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4  Diskussion

Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Untersuchung der anti-IgM-induzierten Apoptose in B-Zellen und die Identifikation differentiell exprimierter Gene. Durch Anwendung der Differential Display RT-PCR erfolgte der Nachweis von Genen, die in anti-IgM-stimulierten und nichtstimulierten Zellen unterschiedlich stark exprimiert werden. Die differentielle Expression dieser Gene in B-Zellen wurde durch nachfolgende Northern-Blot-Analysen überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass das LAPTM5-Gen im Verlauf der B-Zell- Apoptose verstärkt exprimiert wird. Anschliessend wurde LAPTM5 hinsichtlich seiner subzellulären Lokalisation in BL-60-Zellen sowie der Expression in humanen Geweben untersucht.

Ein zweiter Schwerpunkt der Arbeit war die Etablierung eines System für die episomal-stabile Expression von Genen in B-Zellen. Unter Verwendung des Vektors pREP9 sowie durch magnetische Aufreinigung von transfizierten Zellen über das Oberflächen-Antigen ΔCD4 wurde ein effizientes Expressions- und Selektionssystem entwickelt. Es erlaubt eine über 10 Tage anhaltende, gleichmässig hohe Expression von Genen sowie die Selektion einer Zellpopulation, die zu ca. 80% das transfizierte Gen produziert. Die hohe Transfektionseffizienz sowie das Selektionsverfahren ermöglichen die Anreicherung von Zellen innerhalb kurzer Zeit und ohne die potentiell zytotoxische Anwendung von Antibiotika. Die Ergebnisse dieser Experimente sowie die unterschied-lichen Methoden, die zur Identifikation differentiell exprimierter Gene und zur Gen-Expression in B-Zellen eingesetzt werden können, werden im folgenden diskutiert.

In den letzten Jahren wurde die Bedeutung der physiologischen Form des Zelltodes für den Gesamtorganismus verstärkt erkannt und die Untersuchung dieses ubiquitären, evolutionär konservierten Prozesses intensiviert. Neben verschiedenen Induktoren von Apoptose konnten mehrere Transduktionswege für apoptotische Signal charakterisiert werden. Dazu zählen das FAS-Ligand/FAS-Rezeptor-System, das mit diesem verwandte TNF/TNF-Rezeptor-System sowie, spezifisch für B-Zellen, der IgM-Komplex. Im Vergleich mit anderen Apoptose-induzierenden Systemen lagen für die IgM-vermittelte Apoptose relativ wenig Daten vor, so dass ein umfassendes Verständnis dieses komplexen Prozesses fehlte. Eine wesentliche Frage war, inwieweit eine de novo Synthese von Proteinen erfolgt und ob diese Proteine für die Ausführung des apoptotischen Programmes notwendig sind oder ob die Neusynthese eine unspezifische Reaktion auf einen biologischen Stress darstellt. Aufgrund der Bedeutung [Seite 76↓]der B-Zell-Apoptose im Rahmen der Entwicklung und Homöostase eines funktionellen Immunsystems sowie der Folgen einer Fehlregulation, die Grundlage lympho-proliferativer oder Autoimmunerkrankungen sein können, ist die genaue Kenntnis apoptotischer Pozesse notwendig. Die Identifizierung involvierter Gene bzw. Proteine kann einen wesentlichen Beitrag dazu liefern und Ausgangspunkt für die Entwicklung von geeigneten Therapiekonzepten sein.

4.1 Identifizierung Apoptose-assoziierter Gene in BL60-Zellen

Zur Identifikation von Genen, deren Expression während der IgM-vermittelten Apoptose von B-Zellen verändert ist, wurde ein Subklon der Burkitt-Lymphom-Linie BL60 benutzt (BL60-2). BL60-2 Zellen zeigen nach 24-stündiger Inkubation mit anti-IgM zu 50% - 70% einen apoptotischen Phänotyp (fragmentierte Kerne, Phosphatidylserin auf der Zelloberfläche).
Der Vergleich der Genexpression apoptischer Zellen und nichtapoptotischer Zellen erfolgte durch die Differential-Display-RT-PCR-Technik: RNA beider Populationen wurde in cDNA transkribiert und mit spezifischen Primer-Paaren amplifiziert. Nach Auftrennung der PCR-Produkte zeigt die Intensität der Banden korrespondierender Primerpaare die konstante bzw. differentielle Expression des entsprechenden Genes an. 38 PCR-Amplifikate wurde als eindeutig differentiell eingestuft und mit den entsprechenden Primer-Paaren reamplifiziert. Da die Amplifikate bei gleicher Länge unterschiedliche Sequenzen besitzen können und jedes dieser Fragmente für das differentielle Bandenmuster verantwortlich sein kann, wurden diese kloniert und verdaut. Pro Amplifikationsansatz lagen nach Kontrollverdau 1-5 Fragmentmuster vor. Anhand von Sequenzanalysen der klonierten Fragmente wurde eine Auswahl für die notwendige Bestätigung der differentiellen Expression mit Northern-Blot-Analyse getroffen. Es erfolgte die Bildung von Fragment-Gruppen mit Hilfe der bisherigen Kenntnisse über die jeweilige Sequenz, um die Northern-Blot-Verfahren möglichst effektiv einsetzen zu können.

Bei den untersuchten 58 Sequenzen handelt es sich um 17 bekannte Gensequenzen bei teilweiser Redundanz (29%), 4 EST-Sequenzen (7%), 11 chromosomale Sequenzen (19%), 6 mitochondriale oder ribosomale RNA-Sequenzen(10%) sowie um 20 Sequenzen ohne bekannte Homologien (35%). Primär wurden Sequenzen bekannter Gene sowie EST-Sequenzen weiter untersucht, weil bei diesen die [Seite 77↓]Expression des entsprechenden Proteins bereits gesichert ist.

Da die RT-PCR, u.a. aufgrund der exponentiellen Amplifikation der cDNA, eine grosse Anzahl falsch positiver Ergebnisse liefert, ist eine Bestätigung der differentiellen Expression nötig. Die Northern Analyse mit RNA aus apoptotischen und nichtapoptotischen Zellen konnte für die zu Beginn untersuchten Fragmente (Humanes CSF-1-Rezeptor-Gen, EST 190584, EST vu.28h09.r1, EST 187298 und Humanes differenzierungsabhängiges Protein A4) eine differentielle Expression in apoptotischen Zellen nicht bestätigen. Die Hybridisierung der entsprechenden Sonden erfolgte entweder konstant oder gar nicht. Mögliche Ursache für eine fehlende Hybridisierung ist die geringere Sensitivität der Northern-Hybridisierung im Gegensatz zur DD RT-PCR. Die Detektion von RNA-Sequenzen, die in geringer Zahl pro Zelle vorliegen und durch DD RT-PCR vervielfältigt werden können, gelingt mit Northern Analysen meist nicht. Eine Alternative hierzu ist die Verwendung von poly-A+-RNA für die Blots oder der Einsatz anderer Hybridisierungsmethoden (nuclear run on: Hybridisierung von geblotteter DNA mit poly-A-RNA der Vergleichspopulationen). Diese erfassen jedoch trotz höherer Sensitivität ebenfalls nicht alle Transkripte.

Die differentielle Expression des Klons 0503HD, dessen Sequenz im untersuchten Bereich eine nahezu vollständige Homologie (99%) zum Protein LAPTM5 aufwies, konnte bestätigt werden. Die Expression von LAPTM5 (lysosomal-associated protein, 5 transmembranes) in BL60-2 Zellen nimmt 2 Stunden nach Inkubation mit anti-IgM zu und bleibt anschliessend nahezu konstant. Auch auf Proteinebene erfolgt 2 Stunden nach Induktion von Apoptose eine verstärkte Expression von LAPTM5, wie die Western-Analysen mit einem gegen den C-Terminus des Proteins gerichteten Antikörper zeigten.


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4.2  LAPTM5: Struktur und Expressionsmuster

4.2.1 Struktur des LAPTM5-Gens und potentielle Struktureigenschaften von LAPTM5

Das evolutionär konservierte LAPTM5-Gen wurde auf Chromosom 1 lokalisiert (1p34), eine Beteiligung dieses Genabschnitts an genetisch bedingten Erkrankungen ist nicht bekannt (Adra et al.,1996). Das RNA-Transkript besitzt eine Grösse von ca. 2,2 kbp und wurde in hämatopoetischem Gewebe sowie in geringen Mengen in Plazenta, Leber und Nieren nachgewiesen. Für das LAPTM5-Protein wurde ein Molekulargewicht von 29 kDa angegeben. Das LAPTM5-Transkript wurde in der entsprechenden Grösse (2,2 kbp) auch in den untersuchten BL60-2-Zellen gefunden. Daneben wurden weitere Transkripte geringer Grösse detektiert, insbesondere in Herz- und Skelettmuskelgewebe (1.3-1.7 kbp). Für lamp-2 und andere lysosomale Membranproteine wurden RNA-Splice-Varianten beschrieben, die gewebsspezifisch exprimiert werden und wahrscheinlich unterschiedliche biologische Funktionen besitzen (Konecki et al.,1995; Cuervo et al.,2000). Unklar ist, ob dies auf die unterschiedlichen LAPTM5-Transkripte zutrifft.

Die Grösse des LAPTM5-Proteins lag in der Immunpräzipitation sowie in Western-Analysen jeweils bei 27 kDa. Ob die Differenz zur angegeben Grösse auf unterschiedlichen Reaktionsbedingungen oder auf zellspezifischen Modifikationen des Proteins beruht, ist unklar.

Das LAPTM5-Gen (cDNA) hat eine Länge von 2232 Nukleotiden, die codierende Sequenz (786bp = 262 Aminosäuren) beginnt nach einem untranslatierten Bereich (76 Nukleotide) und wird in 3‘-Richtung gefolgt von einer relativ grossen, nichttranslatierten Region (1371 Nukleotide). Potentielle strukturelle Eigenschaften sind 5 hydrophobe Bereiche, 6 Phosphorylierungsstellen sowie eine Prolin-reiche Region im C-terminalen Abschnitt. Für Proteine mit Prolin-reichen Regionen wurden Interaktionen mit SH3-haltigen Proteinen sowie eine Funktion als Ionenkanal beschrieben (Ren et al.,1993; Rotin et al.,1994).


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4.2.2  Gewebespezifische Expression von LAPTM5

Die gewebespezifische Expression von LAPTM5 konnte im Northern Blot bestätigt werden. Neben der Expression in hämatopoetischen bzw. lymphatischen Geweben (Milz, Lymphknoten, Thymus, Appendix, Knochenmark) zeigte sich eine besonders starke Expression in quergestreifter Muskulatur und Herzmuskulatur. Daneben wird LAPTM5 auch in anderen Geweben exprimiert, jedoch in wesentlich geringeren Mengen. Die Diskrepanz zu den Vorarbeiten, in denen keine extralymphatische Expression festgestellt wurde, ist erklärbar durch die Verwendung einer RNA-Sonde, die im Gegensatz zu DNA-Sonden stärker mit RNA hybridisiert und damit sensitiver ist. Die Beobachtung höherer RNA-Level in fetaler Leber als in adulter Leber unterstützt die Annahme, das LAPTM5 während der Embryogenese in einer wesentlich grösseren Anzahl von Geweben exprimiert wird. Ein Hinweis auf eine Rolle während der Entwicklung von B-Zellen ist die Beobachtung, dass LAPTM5 in unreifen B-Zellen (SP2-Linie) stärker exprimiert wird als in höher differenzierten B-Zellen (MPC-11-Linie) (Adra et al.,1996).

4.2.3 Transkriptionelle Regulation von LAPTM5

In einer Arbeit von Scott wurde gezeigt, dass die Expression von LAPTM5 während der Differenzierung von myeloischen Zellen durch Retinolsäure (RA, über den intrazellulären Retinolsäure-Rezeptor RARα) beeinflusst wird ( Scott et al., 1996, dort als E3 bezeichnet). LAPTM5 kann im Kontext der Myelozyten-Differenzierung als immediate-early-Gen bezeichnet werden: 15 Minuten nach Inkubation von MPRO-Zellen mit RA steigt die Transkriptionsrate, besitzt nach ca. einer Stunde ein Maximum und bleibt über 4 Stunden konstant, um dann langsam abzufallen. Early response-Gene, deren Expression innerhalb von 30 Minuten nach Induktion ansteigt, codieren häufig für Transkriptionsfaktoren. Neben der Induktion von Transkriptionsfaktoren kann jedoch auch die transkriptionelle Regulation von Membranproteinen innerhalb kurzer Zeit erfolgen (gas-3 und mtf). Retinolsäure ist als Vitamin-A-Metabolit in eine Vielzahl biologischer Prozesse involviert. Dazu gehören Embryogenese, zelluläre Homöostase, Differenzierung von Geweben und Tumorsuppresion. Die Vermittlung von RA-Effekten erfolgt über intrazelluläre Rezeptoren (RAR, RXR), die zur Familie der Steroid-Rezeptoren gehören und sich in ihrer Affinität zu verschieden Formen von Retinolsäure-Isomeren unterscheiden. Die Wirkung dieser Rezeptoren wird über spezifische DNA-[Seite 80↓]Sequenzen vermittelt (Retinoic Acid Receptor Response Elements, RARE), zu finden u.a. in Genen wie CRBP1/2 (Cellular retinol binding proteine) und Hoxa1/2 (Homöobox-Proteine).

Als RA-Rezeptor-bindende Elemente (RARE) wurden in der 5‘-Region des LAPTM5-Gens (Maus) zwei benachbarte Sequenzbereiche ca. 580 bp in 5‘-Richtung ab ATG-Codon identifiziert. Die TATA-Box (Transkriptionsstart) liegt 210 bp upstream der ATG-Start-Sequenz. Potentielle Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und regulative Elemente (E2A, TCFα, AP2, IRF1, IRF2, GATA, PEBP2, NFκB und SRF1) sind innerhalb von -1000bp vorhanden. Da die Induktion von Apoptose in BL60-Zellen über den IgM-Transduktionsweg erfolgte, ist eine Beteiligung von Retinolsäure bzw. RA-Rezeptor an diesem Prozess unwahrscheinlich. Eine erhöhte Expression von LAPTM5 nach Inkubation von BL60-2 mit RA konnte für die eingesetzten RA-Konzentrationen nicht nachgewiesen (Ergebnisse nicht gezeigt). Möglicherweise sind jedoch die anderen Faktoren, für die potentielle Bindungsstellen im LAPTM5-Promotor existieren, für die erhöhte LAPTM5-Expression verantwortlich.

Der Transkriptionsfaktor NFκB wirkt bei verschiedenen apoptotischen Stimuli protektiv (TNFα, Wachstumsfaktorentzug, Chemotherapeutika), indem die verstärkte Expression antiapoptotischer Gene induziert wird. Für NFκB wurde bereits eine Rolle im Rahmen der IgM-induzierten Apoptose diskutiert (Scott,1995). Hypothetisch ist eine NFκB-vermittelte Regulation von LAPTM5. Ein nächster Schritt ist daher die Analyse der Promotorsequenz von LAPTM5, z.B. in Reporterassays, oder die Expression von LAPTM5 in NFκB-Transfektanten.

Während des Programmierten Zelltodes in B-Zellen erfolgt eine veränderte Expression verschiedener Gene, u.a. des Transkriptionsfaktors c-myc. Der Einfluss von c-myc auf Zellzyklus und Apoptose ist abhängig von Zelltyp und Differenzierungsstadium. In BL60-Zellen wird die Expression von c-myc nach Inkubation mit anti-IgM stark reduziert (A. Rickers, Promotion). Die alleinige verminderte Expression scheint jedoch nicht ausreichend für die Auslösung von Apoptose zu sein (McCormack et al.,1984). Für die IgM-vermittelte Apoptose konnte jedoch gezeigt werden, dass neben der Modifikation und Interaktion vorhandener Proteine auch die Neusynthese von Proteinen notwendig ist: Die Inkubation von BL60-Zellen mit Cyclohexamid hemmt die Ausbildung des apoptotischen Phänotyps nach Induktion mit anti-IgM.

Inwieweit die verstärkte Expression von LAPTM5 im Rahmen der Apoptose essentiell [Seite 81↓]für den Ablauf dieses Prozesses ist oder ob es sich um eine unspezifische Reaktion auf den induzierten zellulären Stress handelt, ist unklar. Ein Ansatz zur Klärung dieser Frage ist die Überexpression von LAPTM5 in BL60-Zellen. Hierfür wurde ein LAPTM5-Konstrukt hergestellt sowie ein Expressionssystem etabliert. In weiteren Experimenten soll damit der Einfluss einer erhöhten LAPTM5-Konzentration auf B-Zellen und hier vor allem auf die Apoptose-Rate und die Proliferation der Zellen untersucht werden.

4.3 LAPTM5 – Subzelluläre Lokalisation

Kolokalisationsanalysen sowie die Untersuchungen von subzellulären Fraktionen hatten ergeben, dass LAPTM5 mit Lysosomen assoziiert ist. Zusammen mit den aufgrund der hydrophoben Bereiche angenommenen 5 Transmembran-Domänen führte dies zur Namensgebung (Lysosomal associated protein, transmembrane-5).

Das LAPTM5-Protein wurde durch Immunfluoreszenz auch in BL60-Zellen nachge-wiesen. Dabei zeigten sich punktförmige Bereiche erhöhter Fluoreszenzintensität, die zusammen mit den bekannten Daten sowie den Ergebnissen der elektronen-mikroskopischen Untersuchungen als Konzentration des Proteins in Lysosomen bzw. endosomalen Kompartimenten zu werten sind. Nach Auslösung von Apoptose ist keine generelle Zunahme der Fluoreszenz und damit der LAPTM5-Expression zu beobachten. Ob die festgestellte Erhöhung der Fluoreszenzintensität nach Apoptose-Induktion in den lysosomalen Bereichen von biologischer Bedeutung ist, muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden.

Eine in der äusseren Zellmembran verstärkte Fluoreszenz liess auf eine Lokalisation des Proteins auch in der Plasmamembran schliessen. In daraufhin durchgeführten FACS-Analysen konnte diese Annahme bestätigt und eine Expression von LAPTM5 auf der Zelloberfläche gezeigt werden. Die Expressionsdichte von LAPTM5 in der Plasmamembran der BL60-Zellen ist gering und bleibt nach IgM-vermittelter Apoptose im untersuchten Zeitraum konstant. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob es sich bei den vom Antikörper erkannten Strukturen der Zelloberfläche um LAPTM5 oder andere Moleküle mit vergleichbarem Epitop handelt. Der Nachweis von LAPTM5 gibt einen Hinweis auf die Orientierung zumindestens des C-Terminus des Proteins, gegen den der Antikörper gerichtet ist und der demzufolge extrazellulär liegt.


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Zur weiteren Differenzierung der subzellulären Lokalisation von LAPTM5 wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen von BL60-Zellen nach Immunogold-Färbung hergestellt (Dr. Vogel, MDC Berlin). LAPTM5 befindet sich im endosomal-lysosomalen Kompartiment sowie in geringen Mengen auch in der Zellmembran der B-Zellen. Die Systematik endozytotischer Kompartimente in B-Zellen nach Kleijmer unterscheidet 6 Subtypen (Kleijmer [ et al. ] ,1997; Tabelle 4). LAPTM5 liegt vorwiegend in multivesikulären, späten Endosomen (Typ 4) sowie in multivesikulären und laminären Lysosomen vor (Typ 5). Ausgehend von den Ergebnissen der FACS-Analyse und der Elektronenmikroskopie liegt der C-Terminus des Membranproteins in der Plasmamembran extrazellulär und in der lysosomalen Membran luminal (Abb. 28).

Abbildung 28 Modell für die Orientierung des C-Terminus von LAPTM5.Das C-terminale Ende des Proteins ist in der Plasmamembran nach extrazellulär gerichtet. Nach Endocytose und Fusion der Endosomen mit primären Lysosomen liegt der C-Terminus luminal. In der Membran der intralysosomalen Vesikel (ILV) ist der C-Terminus zur lysosomalen Matrix hin orientiert.

Lysosomen sind reich an sauren Hydrolasen und verantwortlich für den Abbau von Makromolekülen. Diese können extrazellulären Ursprungs sein (Endozytose, Phagozytose) oder aus dem Zytoplasma stammen (Autophagie). Über die Funktion und Biochemie lysosomaler Membranproteine, die vor allem in späten Endosomen und in Lysosomen lokalisiert sind, ist relativ wenig bekannt. Sie werden aufgrund ihrer Proteinstruktur in 5 Familien unterteilt und ihr Molekulargewicht liegt zwischen 30 und [Seite 83↓]120 kDa. Die bekannten Proteine besitzen einen grossen intraluminalen Anteil, der stark glykosiliert ist.

Für lysosomale Membranproteine werden aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften sowie der Rolle der Lysosomen verschiedene Funktionen angenommen (Hunziker and Geuze,1996):

Durch Genmutationen bedingte Funktionsausfälle lysosomaler Membranproteine sind Ursache seltener, sehr heterogene Erkrankungen (Mancini et al.,2000).

LAPTM5 unterscheidet sich strukturell stark von den beschriebenen lysosomalen Membranproteinen und wurde bis jetzt noch nicht klassifiziert. Eine ausgeprägte Glykosylierung ist aufgrund der 5 Transmembran-Domänen sowie des geringen luminalen Anteils unwahrscheinlich. Die für die bekannten Proteine gefundenen lysosomalen Target –Sequenzen (Tyrosin-, Di-Leucin- und KCPL-Motif), notwendig für den Transport der Proteine zu den Lysosomen, sind nicht im C- oder N-terminalen Anteil von LAPTM5 vorhanden. Alternativ zu terminalen Target-Sequenzen können diese auch zwischen den Transmembran-Domänen lokalisiert sein (Blagoveshenskaya et al.,1998). Eine modifizierte Form des KCPL-Motifs (Cherqui et al.,2001) (KFPL) ist in einem der hydrophilen Bereiche von LAPTM5 vorhanden. Die Expression von LAPTM5 mit partiell veränderter Aminosäure-Sequenz könnte zur Identifikation des lysosomalen Target-Motifs beitragen.

Der Transport lysosomaler Membranproteine erfolgt über zwei unterschiedliche Transportwege. Beim sekretorischen Transport erfolgt nach Synthese im ER der Transport über das trans-Golgi-System zur Plasmamembran. Durch nachfolgende Endocytose und Fusion der frühen Endosomen gelangen die Membranproteine schliesslich zu späten Endosomen und Lysosomen. Für LAMP-1 wurde gezeigt, dass ein schneller Austausch zwischen Zellmembran- und endosomaler Fraktion existiert und ca. 4% der gesamten Proteinmenge konstant in der Zellmembran vorhanden ist [Seite 84↓](Mathews et al.,1992). Ein zweiter, direkter Weg verläuft über Clathrin-haltige Vesikel (Clathrin coated vesicals, CCV), die ebenfalls aus dem trans-Golgi-System stammen, jedoch direkt zu Lysosomen gelangen. Über diesen direkten Weg erfolgt der grössere Anteil des Transports lysosomaler Proteine.

LAPTM5 ist in geringem Ausmass ebenfalls auf der Oberfläche der untersuchten BL60-Zellen zu finden. Die nach Inkubation mit anti-IgM konstante Expression auf der Zelloberfläche ist möglicherweise auf einen direkten Transport der neusynthetisierten Proteine zu Lysosomen oder auf einen erhöhten Umsatz bei indirektem Transport via Plasmamembran zurückzuführen.Ob der Lokalisation des Proteins in der Plasmamembran eine funktionelle Bedeutung zukommt, ist unklar. Beobachtet wurde eine erhöhte Expression lysosomaler Transmembran-Proteine auf stark metastasierenden Tumorzellen sowie vermehrte Adhäsion dieser Zellen. Auf Antigen-präsentierenden Zellen ist eine verstärkte Expression im Zusammenhang mit der Exocytose von MHCII-Peptid-Komlexen vorhanden (Kannan et al.,1995; Kannan et al.,1996).

Es ergibt sich die Frage, ob dem lysosomen Kompartiment eine spezifische Funktion innerhalb des apoptotischen Programmes zukommt und worin diese bestehen kann. Freigesetzte lysosomale Enzyme können Apoptose auslösen, wahrscheinlich über die proteolytische Aktivierung von BID. Während des PCD bleiben Lysosomen jedoch intakt und behalten somit wahrscheinlich auch ihre Fähigkeit, Makromoleküle abzubauen.
Einem weitestgehend unspezifischen Abbau von Proteinen in Lysosomen wird eine selektive, rezeptorvermittelte Aufnahme von Proteinen gegenübergestellt (Cuervo et al.,1998). Das die selektive lysosomale Proteolyse eine physiologische Bedeutung für die Regulation cytosolischer Proteinkonzentrationen oder die Aktivität von Proteinen besitzt, konnte bisher nicht eindeutig nachgewiesen werden. Ebenfalls diskutiert wurde eine Ubiquitin-vermittelte Aufnahme von Proteinen in Lysosomen, in die LAPTM5 involviert sein soll (Adra et al.,1996). Aufschluss über die Funktion lysosomaler Membranproteine während des PCD können letztlich nur weitere Untersuchungen liefern ( z.B. Elektronenmikroskopie, Identifikation von Substraten/Liganden).


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4.4  Differential Display RT-PCR und alternative Methoden

Zur Identifikation von Genen, die in zu vergleichenden Zellpopulationen unterschiedlich stark exprimiert werden, stehen verschiedene molekularbiologische Methoden zur Verfügung. Häufig angewandt werden differentielle und subtraktive Hybridisierung, Differential-Display-Techniken sowie cDNA- bzw. Oligonukleotid-Arrays. Eine Charakterisierung von Unterschieden zwischen Zellarten auf Proteinebene kann mit proteinchemischen Methoden, z.B. zweidimensionaler Gelelektrophorese, erfolgen.1992 durch Liang und Pardee eingeführt, hat sich die DD RT-PCR als effiziente Methode zur Identifikation von differentiell exprimierten Genen erwiesen und zur Identifikation von mehr als einhundert spezifischen Genen geführt (Liang and Pardee, 1995; Matz and Lukyanov,1998). Die DD RT-PCR-Technik zeichnet sich aus durch

Grösstes Problem der Methode ist das Auftreten falsch positiver cDNA-Fragmente (50% und mehr), dementsprechend zeit- und kostenintensiv ist die Identifikation der richtig positiven Fragmente, wodurch der Vorteil des initial geringen Aufwandes relativiert wird. Das Ausgangsmaterial ist Gesamt-RNA der zu vergleichenden Populationen (BL60-2 ohne / nach Inkubation mit anti-IgM). Mögliche Fehlerquelle für spätere falsch positive cDNA‘s ist die Kontamination der RNA mit genomischer DNA, die durch Behandlung mit DNAse I vermieden werden kann.

Die reverse Transkription (RT) wurde mit unspezifischen oligo-dT-Primern durchgeführt, die Einführung spezifischer Primer erfolgte während der anschliessenden PCR. Vorteile einer der RT-Einzelreaktion mit unspezifischen Primern sind neben Zeit- und Kostenersparnis eine höhere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Nachteile scheinen die verminderte Repräsentation von gering exprimierten Genen sowie stärkere Hintergrundsignale in den Fingerprints zu sein.

Die Polymerase-Ketten-Reaktion wurde initial mit spezifischen 5‘-Primern (25 Nucleotide) und 3‘ Primern (30 Nukleotide) durchgeführt. Zur Reduktion falsch positiver Ergebnisse wurden jeweils zwei Amplifikationen pro Paar durchgeführt. Ausgehend vom exponentiellen Charakter der PCR wird deutlich, dass in diesem Teil der Methode die [Seite 86↓]grösste Fehlerquelle für falsch positive Ergebnisse liegt. Die PCR-Bedingungen sind entscheidend für den jeweiligen Fingerprint und dessen Reproduzierbarkeit. Die ersten 3 Zyklen der Reaktion wurden als low stringency PCR mit einer annealing-Temperatur von 40° durchgeführt, um möglichst alle Transkripte zu erfassen. Im Gegensatz zur Originalmethode wurde in den folgenden 25 Zyklen eine annealing-Temperatur von 60° benutzt, um die Spezifität zu erhöhen. Letztlich stellen die gewählten Bedingungen einen Kompromiss hinsichtlich Ausbeute und Spezifität dar.

Denaturierende Polyacrylamidgele wurden zur Auftrennung der [α-33P]-dATP markierten cDNA-Fragmente benutzt, das entstandene Bandenmuster wird als cDNA-Fingerprint bezeichnet. Es wurden parallel jeweils zwei Ansätze von BL60-2-Zellen ohne bzw. nach Inkubation mit anti-IgM aufgetragen und nach Autoradiographie miteinander verglichen. Differentielle Banden wurden aus dem Gel eluiert.

Northern blot-Analysen wurden nach Klonierung und Sequenzierung differentieller Banden als Bestätigungstests durchgeführt. Gründe für falsch positive cDNA’s, d.h. eine im Northern nicht zu bestätigende differentielle Expression, wurden in den vorangehenden Abschnitten diskutiert. Eine Möglichkeit zur effizienteren Bestätigung von differentieller Transkription stellen reverse Northern-Analysen dar. Dabei werden die DD RT-PCR-cDNA‘s auf zwei Filter geblottet und mit radioaktiv markierter cDNA, hergestellt aus mRNA der zu vergleichenden Populationen, inkubiert.
Alternative Methoden zur Identifikation von differentiellen Transkripten sind die Ende der siebziger Jahre eingeführten Techniken der differentiellen und der subtraktiven Hybridisierung (St. John and Davies,1979). Es handelt sich um qualitative Methoden, die relativ zeitaufwendig (mehrere Hybridisierungsrunden) und bezüglich der Ausbeute häufig nicht befriedigend sind. Eine Weiterentwicklung im Bereich der subtraktiven Methoden stellen PCR-basierte RDA (representational difference analysis)-Methoden dar (Lisitsyn et al.,1993).

Mit Abschluss des Human Genome Project stehen sämtliche menschliche Gensquenzen zur Verfügung. Im Mittelpunkt der Untersuchungen biologischer Systeme werden zukünftig neben einzelnen Genen vor allem die Expressionsmuster (mRNA, Proteine) von Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien oder unter unterschiedlichen Bedingungen stehen. In den vergangenen Jahren wurden Technologien entwickelt, die im weiteren Sinne zur Identifikation von differentiellen Transkripten beitragen können und mit deren Hilfe diese Suche weitaus effektiver als [Seite 87↓]bisher durchführbar ist: cDNA-Microarray-Hybridisierungen basieren wie Oligo-Nukleotid-Arrays auf der Immobilisierung von spezifischen DNA-Sequenzen auf Chips und erlauben die gleichzeitige Analyse mehrerer tausend Gene sowie eine kontinuierliche Verlaufsbeobachtung zellulärer Prozesse. Dazu werden cDNA’s bekannter Gene, Expressed Sequence Tags oder Oligonukleotide auf Glas-Chips gebunden, mit Floureszenz-markierter cDNA inkubiert und anschliessend mit CCD-Kamera analysiert (Schena et al.,1995; Schena et al.,1998). Es ist geplant, die Expression von Genen im Rahmen der IgM-vermittelten Apotose mit cDNA-Microarray-Hybridisierungen weiter zu untersuchen und hierfür die bereits isolierten Fragmente der Differential-Display-Analyse zu verwenden.

Die Charakterisierung des Proteoms einer Zelle, d.h. der zu einem definierten Zeitpunkt vorhandenen Proteine, erfolgt in grösserem Massstab vor allem durch Zweidimensionale (2D) Gel-Elektrophorese. Wie sich gezeigt hat, erfolgt die Weiterleitung apoptotischer Signale in wesentlichen Teilen durch Modifikationen von Proteinen, insbesondere von Caspasen und deren Substraten. Daher ist die 2D-Gel-Elektrophorese zur Untersuchung dieser Prozesse sehr gut geeignet. Mit Hilfe dieser Methode wurde durch Rickers et. al. eine Reihe von Proteinen identifiziert (u.a. D4-GDI, hnRNP A1, C1, C3 sowie SP1), die spezifisch im Rahmen des anti-IgM vermittelten Zelltodes in B-Zellen modifiziert werden (Rickers et al.,1998; Brockstedt et al.,1998).

DNA-Chip-Technologien und proteinchemischen Methoden besitzen ein grosses Potential bei der weiteren Aufklärung der IgM-induzierten Apoptose und anderer zellbiologischer Prozesse. Die Integration der gewonnenen Daten ermöglicht ein sehr viel genaueres Verständnis dieser Abläufe, als dies bisher möglich war. Daneben wird auch weiterhin die genaue biochemische Charakterisierung einzelner Proteine und die Analyse ihrer Interaktionen von Bedeutung sein.


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4.5  Episomal stabile Genexpression in B-Zellen

4.5.1 Elektroporation von B-Zellen und Expression von EGFP

Eine Zielstellung dieser Arbeit war die Etablierung eines Expressionssystems, das die Untersuchung von Kandidatengenen durch Überexpression in B-Zellen ermöglicht. Als effektive und gut reproduzierbare Methode für den Gentransfer in B-Zellen gilt die Elektroporation. Die Testung der dabei erreichten Transfektionseffizienz in BL60-Zellen erfolgte mit Hilfe eines EGFP-Konstruktes, die Expressionsrate wurde durch FACS-Analyse gemessen.

Zunächst erfolgte nach einem Standardprotokoll die Elektroporation der B-Zellen mit einem EGFP-Konstrukt auf Basis des Vektors pRc/CMV, der eine transiente Expression von EGFP ermöglicht. Zur Optimierung der Transfektionsraten wurden verschiedene Parameter variiert (Temperatur, Zellzahl, DNA-Konzentration, Medium). Insbesondere die Erhöhung der DNA-Konzentration führte zu einer Steigerung der Expressionsrate, die dem Anteil EGFP-produzierender Zellen an der Gesamtzahl vitaler Zellen entspricht und deren Maximum bei 45% lag. Beim Einsatz hoher DNA-Mengen (> 10µg) wurde neben der erhöhten Expressionsrate auch eine verstärkte Schädigung der elektroporierten Zellen beobachtet: die absolute Anzahl vitaler, EGFP-produzierender Zellen fällt somit nach einem Maximum wieder ab. Ursache ist wahrscheinlich der erhöhte Stromfluss, der zur Ausbildung grösserer Poren in der Zellmembran führt. Diese können sich nicht mehr vollständig schliessen, so dass die Zelle irreparabel geschädigt wird. Der Anteil EGFP-exprimierender Zellen ist Marker für den „Reinheitsgrad“ der transfizierten Zellpopulation, die Gesamtzahl der EGFP-produzierenden Zellen ist von Bedeutung für die nachfolgend benötigte Kultivierungsdauer. Die eingesetzte DNA-Konzentration stellt somit einen Kompromiss dar und ist von den anschliessend zu untersuchenden Prozessen abhängig. Neben der Expressionsrate wurden Dauer der EGFP-Expression sowie Wachstum und Vitalität der transfizierten Zellen untersucht. Der Anteil EGFP-exprimierender Zellen sank von initial 40% auf weniger als 5% nach 3 Tagen. Da das Wachstum der EGFP-transfizierten Zellen im Vergleich mit nicht-transfizierten Zellen konstant blieb, ist von einem Verlust des Plasmids im Verlauf mehrer Zellteilungen und nicht vom Absterben der transfizierten Zellen auszugehen.


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Die Expressionsrate von EGFP nach Elektroporation von pRc/CMV-EGFP in BL60-2 Zellen war mit 40% transfizierten Zellen ausreichend hoch. Da jedoch mit dem vorliegenden Konstrukt keine anhaltende Expression möglich war, wurde die EGFP-cDNA in den episomal stabilen Vektor pREP9 umkloniert. Nach Elektroporation der BL60-2 Zellen mit dem Vektor pREP9-EGFP (50 µg DNA) exprimierten ca. 50% der vitalen Zellen EGFP. Die Expessionsrate blieb über 14 Tage nahezu konstant und fiel danach leicht ab. Im Vergleich mit pREP9-Transfektanten konnten keine Unterschiede in Proliferationsgeschwindigkeit und Vitalität festgestellt werden.

Der verwendete Vektor pREP9 codiert u.a. für das EBNA1-Antigen und besitzt den Replikationsstart (oriP) des Epstein-Barr-Virus (EBV), so dass eine episomale Replikation des Vektors und damit eine relativ stabile Expression des Zielgens erfolgt. Ein Vorteil gegenüber retroviralen Vektoren ist neben dem geringeren labortechnischen Aufwand die fehlende Integration in das Genom der Zielzelle und der Ausschluss von Insertionsmutationen. Eine wesentliche Frage ist, ob EBNA-1 einen Einfluss auf die Proliferationsrate der zu transfizierenden BL60-Zellen besitzt. Im menschlichen Organismus wird EBNA-1 in ruhenden B-Zellen exprimiert. Für die Transformation bzw. Proliferation der Zellen sind weitere virale Proteine nötig, eine isolierte Wirkung von EBNA-1 auf die Zellproliferation ist sehr unwahrscheinlich. So wurde gezeigt, dass die Expression von EBNA-1 in EBV-negativen B-Zellen im Gegensatz zu anderen EBV-Proteinen keinen Einfluss auf die Expression von bcl-2 besitzt (Finke,1992).

4.5.2 Selektion transfizierter Zellen

Zur weiteren Erhöhung des Reinheitsgrades der transfizierten Zellpopulation wurden verschiedene Selektionsverfahren getestet. Die Anreicherung transfizierter Zellen erfolgte zunächst durch Inkubation mit G418 und Selektion über pREP9-codierte G418-Antibiotika-Resistenz. Dadurch konnte der Anteil EGFP-positiver Zellen in einem Zeitraum von 10 Tagen von 50% auf 60% gesteigert werden. Ein weiterer Anstieg ist nach längerer Inkubation mit G418 zu erwarten. Da jedoch die zu beobachtenden apoptotische Prozesse wesentlich früher abgeschlossen sind, ist eine Inkubationsdauer von mehr als 3 Tagen nicht sinnvoll. Aus diesem Grund wurde die Selektion pREP-9-transfizierter Zellen mit G418 nicht weiter verfolgt.


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Einen alternativen Ansatz stellt die Aufreinigung über ein cotransfiziertes Oberflächenantigen und anschliessende magnetische Separation dar. Das CD4-Antigen wird vorwiegend in T-Helfer-Zellen exprimiert, nicht jedoch in B-Zellen, es kann also als Selektionsmarker für transfizierte B-Zellen eingesetzt werden. Die cDNA eines trunkierten CD4-Moleküls (ΔCD4) ist in dem Vektor pMACS4 kodiert. Nach Transfektion von BL60-2 konnte die Expression von ΔCD4 auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Da jedoch auch bei Einsatz grösserer Mengen Vektor-DNA die Expressionrate unter 20% blieb und innerhalb von 3 Tagen stark abfiel, wurde die ΔCD4-cDNA in den Vektor pREP9 kloniert. Nach Elektroporation der BL60-2-Zellen mit pREP9-ΔCD4 exprimierten ca.60% der Zellen das ΔCD4-Molekül.

Zur magnetischen Separation der ΔCD4-positiven Zellen wurde zunächst das MACSelect-System eingesetzt. Während der Inkubation der pREP-ΔCD4-Transfektanten mit anti-CD4-gekoppelten, magnetischen Partikeln (anti-CD4-beads) und der anschliessenden Waschschritte wurden die Transfektanten jedoch stark geschädigt. Die Ausbeute vitaler, ΔCD4-positiver Zellen nach der Selektion blieb unbefriedigend. Am ehesten ist die Ursache hierfür in der Interaktion der Transfektanten mit den beads zu suchen: Transfektanten, die nicht mit den Partikeln inkubiert wurden, sonst jedoch nach Protokoll behandelt wurden, blieben vital. Da auch eine Änderung der Inkubationsbedingungen zu keiner wesentlich Besserung führte, wurde dieses System verlassen.

Ähnlich dem MACSelect-System beruht das Dynal-System auf Antikörper-gekoppelten, magnetischen Partikeln. Vorteil dieses Systems ist die Verfügbarkeit eines weiteren, löslichen Antikörpers, der gegen den Partikel-gebundenen CD4-Antikörper gerichtet ist und die Abtrennung der beads von den CD4-positiven Transfektanten erlaubt. Unter Verwendung anti-CD4-gekoppelter DYNAbeads konnte der Anteil ΔCD4-exprimierender Zellen nach Transfektion, magnetischer Separation und nachfolgender Trennung der ΔCD4-anti-CD4-Bindungen auf ca. 90% erhöht werden (FACS-Analyse nach 24 Stunden).

Zur Abschätzung der Expressionsrate eines kotransfizierten, zu analysierenden Proteins nach Selektion wurden BL60-2 Zellen mit den Konstrukten pREP9-ΔCD4 und pREP9-EGFP kotransfiziert und die ΔCD4-positiven Zellen magnetisch aufgereinigt. Die nachfolgende Analyse der EGFP-Expression der selektionierten Zellen zeigte, dass ca. 80% der Zellen das EGFP-Molekül produzieren. Durch Anwendung der magnetischen [Seite 91↓]Separation nach Kotransfektion konnte somit der Anteil der EGFP-produzierenden Zellen von ca. 50% auf ca. 80% erhöht werden. Für BL60-2-Zellen, die entweder mit pREP9-ΔCD4 oder mit pREP9-EGFP transfiziert wurden, konnte keine Abnahme der Wachstumsgeschwindigkeit beobachtet werden. Eine massive Behinderung der Proteinbiosynthese durch die codierten Proteine oder relevante Interaktionen mit weiteren zellulären Proteinen sind somit unwahrscheinlich, müssen jedoch bei der Beurteilung nachfolgender Experimente mit anderen Konstrukten auf Basis des pREP9-Vektors mit berücksichtigt werden.

Abschliessend erfolgt eine zusammenfassende Beschreibung der wichtigsten Charakteristika des Expressions- und Selektionssystems:

Teilschritte:

Cotransfektion von BL60-2-Zellen mit den Konstrukten pREP9-ΔCD4 und pREP-X (X entspricht dem zu analysierenden Protein) durch Elektroporation

Abtrennung toter Zellen durch FICOLL-Dichtegradienten-Zentrifugation

Magnetische Separation ΔCD4-positiver Transfektanten mit anschliessender Abtrennung der magnetischen Partikel von den ΔCD4-positiven Zellen

Eigenschaften:

Eine Weiterentwicklung des beschriebenen Expressionssystems insbesondere hinsichtlich einer kontrollierten Genexpression ist denkbar. Die kontrollierte Expression des zu analysierenden Genes erst nach der Selektion würde eine genauere Untersuchung der Auswirkungen dieses Genes auf die transfizierte Zelle ermöglichen. Ein episomal-stabiler Vektor, pCEP4-TetP, dessen Genexpression durch Tetracyclin regulierbar ist, wurde bereits beschrieben (Jost et al.,1997).

Das beschriebene Expressions- und Selektionssystem auf der Basis des pREP9-Vektors ermöglicht es, den Einfluss einer erhöhten Konzentration von Kandidatengenen in B-Zellen und anderen, CD4-negativen Zellen, zu analysieren. Für die Untersuchungen der IgM-vermittelten Apoptose in B-Zellen steht eine effiziente [Seite 92↓]Methode zur Verfügung, mit der die durch DD-RT PCR und 2D-Gelelektrophorese identifizierten Gene zuverlässig und schnell exprimiert und untersucht werden können.


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06.08.2004