung der intrazellulären Lokalisation und der Verteilung von LAPTM5 wurden BL60-2-Zellen sowie als Kontrolle HEL-Zellen mit anti—LAPTM5 sowie Cy3-markiertem Zweitantikörper immunzytochemisch gefärbt und anschliessend fluoreszenzmikroskopisch untersucht. LAPTM5 ist sowohl in BL60-2 Zellen als auch in HEL-Zellen detektierbar. Es liegt ein nahezu gleichmäßiges Verteilungsmuster von punktförmigen Fluoreszenzmarkierungen vor. Mehrere Bereiche pro Zelle weisen jedoch eine erhöhte Dichte dieser Fluoreszenz-[Seite 58↓]markierungen auf und können als Konzentration des Proteins im Bereich der Lyso-somen bzw. assoziierter Kompartimente angesehen werden (siehe Elektronen-mikroskopie LAPTM5). Eine teilweise membranständige Fluoreszenz in beiden Zell-linien weist auf eine Lokalisation des Proteins in der Zellmembran hin. Um die Veränderung der Expression von LAPTM5 und eine mögliche intrazelluläre Umverteilung während des programmierten Zelltodes zu untersuchen, wurden BL60-2-Zellen angefärbt, die zuvor mit anti—IgM inkubiert wurden (Abb. 12). Im zeitlichen Verlauf (ohne Inkubation; 16 Stunden nach Inkubation mit anti-IgM) konnte insgesamt keine ausgeprägte Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden. Die oben erwähnten Bereiche mit einer erhöhten Dichte der punktförmigen Fluoreszenzen zeigen eine stärkere Intensität nach Apoptose-Induktion als Hinweis auf eine Zunahme der Konzen-tration des Proteins im lysosomalen Kompartment nach Induktion.

Abbildung 12 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen. BL60-2-Zellen nach Inkubation mit anti-LAPTM5 sowie anti-Rabbit-Cy3. A: Intakte Zellen mit punktförmigem Fluoreszenzmuster und Bereichen mit erhöhter Fluoreszenzdichte. B: Zellen 16 Stunden nach Inkubation mit anti-IgM. Leichte Zunahme der Fluoreszenzintensität nach Inkubation der Zellen mit anti-IgM in Bereichen, die auch ohne Inkubation eine erhöhte Fluoreszenz aufweisen.

3.1.7 FACS-Analyse von LAPTM5

Um die Lokalisation von LAPTM5 in der Plasmamembran zu bestätigen, wurde die Expression des Proteins auf der Zelloberfläche mittels Durchflusszytometrie gemessen. [Seite 59↓]Als Kontrolle wurde die Expression des Oberflächen-Antigens CD19 bestimmt, das in B-Zellen aller Differenzierungsstadien mit Ausnahme von Plasmazellen produziert wird und ein B-Zell-Marker ist (Abb. 13). Weiterhin erfolgte die Bestimmung der Oberflächen-Expression von LAPTM5 (und CD19) im Verlauf der IgM-vermittelten Apoptose.

Abbildung 13 FACS-Analyse von LAPTM5. BL60-2-Zellen ohne Inkubation mit anti-IgM (0h) oder 4 Stunden nach Inkubation mit anti-IgM (4h) wurden mit anti-CD19-FITC (Becton Dickinson) oder anti-LAPTM5 (Rabbit) und Zweitantikörper (anti-Rabbit-FITC) inkubiert. K: Kontrolle: FACS-Analyse ohne Antikörper (CD19), nur Zweitantikörper anti-Rabbit-FITC (LAPTM5). LAPTM5 und CD19 können auf der Oberfläche von BL60-2-Zellen detektiert werden. Die LAPTM5-Expression bleibt im untersuchten Zeitraum (4 Stunden) konstant. der Expression von LAPTM5 in BL60-Zellen.

Es zeigte sich, dass LAPTM5 auf der Zelloberfläche detektiert werden kann und somit als Transmembranprotein auch innerhalb der Plasmamembran lokalisiert ist. Entsprechend der Bindungsdomäne des verwendeten Antikörpers ist es wahrscheinlich, dass der C-terminale Anteil von LAPTM5 auf der extrazellulären Seite der Plasma-membran liegt. Da keine weiteren LAPTM5-Antikörper zur Verfügung stehen, ist die Detektion von LAPTM5-Varianten bzw. von strukturell ähnlichen Proteinen mit gleichem Epitop durch den eingesetzten Antikörper nicht auszuschliessen. Die Expressionsdichte innerhalb der Plasmamembran ist relativ niedrig und verändert sich nach Inkubation mit anti-IgM nicht. Eine Zunahme der Expression von LAPTM5 in der Plasmamembran ist also während des programmierten Zelltodes nicht vorhanden.


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3.1.8  Membranständige Lokalisation von LAPTM5

Zur Kontrolle der Lokalisation von LAPTM5 in Membranen von B-Zellen wurde die Expression des Proteins in membranhaltigen Zellbestandteilen untersucht. Dazu wurden die Zellen solubilisiert und durch Zentrifugation Membrankompartimente von Cytosol getrennt. Die einzelnen Fraktionen wurden im Gel aufgetrennt und geblottet. Nach Inkubation des Blottes mit anti-LAPTM5 konnte das Protein nur in der membran-haltigen Fraktion detektiert werden (Abb. 14). α-Tubulin, das als Kontrollprotein untersucht wurde, ist ein vorwiegend zytoplasmatisch lokalisiertes, teilweise auch membranassoziiertes Strukturprotein, dass sich auch in BL60-Zellen vor allem in der cytosolischen Fraktion nachweisen lässt.

Abbildung 14 Membranständige Lokalisation von LAPTM5. Auftrennung von BL60-2-Lysaten mit unterschiedlicher Proteinmenge (in µg) nach Fraktionierung in Membranbestandteile und Überstand. Inkubation mit anti-LAPTM5-AK und anti-Tubulin-AK. LAPTM5 liegt nur in der Membranfraktion vor, Tubulin vorwiegend im Überstand, wie der Vergleich beider Fraktionen zeigt.

3.1.9 Protein-labeling und Immunpräzipitation von LAPTM5

Nach [35S]-in vitro-labeling wurden die Lysate von BL60-Zellen und HEL-Zellen mit anti-LAPTM5-AK inkubiert und anschliessend aufgetrennt. Die Immunpräzipitation wurde zur Suche nach LAPTM5-assoziierten Proteinen bzw. LAPTM5-Varianten mit unterschiedlichem Molekulargewicht eingesetzt. Hinweise auf mögliche LAPTM5-Varianten lieferte insbesondere die Northern-Analyse, die in einigen Geweben RNA-Banden unterschiedlicher Grösse zeigte. Das Molekulargewicht des Proteins beträgt in BL-60-Zellen ca. 27 kDa, assoziierte Proteine wurden unter den angewandten Bedingungen nicht gefunden. Die Übereinstimmung der detektierten Bande mit dem LAPTM5-Protein wurde durch anschliessende Western-Analyse der Präzipitate bestätigt.
[Seite 61↓]Ein nur in BL-60-Zellen, nicht jedoch in Kontrollzellen (HEL) detektiertes Protein wurde als beta-Aktin identifiziert, das unspezifisch an Agarose A bindet. Die Bestimmung als beta-Aktin erfolgte aufgrund des Molekulargewichtes (42kDa) sowie durch massenspektrometrische Analyse (MALDI-MS, matrix-assisted laser desorption /ionization mass spectrometry) und SWISSPROT-Datenbankrecherche (Volker Badock, MDC Berlin). Mögliche Ursache für die fehlende Detektion von beta-Aktin in HEL-Zellen ist eine geringe Expression oder die Expression eines LAPTM5-Variante, die nicht an Agarose bindet.

Abbildung 15 Immunpräzipitation von LAPTM5. Links: [35S]-haltige Lysate (BL60-2, Kontrolle: HEL) wurden mit anti-LAPTM5-gekoppelter Agarose A inkubiert, die Präzipitate wurden elektrophoretisch aufgetrennt und autoradiographisch detektiert. Das LAPTM5-Protein ist ca. 27 kDa gross. Die zweite Bande der BL60-2-Linie bei ca.45 kDa wurde als beta-Aktin identifiziert. Rechts:Inkubation von nichtmarkierten Lysaten (BL60-2, HEL) mit Agarose A, Auftrennung und Färbung des Blottes nach Coomassie. Die detektierte Bande bei ca. 45 kDa entspricht beta-Aktin, das unspezifisch an Agarose A bindet.

3.1.10 Elektronenmikroskopische Lokalisation von LAPTM5

Die subzelluläre Lokalisation von LAPTM5 wurde bisher in Kolokalisationsexperimenten mit lysosomal-assoziierten Proteinen sowie durch Western-Analyse von Zellfraktionen untersucht. Zur genaueren Bestimmung der Lokalisation von LAPTM5 innerhalb endosomal-lysosomaler Kompartimente sowie zur Untersuchung der vermuteten Lokalisation in der Plasmamembran wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen angefertigt (Immunogold-Staining-Verfahren, Dr. Vogel, MDC). Diese zeigten wie erwartet die intrazellulläre Lokalisation im endosomal-lysosomalen Kompartiment sowie vereinzelt die Assoziation mit der Plasmamembran. Durch Kleijmeer et. al. wurden endocytotische Kompartimente in B-Zellen in 6 Subtypen eingeteilt (Kleijmeer et al.,1997). Die folgende Tabelle gibt einen Überblick.


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Tabelle 4 Einteilung endosomaler und lysosomaler Kompartimente in B-Zellen.

Subtyp

Beschreibung

Marker

1

Frühe Endosomen (early endosomes, EE)

Transferrin-Rezeptor

2

Frühe Endosomen (early endosomes, EE)

Transferrin-Rezeptor

3

Späte Endosomen (late endosomes, LE)

Mannose-6-Phosphat-Rezeptor

4

Späte Endosomen (late endosomes, LE)

Lysosomal-assoziierte Proteine

5

Lysosomen, multivesikulär und laminär

Lysosomal-assoziierte Proteine

6

Lysosomen, laminär

Lysosomal-assoziierte Proteine

Entsprechend den morphologischen Kriterien liegt LAPTM5 vorwiegend innerhalb der Kompartiment-Typen 4 und 5 vor. Diese Subtypen enthalten weitere Vesikel und werden daher als multivesikulär bezeichnet. LAPTM5 ist, wie in Abbildung 16 zu sehen ist, innerhalb von späten Endosomen bzw. multivesikulären Lysosomen vorwiegend in der Membran und der Matrix der Endosomen / Lysosomen lokalisert, eine Lokalisation innerhalb der intralysosomalen Vesikel wurde nicht festgestellt. Diese Beobachtung ist konsistent mit den Egebnissen der Western-Analyse, die für LAPTM5 eine ausschliessliche Lokalisation in der membranhaltigen Fraktion zeigte.

Abbildung 16 Elektronenmikroskopische Lokalisation von LAPTM5 in BL60-2-Zellen (Immunogold staining). LAPTM5 befindet sich vorwiegend in späten Endosomen (Typ 4) und multivesikulären Lysosomen. N=Nukleus, C=Zytoplasma, M=Mitochondrien, 4=Typ-4-Kompartiment (multivesikuläre, späte Endosomen), 5=Typ-5-Kompartiment (multivesikuläre Lysosomen).


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Ebenfalls untersucht wurde die Lokalisation von LAPTM5 in BL60-2-Zellen nach Inkubation mit anti-IgM (16 Stunden). Da es sich um Einzelzell-Untersuchungen handelt und die Zellen nach morphologischen Kriterien ausgewählt wurden (Chromatinkondensation, Fragmentierung zytolasmatischer Bestandteile), kann nicht mit Sicherheit gesagt werden, in welchem Stadium des programmierten Zelltodes sich die Zellen befinden. Aus diesem Grund keine quantitative Auswertung der LAPTM5-Expression durchgeführt. In den untersuchten Lymphozyten sind die Endosomen und Lysosomen auch nach Beginn apoptotischer Prozesse morphologisch intakt, teilweise sind sie verkleinert und eher länglich. Sie liegen gemeinsam mit anderen Organellen im verschmälerten Zytoplasmasaum um den Zellkern herum. LAPTM5 ist auch innerhalb der lysosomalen Membran apoptotischer Zellen vorhanden, wie Abbildung 17 zeigt. Eine Veränderung der Expression oder subzellulären Lokalisation des Proteins war nach Induktion in den untersuchten Zellen nicht sichtbar.

Abbildung 17 Elektronenmikroskopische Lokalisation von LAPTM5 in BL60-2-Zellen nach Inkubation mit anti-IgM. N=Nukleus, C=Zytoplasma, L=Lysosomen.

Abschliessend erfolgt eine kurze Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse dieses Kapitels:

LAPTM5 wird als lysosomal-assoziiertes Protein während der anti-IgM-induzierten Apoptose unreifer B-Zellen verstärkt exprimiert. Eine erhöhte Expression von LAPTM5 erfolgt nach 2 Stunden auf RNA- und Protein-Ebene und bleibt anschliessend nahezu konstant.


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Für LAPTM5 wurde neben der lysosomalen auch eine Lokalisation in der Plasmamembran nachgewiesen. Während der B-Zell-Apoptose bleibt die Expression von LAPTM5 in der Plasmamembran konstant.

Neben der vorwiegenden Expression in hämatopoetischen Geweben findet sich eine hohe Konzentration von LAPTM5-RNA in Herz- und Skelettmusel-Gewebe. In Abhängigkeit von der jeweiligen Zellart liegen unterschiedliche RNA-Transkripte vor.

LAPTM5 wurde kloniert und es wurde nachgewiesen, dass auf Grundlage der LAPTM5-cDNA in vitro ein funktionelles Protein synthetisiert wird (Ergebnisse nicht gezeigt). Damit steht eine LAPTM5-cDNA zur Verfügung, die zusammen mit dem im folgenden Kapitel beschriebenen Expressionssystem zur weiteren Charakterisierung von LAPTM5 eingesetzt werden kann.


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3.2  Episomale Genexpression in BL60-2-Zellen

Die funktionelle Charakterisierung von Proteinen kann durch die Expression transfizierter Gene erfolgen. Für den Gentransfer stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, die in virale und nicht-virale Transfermethoden eingeteilt werden. Zur letzten Gruppe gehören z.B. Liposomaler Transfer, Rezeptor-vermittelter Transfer, die direkte Injektion von DNA in die Zielzelle oder die Elektroporation von Zellen. Dabei können die Empfängerzellen die transfizierten Gene kurzzeitig produzieren (transiente Expression) oder, nach Integration der codierenden DNA in das Genom, dauerhaft exprimieren (stabile Expression). Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz von Vektoren, die nicht in das Genom integrieren, jedoch durch autonome Replikation eine über mehrere Wochen anhaltende Expression ermöglichen (episomale Stabilität / metastabile Expression).

Für die Untersuchung von Genen in BL60-2-Zellen sollte ein Expressionssystem angewandt werden, das die Herstellung einer grossen Anzahl von Transfektanten innerhalb kurzer Zeit (3 Tage) ermöglicht. Um eine Zellpopulation mit hohem Anteil an transfizierten Zellen herstellen zu können, muss entweder eine Methode mit hoher Transfektions-Effizienz eingesetzt werden oder die transfizierten Zellen müssen selektioniert werden. Diese Selektion kann zum Beispiel über Antibiotika-Resistenz-Marker, über magnetische Separation oder durch Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) erfolgen. Voraussetzung für eine effiziente Anwendung dieser Verfahren ist die intrazelluläre Stabilität der transfizierten Plasmid-DNA, verbunden mit einer hohen, konstanten Expressionsrate. Ausgehend von diesen Überlegungen sollte der Gentransfer durch Elektroporation sowie eine nachfolgende Selektion unter Verwendung eines episomal-stabilen Vektorsystems (pREP-Vektoren, Invitrogen) erfolgen.

3.2.1 EGFP-Expression als Reportersystem und Elektroporation von B-Zellen

Zur Etablierung eines Transferverfahrens ist die reproduzierbare Quantifizierung der Transfektionsrate nötig. Als Reportersystem wurde die Expression von EGFP (enhanced green fluorescent protein) in den transfizierten Zellen benutzt, die sich fluoreszenzmikroskopisch oder durch FACS-Analyse messen lässt. Die EGFP-cDNA stellt eine modifizierte Form des GFP-Proteins dar, die für die Expression in Humanzellen optimierte Codons besitzt sowie nach Anregung eine verstärkte Fluoreszenz aufweist. Zunächst wurde die Expression von EGFP in BL60-2-Zellen [Seite 66↓]durch Transfektion des Plasmids pRc/CMV-EGFP (V. Pevzner, MDC Berlin) mittels Elektroporation nach Standardprotokoll getestet. Wie Abbildung 18 zeigt, wird EGFP in den B-Lymphozyten exprimiert.

Abbildung 18 Expression von pRc/CMV-EGFP in BL-60-2-Zellen. Fluoreszenzmikroskopie. Links:Hellfeld-Aufnahme. Rechts: Dunkelfeld-Aufnahme. EGFP-produzierende Zellen emittieren grünes Licht.

Zum Transfer von Plasmid-DNA in BL60-2-Lymphozyten wurden die Zellen in DNA-haltigem Medium elektroporiert. Zur Optimierung der in der Literatur für B-Lymphozyten zitierten Transfektionsbedingungen für die eingesetzten BL-60-Zellen wurden unterschiedliche Parameter variiert (Temperatur, Zellzahl, DNA-Konzentration oder Medium). Die Vitalität der Zellen wurde mikroskopisch nach Färbung mit Trypanblau gemessen, die Transfektionsrate durch FACS-Analyse quantifiziert. Vor allem die Änderung der eingesetzten Plasmid-Menge führte zu einer Zunahme der Transfektionseffizienz. Neben der Transfektionsrate erhöhte sich dabei jedoch auch der Anteil toter Zellen, so dass die absolute Anzahl transfizierter Zellen nach einem Maximum wieder abfällt. Aus diesem Grund wurden die geschädigten Zellen bzw. Zelltrümmer 24 Stunden nach der Transfektion durch FICOLL-Dichtegradienten-Zentrifugation abgetrennt. Der Anteil vitaler, EGFP-produzierender Zellen lag für das Plasmid pRc/CMV-EGFP nach Aufreinigung bei ca. 40%. Die Abhängigkeit der Transfektionrate von der eingesetzten DNA-Menge zeigt Abbildung 19.


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Abbildung 19 Expression von EGFP in BL60-2-Zellen. Die Zellen wurden mit dem Plasmid pRc/CMV-EGFP mittels Elektroporation transfiziert und über FICOLL-Dichtegradenten-Zentrifugation aufgereinigt. Links: Die Messung der EGFP-Expression erfolgt durch FACS-Analyse. A) Untersuchte Zellpopulation. B) Kontrolle: Elektroporierte Zellen ohne DNA im Transfektionsansatz. C) pRc/CMV-EGFP, 1µg. D) pRc/CMV-EGFP, 40µg. Rechts: Abhängigkeit der Transfektionsrate von der eingesetzten Plasmid-Menge.

Nach der Transfektion wurden die aufgereinigten Zellen weiter kultiviert und auf Vitalität und Wachstum sowie auf die Expression von EGFP untersucht. Dabei zeigte sich kein Unterschied in der Wachstumsgeschwindigkeit im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen und keine erhöhte Zahl toter Zellen. Der Anteil EGFP-produzierender Zellen nahm innerhalb von 3 Tagen von 40% auf weniger als 5% ab und war eine Woche nach Transfektion nicht mehr zu bestimmen. Die Verwendung des Vektors pRc/CMV zeigte in Verbindung mit der Transfektion durch Elektroporation und der anschliessenden Aufreinigung eine ausreichende hohe Expression in BL60-Zellen. Da die Dauer der Expression nicht anhielt, wurde ein Vektor-Konstrukt hergestellt, das aus dem episomal-stabilen Vektor pREP9 und EGFP-cDNA (aus pRc/CMV-EGFP) besteht (Abb. 20).

Abbildung 20 pREP9-EGFP-Konstrukt. Kontrollrestriktion.1-4: pREP9-EGFP, 5 EGFP-Insert, 6 pREP9


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Das pREP9-EGFP-Konstrukt wurde in unterschiedlicher Konzentration in BL60-2 Zellen transfiziert. Nach 24 Stunden Kultivierung und anschliessender Ficoll-Aufreinigung wurde die Expression von EGFP gemessen. Auch mit diesem Vektor konnte in Abhängigkeit von der eingesetzten Plasmid-Menge eine hohe Expressionsrate (maximal um 50%) bei unveränderter Wachstumsgeschwindigkeit und Vitalität erreicht werden (Abbildung 21). Die Expression von EGFP blieb über 14 Tage annähernd konstant und nahm danach leicht ab.

Abbildung 21 Expression von pREP9-EGFP in BL60-2-Zellen. A) Untersuchte Zellpopulation. B) Kontrolle: 10 µg pREP9 ohne Insert. C) 10µg pREP9-EGFP. D) 60µg pREP9-EGFP.

Ausgehend von diesen Experimenten wurde das im Abschnitt „Methoden“ aufgeführte Elektroporationsprotokoll für weitere Transfektionen von BL60-2-Zellen mit Vektorkonstrukten auf der Basis des Vektors pREP9 eingesetzt.

3.2.2 Aufreinigung transfizierter Zellen

Eine weitere Erhöhung des Anteils transfizierter B-Zellen ist durch Selektion der Transfektanten zu erreichen. Die Identifikation transfizierter Zellen kann prinzipiell über die Expression von Protein-Markern erfolgen, die im transfizierten Plasmid oder in einem zweiten, cotransfizierten Plasmid kodiert sind (Antibiotika-Resistenz-Proteine, Enzyme, Oberflächenmarker, Fluoreszenz-Proteine). Teilweise können die Proteine auch für die Selektion der Transfektanten benutzt werden. Zur Anreicherung von pREP9-transfizierten B-Zellen sollten folgende Methoden auf ihre Effizienz überprüft werden:

.1 Selektion über Resistenzmarker:

G418-Sulfat (Neomycin/Geneticin-Analogon) ist ein Aminoglykosid, das mit der 80S-Untereinheit eukaryotischer Zellen interagiert und dadurch die Proteinsynthese hemmt. Für eine Resistenz gegenüber G418 codiert das Gen tn5, das im Vektor pREP9 vorhanden ist. Zunächst wurde die G418-Empfindlichkeit der BL60-2-Linie getestet und G418 dem Kulturmedium bis zu einer Konzentration von 2 mg/ml zugesetzt (Abbildung 22). Die Zellen wurden jeweils nach 3 Tagen umgesetzt, mit G418-haltigem Medium versorgt und im gleichen Ausmass verdünnt. Wurden die Zellen mit G418 in einer Konzentration > 1mg/ml kultiviert, dann fand sich nach 15 Tagen eine relative Reduktion der Zellzahl um 95% im Vergleich zur Kontrollpopulation (ohne G418).

Abbildung 22 G418-Sensitivität von BL60-2-Zellen. Angegeben sind die Zellzahlen von Populationen mit G418-Zusatz im Vergleich mit der Kontrollpopulation ohne G418 im Medium.

Als Selektionskonzentration wurde in der Folge 1mg G418/ml eingesetzt, da eine komplette Selektion durch ein höhere Konzentration nicht wesentlich früher einsetzt und eine hohe Konzentration auch das Wachstum resistenter Zellen vermindert. BL60-2-Zellen wurden wie beschrieben mit pREP9-EGFP transfiziert und in G418-haltigem Medium kultiviert. 10 Tage nach der Transfektion stieg der Anteil EGFP-produzierender Zellen von ca. 50% auf 60% (Abb. 23). Der weitere Selektionsverlauf wurde nicht ausgewertet, da mit dem Expressionssystem vor allem apoptotische Prozesse untersucht werden sollen und diese in B-Zellen nach maximal 48 Stunden beendet sind.


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Abbildung 23 G418-Selektion von BL60-2-Zellen nach Transfektion mit pREP9-EGFP. FACS-Analyse der EGFP-Expression nach 3, 5 und 10 Tagen. Bei einem Selektionsdruck von 1 mg G418/ml kommt es zu einer Erhöhung des Anteils EGFP-positiver Zellen, ohne Selektionsdruck bleibt dieser Anteil konstant.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch G418-Inkubation transfizierte Zellen selektioniert werden können, eine Anwendung bei den zu untersuchenden Prozessen jedoch aufgrund der Selektionsdauer nicht sinnvoll ist.

.2 Magnetische Separation über das Oberflächenantigen ΔCD4

Eine weitere Möglichkeit zur Anreicherung von Transfektanten ist die Selektion über spezifisch in den transfizierten Zellen exprimierte Oberflächenantigene. CD4 ist ein Molekül, das an der Oberfläche von T-Helfer-Zellen exprimiert wird und für die Interaktion mit MHCII-exprimierenden Zellen und die anschliessende Transduktion eines Interaktionssignals in das Innere der T-Zelle verantwortlich ist. Da CD4 nicht in B-Zellen exprimiert wird, kann es nach Transfektion in B-Zellen als Selektionsmarker benutzt werden. Eine trunkierte Form des CD4-Moleküls (ΔCD4) ohne zytoplas-matischen, signaltransduzierenden Anteil ist in dem Vektor pMACS4 (Miltenyi Biotec) kodiert. ΔCD4-exprimierende Transfektanten können über magnetische Aufreinigung von nicht-transfizierten Zellen abgetrennt werden. Nach Transfektion von pMACS4 in BL60-2-Zellen wurde das ΔCD4-Protein auf der Zelloberfläche exprimiert, wie durch FACS-Analyse unter Verwendung von anti-CD4-AK nachgewiesen werden konnte (Abbildung 24).


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Abbildung 24 Links: CD4-Expression in Lymphozyten: A, B: Positiv-Kontrolle: Periphere Blut-Lymphozyten (PBL). C, D: Negativ-Kontrolle: BL60-2-Zellen. Rechts: Expression von ΔCD4 in BL60-2-Zellen nach Transfektion des pMACS4-Vektors. FACS-Analyse. A: untersuchte Zellpopulation. B, C,D: BL60-2-Zellen transfiziert mit pMACS4-DNA (10, 20, 30 µg Plasmid-DNA).

Insgesamt ist die Transfektionseffizienz bzw. Expression von pMACS4-kodiertem ΔCD4 in den BL60-Zellen geringer als die Expression von EGFP nach Transfektion von pREP9-EGFP. Bei gleicher DNA-Menge hätte, zumindestens theoretisch, aufgrund der geringeren Plasmidgrösse eine höhere Expression von ΔCD4 im Vergleich zu EGFP erfolgen müssen, ein genauer Vergleich ist jedoch aufgrund der unterschiedlichen Vektoren und Proteine nicht möglich.

Um die Expression des trunkierten CD4-Moleküls zu erhöhen, wurde die ΔCD4-cDNA in den Vektor pREP9 kloniert und das Plasmid wie beschrieben in B-Zellen transfiziert. Anschliessend wurde die Expression des ΔCD4-Proteins durch FACS-Analyse gemessen. Auch auf Basis des transfizierten pREP9-ΔCD-Konstrukts synthetisierten die Zellen das ΔCD4-Molekül (Abb. 25).


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Abbildung 25 Expression von ΔCD4 in BL60-2-Zellen nach Transfektion des Vektors pREP9-ΔCD4. Oben: Periphere Blutlymphozyten. A: Zellpopulation. B: ohne Inkubation mit anti-CD4. C: nach Inkubation mit anti-CD4. Unten: BL60-2-Zellen. D: Transfizierte Zellpopulation. E: Transfizierte Zellen ohne Inkubation mit anti-CD4. F: Transfizierte BL60-2-Zellen nach Inkubation mit anti-CD4.

Zunächst wurde zur Selektion der ΔCD4-exprimierenden Zellen das MACSelect-System benutzt. Hierbei werden mit anti-CD4-Antikörpern gekoppelte Partikel mit den ΔCD4-exprimierenden Zellen inkubiert und die entstehenden Konjugate von den restlichen Zellen abgetrennt. Die Zellen wurden jedoch während der Aufreinigungsprozedur stark geschädigt, so dass die Ausbeute intakter, ΔCD4-positiver Zellen nach der Selektion gering blieb. Da dies auch nach Abänderung des Protokolls (Einsatz modifizierter Puffer, Abtrennung der magnetischen Partikel nach der Aufreinigung) nicht verbessert werden konnte, wurde dieses System verlassen. Als Alternative wurde das ebenfalls auf Metallpartikeln basierende DYNAL-System eingesetzt, bei dem keinerlei Effekte auf Wachstum und Vitalität beobachtet wurden. Das DYNAL-System bietet zudem den Vorteil, dass nach der Selektion die Konjugate durch Inkubation mit einem weiteren Antikörper wieder aufgetrennt werden können. Dadurch stehen die aufgereinigten Zellen für eine sofortige FACS-Analyse zur Verfügung. Abbildung 26 zeigt das Ergebnis einer Selektionsrunde.


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Abbildung 26 DYNAL-Aufreinigung pREP9-ΔCD4-transfizierter Zellen. FACS-Analyse der ΔCD4-Expression nach Inkubation mit anti-CD4-AK. A: pREP9-Transfektanten. B: pREP9-ΔCD4 Transfektanten vor der Aufreinigung. C: pREP9-ΔCD4-Transfektanten nach Aufreinigung.

Im Durchschnitt liegt der Anteil ΔCD4-positiver, vitaler Zellen 24 Stunden nach DYNAL-Selektion bei 90%. Eine Erhöhung durch weitere Selektionsrunden ist denkbar, wurde aber wiederum aufgrund des damit verbundenen erhöhten Zeitaufwandes für die gesamte Selektion nicht weiter verfolgt. Unter optimalen Bedingungen ist bei der Cotransfektion von zwei Plasmiden die Wahrscheinlichkeit, dass eine Zelle beide Plasmide erhält, sehr hoch. Um den Anteil der Zellen zu ermitteln, die ein zu untersuchendes zweites Protein nach Selektion exprimieren, wurden BL60-Zellen mit pREP9-EGFP und pREP9-ΔCD4 cotransfiziert. Nach magnetischer Aufreinigung der ΔCD4-positiven Transfektanten wurde die Expression von EGFP in diesen Zellen gemessen. Dabei lag der Anteil EGFP-produzierender Transfektanten zwischen 80 und 85% (Abbildung 27).

Abbildung 27 Expression von EGFP in BL60-2-Zellen nach Cotransfektion von pREP9-EGFP und pREP9-ΔCD4. FACS-Analyse der EGFP-Expression. A: Kontrolle: Cotransfizierte Zellen (pREP9-ΔCD4, pREP9). B: Cotransfizierte Zellen (pREP9-ΔCD4, pREP9-GFP) vor Selektion. C: Cotransfizierte Zellen (pREP9-ΔCD4, pREP9-GFP) nach Selektion, ΔCD4-positive Fraktion.

Durch die magnetische Aufreinigung lässt sich also der Anteil von Zellen mit dem letztlich interessierenden, kotransfizierten Protein von 45% (vor der Selektion) auf ca. 80% steigern.


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Damit steht ein Expressions-und Selektionssystem für BL60-Zellen mit folgenden Eigenschaften zur Verfügung:


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06.08.2004